Summary
Generation av inducerade pluripotenta stamceller ger fascinerande utsikterna för härledning av autologa transplantationer. Men progression genom ett pluripotent tillstånd och mödosam åter differentiering hindrar fortfarande kliniska översättning. Här beskriver vi härledningen av vuxna humana fibroblaster och deras direkta omvandling till inducerade neurala progenitorceller och efterföljande differentiering till neurala härstamningar.
Abstract
Generation av inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) från vuxna hudfibroblaster och efterföljande differentiering till somatiska celler ger fascinerande utsikterna för härledning av autologa transplantationer som kringgår histokompatibla hinder. Men progression genom ett pluripotent tillstånd och efterföljande fullständig differentiering i önskade linjerna förblir en vägspärr för klinisk översättning av iPSC teknik på grund av den tillhörande neoplastisk potential och genomisk instabilitet. Nyligen, vi och andra visade att somatiska celler inte bara kan omvandlas till iPSCs utan även i olika typer av multi somatiska stamceller genom att använda definierade faktorer, och därigenom kringgå progression genom pluripotent tillstånd. I synnerhet den direkta omvandlingen av humana fibroblaster i inducerade neurala progenitorceller (iNPCs) förebådar möjligheten av en ny autolog cellkälla för olika applikationer såsom cellersättning, sjukdom modelleringoch drogscreening. Här beskriver vi isoleringen av adulta humana primära fibroblaster från hudbiopsi och deras effektiva direkt omvandling till iNPCs från tid begränsade expressionen av Oct4, Sox2, Klf4, samt c-Myc. Sox2-positiv neuroepiteliala kolonier visas efter 17 dagar av induktion och INPC linjer kan fastställas effektivt genom monoklonal isolering och expansion. Exakt justering av viral infektions och komplettering av leukemiinhiberande faktor under induktionsfasen utgör kritiska faktorer för att uppnå konvertering verkningsgrader på upp till 0,2%. Hittills kunde patientspecifika INPC linjer utökas för mer än 12 passager och enhetligt visa morfologiska och molekylära egenskaper hos neurala stamceller / progenitorceller, såsom ett uttryck för nestin och Sox2. INPC linjer kan differentieras till neuroner och astrocyter som bedöms genom färgning mot TUJ1 och GFAP respektive. Sammanfattningsvis rapporterar vi en robust protokoll för härledning och ödesdigract omvandling av humana fibroblaster i stabilt expander neurala stamceller som kan ge en cellulär källa för biomedicinska tillämpningar såsom autolog neural cell ersättning och sjukdom modellering.
Introduction
Under 2006 Yamanaka och kollegor kunde visa för första gången möjligheten att omprogrammering somatiska celler i ett pluripotent tillstånd 1. Denna dedifferentiering uppnåddes genom överuttryck av fyra transkriptionsfaktorer Oct4, Sox2, Klf4, och c-Myc i murina fibroblaster. De genererade s.k. inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) visar funktionell ekvivalens med embryonala stamceller (ESCS) och kan sålunda differentieras till alla celltyper hos den vuxna organismen. Ett år senare omprogrammering till iPSCs skulle också kunna uppnås för humanfibroblaster 2. Experiment i djurmodeller visar att iPSC-härledda celler i allmänhet kan användas för cellersättningsterapi, t.ex., vid Parkinsons sjukdom (PD) 3-5. Men flera begränsningar i samband med användning av iPSCs representerar vägspärrar för det fulla förverkligandet av deras terapeutiska potential. Först av allt, omprogrammering av celler i ett pluripotent tillstånd och efterföljandekvalitetskontroll är i allmänhet en tidskrävande och ineffektiv process, vilket gav i omfattande och därmed kostsamma cellodlingsförfaranden. För det andra, iPSCs måste åter differentieras till önskad celltyp av intresse innan biomedicinska program och sannolikheten för kvarvarande pluripotenta celler i den differentierade befolkningen hyser en betydande tumörframkallande potential och visar därmed en hög risk efter celltransplantation 6. För det tredje är omprogrammering processen vanligtvis uppnås genom att inducera de omprogrammering faktorerna genom lenti- eller retroviral infektion. Integreringen av dessa virus i värdgenomet kan leda till insertionsmutationer och / eller okontrollerad reaktivering av transgenerna 7,8. Icke-integrativa system har utvecklats för att leverera omprogrammeringar faktorer som målceller, vilket minimerar risken för insertionsmutationer och transgen reaktivering. Exempel på dessa transgen fria metoder är omprogrammering av celler med användning av icke-integreringAdeno eller Sendai-virus 9,10, DNA-baserade vektorer 11 eller tillämpningen av DNA fria metoder, såsom transfektion av syntetisk mRNA 12 eller transduktion av rekombinanta proteiner 13,14. En annan lovande metod för härledning av transgen fritt iPSC är användningen av loxP-modifierade Lentiviral omprogrammering konstrukt och efterföljande deletion av transgener som använder Cre-loxP-DNA-rekombination systemet 15,16.
En enklare metod för att generera nervceller för cellersättningsterapi representerar direkt omvandling av fibroblaster till efter mitotiska neuroner 17-20. Vierbuchen et al., Rapporterade att överuttryck av transkriptionsfaktorer Ascl1, Brn2 och Myt1l resulterar i alstrandet av 20% neuroner från murina fibroblaster 17. Under 2011 visade det sig att samma tre transkriptionsfaktorer i kombination med överuttryck av NeuroD1 möjliggöra transdifferentiering av humana fibroblaster i neurons 19. Mänskliga inducerade nervceller kan också genereras genom överuttryck av Ascl1 och Ngn2 enligt dubbla SMAD- och GSK3β- hämning 20. Notably, direkt omvandling av fibroblaster till neuron genererar en icke-proliferativ, post-mitotiska cellpopulation som inte tillåter ytterligare expansion och biobank.
Nyligen var den direkta omvandlingen av fibroblaster i en växande neurala stam / stamceller befolkningen rapporteras 21-26. För tydlighetens skull kommer alla dessa celltyper namnges som inducerade neurala stamceller (iNPCs) i denna rapport. Han et al., Överuttryckt Brn4, Sox2, c-Myc och Klf4 att generera iNPCs. Liksom deras neurala stamcells motsvarigheter som härrör från antingen primär vävnad eller pluripotenta celler dessa iNPCs är tripotential och kan differentieras i neuroner, astrocyter och oligodendrocyter 21. Vår grupp rapporterade en något annorlunda omvandlingsprotokoll som involverar överuttryck av Sox2, Klf4Och c-Myc och inducerad Oct4-uttryck endast 5 dagar. Med detta synsätt som vi skulle kunna generera stabilt prolifererande iNPCs från murina embryonala och vuxna fibroblaster som uppvisar fullständig ljuddämpning av omprogrammering faktorer 22. I motsats till iPSCs behöver iNPCs inte uppvisar en tumörframkallande potential efter transplantation 27. Vi använde konverterade celler framgångsrikt i en djurmodell av demyelinisering, myelin bristfälliga råttor, vilket visar att iNPCs är kliniskt användbara 22. Fram till dess kan NPCs endast genereras från pluripotenta stamceller eller primära nervvävnad 28-32. iNPCs är stabilt expander celler som kan kryokonserverade och är i stånd att differentiera till neuron, astrocyter och oligodendrocyter. Stora ansträngningar har gjorts för att anpassa den direkta omvandlingen protokollet från mus till humana celler 23,26,33,34. År 2012 offentliggjordes att överuttryck av den enda faktorn Sox2 i fibroblaster är tillräcklig för att generera mus och mänskliga iNPCs
Flera studier visar den cellulära funktionen av NSCs eller deras differentierade motsvarigheter i olika djurmodeller. Neurala stamceller från humana pluripotenta stamceller har transplanterats i musmodeller av neuroinflammatoriska störningen multipel skleros 35,36. Huruvida hESC-derived neurala stamceller i EAE (experimentell autoimmun encefalomyelit) -mice visades för första gången år 2008 35. Multipotenta neurala prekursorceller injicerades i ventriklar mushjärna, och transplantations resultated i en minskning av kliniska tecken på EAE. Kim et al. Genererade oligodendrogliala prekursorer från hESCs och transplanteras dem intracerebroventrikulärt i EAE-möss. Även om transplantationer inte överleva i mer än 10 dagar, möss visade signifikant förbättring av neurologisk funktion och minskning av proinflammatoriska immunceller i den vita substansen 36. Stamcellsterapi har också tillämpats för prekliniskt målsökning av Parkinsons sjukdom som NPC kunde med framgång användas i de respektive djurmodeller. För detta var progenitorceller antingen härstammar från fetal hjärnvävnad 37 skiljer sig från pluripotenta stamceller 38-40 eller mesenkymala stamceller 41 användes. Under 2012 visade vi att musen iNPCs kan producera proteolipidprotein, huvudmyelinproteinkomponenten, efter transplantation in i hjärnan hos myelin bristfällig (MD) råttor 22. Genom att proof-of-principle experiment terapeutiska applicabilheten i iNPCs var först bevisade och snart bekräftats av en annan studie 32. Emellertid förblir den fulla potentialen av terapeutisk användning av mänskliga iNPCs att utforskas.
Här visar vi en robust och integrerad process av (i) utvinning av mänskliga primära celler från vuxna patienter via hudbiopsi, (ii) direkt omvandling av humana fibroblaster i en neural progenitorceller stat och (iii) förmåga iNPCs att differentieras till neuronal och gliaceller härstamningar. Användning av detta protokoll kommer att bidra till att påskynda generation av autologa humana celler för terapeutiska tillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De humana fibroblaster som används i denna studie erhölls från en hud punch biopsi efter att få informerat samtycke och etisk godkännande från den etiska kommittén vid universitetet i Würzburg, Tyskland (etisk rapport nr: 96/11 daterad 10.06.2011).
1. Punch biopsi
- Desinficera huden av patienten. Söva hud varav en del biopsi kommer att tas från (företrädesvis mindre sol-exponerade området) genom att använda 0,5 till 1 ml mepivakain klorid intrakutant och förbereda hudbiopsi med en steril 3mm biopsistans, skölj biopsi med DPBS + 1 pl / 1 ml gentamicin och ta bort fett. Skölj biopsi två gånger med DPBS + gentamicin, aspirera DPBS helt och täck biopsi med Dispas II (2,4 U / ml) och inkubera 16-18 timmar vid 4 ° C.
- Sug Dispase helt, tvätta två gånger med DPBS och avlägsna epidermis med pincett. Tvätta biopsi två gånger med DPBS, tillsätt 2 ml kollagenas typ 2 (500 U / ml CDU), överföring 15 ml rör och tillsätt CollagenaSE upp till 5 ml total volym. Inkubera under 45 minuter vid 37 ° C, 5% CO2.
- Centrifugera i 5 minuter vid 180 xg och kassera supernatanten efteråt. Resuspendera pelleten i 10 ml DMEM-FCS-gentamicin-media (10% FCS, 1 pl / ml gentamicin) och centrifugera igen i 5 minuter vid 180 x g. Kasta supernatanten och återsuspendera pelleten i 1,5 ml DMEM-FCS-Gentamicin-media. Överföring till T25 vidhäftande vävnadsodlingskolv och inkubera vid 37 ° C, 5% CO2.
- Ändra media var 3 dagar.
- Efter ca 2 veckor, när celler konfluenta runt hud delar, delade celler med användning av trypsin / EDTA (0,05%): Tvätta cellerna en gång med DPBS, inkubera 5 minuter vid 37 ° C, 5% CO2 efter tillsats av 2 ml trypsin / EDTA (0,05%), tillsätt 2 ml DMEM-FCS-gentamicin-media, transfer till 15 ml rör och centrifugera vid 180 xg under 5 min; kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i lämplig mängd DMEM-FCS-Gentamicin-media.
- Ytterligare expandera cellerna genom att ändra mediet var 3 rd dag och delning som beskrivits ovan när cellerna är konfluenta; tillsats av Gentamicin kan stoppas efter passage 2.
- Innan du använder celler för direktomvandlings experiment, se till att utesluta mykoplasmkontaminering av standardanalyser.
- När celler har utökats, kan du direkt starta omvandlingen eller frysa celler ner med 10% DMSO och 90% FCS. Celler bör förvaras i -80 ° C under två dagar och överfördes sedan till flytande kväve för långtidslagring.
- För framställning av omvandling, tvätta cellerna en gång med DPBS, aspirera DPBS och tillsätt 2,5 ml Trypsin / EDTA (0,05%). Håll under 5 min vid 37 ° C, 5% CO2. Knacka kolv försiktigt för att lösgöra celler, återsuspendera i 2,5 ml fibroblast medium (DMEM inkl. L-Glu + 10% FCS + 1% NEAA + 1% Natriumpyruvat) och överför till 15 ml rör. Centrifugera vid 180 x g under 5 min och aspirera supernatanten. Resuspendera cellerna i 1 ml fibroblast media och pipett upp och ner för att generera encellssuspension. </ Li>
- Räkna antalet celler med användning av en Fuchs-Rosenthal- eller Neubauer-cellräkningskammare och plattan 3 x 10 4 celler per brunn i en 24 brunn-platta. Inkubera O / N vid 37 ° C, 5% CO2.
2. Infektion av humana fibroblaster med Sendai virus och transdifferentiering
OBS: För att garantera säkerheten, följande steg som hanterar virus måste utföras i ett biologiskt säkerhetsskåp och ett laminärt flöde huva, och med lämplig personlig skyddsutrustning, särskilt en kirurgisk mask, för att förhindra mukosal exponering.
- Byt celler till 100 ^ fibroblaster media (steg 1,9). Tina portioner av Oct4-, Klf4-, Sox2- och c-myc-Sendaivirus och återsuspendera varje virus i 1 ml fibroblast medier. Lägg varje virus med ett MOI på 3 till celler (virustiter varierar från parti till parti, men en portion av varje virus kan i allmänhet användas för infektion av 10 brunnar i en 24 väl plattan) och blanda försiktigt. Inkubera O / N vid 37 ° C, 5% CO2
- Efter 24 h aspirera mediet och tillsätt 500 | il neuroinduction media (1: 1 DMEM / F-12: Neurobasal, 1x N2, 1x B27, 1% GlutaMAX, 10 ng / ml hLIF, 3 pM CHIR99021, 2 iM SB431542) och kultur vid 39 ° C, 5% CO 2 från och med nu. Ändra media varannan dag.
- På dag 6 efter infektion förbereda laminin-belagda 6-brunnsplattor: Späd laminin till 1 mikrogram / ml i DPBS, tillsätt 1 ml av lösningen på 6 brunnsplattor och hålla vid 4 ° C under 24 timmar.
- På dag 7 efter infektion dela cellerna med hjälp av DPBS / EDTA: suga ut mediet och tvätta cellerna en gång med DPBS, tillsätt sedan 500 | il DPBS / EDTA och inkubera i 10 minuter vid 37 ° C, 5% CO2.
- Lägg 500 | il DMEM / F12 och avlägsna suspensionen från plattan i en 15 ml rör och centrifugera vid 180 xg under 5 minuter.
- Aspirera supernatanten och suspendera pelleten i 1,5 ml neuroinduction media, platta på laminin-belagda 6 brunnsplattor och lägga ROCK-inhibitor Y27632 i en slutlig concentration av 10 pM till celler, odling vid 39 ° C, 5% CO2.
- Ändra media varannan dag.
- Från dag 14 efter infektion odla cellerna vid 37 ° C, 5% CO2. Neuro kolonier blivit uppenbart runt dag 17 efter infektion genom faskontrastmikroskopi. De bör vara tillräckligt stor för att plockas runt dag 20 efter infektion.
3. Isolering av Förmodade INPC Kolonier
- En dag innan plocka, päls en 48 väl skylt med laminin: Späd laminin till 1 mikrogram / ml i DPBS, tillsätt 300 pl lösning på tallrikar och hålla vid 4 ° C under 24 timmar. En dag senare aspirera laminin från plattor och tillsätt 200 | il av neuroinduction media till brunnarna.
- Tvätta 6 väl plattor innehållande kolonierna som ska plockas en gång med DPBS och tillsätt 2 ml DPBS per brunn av 6 väl platta. Välj kolonierna mekaniskt: skrapa runt kolonier med hjälp av en tunn nål för att bli av med omgivande celler; ställa in 2001; l pipetman på 50 pl och plocka kolonier med hjälp av respektive pipettspetsar.
- Överför en koloni varje del i en brunn på en laminin-belagd 48 väl platta och generera en enkelcellsuspension mekaniskt genom att pipettera upp och ner 10 gånger. Lägg ROCK-inhibitor Y27632 i en slutlig koncentration av 10 | iM till cellerna.
- Odla cellerna på 48 väl-platta vid 37 ° C, 5% CO2 under 2 dagar. Ändra media varannan dag tills cellerna når 80-90% konfluens (ca 3 -. 4 dagar).
4. Expansion och Cryo-bevarande av iNPCs
- Passaging och utbyggnad av iNPCs
- Aspirera mediet och tvätta cellerna med DPBS. Aspirera DPBS och tillsätt 200 | il DPBS / EDTA och inkubera i 10 minuter vid 37 ° C, 5% CO2, tillsätt 200 | il DMEM / F12 och avlägsna suspensionen från plattan i en 15 ml rör, centrifugera vid 180 xg under 5 minuter .
- Aspirera supernatanten och återsuspendera pelleten i 0,5 ml neuroinduction medier (steg 2,2), platta på laminin-belagda 12-brunnsplattor och lägg ROCK-inhibitor Y27632 i en slutlig koncentration av 10 | iM till cellerna, odling vid 37 ° C, 5% CO2. Efter cellerna når 80-90% konfluens de kan antingen utvidgas ytterligare eller frysta enligt följande.
- Frysning av iNPCs
- Aspirera mediet och tvätta cellerna med DPBS. Aspirera DPBS och tillsätt 300 ul DPBS / EDTA och inkubera i 10 minuter vid 37 ° C, 5% CO2, tillsätt 300 | il DMEM / F12 och avlägsna suspensionen från plattan i en 15 ml rör, centrifugera vid 180 xg under 5 minuter.
- Aspirera supernatanten och suspendera pelleten i 0,5 ml kommersiell NSC frysning medium. Överför suspensionen till frysning flaskor och sätta i cell frysning behållare. Förvara vid -80 ° C under 2 dagar, sedan överföra till flytande kväve för långtidslagring.
5. Differentiering av iNPCs
- Differentiering mot neuronal härstamning
- Kultur cellerna på laminin-belagda plattor som beskrivits ovan. Ändra media till neuro-diff-medium (DMEM / F-12, 1 x N2, 1x B27, 300 ng / ml cAMP, 200 ^ M C-vitamin, 10 ng / ml BDNF, 10 ng / ml GDNF) när celler är ungefär 70% konfluenta. Ändra media varannan dag under tre veckor. Gör spaltade celler under differentiering.
- Efter tre veckor celler bör uttrycka neuronala markör TUJ1. För att få mer mogna nervceller och neuronala subtyper fortsätter differentiering upp till 3 månader.
- Differentiering mot glia härstamning
- Ändra media till glia induktionsmedia (1: 1 DMEM / F-12: Neurobasal, 1x N2, 1x B27, 10 pM β-merkaptoetanol, 100 | jM icke-essentiella aminosyror, 1,5 mM L-glutamin, 5 | ig / ml insulin, 40 ng / ml T3) inklusive 20 ng / ml EGF för att inducera differentiering till gliaceller prekursorceller. Ta bort hälften av media och ersätt med färskt medium varannan dag i ca 2 veckor. Under denna period bör delas celler1: 3 i närvaro av 10 | iM ROCK-inhibitor Y27632 när 100% konfluens uppnåtts.
- Efter 2 veckor differentiera celler vidare till astrocyter: när celler är nästan sammanflytande förändring media till kommersiellt tillgängliga astrocyternas media, ändra media varannan dag. Efter ca 7 dagar cellerna börjar uttrycka astrocyternas markörer (t.ex. GFAP). Om celler får 100% konfluenta under differentieringsprotokoll, dela upp dem i en 1: 2-förhållande i närvaro av 10 | iM ROCK-inhibitor Y27632.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här presenterar vi beskrivning av en integrerad process som möjliggör generering av inducerade neurala stamceller (iNPCs) från humana fibroblaster som har erhållits genom en stansbiopsi från huden inom mindre än 8 veckor (Figur 1). Patient specifc iNPCs kan ytterligare differentieras till neuronala och gliaceller linjer och hamnen stor potential för cellersättningsterapi och sjukdom modellering.
Infektion av fibroblaster med Oct4-, Klf4-, Sox2- och c-myc- Sendai virus 23 och kultur i neuroinductive medie förhållanden 22,31 resulterade i en förändring av morfologin för fibroblaster och senare uppkomst av kolonier 17 dagar efter infektion (Figur 2). Genererade monoklonala cellinjer kan utökas och fläck positivt för neurala markörer stamceller som Sox2, Sox1, nestin, Vimentin, Otx2 och Pax6, samt för spridning markör Ki67, medan de inte uttrycker pluripotency-tillhörande markör Oct4 (Figur 3).
Vidare, genom tillsats av neuronala tillväxtfaktorer till cellodlingsmedia de neurala progenitorceller kan differentieras till neuroner. Genom att tillämpa en differentiering protokoll baserat på Izrael et al. 42 och efterföljande slut differentiering med cellinjer astrocyternas induktions media kan också differentieras i gliaceller linjerna som bedömdes genom analys av typiska morfologiska förändringar och färgning mot gliafibrillärt surt protein (GFAP) (Figur 4 ).
Figur 1. Schematisk representation av tre-stegs protokoll som tillämpades i denna studie. Fibroblaster kan isoleras från patienter genom en stansbiopsi och expanderas. Dessa cellinjer kan sedan direkt omvandlas till inducerade multipotenta neurala stamceller (iNPCs) och monoclonally expanderad. INPC linjer kan användas för långtidslagring (biobanker för upprepad eller standardiserad användning) eller så kan differentieras till neuronala och gliaceller linjer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Morfologisk analyser av direkt omvandling av humana fibroblaster i inducerade neurala stamfaderceller med användning av faskontrastmikroskopi (A) Mänskliga fibroblaster tre dagar efter infektion med OKSM -. Sendai-virus och två dagar efter tillsats av neuroinduction medium. Celler visar typisk fibroblast-liknande morfologi. (B) Sju dagar efter infektion celler med förändrad morfologi dyker upp. Celler delas för att minska konfluens på samma dag. (C) Tio dags efter infektion endast celler med förändrad morfologi är närvarande. (D) Första små neuroliknande kolonier kan hittas 17 dagar efter infektion. Dessa kolonier öka i storlek (E) och outgrowing celler kan återfinnas (F) tre dagar senare. Celler plockas på dag 21 efter infektion och expander cellinjer kan genereras från dem (GI). Olika kloner visas i passagen 1 (G), passage 3 (H) och passagen 10 (I) efter plockning, respektive. Skala bar = 200 nm. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Analys av neurala stamceller markörgenuttryck genererat neurala progenitorceller celL-linjer. Antikropp färgning av cellinjer efter 10 passager avslöjade att celler uttrycker de neurala stamcellsmarkörer Sox1, Sox2 (A) samt nestin och Pax6 (B). Celler är negativa för pluripotens markör Oct4 indikerande frånvaro av pluripotens (C). Majoriteten av cellerna färgas positivt för markör Ki67, vilket visar en hög proliferativ tillstånd (C). Skala bar = 50 nm. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Analys av NPCs efter riktad differentiering till neuronala och gliaceller linjer. (A) För att uppnå neuronala specifikations iNPCs differentierades under sju dagar i närvaro av BDNF, GDNF, C-vitamin och cAMP. (B) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här visar vi isolering och direkt omvandling av humana fibroblaster i expander transgen fria neurala stamceller och deras differentierade avkomma som en förmodad grund för cellersättningsterapi eller för tillämpningar i läkemedelsscreening analyser. Direkt härstamning omvandling av somatiska celler i NPC har uppnåtts genom forcerad expression av härstamning specifika transkriptionsfaktörer 26,33,34. Men i många fall fetala fibroblaster användes för transdifferentiering experiment 33,34. För biomedicinska tillämpningar användningen av dessa celler är olämpligt eftersom detta cellkälla utesluter klinisk användning för autolog cellersättningsterapi. Nyligen har undersökningar publicerats som beskriver genereringen av neurala prekursorceller från mer lättillgängliga vävnader, såsom hematopoetiska celler 43,44. Den framgångsrika generationen tripotent neurala stamcellslinjer kunde visas för murina blodhärledda B-celler genom den inducerbara overexpresion av åtta transgener 43. Dessutom Castano et al. Publicerade en metod för induktion av neuronala stamceller från mänskliga hematopoetiska celler använder Sox2- och c-myc-Sendaivirus 44. Protokollet beskrivs möjliggör snabb och effektiv generering av nervceller från CD133 + sladd blodkroppar. Men när den tillämpas för omvandling av vuxna perifera mononukleära blodceller protokollet gav låg effektivitet och kapacitetsökning av de genererade cellinjer var mycket begränsad 44. Således visar den enda studie som publicerades med perifera blodceller i människo systemet hittills 44 klart begränsningarna i denna celltyp i direktomvandlingsexperiment. Eftersom tillgången på patientspecifika celler är avgörande för autolog cell ersättning, den föredragna celltypen utgör fortfarande vuxna fibroblaster, som lätt kan härledda via en hud punch biopsi som beskrivs i vår studie.
Den overexpression av transgener som krävs för transdifferentiering har främst uppnåtts genom integrerande virala vektorer 26,33,34. Detta hindrar tillämpningen av de härledda cellinjer för biomedicinska tillämpningar, eftersom integrationen av virus i värdgenomet kan leda till insermutagenes eller oönskad reaktivering av transgener 7,8. Transdifferentiering till NPCs utan transgen uttryck men baserat på kemisk behandling har beskrivits för humana fibroblaster 45. Men i denna studie dessa prekursorceller var endast förekommer i ett övergående tillstånd som syftet med studien var genereringen av mogna Schwannceller 45. Nyligen har andra transgen fria metoder baserade på tillämpning av Sendai-virus har beskrivits för direkt omvandling av humana fibroblaster i NPCs 23,44 och verkar vara den strategi som hittills. För att härleda expanderbara NPC som kan därefter differentieras i neuronala och gliaceller linjer,tillämpar vi överuttryck av alla Yamanaka-faktorer från Sendai-virus tillsammans med värmeinaktivering av virus 23 liksom neural induktion genom tillsats av små molekyler till odlingsmediet 22,31 med viktiga modifieringar såsom beskrives i det följande.
Även i våra händer, är protokollet effektivt arbetar med många fibroblastlinjer testade, det finns en uppenbar tendens att den direkta omvandlingen av fibroblastceller från gamla givare uppvisar ett dåligt proliferativ potential resulterar i en låg verkningsgrad INPC generation. Vi observerade kolonibildande effektivitet på upp till 0,2% efter en viral transduktionseffektiviteten av mer än 90% bedömt genom infektion av celler med Oct4 bara och efterföljande färgning. Denna effektivitet är ca 3 gånger högre än vad som tidigare publicerats 23.
Den exakt justerade tillämpning av en optimerad viral MOI är kritisk. Sats till sats variationer i Sendai-virus titermåste tas med i beräkningen. Eftersom viruset är vanligtvis förvärvas kommersiellt, kan respektive information finns på tillverkarens hemsida. Vi föreslår att använda en relativt låg MOI av 3 för transdifferentiering experiment.
Tillsats av human LIF i våra händer är av avgörande betydelse för förnyelsen av de etablerade INPC linjerna själv som har beskrivits för differentieringen av humana pluripotenta celler till NPCs 31. Utan tillsats av LIF, cellerna börjar att differentiera så tidigt som två dagar efter utsättning på ett icke-reversibelt sätt.
Cellodling efter infektion utförs vid 39 ° C och inte med användning av standard 37 ° C cellodlingsbetingelser. Denna temperaturökning börjar redan en dag efter infektion och leder till en värmeinaktivering av Sendai-virus. Kulturen vid 39 ° C tills dag 14 efter infektionen är av avgörande betydelse för generering av neuroepiteliala kolonier.
Som en sakfråga, ibland INPC kolonier komma upp senare än vad som beskrivs i protokollet avsnitt. Enligt vår erfarenhet, så länge som cellerna förblir proliferativ de kan polyklonalt passe och isoleras genom manuell plockning. De etablerade cellinjer från dessa kolonier visar liknande egenskaper såsom beskrivits för tidigt förekommande kolonierna.
Under uppdelning av etablerade cellinjer är det viktigt att inte frö ett för litet antal celler eftersom de kräver cell-till-cell kontakter eller parakrina signaler att föröka sig väl. Om celler är seedade i alltför låg densitet spridning kommer att upphöra. I detta fall kan cellerna räddas genom omstryka på en cellodlingsskål med en mindre yta för att återinitiera proliferation.
För gliaceller differentiering av iNPCs är det mycket viktigt att ympa cellerna i en hög densitet och att dela dem när plattan är nästan sammanflytande. Om celler är uppdelade för tidigt, kommer huvudsakligen neuronal differentiering observeras.
innehåll "> Den process som beskrivs i detta manuskript hyser potential att användas i en halv- eller helautomatisk sätt, vilket skulle vara nödvändigt för att uppnå den önskade biomedicinsk potential, inklusive sjukdom modellering och cellersättningsterapi. Automation skulle också möjliggöra kostnads effektiv skala upp och parallellisering av genereringen av neurala stamceller.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi vill tacka alla medlemmar i Stamcells och regenerativ medicin Group vid universitetet i Würzburg för användbara förslag och Martina Gebhardt samt Heike Arthen för utmärkt teknisk support. Detta arbete har finansierats med bidrag från Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (ED79 / 1-2), det tyska ministeriet för utbildning och forskning BMBF (01 GN 0813), den bayerska Research Network inducerade pluripotenta stamceller "forIPS" och "Stiftung Sibylle Assmus ". Figur 1 framställdes med användning Servier Medicinsk konst, tillgänglig från www.servier.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Astrocyte media | ScienCell | 1801 | |
| B27 | LifeTechnologies | 17504-044 | |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| Biopsy Punch | pfm medical | 48301 | |
| cAMP | Sigma | A6885 | |
| CHIR99021 | Axon medchem | 1386 | |
| Collagenase Type2 | Worthington Biochemical | LS004177 | |
| Dispase | PAN | P10-032100 | |
| DMEM | LifeTechnologies | 41966-029 | |
| DMEM F12 | LifeTechnologies | 11320-033 | |
| DMSO | Roth | 4720 | |
| DPBS | LifeTechnologies | 14190-094 | |
| EGF | Life Technologies | PHG0313 | |
| FCS | Biochrom AG | 50115 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| Gentamicin | Sigma | G1397 | |
| GFAP-antibody | Dako | Z0334 | |
| GlutaMAX | LifeTechnologies | 35050-038 | |
| hLIF | Peprotech | 300-05 | |
| Insulin | Seralab | GEM-700-112-P | |
| Ki67-antibody | NeoMarkers | RM-9106-S | |
| L-Glutamine | LifeTechnologies | 25030-024 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| N2 | LifeTechnologies | 17502-048 | |
| Nestin-antibody | R&D Systems | MAB1259 | |
| Neurobasal | LifeTechnologies | 21103-049 | |
| Non-essential amino acids | LifeTechnologies | 11140-050 | |
| NSC freezing media | Sigma | C6295 | |
| Oct4-antibody | Santa Cruz | sc9081 | |
| Pax6-antibody | Covance | PRB-278P | |
| SB431542 | Invivogen | inh-sb43 | |
| Sendai virus: CytoTune Sendai Reprogramming Kit | LifeTechnologies | A1378001 | |
| Sodiumpyruvate | Life Technologies | 11360-039 | |
| Sox1-antibody | R&D Systems | AF3369 | |
| Sox2-antibody | R&D Systems | MAB2018 | |
| T3 | Santa Cruz | sc-205725 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| TUJ1-antibody | Covance | MMS-435P-250 | |
| Vitamin C | Sigma | A4544 | |
| Y27632 | Calbiochem | CAS 146986-50-7 | |
| β-Mercaptoethanol | LifeTechnologies | 21985023 |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Cai, J., Yang, M., Poremsky, E., Kidd, S., Schneider, J. S., Iacovitti, L. Dopaminergic neurons derived from human induced pluripotent stem cells survive and integrate into 6-OHDA-lesioned rats. Stem Cells Dev. 19 (7), 1017-1023 (2010).
- Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson’s disease. Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).
- Rhee, Y. H., et al. Protein-based human iPS cells efficiently generate functional dopamine neurons and can treat a rat model of Parkinson disease. J Clin Invest. 121 (6), 2326-2335 (2011).
- Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448 (7151), 313-317 (2007).
- Soldner, F., et al. Parkinson’s disease patient-derived induced pluripotent stem cells free of viral reprogramming factors. Cell. 136 (5), 964-977 (2009).
- Sommer, C. A., Stadtfeld, M., Murphy, G. J., Hochedlinger, K., Kotton, D. N., Mostoslavsky, G. Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 27 (3), 543-549 (2009).
- Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27, 2667-2674 (2009).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, 348-362 (2009).
- Montserrat, N., et al. Simple generation of human induced pluripotent stem cells using poly-beta-amino esters as the non-viral gene delivery system. J Biol Chem. 286 (14), 12417-12428 (2011).
- Warren, L., Nu, Y., Wang, J., Guo, X. Feeder-free derivation of human induced pluripotent stem cells with messenger RNA. Sci Rep. 2, 657 (2012).
- Bosnali, M., Edenhofer, F.
- Zhou, H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins. Cell Stem Cell. 4 (5), 381-384 (2009).
- Awe, J. P., et al. Generation and characterization of transgene-free human induced pluripotent stem cells and conversion to putative clinical-grade state. Stem Cell Res Ther. 4 (4), 87 (2013).
- Kadari, A., et al. Excision of viral reprogramming cassettes by Cre protein transduction enables rapid, robust and efficient derivation of transgene-free human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res Ther. 5 (2), 47 (2014).
- Vierbuchen, T., Ostermeier, A., Pang, Z. P., Kokubu, Y., Südhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
- Caiazzo, M., et al. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476 (7359), 224-227 (2011).
- Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476 (7359), 220-223 (2011).
- Ladewig, J., et al. Small molecules enable highly efficient neuronal conversion of human fibroblasts. Nat Methods. 9 (6), 575-578 (2012).
- Han, D. W., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into neural stem cells by defined factors. Cell Stem Cell. 10 (4), 465-472 (2012).
- Thier, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).
- Lu, J., et al. Generation of integration-free and region-specific neural progenitors from primate fibroblasts. Cell Rep. 3 (5), 1580-1591 (2013).
- Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Südhof, T. C., Werning, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (7), 2527-2532 (2012).
- Tian, C., et al. Direct conversion of dermal fibroblasts into neural progenitor cells by a novel cocktail of defined factors. Curr Mol Med. 12 (2), 126-137 (2012).
- Zhu, S., et al. Small molecules enable OCT4-mediated direct reprogramming into expandable human neural stem cells. Cell Res. 24 (1), 126-129 (2014).
- Hemmer, K., et al. Induced neural stem cells achieve long-term survival and functional integration in the adult mouse brain. Stem Cell Reports. 3 (3), 423-431 (2014).
- Conti, L., et al. Niche-independent symmetrical self-renewal of a mammalian tissue stem cell. PLoS Biol. 3 (9), e283 (2005).
- Elkabetz, Y., Panagiotakos, G., Al Shamy,, Socci, G., Tabar, N. D., Studer, V., L, Human ES cell-derived rosettes reveal a functional distinct early neural stem cell stage. Genes Dev. 22 (2), 152-165 (2008).
- Koch, P., Opitz, T., Steinbeck, J. A., Ladewig, J., Brüstle, O. A rosette-type self-renewing human ES cell-derived neural stem cell with potential for in vitro instruction and synaptic integration. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (9), 3225-3230 (2009).
- Li, W., et al. Rapid induction and long-term self-renewal of primitive neural precursors from human embryonic stem cells by small molecule inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (20), 8299-8304 (2011).
- Reinhardt, P., et al. Derivation and expansion using only small molecules of human neural progenitors for neurodegenerative disease modeling. PLoS One. 8 (3), c59252 (2013).
- Ring, K. L., et al. Direct reprogramming of mouse and human fibroblasts into multipotent neural stem cells with a single factor. Cell Stem Cell. 11 (1), 100-109 (2012).
- Zou, Q., et al. Direct conversion of human fibroblasts into neuronal restricted progenitors. J Biol Chem. 289 (8), 5250-5260 (2014).
- Aharonowiz, M., Einstein, O., Fainstein, N., Lassmann, H., Reubinoff, B., Ben-Hur, T. Neuroprotective effect of transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursor in an animal model of multiple sclerosis. PLoS One. 3 (9), e3145 (2008).
- Kim, H., et al. Immunomodulation by transplanted human embryonic stem cell-derived oligodendroglial progenitors in experimental autoimmune encephalomyelitis. Stem Cells. 30 (12), 2810-2829 (2012).
- Kondoh, T., Pundt, L. L., Blount, J. P., Conrad, J. A., Low, W. C. Transplantation of human fetal tissue from spontaneous abortions to a rodent model of Parkinson’s disease. Cell Transplant. 5 (1), 69-75 (1996).
- Takagi, Y., et al. Dopaminergic neurons generated from monkey embryonic stem cells function in a Parkinson primate model. J Clin Invest. 115 (1), 102-109 (2005).
- Kikuchi, T., et al. Survival of human induced pluripotent stem cell-derived midbrain dopaminergic neurons in the brain of a primate model of Parkinson’s disease. J Parkinson’s Dis. 1 (4), 395-412 (2011).
- Kirkeby, A., et al. Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions. Cell Rep. 1 (6), 703-714 (2012).
- Dezawa, M., et al. Specific induction of neuronal cells from bone marrow stromal cells and application for autologous transplantation. J Clin Invest. 113, 1701-1710 (2004).
- Izrael, M., et al. Human oligodendrocytes derived from embryonic stem cells: Effect of noggin on phenotypic differentiation in vitro and on myelination in vivo. Mol Cell Neurosci. 34 (3), 310-323 (2007).
- Cassady, J. P., et al. Direct lineage conversion of adult mouse liver cells and B lymphocytes to neural stem cells. Stem Cell Rep. 3 (6), 948-956 (2014).
- Castano, J., et al. Fast and efficient neural conversion of human hematopoietic cells. Stem Cell Rep. 3 (6), 1118-1131 (2014).
- Thoma, E. C., et al. Chemical conversion of human fibroblasts into functional Schwann cells. Stem Cell Rep. 3 (4), 539-547 (2014).
