Summary
Uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi otolog nakli türetilmesi için ilginç umutları sağlar. Ancak, pluripotent devlet ve zahmetli yeniden farklılaşma yoluyla ilerleme hala klinik çeviri engellemektedir. Burada erişkin insan fibroblast türetme ve uyarılmış nöral progenitör hücrelerin içine doğrudan dönüşüm ve nöral soy içine sonradan farklılaşmayı açıklar.
Abstract
Somatik hücre içine yetişkin deri fibroblastlardan uyarılmış pluripotent kök hücre (iPSCs) ve sonraki farklılaşma Nesil histokompatibilite engelleri aşmak otolog nakli türetilmesi için ilginç umutları sağlar. Ancak, pluripotent devleti ve istenen soy içine sonradan tam farklılaşma yoluyla ilerleme nedeniyle ilgili neoplastik potansiyeli ve genomik istikrarsızlık iPSC teknolojisinin klinik çeviri için bir barikat olmaya devam etmektedir. Son zamanlarda, ve diğerleri, somatik hücreler, sadece bu şekilde, pluripotent durumda ilerlemeyi engellemeyi, tanımlanmış faktörleri kullanılarak iPSCs halinde değil, aynı zamanda multipotent somatik kök hücrelerin farklı tiplerine dönüştürülemez gösterdi. Özel olarak, indüklenen nöral projenitör hücreler (iNPCs), insan fibroblast doğrudan dönüştürme, hücre değiştirme, hastalık modelleme gibi çeşitli uygulamalar için yeni bir otolog hücre kaynağı olasılığını habercisidirve ilaç tarama. Burada, zamanında yoktur Oct4, Sox2, Klf4 ifadesi, hem de c-myc göre iNPCs içine deri biyopsisi ve etkin doğrudan dönüştürme ile, yetişkin insan primer fibroblastlar izolasyonunu tarif eder. Sox2 pozitif nöroepitelyal koloniler indüksiyon 17 gün sonra ortaya çıkar ve iNPC hatları monoklonal izolasyon ve genişlemesi ile etkin bir şekilde tespit edilebilir. Indüksiyon aşamasında enfeksiyon ve lösemi inhibitör faktör takviyesi viral çokluğu hassas ayar kadar% 0.2 dönüşüm verimi elde etmek için kritik faktörleri temsil etmektedir. Şimdiye kadar, hastaya özgü iNPC hatları fazla 12 geçişleri için genişletilmiş ve eşit örneğin Nestin ve Sox2 ifadesi olarak nöral kök / progenitör hücrelerin morfolojik ve moleküler özellikleri göstermek mümkündür. sırasıyla Tuj1 ve GFAP karşı boyama tarafından değerlendirilecek iNPC hatları nöronlar ve astrositler içine ayırt edilebilir. Sonuç olarak, türev ve korkunç için sağlam bir protokol raporBöyle otolog sinir hücre değişimi ve hastalık modelleme gibi biyomedikal uygulamalarda bir hücresel kaynak sağlayabilir stabil genişletilebilir nöral progenitör hücrelerin içine insan fibroblastlar ct dönüşüm.
Introduction
2006 yılında Yamanaka ve arkadaşları ilk kez bir pluripotent devleti 1 içine somatik hücre yeniden programlanması olasılığını gösterebilir. Bu farksızlaşma Oct4, Sox2, Klf4 ve c-Myc murin fibroblast dört transkripsiyon aşırı ifadesi ile faktörleri elde edilmiştir. oluşturulan adlandırılan uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs), embriyonik kök hücrelerin (ESCs) fonksiyonel eşdeğerliği gösterir ve bu nedenle, yetişkin organizmanın bütün hücre tiplerine ayırt edilebilir. Daha sonra iPSCs için yeniden programlama bir yıl insan fibroblastlar 2 için elde edilebilir. Hayvan modellerinde deneyler iPSC türetilmiş hücreler, genel olarak, Parkinson hastalığı (PD), örneğin, hücre değiştirme terapisi, 3-5 için kullanılabileceğini göstermektedir. Bununla birlikte, iPSCs kullanımı ile ortaya çıkan çeşitli sınırlamalar terapötik potansiyelinin tam olarak gerçekleştirilmesi için engelleri temsil etmektedir. Pluripotent durumuna ve daha sonra, hücrelerin yeniden programlanmasının Her şeyden önce,kalite kontrol, genel olarak, bir zaman alan ve geniş ve bu yüzden pahalı bir hücre kültürü prosedürlerinde elde verimsiz bir işlemdir. İkincisi, iPSCs önemli tümörojenik potansiyeli barındırmaktadır biyomedikal uygulama öncesi ilgi istenilen hücre tipi ve farklılaşmış nüfusa artık pluripotent hücrelerin olasılığı re-ayırt edilmesi gerekir ve böylece hücre nakli 6 sonra yüksek riski gösterir. Üçüncü olarak, yeniden programlama işlemi, genellikle lenti- ya da retroviral enfeksiyonu ile yeniden programlama faktörleri uyarılması ile elde edilir. konukçu genomuna bu virüslerin entegrasyonu girmeyle mutagenez ve / veya transgenlerin 7,8 kontrolsüz bir şekilde yeniden aktive edilmesine yol açabilir. Bütünleştirici olmayan sistemler sokma mutajenez ve transgen reaktivasyonu riskini en aza indirmek olduğu, hedef hücrelere yeniden programlama faktörleri sağlamak için geliştirilmiştir. Bu transgen içermeyen yaklaşımlar için, non-entegre kullanarak hücrelerin yeniden programlama olanAdeno veya Sendai virüsü 9,10, DNA-temelli vektörler 11 ya da yeniden birleştirici proteinlerin 13,14 sentetik mRNA 12 ya da transdüksiyon transfeksiyonu gibi bir DNA içermeyen yöntemlerin uygulanması. Transgen ücretsiz IPSC derivasyon için bir başka umut verici bir yöntem loxP modifiye lentiviral yeniden programlama yapıları ve Cre-loxP DNA rekombinasyon sistemini kullanan 15,16 transgenlerin sonraki silinmesi kullanılmasıdır.
Hücre replasman tedavisi post-mitotik nöronlar 17-20 içine fibroblastların doğrudan dönüşüm temsil için daha basit bir yaklaşım nöral hücreleri üretmek için. Vierbuchen ve ark., Transkripsiyon aşırı murin fibroblast 17 den% 20 nöronların nesil Ascl1, Brn2 ve Myt1l sonuçları faktörler olduğunu bildirmiştir. 2011 yılında NeuroD1 aşırı ekspresyonu ile kombinasyon halinde aynı üç transkripsiyon faktörleri neu, insan fibroblast transdiferansiyonun etkinleştirmek, gördünöronlar 19. İnsan kaynaklı nöron ayrıca çift SMAD- ve GSK3β- inhibisyonu altında 20 Ascl1 ve Ngn2 aşırı ifadesi ile oluşturulabilir. Özellikle, nöronlar fibroblastların doğrudan dönüşüm daha da genişlemesi ve biobanking izin vermeyen bir non-proliferatif, post-mitotik hücre popülasyonunu oluşturur.
Son zamanlarda, bir çoğalan sinir kök / progenitör hücre popülasyonunun içine fibroblastların doğrudan dönüşüm 21-26 bildirildi. Açıklık uğruna, bütün bu hücre tipleri bu raporda uyarılmış nöral progenitör hücrelerin (iNPCs) olarak adlandırılır. Han ve ark. INPCs oluşturmak için Brn4, Sox2, c-myc ve Klf4 aşırı eksprese. Birincil doku veya pluripotent ya hücrelerden türetilmiş kendi nöral kök hücre meslektaşları gibi bu iNPCs tripotential ve nöronlar, astrositler ve oligodendrosit 21 içine ayırt edilebilir. Grubumuz Sox2, Klf4 aşırı ekspresyonu içeren biraz daha farklı bir dönüşüm protokolü bildirdiC-myc, ve sadece 5 gün süre ile indüklenen Oct4-ekspresyonu ve. Bu yaklaşımla biz yeniden programlama 22 faktörleri tam susturulması sergileyen fare embriyonik ve yetişkin fibroblastlardan stabil çoğalan iNPCs yaratabilir. IPSCs aksine, iNPCs nakli sonra 27 tümörijenik potansiyeli göstermezler. Biz iNPCs klinik 22 faydalı olduğunu gösteren, bir hayvan demiyelinizasyon modelinde miyelin eksikliği sıçanlarda başarıyla hücreleri dönüştürüldü kullandık. O zamana kadar, NPC yalnızca pluripotent kök hücreler veya birincil sinir dokusu 28-32 elde edilebilir. iNPCs dondurularak ve nöronlar, astrositler ve oligodendrositlere ayırt edebiliyoruz olabilir stabil genişletilebilir hücrelerdir. Çok çaba insan hücreleri 23,26,33,34 fare arasında doğrudan dönüşüm protokolü adapte yapılmıştır. 2012 yılında fibroblastlarda tek faktör Sox2 fazla sentezlenmesi sıçangil ve insan iNPCs oluşturmak için yeterli olduğu yayınlanmıştır
Çeşitli çalışmalar NSC'lerde veya farklı hayvan hastalık modellerinde kendi farklılaşmış meslektaşları hücresel işlevlerini göstermektedir. Insan pluripotent kök hücrelerinden Sinir atalarıdır birden 35,36 skleroz nöroenflamatuar bozukluğu fare modellerinde nakledilen oylandı. EAE'de HESC türetilmiş nöral projenitör hücrelerin uygulanabilirliği (deneysel otoimmün ensefalomiyelit) -mice ilk olarak 2008 yılında gördü 35. Multipotent nöral ön-madde hücreleri, fare beyin ventriküller içine enjekte edildi ve transplantasyon sonuçlarıEAE klinik belirtilerinin azalmasında ed. Kim ve ark. HESC oligodendroglial öncüleri oluşturulur ve EAE-farelere intraserebrovantriküler olan nakledilen. Nakli fazla 10 gün boyunca hayatta olmasa da, fareler, nörolojik fonksiyonu ve beyaz cevher 36 proinflamatuar bağışıklık hücrelerinin azalması önemli gelişme gösterdi. Kök hücre tedavisi, aynı zamanda NPC başarılı bir şekilde, ilgili hayvan modellerinde kullanılabilir olabilir gibi klinik öncesi Parkinson Hastalığının hedeflenmesi için uygulanmıştır. Bunun için, projenitör hücreler ya pluripotent kök hücreler 38-40 veya 41 kullanılmıştır mezenkimal kök hücrelerden ayırt fetal beyin dokusu 37 elde edilmiştir. 2012 yılında fare iNPCs miyelin eksikliği (md) sıçan 22 beyinlerine naklinden sonra proteolipid protein, büyük bir protein miyelin bileşenini üretmek mümkün olduğunu gösterdi. Bu proof-of-prensibi deney tedavi applicabil tarafındaniNPCs of Sığ öncelikle kanıtlanmış ve yakında başka bir çalışmada 32 ile teyit edilmiştir. Bununla birlikte, insan iNPCs terapötik kullanımı tam potansiyeli bir araştırma konusudur.
Burada cilt biyopsisi yoluyla erişkin hastalarda insan primer hücreleri (i) türetme bir sağlam ve entegre sürecini göstermek, (ii) nöral progenitör devlet ve iNPCs (iii) yeteneği, insan fibroblast doğrudan dönüşüm nöronal içine ayırt edilmesi ve glial soy. Bu protokolün kullanımı terapötik uygulamalar için otolog insan hücrelerinin üretimini hızlandırmak için yardımcı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışmada kullanılan insan fibroblastlar Würzburg, Almanya Üniversitesi etik kurulu tarafından onay ve etik açıklığı haberdar olduktan sonra bir cilt punch biyopsi elde edildi (etik raporu no: 96/11 2011/10/06 tarihli).
1. Punch Biyopsi
- Hastanın cilt dezenfekte edin. Intrakütan 0.5 ml 1 mepivakain hidroklorür biyopsi (tercihen daha az güneşe maruz kalan bölge) alınacak olan cilt kısmını uyutmak ve steril 3mm biyopsi yumruk kullanarak deri biyopsisi hazırlamak, DPBS biyopsi + 1 ul / 1 ml gentamisin durulayın ve kaldırmak şişman. DPBS + Gentamisin, Dispase II aspirat DPBS tamamen ve kapak biyopsisi (2.4 U / ml) ile iki kez biyopsi durulayın ve 16 inkübe - 4 ° C'de 18 saat.
- Aspire Dispase tamamen DPBS ile iki kez yıkayın ve cımbızla epidermis çıkarın. 15ml tüp içinde, transfer 2 mi kollajenaz tip 2 (500 U / ml CDU) ekleyin, DPBS ile iki kez biyopsi yıkayın Collagena eklese kadar 5 ml toplam hacim. 37 ° C'de,% 5 CO2 seviyesinde 45 dakika boyunca inkübe edin.
- Santrifüj 5 180 xg'de dakika ve sonrasında süpernatant atın. 180 x g hızında 5 dakika süreyle yeniden 10 mi DMEM-FCS-Gentamisin-ortam (% 10 FCS, 1 ul / ml Gentamisin) ve santrifüj içinde süspanse pelet. 1.5 ml DMEM-FCS-Gentamisin-medya süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet atın. Yapışkan doku kültürü şişesi T25 ve 37 ° C'de,% 5 CO2 inkübe aktarın.
- 3 günde ortamı değiştirmek.
- Yaklaşık olarak 2 hafta, hücreler deri parçaları, tripsin / EDTA (% 0.05) ile bölünmüş hücrelerinin etrafında konfluent olduğunda: Yıkama hücreleri bir kez DPBS ile, 37 ° C'de 5 dakika inkübe,% 5 CO2 2 ml tripsin / EDTA ilave edildikten sonra (% 0.05), DMEM-FCS-Gentamisin-ortam 2 ml ilave 5 dakika boyunca 180 x g'de 15 ml tüp ve santrifüj aktarmak; DMEM-FCS-Gentamisin-medya uygun miktarda supernatant ve tekrar süspansiyon pelet atın.
- Ortam ayrıca her 3 r değiştirerek hücreleri genişletmekhücreler konfluent olduğunda, yukarıda tarif edildiği gibi d günü ve bölme; Gentamisin eklenmesi geçit 2'den sonra durdurulabilir.
- Doğrudan dönüşüm deneyler için hücreleri kullanmadan önce, standart tahlillerle mikoplazma kontaminasyonu dışlamak için emin olun.
- Hücreler genişletilmiş zaman, doğrudan dönüşüm başlatmak ya da% 10 DMSO ve% 90 FCS kullanarak hücreleri aşağı donabilir. Hücreler, 2 gün boyunca -80 ° C'de saklanır ve daha sonra uzun süreli saklama için sıvı nitrojen transfer edilmelidir.
- Dönüşüm hazırlanması için, DPBS, aspirat DPBS ile bir kez hücreleri yıkayın ve 2.5 ml tripsin / EDTA (% 0.05) ilave edin. 37 ° C'de,% 5 CO2 de 5 dakika için tutun. Dokunun Şişe hafifçe fibroblast ortamı, 2.5 ml (DMEM dahil. L-Glu +% 10 FCS +% 1 NEAA +% 1 sodyum piruvat) içinde tekrar süspansiyon hücreleri ayırmak ve 15 ml tüp aktarmak için kullanılır. 5 dakika boyunca 180 xg'de Santrifüj ve süpernatant aspire. 1 ml aşağı fibroblast medya ve pipet yukarı ve yeniden süspanse hücreleri tek bir hücre süspansiyonu elde etmek. </ Li>
- Bir Fuchs-Rosenthal- ya Neubauer hücresi sayma odacığı ve plaka, bir 24 yuvalı plaka içinde çukur başına 3 x 10 4 hücreleri kullanılarak hücre sayısı. 37 ° C'de,% 5 CO2 de O / N inkübe edin.
Sendai virüs ve transdiferansiyonun İnsan Fibroblastları 2. Enfeksiyon
NOT: virüs taşıma Aşağıdaki adımlar, biyolojik güvenlik kabini ve bir laminer akış kaputu, ve mukozal maruziyetini önlemek için uygun kişisel koruyucu donanımları, özellikle cerrahi maske ile yapılması gereken, güvenliğini sağlamak için.
- 100 ul fibroblast medya (Adım 1.9) hücreleri geçin. Oct4-, Klf4-, Sox2- hacimde ve c-myc-Sendai virüsü çözülme ve 1 ml fibroblast ortam her virüs tekrar süspansiyon. Hücrelere 3 bir MOI (virüs titresi, partiden partiye değişiklik gösterir, ancak her virüsün bir alikosu genellikle 24 kuyu-plakasının 10 kuyu enfeksiyonu için kullanılabilir) her virüs ekleyin ve yavaşça karıştırın. 37 ° C'de,% 5 CO2 de O / N inkübe
- Ve 24 saat sonra aspire orta ve neuroinduction ortamı (: 1 DMEM / F-12 Neurobasal, 1 x N2, 1 x B27,% 1 GlutaMAX, 10 ng / ml hLIF, 3 uM CHIR99021, 2 uM SB431542 1) 500 ul Bundan sonra 39 ° C'de,% 5 CO2 de kültür. Her gün medya değiştirin.
- DPBS içinde 1 ug / ml'ye seyreltin laminin 6 iyi plakalar üzerine çözeltinin 1 ml ilave edilir ve 24 saat boyunca 4 ° C'de tutun: 6. günde, enfeksiyondan sonra laminin kaplı 6 oyuklu plakaları hazırlar.
- Ortamı aspire ve DPBS ile bir kez yıkama hücreleri, ardından DPBS / EDTA, 500 ul ve 37 ° C'de,% 5 CO2 'de 10 dakika süreyle inkübe edilir: 7. günde enfeksiyondan sonra DPBS / EDTA kullanılarak hücreler ayrıldı.
- DMEM / F12 500 ul ilave edin ve 5 dakika boyunca 180 x g'de 15 ml'lik bir tüp ve santrifüj plaka süspansiyon çıkarın.
- Süpernatant aspire ve neuroinduction ortam, laminin kaplı 6 iyi plakalar üzerinde plakanın 1,5 ml pelet tekrar süspansiyon ve nihai conce ROCK önleyicisi Y27632 ekleme39 ° C'de hücreler, kültür 10 uM ntration,% 5 CO2.
- Her gün medya değiştirin.
- Enfeksiyon kültürden sonra 14 gün kadar 37 ° C 'de hücreler,% 5 CO2. Nöroepitelyal koloniler faz kontrast mikroskobu ile enfeksiyon gün sonra 17 civarında belirgin hale gelir. Bunlar enfeksiyondan 20 gün sonra yaklaşık çekilmesi için yeterince büyük olmalıdır.
Putatif iNPC Kolonileri 3. İzolasyonu
- Çekme bir gün önce, kaplama, bir 48 laminin ile iyi bir şekilde plakası:, DPBS içinde 1 ug / ml'ye seyreltin laminin plakalar üzerine çözelti, 300 ul 24 saat süre ile 4 ° C'de tutun. Bir gün sonra aspire laminin plakaları ve kuyulara neuroinduction medya 200 ul ekleyin.
- 6 kuyu-plakasının oyuk başına 6 kuyucuklu plaklar kolonileri ihtiva eden DPBS ile bir kez aldı ve ekleme için 2 mi DPBS yıkayın. Mekanik koloniler seçin: hücrelerini çevreleyen kurtulmak için ince bir iğne kullanılarak kolonilerin etrafında kazıyın; 200 set1 l 50 ul üzerinde pipetman ve ilgili pipet uçları kullanarak koloniler seçin.
- Bir laminin kaplı 48 çukurlu plaka içinde bir kuyuya bir koloni, her aktarın ve aşağı doğru 10 kere ve yukarı pipetlenerek mekanik tek bir hücre süspansiyonu üretmek. Hücrelere 10 uM bir nihai konsantrasyona ROCK önleyicisi Y27632 ekleyin.
- 2 gün boyunca 37 ° C'de,% 5 CO2 seviyesinde 48 oyuklu plaka üzerindeki hücreler büyür. % 90 confluency (yaklaşık 3 - -. 4 gün) hücreleri 80 ulaşana kadar her ikinci gün medya değiştirin.
4. Genişleme ve iNPCs Cryo-koruma
- Pasajlanması ve iNPCs genişletilmesi
- Orta aspire ve DPBS ile hücrelerin yıkayın. DPBS aspire ve 200 ul DPBS / EDTA ekleyin ve 37 ° C'de,% 5 CO2 'de 10 dakika süreyle inkübe edilir, ekleme DMEM / F12 200 ul, 5 dakika boyunca 180 x g'de, 15 ml'lik bir tüp içinde plaka santrifüj süspansiyon kaldırma .
- Süpernatant aspire ve neuroi 0.5 ml pelletininduction ortamı (Adım 2.2), laminin ile kaplanmış 12 oyuklu plakalarda levha ve hücrelere 10 uM bir nihai konsantrasyona ROCK önleyicisi Y27632 ekleyin, 37 ° C 'de kültür,% 5 CO2. Hücreler 80 ulaşır sonra -% 90 confluency onlar da daha genişletilmiş olabilir ya da aşağıdaki gibi donmuş.
- INPCs dondurulması
- Orta aspire ve DPBS ile hücrelerin yıkayın. Aspire DPBS ve 300 ul DPBS / EDTA ekleyin ve 37 ° C'de,% 5 CO2 'de 10 dakika süreyle inkübe edilir, DMEM / F12 300 ul ilave et ve 5 dakika boyunca 180 x g'de, 15 ml'lik bir tüp içinde plaka santrifüj süspansiyon çıkarın.
- Süpernatantı aspire ve ticari MGK dondurma orta 0.5 ml pelletini. Dondurma şişeleri Transfer süspansiyon ve hücre dondurma kabının koymak. 2 gün süre ile -80 ° C'de saklayın, daha sonra uzun süreli saklama için sıvı nitrojen aktarın.
INPCs 5. Farklılaşma
- Nöron doğru Farklılaşmaal soyu
- Laminin kaplanmış plakalar üzerinde kültür hücreleri, yukarıda tarif edildiği gibi. Hücreler, yaklaşık% 70 olan nöro-diff-ortam (DMEM / F-12, 1 x N2, 1 x B27, 300 ng / ml cAMP, 200 uM C vitamini, 10 ng / ml, BDNF, 10 ng / ml, GDNF) bir ortam confluent. Üç hafta boyunca her gün medya değiştirin. Farklılaşma sırasında değil bölünmüş hücreler yapın.
- Üç hafta sonra hücreler nöronal belirteç Tuj1 ifade etmelidir. Daha olgun nöronlar kazanmak ve nöronal alt tiplerinin 3 ay farklılaşma kadar devam etmek.
- Glial soy doğru Farklılaşma
- Glial indüksiyon ortamı (1 bir ortam: 1 DMEM / F-12: Neurobasal, 1 x N2, 1 x B27, 10 uM β-mersaptoetanol, 100 uM temel olmayan amino asitler, 1.5 mM L-Glutamin, 5 ug / ml insülin, 40 ng / ml T3) 20 ng / ml EGF glial öncü hücrelerine farklılaşmaya yol da dahil olmak üzere. Medyanın yarısı çıkarın ve yaklaşık 2 hafta süreyle her gün taze medya tarafından değiştirin. Bu süre içinde hücreler bölünmüş olmalıdır1:% 100 konfluansa 10 uM ROCK önleyicisi Y27632 mevcudiyetinde 3 ulaşıldığında.
- Hücreler, ticari mevcut astrosit medyaya neredeyse konfluent değişiklik medya olduğunda, her ikinci gün ortamı değiştirmek: 2 hafta sonra daha astrositlerde içine hücreleri ayırt. 7 gün geçtikten sonra hücreler, astrosit belirteçleri (örneğin, GFAP) ifade etmek için başlar. 10 uM ROCK inhibitörü Y27632 varlığında 2 oranında: Hücreler farklılaşma protokol sırasında% 100 konfluent alırsanız, 1 onları bölmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada en az 8 haftalık (Şekil 1) içinde deriden punch biyopsi ile elde edilmiş olan insan fibroblastlarında indüklenen nöral projenitör hücreleri (iNPCs) üretilmesini sağlayan entegre işlemin tanımını. Hasta specifc iNPCs daha nöronal ve glial soy içine farklılaşmış hücre replasman tedavisi ve hastalık modelleme için büyük bir potansiyel liman olabilir.
Oct4-, Klf4-, Sox2- ve c-Myc Sendai ile fibroblast Enfeksiyon fibroblast ve 17 gün sonra enfeksiyon kolonilerin ortaya çıkması, morfoloji değişikliği sonuçlandı neuroinductive medya koşullarında 22,31 yılında 23 ve kültürünü virüsleri (Şekil 2). Bunlar pluripotency- eksprese etmeyen ise üretilen monoklonal hücre çizgileri, genişletilmiş ve Sox2 Sox1, Nestin, vimentin, Otx2 ve Pax6 gibi nöral kök hücre markörleri için pozitif leke olarak çoğalması belirteci Ki67 için edilebilirbağlantılı bir işaretleyici Oct4 (Şekil 3).
Ayrıca, hücre kültür ortamına nöronal büyüme faktörlerinin ilave edilmesiyle nöral projenitör hücreleri, nöronlar ayırt edilebilir. Glial fibriller asidik proteine karşı, tipik morfolojik değişiklikler ve lekelenme (GFAP) (Şekil 4, analizi ile belirlendiği üzere Izrael dayalı bir farklılaşma protokolü uygulayarak ve ark., 42 ve astrosit endüksiyon ortamı hücre hatları ile daha sonra nihai farklılaşma, aynı zamanda, glial soy içine ayırt edilebilir ).
Şekil 1. Şematik bu çalışmada uygulanan üç aşamalı protokol gösterimi. Fibroblastlar bir punch biyopsi ile hastalardan izole ve genişletilebilir. Bu hücre çizgileri, daha sonra doğrudan bağlı multipotent nöral projenitör hücreler (iNPCs) ve mo dönüştürülebilirnoclonally genişletti. iNPC hatları (tekrarlanan veya standartlaştırılmış kullanımı için biobanking) Uzun süreli depolama için kullanılabilir ya da nöronal ve glial soy içine ayırt edilebilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. morfolojik faz kontrast mikroskopisi kullanılarak indüklenen nöral projenitör hücrelerine insan fibroblastlarında doğrudan dönüşüm analizi (a) İnsan fibroblastları, üç gün OKSM ile enfeksiyondan sonra -. Sendai virüsü ve neuroinduction ortamı ilave edildikten sonra iki gün. Hücreler tipik fibroblast benzeri morfoloji gösterir. (B) yedi gün değiştirilen morfoloji göstermek yukarıya enfeksiyon hücreleri sonrası. Hücreler aynı gün konfluense azaltmak için bölünür. (C) On güns sonrası enfeksiyon yalnızca değiştirilen morfolojiye sahip hücreler mevcuttur. (D) İlk küçük nöroepitelyal benzeri koloniler 17 gün sonra enfeksiyon bulunabilir. Bu koloniler, boyut (D) 'de arttırır ve outgrowing hücreler üç gün sonra (F)' da bulunabilir. Hücreler gün 21 sonrası enfeksiyon ve genişletilebilir hücre hatları onlara (GI) elde edilebilir üzerinde toplanır. Farklı klonlar sırasıyla çekme sonra geçit 1 (G), geçit 3 (lH) ve geçiş 10 (I) 'de gösterilmiştir. Ölçek çubuğu = 200 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Oluşturulan nöral projenitör cel nöral kök hücre işaretleyici gen ekspresyonu Şekil 3. Analizl hatları. hücre çizgilerinin antikor boyama 10 pasajlar hücrelerin nöral kök hücre işaretçilerini Sox1, Sox2 (A) yanı sıra Nestin ve Pax6 (B) eksprese olduğunu ortaya çıkardı. Hücreler pluripotense (C) olmadığına işaret pluripotense markör Oct4 için negatiftir. hücrelerin çoğunluğu yüksek proliferatif durumu göstermektedir markör Ki67, (Cı) için pozitif leke. Ölçek çubuğu = 50 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
NPCs Şekil 4. Analiz sonrasında nöronal ve glial soy içine farklılaşma yönetti. Nöronal şartname iNPCs ulaşmak için (A) BDNF, GDNF, C vitamini ve cAMP varlığında yedi gün boyunca ayırt edildi. (B) Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada yalıtım ve genleşebilen transgen içermeyen nöral projenitör hücreleri içine insan fibroblastlarının doğrudan dönüşümü ve hücre değiştirme tedavisi ya da ilaç tarama analizleri uygulama için varsayılan bir temel olarak farklılaşmış döl göstermektedir. NPC içine somatik hücre soyu doğrudan dönüşüm seri spesifik transkripsiyon zorla ifade 26,33,34 faktörleri ile elde edilmiştir. Bununla birlikte, bir çok durumda fetal fibroblastlar transdiferansiasyon deneyler 33,34 kullanılmıştır. Bu hücre kaynağı otolog hücre replasman tedavisi için klinik kullanımını engellemektedir gibi biyomedikal uygulamalar için bu hücrelerin kullanımı yersiz olduğunu. Son zamanlarda yapılan çalışmalar bu tür hematopoetik hücrelerin 43,44 olarak daha kolay erişilebilir dokulardan, nöral prekürsör hücrelerinin üretimini açıklayan yayınlandı. tripotent nöral kök hücre çizgilerinin başarılı üretimi uyarılabilir overexpr murin kandan alınan B hücreleri için gösterilebilirSekiz transgenlerin 43 esion. Ayrıca, Castano ve ark., Insan Sox2- kullanılarak hematopoietik hücreler ve c-myc-Sendai virüsü 44 nöronal progenitörlerin uyarılması için bir yaklaşım yayınladı. protokol CD133 + kordon kanı hücrelerinden sinir hücrelerinin hızlı ve etkin nesil sağlar nitelendirdi. Yetişkin periferal kan tek-çekirdekli hücrelerinin dönüştürülmesi için uygulanan Ancak, protokol, düşük verimlilik ve üretilen hücre çizgilerinin genleşme kapasitesi çok 44 sınırlı elde edildi. Bu nedenle, bugüne 44 insan sisteminde periferik kan hücreleri ile geçme tek çalışma açık bir şekilde doğrudan dönüşüm deneylerinde, bu özel hücre tipine sınırlarını gösterir. Hastaya özgü hücrelerin mevcudiyeti otolog hücre değiştirilmesi için önemli olduğu için, tercih edilen bir hücre tipi hala çalışmada tarif edildiği gibi kolayca deri punch biyopsi ile elde edilebilir, yetişkin fibroblastlar, temsil etmektedir.
overexpretransdiferansiyonun için gerekli transgenlerin salgılanması daha çok entegre viral vektörler 26,33,34 ile elde edilmiştir. Konukçu genomuna virüs entegrasyonu sokma mutajenez veya transgenlerin 7,8 istenmeyen yeniden aktive edilmesine yol açabilir, çünkü bu biyomedikal uygulamalar için elde edilen hücre çizgilerinin uygulanabilirliğini engellemektedir. Transgen aşırı ekspresyonu olmayan NPC içine transdiferansasyonu ama kimyasal işleme göre, insan fibroblast 45 için tarif edilmiştir. Bu çalışmanın amacı, olgun Schwann hücrelerinin 45 kuşağı olduğu gibi Ancak, bu çalışmada bu öncül hücreleri geçici devlet sadece mevcuttu. Son zamanlarda, Sendai virüsü uygulamaya dayalı diğer transgen ücretsiz yaklaşımlar NPC 23,44, insan fibroblast direkt dönüşümü için açıklanan ve bugüne kadar tercih edilebilir bir strateji gibi görünüyor oylandı. Sonradan nöronal ve glial soy içine ayırt edilebilir genişletilebilir NPC türetmek için,Aşağıda tarif edildiği gibi önemli değişiklikler ile kültür ortamı 22,31 küçük moleküllerin ilave edilmesi ile ısı virüsü 23 inaktivasyonu gibi nöronal indüksiyonu ile birlikte Sendai virüsü bütün Yamanaka-faktörlerin aşırı ekspresyonu uygulanır.
Bizim ellerde, protokol verimli test birçok fibroblast hatları ile çalışıyor rağmen, eski bağışçılardan fibroblast hücreleri doğrudan dönüşüm iNPC nesil düşük verimlilik fakir proliferatif potansiyel sonuç sergileyen bu belirgin bir eğilim vardır. Biz Oct4 okunur ve daha sonra boyama ile hücrelerin enfeksiyonu ile değerlendirildiği gibi% 90'dan daha fazla olan bir viral transdüksiyon verimliliği sonraya kadar% 0.2 verimi oluşturan koloni gözlenmiştir. Bu verimlilik, daha önce 23 yayınlanmış yaklaşık 3 kat daha fazladır.
optimize edilmiş viral İçişleri Bakanlığı hassas ayarlanmış bir uygulama çok önemlidir. Sendai virüsü titresi toplu değişkenlik topludikkate alınması gerekir. Virüs genellikle ticari kazanılmış olduğundan, ilgili bilgi üreticisinin ana sayfasında bulunabilir. Biz transdiferansiasyon deneyler için, 3 nispeten düşük bir MOI öneriyoruz.
NPC 31, insan pluripotent hücrelerin farklılaşması için tarif edildiği gibi bizim elimizde insan LİF eklenmesi kurulan iNPC hatlarının kendini yenileme için çok önemlidir. LIF ilave olmadan hücreler erken iki gün geri dönüşü olmayan bir şekilde geri çekilmesinden sonra da ayırt başlar.
Enfeksiyondan sonra hücre kültürü 39 ° C sıcaklıkta gerçekleştirildi ve standart 37 ° C hücre kültürü koşulları kullanılarak değildir. Bu ısı artışı bir günlük enfeksiyondan sonra daha önce başlar ve Sendai virüsü ısı inaktivasyonu yol açar. enfeksiyondan 14 gün sonra kadar, 39 ° C 'de kültür nöroepitelyal koloni üretimi için esastır.
Doğrusu, bazen iNPC kolonileri protokol bölümünde açıklanan daha sonra gelip. Bizim tecrübelerimize göre, sürece hücreler proliferatif kalır onlar poliklonal geçişli olabilir ve manuel toplama izole. Erken ortaya çıkan koloniler için tarif edildiği gibi, bu kolonilerin yerleşik hücre hatları benzer özellikler göstermektedir.
Hücre serileri yarılması sırasında onlar da çoğalmaya hücre-hücre temas veya parakrin sinyallerini gerektiren bir hücre çok az sayıda tohum önemlidir. Hücreler numaralı seribaşı ise çok düşük yoğunluklu çoğalması sona erecek. Bu durumda, hücreler, proliferasyonu yeniden başlatmak için daha küçük bir yüzeye sahip bir hücre kültürü tabağına şarjı ile kurtarılan olabilir.
INPCs glial farklılaşması için, yüksek yoğunluklu hücreleri tohum ve plaka hemen konfluent olduğunda, onları ayırmak için çok önemlidir. Hücreler çok erken bölme ise, esas olarak nöronal farklılaşma gözlenecektir.
İçerik "> Bu yazıda anlatılan süreç yarı veya tam otomatik bir şekilde uygulanacak potansiyeli, hastalık modelleme ve hücre replasman tedavisi de dahil olmak üzere, arzu edilen biyomedikal potansiyele ulaşmak için gerekli olacak barındırır. Otomasyon de maliyet sağlayacak nöral progenitör hücrelerin nesil verimli ölçek büyütme ve parallelleştirme.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Biz mükemmel teknik destek için yararlı öneriler ve Martina Gebhardt yanı sıra Heike Arthen için Kök Hücre ve Würzburg Üniversitesi Rejeneratif Tıp Grubu'nun tüm üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (ED79 / 1-2), Milli Eğitim Bakanlığı ve Alman Araştırma BMBF (0813 01 GN), Bavyera Araştırma Ağı uyarılmış pluripotent kök hücrelerin "forIPS" ve "Stiftung Sibylle Assmus hibe ile desteklenmiştir ". Şekil 1, www.servier.com temin edilebilen Servier tıp tekniğinde, kullanılarak üretilir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Astrocyte media | ScienCell | 1801 | |
| B27 | LifeTechnologies | 17504-044 | |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| Biopsy Punch | pfm medical | 48301 | |
| cAMP | Sigma | A6885 | |
| CHIR99021 | Axon medchem | 1386 | |
| Collagenase Type2 | Worthington Biochemical | LS004177 | |
| Dispase | PAN | P10-032100 | |
| DMEM | LifeTechnologies | 41966-029 | |
| DMEM F12 | LifeTechnologies | 11320-033 | |
| DMSO | Roth | 4720 | |
| DPBS | LifeTechnologies | 14190-094 | |
| EGF | Life Technologies | PHG0313 | |
| FCS | Biochrom AG | 50115 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| Gentamicin | Sigma | G1397 | |
| GFAP-antibody | Dako | Z0334 | |
| GlutaMAX | LifeTechnologies | 35050-038 | |
| hLIF | Peprotech | 300-05 | |
| Insulin | Seralab | GEM-700-112-P | |
| Ki67-antibody | NeoMarkers | RM-9106-S | |
| L-Glutamine | LifeTechnologies | 25030-024 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| N2 | LifeTechnologies | 17502-048 | |
| Nestin-antibody | R&D Systems | MAB1259 | |
| Neurobasal | LifeTechnologies | 21103-049 | |
| Non-essential amino acids | LifeTechnologies | 11140-050 | |
| NSC freezing media | Sigma | C6295 | |
| Oct4-antibody | Santa Cruz | sc9081 | |
| Pax6-antibody | Covance | PRB-278P | |
| SB431542 | Invivogen | inh-sb43 | |
| Sendai virus: CytoTune Sendai Reprogramming Kit | LifeTechnologies | A1378001 | |
| Sodiumpyruvate | Life Technologies | 11360-039 | |
| Sox1-antibody | R&D Systems | AF3369 | |
| Sox2-antibody | R&D Systems | MAB2018 | |
| T3 | Santa Cruz | sc-205725 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| TUJ1-antibody | Covance | MMS-435P-250 | |
| Vitamin C | Sigma | A4544 | |
| Y27632 | Calbiochem | CAS 146986-50-7 | |
| β-Mercaptoethanol | LifeTechnologies | 21985023 |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Cai, J., Yang, M., Poremsky, E., Kidd, S., Schneider, J. S., Iacovitti, L. Dopaminergic neurons derived from human induced pluripotent stem cells survive and integrate into 6-OHDA-lesioned rats. Stem Cells Dev. 19 (7), 1017-1023 (2010).
- Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson’s disease. Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).
- Rhee, Y. H., et al. Protein-based human iPS cells efficiently generate functional dopamine neurons and can treat a rat model of Parkinson disease. J Clin Invest. 121 (6), 2326-2335 (2011).
- Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448 (7151), 313-317 (2007).
- Soldner, F., et al. Parkinson’s disease patient-derived induced pluripotent stem cells free of viral reprogramming factors. Cell. 136 (5), 964-977 (2009).
- Sommer, C. A., Stadtfeld, M., Murphy, G. J., Hochedlinger, K., Kotton, D. N., Mostoslavsky, G. Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 27 (3), 543-549 (2009).
- Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27, 2667-2674 (2009).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, 348-362 (2009).
- Montserrat, N., et al. Simple generation of human induced pluripotent stem cells using poly-beta-amino esters as the non-viral gene delivery system. J Biol Chem. 286 (14), 12417-12428 (2011).
- Warren, L., Nu, Y., Wang, J., Guo, X. Feeder-free derivation of human induced pluripotent stem cells with messenger RNA. Sci Rep. 2, 657 (2012).
- Bosnali, M., Edenhofer, F.
- Zhou, H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins. Cell Stem Cell. 4 (5), 381-384 (2009).
- Awe, J. P., et al. Generation and characterization of transgene-free human induced pluripotent stem cells and conversion to putative clinical-grade state. Stem Cell Res Ther. 4 (4), 87 (2013).
- Kadari, A., et al. Excision of viral reprogramming cassettes by Cre protein transduction enables rapid, robust and efficient derivation of transgene-free human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res Ther. 5 (2), 47 (2014).
- Vierbuchen, T., Ostermeier, A., Pang, Z. P., Kokubu, Y., Südhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
- Caiazzo, M., et al. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476 (7359), 224-227 (2011).
- Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476 (7359), 220-223 (2011).
- Ladewig, J., et al. Small molecules enable highly efficient neuronal conversion of human fibroblasts. Nat Methods. 9 (6), 575-578 (2012).
- Han, D. W., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into neural stem cells by defined factors. Cell Stem Cell. 10 (4), 465-472 (2012).
- Thier, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).
- Lu, J., et al. Generation of integration-free and region-specific neural progenitors from primate fibroblasts. Cell Rep. 3 (5), 1580-1591 (2013).
- Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Südhof, T. C., Werning, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (7), 2527-2532 (2012).
- Tian, C., et al. Direct conversion of dermal fibroblasts into neural progenitor cells by a novel cocktail of defined factors. Curr Mol Med. 12 (2), 126-137 (2012).
- Zhu, S., et al. Small molecules enable OCT4-mediated direct reprogramming into expandable human neural stem cells. Cell Res. 24 (1), 126-129 (2014).
- Hemmer, K., et al. Induced neural stem cells achieve long-term survival and functional integration in the adult mouse brain. Stem Cell Reports. 3 (3), 423-431 (2014).
- Conti, L., et al. Niche-independent symmetrical self-renewal of a mammalian tissue stem cell. PLoS Biol. 3 (9), e283 (2005).
- Elkabetz, Y., Panagiotakos, G., Al Shamy,, Socci, G., Tabar, N. D., Studer, V., L, Human ES cell-derived rosettes reveal a functional distinct early neural stem cell stage. Genes Dev. 22 (2), 152-165 (2008).
- Koch, P., Opitz, T., Steinbeck, J. A., Ladewig, J., Brüstle, O. A rosette-type self-renewing human ES cell-derived neural stem cell with potential for in vitro instruction and synaptic integration. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (9), 3225-3230 (2009).
- Li, W., et al. Rapid induction and long-term self-renewal of primitive neural precursors from human embryonic stem cells by small molecule inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (20), 8299-8304 (2011).
- Reinhardt, P., et al. Derivation and expansion using only small molecules of human neural progenitors for neurodegenerative disease modeling. PLoS One. 8 (3), c59252 (2013).
- Ring, K. L., et al. Direct reprogramming of mouse and human fibroblasts into multipotent neural stem cells with a single factor. Cell Stem Cell. 11 (1), 100-109 (2012).
- Zou, Q., et al. Direct conversion of human fibroblasts into neuronal restricted progenitors. J Biol Chem. 289 (8), 5250-5260 (2014).
- Aharonowiz, M., Einstein, O., Fainstein, N., Lassmann, H., Reubinoff, B., Ben-Hur, T. Neuroprotective effect of transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursor in an animal model of multiple sclerosis. PLoS One. 3 (9), e3145 (2008).
- Kim, H., et al. Immunomodulation by transplanted human embryonic stem cell-derived oligodendroglial progenitors in experimental autoimmune encephalomyelitis. Stem Cells. 30 (12), 2810-2829 (2012).
- Kondoh, T., Pundt, L. L., Blount, J. P., Conrad, J. A., Low, W. C. Transplantation of human fetal tissue from spontaneous abortions to a rodent model of Parkinson’s disease. Cell Transplant. 5 (1), 69-75 (1996).
- Takagi, Y., et al. Dopaminergic neurons generated from monkey embryonic stem cells function in a Parkinson primate model. J Clin Invest. 115 (1), 102-109 (2005).
- Kikuchi, T., et al. Survival of human induced pluripotent stem cell-derived midbrain dopaminergic neurons in the brain of a primate model of Parkinson’s disease. J Parkinson’s Dis. 1 (4), 395-412 (2011).
- Kirkeby, A., et al. Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions. Cell Rep. 1 (6), 703-714 (2012).
- Dezawa, M., et al. Specific induction of neuronal cells from bone marrow stromal cells and application for autologous transplantation. J Clin Invest. 113, 1701-1710 (2004).
- Izrael, M., et al. Human oligodendrocytes derived from embryonic stem cells: Effect of noggin on phenotypic differentiation in vitro and on myelination in vivo. Mol Cell Neurosci. 34 (3), 310-323 (2007).
- Cassady, J. P., et al. Direct lineage conversion of adult mouse liver cells and B lymphocytes to neural stem cells. Stem Cell Rep. 3 (6), 948-956 (2014).
- Castano, J., et al. Fast and efficient neural conversion of human hematopoietic cells. Stem Cell Rep. 3 (6), 1118-1131 (2014).
- Thoma, E. C., et al. Chemical conversion of human fibroblasts into functional Schwann cells. Stem Cell Rep. 3 (4), 539-547 (2014).
