Summary
Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte fornisce prospettive affascinanti per la derivazione di trapianto autologo. Tuttavia, la progressione attraverso uno stato pluripotente e laborioso ri-differenziazione impedisce ancora di traduzione clinica. Qui si descrive la derivazione di fibroblasti umani adulti e la loro conversione diretta in cellule progenitrici neurali indotte e la successiva differenziazione in linee neurali.
Abstract
Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) da fibroblasti cutanei adulti e la successiva differenziazione in cellule somatiche fornisce prospettive affascinanti per la derivazione dei trapianti autologhi che aggirano le barriere di istocompatibilità. Tuttavia, la progressione attraverso uno stato pluripotente e la successiva differenziazione completa in linee desiderati rimane un posto di blocco per la traduzione clinica della tecnologia IPSC a causa del potenziale neoplastico e genomica instabilità associata. Recentemente, noi e gli altri dimostrato che le cellule somatiche non possono essere convertiti in iPSCs ma anche in diversi tipi di cellule staminali somatiche multipotenti solo utilizzando fattori definiti, eludendo così la progressione attraverso lo stato pluripotente. In particolare, la conversione diretta di fibroblasti umani in cellule progenitrici neurali indotte (iNPCs) prelude alla possibilità di una fonte di cellule autologhe romanzo per varie applicazioni come la sostituzione delle cellule, modelli di malattiae lo screening di stupefacenti. Qui, descriviamo l'isolamento di adulti fibroblasti primari umani da biopsia cutanea e la loro conversione diretta efficace in iNPCs di espressione tempestivo ristretto di Oct4, Sox2, Klf4, così come c-Myc. Colonie neuroepiteliale Sox2-positivi compaiono dopo 17 giorni di induzione e linee INPC possono essere stabiliti in modo efficiente isolamento monoclonale ed espansione. Regolazione precisa della molteplicità di infezione virale e l'integrazione della leucemia fattore inibitorio durante la fase di induzione rappresentano fattori critici per raggiungere efficienze di conversione fino al 0,2%. Finora, le linee INPC specifici del paziente potrebbero essere ampliati per più di 12 passaggi e uniforme mostrano caratteristiche morfologiche e molecolari delle cellule staminali / progenitrici neurali, come l'espressione di nestina e Sox2. Le linee INPC possono essere differenziate in neuroni e astrociti come giudicato dalla colorazione contro TUJ1 e GFAP, rispettivamente. In conclusione, riportiamo un protocollo robusto per la derivazione e terribileconversione ct di fibroblasti umani in cellule progenitrici neurali stabilmente espandibili che potrebbero fornire una fonte cellulare per applicazioni biomediche come autologo sostituzione delle cellule neurali e modelli di malattia.
Introduction
Nel 2006 Yamanaka e colleghi potrebbero mostrare per la prima volta la possibilità di riprogrammazione delle cellule somatiche in uno stato pluripotente 1. Questo dedifferentiation è stato raggiunto da sovraespressione di quattro fattori di trascrizione Oct4, Sox2, Klf4, e c-Myc in fibroblasti murini. Le generati cosiddette cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) mostrano l'equivalenza funzionale alle cellule staminali embrionali (ESC) e possono quindi essere differenziati in tutti i tipi di cellule dell'organismo adulto. Un anno dopo la riprogrammazione di iPSCs potrebbe essere realizzata anche per fibroblasti umani 2. Gli esperimenti in modelli animali dimostrano che le cellule IPSC derivati vengono generalmente usate per la terapia cellulare di sostituzione, per esempio, in malattia di Parkinson (PD) 3-5. Tuttavia, alcune limitazioni associate con l'uso di iPSCs rappresentano ostacoli per la piena realizzazione del loro potenziale terapeutico. Prima di tutto, riprogrammazione delle cellule in uno stato pluripotente e successivacontrollo di qualità è generalmente un tempo e processo inefficiente cedevole in ampi e quindi costose procedure di coltura cellulare. In secondo luogo, iPSCs bisogno di essere ri-differenziate nel tipo cellulare desiderato di interesse prima applicazione biomedica e la probabilità di cellule pluripotenti residue nella popolazione differenziata porti un significativo potenziale oncogeno e visualizza quindi un elevato rischio dopo il trapianto di cellule 6. In terzo luogo, il processo di riprogrammazione viene ottenuto inducendo i fattori di riprogrammazione da infezioni lenti- o retrovirale. L'integrazione di questi virus nel genoma dell'ospite potrebbe portare a mutagenesi inserzionale e / o riattivazione incontrollata dei transgeni 7,8. I sistemi non integrativi sono stati sviluppati per fornire i fattori di riprogrammazione di cellule bersaglio, che riducono al minimo il rischio di mutagenesi inserzionale e transgene riattivazione. Esempi di questi approcci senza transgene sono la riprogrammazione delle cellule utilizzando non l'integrazioneAdeno o il virus di Sendai 9,10, basati sul DNA vettori 11 o l'applicazione di metodi senza DNA, come la transfezione di mRNA sintetico 12 o trasduzione di proteine ricombinanti 13,14. Un altro metodo promettente per la derivazione del libero-transgene IPSC è l'uso di costrutti riprogrammazione lentivirali loxP modificati e la successiva eliminazione dei transgeni che utilizzano il sistema di ricombinazione Cre-loxP DNA 15,16.
Un approccio più semplice per generare cellule neurali per la terapia di sostituzione cellulare rappresenta conversione diretta dei fibroblasti in neuroni post-mitotico 17-20. Vierbuchen et al. Riferito che la sovraespressione di fattori di trascrizione Ascl1, Brn2 e Myt1l risultati nella generazione di 20% neuroni da fibroblasti murini 17. Nel 2011 è stato dimostrato, che gli stessi tre fattori di trascrizione in combinazione con sovraespressione di NeuroD1 permettono transdifferenziazione di fibroblasti umani in neuRons 19. Umani indotta neuroni potrebbero essere generati anche da sovraespressione di Ascl1 e Ngn2 sotto dual SMAD- e GSK3β- inibizione 20. In particolare, la conversione diretta dei fibroblasti in neuroni genera una popolazione di cellule post-mitotico non proliferativa che non consente ulteriori espansioni e biobanche.
Recentemente, la conversione diretta dei fibroblasti in una popolazione di cellule neurali staminali / progenitrici proliferazione è stato segnalato 21-26. Per motivi di chiarezza, tutti questi tipi cellulari saranno nominati come cellule progenitrici neurali indotte (iNPCs) in questo rapporto. Han et al. Sovraespresso Brn4, Sox2, c-Myc e Klf4 per generare iNPCs. Come i loro omologhi di cellule staminali neurali derivate da cellule o tessuti primaria o pluripotenti questi iNPCs sono tripotential e potrebbero essere differenziate in neuroni, astrociti e oligodendrociti 21. Il nostro gruppo ha un protocollo di conversione leggermente diversa che coinvolge sovraespressione di Sox2, Klf4E c-Myc e indotta Oct4-espressione per 5 giorni soltanto. Con questo approccio si potrebbe generare stabilmente proliferanti iNPCs da murine embrionali e adulte fibroblasti che presentano completo silenziamento della riprogrammazione fattori 22. In contrasto con iPSCs, iNPCs non presentano un potenziale cancerogeno dopo il trapianto 27. Abbiamo usato le cellule convertito con successo in un modello animale di demielinizzazione, ratti privi di mielina, dimostrando che iNPCs sono clinicamente utili 22. Fino ad allora, gli NPC possono essere generati solo da cellule staminali pluripotenti o tessuto neurale primaria 28-32. iNPCs sono cellule stabilmente espandibili che possono essere crioconservati e sono in grado di differenziarsi in neuroni, astrociti e oligodendrociti. Sono stati compiuti molti sforzi per adattare il protocollo conversione diretta da mouse per cellule umane 23,26,33,34. Nel 2012 è stato pubblicato che la sovraespressione del singolo fattore Sox2 nei fibroblasti è sufficiente a generare murine e umane iNPCs
Diversi studi dimostrano la funzionalità cellulare di cellule staminali neurali o dei loro omologhi differenziate in diversi modelli di malattie degli animali. Progenitori neurali da cellule staminali umane pluripotenti sono state trapiantate in modelli murini della malattia neuroinfiammatoria sclerosi multipla 35,36. L'applicabilità di cellule progenitrici neurali hESC-derivati in EAE (encefalomielite autoimmune sperimentale) -mice stato mostrato nel 2008 35. Cellule precursori neurali multipotenti sono state iniettate nei ventricoli del cervello di topo, e il risultato del trapiantocato nella riduzione dei segni clinici di EAE. Kim et al. Generato precursori oligodendrogliali di hESC e trapiantato quelli intracerebroventricolare in EAE-topi. Anche se il trapianto non sopravvissero per più di 10 giorni, i topi hanno mostrato un miglioramento significativo della funzione neurologica e la riduzione delle cellule immunitarie proinfiammatorie nella sostanza bianca 36. Terapia con cellule staminali è stato applicato anche per il targeting preclinico della malattia di Parkinson come PNG potrebbero essere impiegati con successo nei rispettivi modelli animali. Per questo, le cellule progenitrici sono stati derivati da tessuto cerebrale fetale 37 differenziate da cellule staminali pluripotenti 38-40 o cellule staminali mesenchimali 41 sono state usate. Nel 2012 abbiamo dimostrato che iNPCs mouse sono in grado di produrre la proteina proteolipid, la principale componente proteica mielina, dopo il trapianto nel cervello di mielina-deficienti (md) ratti 22. Con questo esperimento prova di principio del applicabil terapeuticalità di iNPCs primo luogo è stato provato e subito confermata da un altro studio 32. Tuttavia, il pieno potenziale di uso terapeutico di iNPCs umani rimane da esplorare.
Qui vi mostriamo un processo affidabile e integrata di (i) derivazione di cellule primarie umane da pazienti adulti tramite biopsia della pelle, (ii) la conversione diretta di fibroblasti umani in uno stato progenitore neuronale e (iii) la capacità di iNPCs essere differenziati in neuronale e lignaggi gliali. L'utilizzo di questo protocollo contribuirà ad accelerare la generazione di cellule umane autologhe per applicazioni terapeutiche.
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Protocol
I fibroblasti umani utilizzati in questo studio sono stati ottenuti da una biopsia cutanea dopo essersi informato consenso e la clearance etico dal comitato etico dell'Università di Würzburg, Germania (rapporto etico no: 96/11 del 10.06.2011).
1. Punch Biopsia
- Disinfettare la pelle del paziente. Anestetizzare parte della pelle di cui biopsia sarà presa da (preferibilmente una zona esposta al sole meno) con 0,5 a 1 ml di mepivacaina cloridrato intracutaneously e preparare biopsia della pelle utilizzando una sterile 3 millimetri biopsia, lavare biopsia con DPBS + 1 ml / 1 ml Gentamicina e rimuovere grasso. Sciacquare biopsia due volte con DPBS + gentamicina, aspirare DPBS completamente e copertura biopsia con dispasi II (2.4 U / ml) ed incubare 16 - 18 ore a 4 ° C.
- Aspirare dispasi completamente, lavare due volte con DPBS e rimuovere l'epidermide con una pinzetta. Lavare biopsia due volte con DPBS, aggiungere 2 ml tipo Collagenasi 2 (500 U / ml CDU), trasferimento in 15 ml di tubo e aggiungere Collagenase il volume totale fino a 5 ml. Incubare per 45 minuti a 37 ° C, 5% CO 2.
- Centrifugare 5 min a 180 xg ed eliminare il surnatante dopo. Risospendere pellet in 10 ml di DMEM-FCS-gentamicina-media (10% FCS, 1 ml / ml gentamicina) e centrifugare ancora per 5 min a 180 x g. Gettare il surnatante e risospendere pellet in 1,5 ml DMEM-FCS-gentamicina-media. Trasferimento t25 aderente pallone di coltura tissutale e incubare a 37 ° C, 5% CO 2.
- Modificare i media ogni 3 giorni.
- Dopo circa due settimane, quando le cellule sono confluenti intorno alle parti della pelle, dividere le celle utilizzando tripsina / EDTA (0,05%): Lavare le cellule una volta con DPBS, incubare 5 minuti a 37 ° C, 5% di CO 2 dopo l'aggiunta di 2 ml tripsina / EDTA (0,05%), aggiungere 2 ml di DMEM-FCS-Gentamicina-media, trasferimento in tubo da 15 ml e centrifugare a 180 xg per 5 minuti; scartare il surnatante e risospendere pellet in quantità appropriata di DMEM-FCS-gentamicina-media.
- Espandere ulteriormente le cellule cambiando il mezzo ogni 3 rd giorno e la divisione come descritto in precedenza quando le cellule sono confluenti; aggiunta di gentamicina può essere interrotto dopo il passaggio 2.
- Prima di utilizzare le cellule per esperimenti di conversione diretta, assicuratevi di escludere la contaminazione da micoplasma da analisi standard.
- Quando le cellule sono state ampliate, si può iniziare direttamente la conversione o congelare cellule verso il basso con il 10% e il 90% DMSO FCS. Le cellule devono essere conservati in -80 ° C per 2 giorni e poi trasferite ad azoto liquido per la conservazione a lungo termine.
- Per la preparazione della conversione, lavare le cellule una volta con DPBS, aspirare DPBS e aggiungere 2,5 ml tripsina / EDTA (0,05%). Conservare per 5 min a 37 ° C, 5% CO 2. Toccare pallone delicatamente per staccare le cellule, risospendere in 2,5 ml di mezzi di fibroblasti (DMEM incl. L-Glu + 10% FCS + 1% + 1% NEAA piruvato di sodio) e trasferimento in 15 ml di tubo. Centrifugare a 180 xg per 5 minuti e aspirare il surnatante. Risospendere le cellule in 1 ml di mezzi di fibroblasti e pipetta su e giù per generare sospensione singola cella. </ Li>
- Contare il numero di cellule utilizzando una camera di conteggio Fuchs-Rosenthal- o Neubauer celle e 3 x 10 4 cellule per pozzetto di una piastra a pozzetti 24 plate. Incubare O / N a 37 ° C, 5% di CO 2.
2. L'infezione di fibroblasti umani con Sendai Virus e Transdifferenziazione
NOTA: Per garantire la sicurezza, le seguenti operazioni che manipolano virus devono essere eseguiti in una cappa di sicurezza biologica e una cappa a flusso laminare, e con gli adeguati dispositivi di sicurezza personale, in particolare una mascherina chirurgica, per evitare l'esposizione della mucosa.
- Passare le cellule a 100 microlitri mezzi di fibroblasti (Passo 1.9). Scongelare aliquote di Oct4-, Klf4-, Sox2- e virus c-myc-Sendai e risospendere ogni virus in 1 ml di mezzi di fibroblasti. Aggiungere ogni virus con una MOI di 3 cellule (titolo virale varia da lotto a lotto, ma un'aliquota di ciascuna virus può generalmente essere utilizzato per l'infezione di 10 pozzetti di una piastra a pozzetti 24) e mescolare delicatamente. Incubare O / N a 37 ° C, 5% CO 2
- Dopo 24 ore aspirare medio e aggiungere 500 ml di mezzi neuroinduction (1: 1 DMEM / F-12: Neurobasal, 1x N2, 1x B27, 1% Glutamax, 10 ng / ml hLIF, 3 micron CHIR99021, 2 mM SB431542) e coltura a 39 ° C, 5% CO 2 da ora in poi. Modificare i media a giorni alterni.
- Il giorno 6 dopo l'infezione preparare laminina rivestite 6-pozzetti-: diluire laminina a 1 mg / ml di DPBS, aggiungere 1 ml di soluzione sulla 6-pozzetti e conservare a 4 ° C per 24 ore.
- Il giorno 7 dopo l'infezione dividere le celle utilizzando DPBS / EDTA: Aspirare il supporto e lavare le cellule una volta con DPBS, poi aggiungere 500 ml di DPBS / EDTA e incubare per 10 min a 37 ° C, 5% di CO 2.
- Aggiungere 500 ml di DMEM / F12 e rimuovere sospensione dalla piastra in una provetta da 15 ml e centrifugare a 180 xg per 5 min.
- Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 1,5 ml di mezzi neuroinduction, piatto su laminina rivestite 6 pozzetti-e aggiungere ROCK inibitore Y27632 in un conce finalentration di 10 micron per le cellule, coltura a 39 ° C, 5% di CO 2.
- Modificare i media a giorni alterni.
- Dal giorno 14 dopo l'infezione coltura le cellule a 37 ° C, 5% di CO 2. Colonie roepiteliale si manifestano intorno al giorno 17 dopo l'infezione al microscopio a contrasto di fase. Essi dovrebbero essere abbastanza grandi per essere prelevati circa 20 giorni dopo l'infezione.
3. Isolamento di Colonie putativo INPC
- Un giorno prima di prendere, cappotto un 48 ben piastra con laminina: diluire laminina a 1 mg / ml di DPBS, aggiungere 300 ml di soluzione su piastre e conservare a 4 ° C per 24 ore. Un giorno dopo aspirare laminina dai piatti e aggiungere 200 ml di mezzi neuroinduction ai pozzetti.
- Lavare i 6 ben piastre contenenti le colonie di essere prelevati una volta con DPBS e aggiungere 2 ml DPBS per pozzetto di 6 ben piastre. Raccogliere le colonie meccanicamente: raschiare intorno colonie usando un ago sottile per liberarsi di cellule circostanti; impostare il 2001; l Pipetman su 50 ml e raccogliere le colonie utilizzando i rispettivi puntali delle pipette.
- Trasferire una colonia ciascuna in un pozzetto di una piastra da 48 pozzetti laminina rivestite e generare una sospensione di cellule singole meccanicamente pipettando su e giù per 10 volte. Aggiungere inibitore ROCK Y27632 in una concentrazione finale di 10 mM alle cellule.
- Grow le celle del 48 micropiastre a 37 ° C, 5% CO 2 per 2 giorni. Modificare i media ogni due giorni fino a quando le cellule raggiungono 80-90% di confluenza (circa 3 - 4 giorni.).
4. Ampliamento e Cryo-conservazione di iNPCs
- Passaging ed espansione di iNPCs
- Aspirare il medio e lavare le cellule con DPBS. Aspirare il DPBS e aggiungere 200 microlitri DPBS / EDTA e incubare per 10 min a 37 ° C, 5% CO 2, aggiungere 200 ml di DMEM / F12 e rimuovere sospensione dalla piastra in una provetta da 15 ml, centrifugare a 180 xg per 5 min .
- Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 0,5 ml di Neuroinduction supporto (punto 2.2), piastra su laminina rivestite 12-pozzetti e aggiungere inibitore ROCK Y27632 in una concentrazione finale di 10 pM alle cellule, coltura a 37 ° C, 5% CO 2. Dopo cellule raggiungono 80-90% confluenza possono essere sia ulteriormente ampliato o congelati come segue.
- Congelamento di iNPCs
- Aspirare il medio e lavare le cellule con DPBS. Aspirare il DPBS e aggiungere DPBS 300μl / EDTA e incubare per 10 min a 37 ° C, 5% CO 2, aggiungere 300 ml di DMEM / F12 e rimuovere sospensione dalla piastra in una provetta da 15 ml, centrifugare a 180 xg per 5 min.
- Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 0,5 ml di mezzo commerciale di congelamento NSC. Trasferimento sospensione fiale congelamento e mettere in un contenitore cella di congelamento. Conservare a -80 ° C per 2 giorni, poi il trasferimento per l'azoto liquido per la conservazione a lungo termine.
5. Differenziazione dei iNPCs
- Differenziazione verso neuroneal lineage
- Cellule di coltura su piastre laminina rivestite come sopra descritto. Cambia supporto per neuro-diff-media (DMEM / F-12, 1x N2, 1x B27, 300 ng / ml cAMP, 200 micron di vitamina C, 10 ng / ml BDNF, 10 ng / ml GDNF) quando le cellule sono circa il 70% confluenti. Modificare i media ogni giorno per tre settimane. Do cellule non dividere durante la differenziazione.
- Dopo tre settimane le cellule dovrebbero esprimere il marcatore TUJ1 neuronale. Per ottenere neuroni maturi e sottotipi neuronali continuano differenziazione fino a 3 mesi.
- La differenziazione verso lineage gliali
- Cambia supporto per i media ad induzione gliale (1: 1 DMEM / F-12: Neurobasal, 1x N2, 1x B27, 10 mM β-mercaptoetanolo, 100 micron aminoacidi non essenziali, 1,5 mm L-glutammina, l'insulina 5 mg / ml, 40 ng / ml T3) incluso 20 ng / ml EGF di indurre il differenziamento in cellule precursori gliali. Rimuovere la metà dei media e sostituirli con mezzi freschi ogni giorno per circa 2 settimane. Durante questo periodo le cellule dovrebbero essere divisi1: 3 in presenza di 10 mM inibitore ROCK Y27632 quando viene raggiunto il 100% di confluenza.
- Dopo 2 settimane differenziare le cellule ulteriormente in astrociti: quando le cellule sono supporti cambiamento quasi confluenti ai media commerciali astrociti disponibili, cambiare i media ogni due giorni. Dopo circa 7 giorni cellule iniziano a esprimere marcatori astrociti (ad esempio, GFAP). Se le cellule diventano 100% confluenti durante il protocollo di differenziazione, dividerli in un rapporto 1: 2 in presenza di 10 micron inibitore ROCK Y27632.
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Representative Results
Qui vi presentiamo una descrizione di un processo integrato che permette la generazione di cellule indotte neurali progenitrici (iNPCs) da fibroblasti umani che sono stati ottenuti da una biopsia di pelle in meno di 8 settimane (Figura 1). INPCs paziente-specifc possono essere ulteriormente differenziati in lignaggi neuronali e gliali e porto un enorme potenziale per la terapia di sostituzione cellulare e modelli di malattia.
L'infezione dei fibroblasti con Oct4-, Klf4-, Sox2- e c-myc- Sendai virus 23 e cultura in neuroinductive condizioni di media 22,31 comportato un cambiamento della morfologia dei fibroblasti e la successiva comparsa di colonie 17 giorni dopo l'infezione (Figura 2). Linee di cellule monoclonali generati possono essere ampliati e macchia positivo per i marcatori di cellule staminali neurali come Sox2, Sox1, Nestin, Vimentina, Otx2 e Pax6, così come per l'indicatore di proliferazione Ki67, mentre essi non esprimono la pluripotency-marcatore associato Oct4 (Figura 3).
Inoltre, per aggiunta di fattori di crescita neuronali ai mezzi di coltura cellulare le cellule progenitrici neurali possono essere differenziate in neuroni. Applicando un protocollo di differenziazione basata su Izrael et al. 42 e la successiva differenziazione finale con linee cellulari multimediali induzione astrociti possono inoltre essere distinte in lignaggi gliali come giudicato da analisi dei cambiamenti morfologici tipici e colorazione contro proteina silicea fibrillare gliale (GFAP) (Figura 4 ).
Figura 1. Rappresentazione schematica di protocollo in tre fasi applicato in questo studio. I fibroblasti possono essere isolati da pazienti da una biopsia e ampliato. Queste linee cellulari possono poi essere convertiti direttamente nel multipotenti cellule indotte neurali progenitrici (iNPCs) e monoclonally espanso. Linee INPC possono essere utilizzati per lo stoccaggio a lungo termine (biobanche per uso ripetuto o standardizzato) oppure possono essere differenziati in lignaggi neuronali e gliali. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. morfologica analisi di conversione diretta dei fibroblasti umani in cellule progenitrici neurali indotte usando la microscopia a contrasto di fase (A) fibroblasti umani tre giorni dopo l'infezione con OKSM -. Virus Sendai e due giorni dopo aggiunta del mezzo neuroinduction. Le cellule mostrano morfologia tipica fibroblasti-like. (B) Sette giorni dopo l'infezione delle cellule con mutato morfologia vedere. Le cellule sono divisi per ridurre confluenza lo stesso giorno. (C) Dieci giornis dopo l'infezione solo celle con mutata morfologia sono presenti. (D) Prime piccole colonie neuroepiteliale simili si possono trovare 17 giorni dopo l'infezione. Queste colonie aumentano di dimensione (E), e le cellule che diventano troppo grandi possono essere trovati (F) tre giorni dopo. Le cellule sono raccolte il giorno 21 dopo l'infezione e linee cellulari espandibili possono essere generati da loro (GI). Diversi cloni sono mostrati in passaggio 1 (G), il passaggio 3 (H) ed il passaggio 10 (I) dopo la raccolta, rispettivamente. Scala bar = 200 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Analisi delle cellule staminali marcatore espressione genica neurale generato neurali progenitrici cellinee l. colorazione anticorpo di linee cellulari dopo 10 passaggi hanno rivelato che le cellule esprimono i marcatori di cellule staminali neurali Sox1, Sox2 (A), così come Nestin e Pax6 (B). Le cellule sono negative per pluripotenza marcatore Oct4 indica assenza di pluripotenza (C). La maggior parte delle cellule positive per macchiare marcatore Ki67, che mostra un alto stato proliferativo (C). Barra di scala = 50 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Analisi dei NPC dopo la differenziazione diretta verso lignaggi neuronali e gliali. (A) Per ottenere iNPCs specifiche neuronali sono stati differenziati per sette giorni in presenza di BDNF, GDNF, Vitamina C e cAMP. (B) Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui vi mostriamo l'isolamento e la conversione diretta di fibroblasti umani in cellule progenitrici neurali senza transgene espandibili e la loro progenie differenziata come base putativo per la terapia cellulare di sostituzione o l'applicazione in analisi lo screening di stupefacenti. Conversione lineage diretta di cellule somatiche nel NPC è stato ottenuto mediante espressione forzata di trascrizione specifici lineage fattori 26,33,34. Tuttavia, in molti casi fibroblasti fetali sono stati usati per esperimenti transdifferenziazione 33,34. Per le applicazioni biomediche l'uso di queste cellule è inopportuno in quanto fonte di cellule preclude l'uso clinico per la terapia di sostituzione cellulare autologa. Recentemente, gli studi sono stati pubblicati che descrivono la generazione di cellule precursori neurali da più facilmente accessibili i tessuti, come le cellule ematopoietiche 43,44. La generazione di successo delle linee neurali tripotent di cellule staminali potrebbe essere indicato per le cellule B derivati dal sangue murini dal overexpr inducibileEsion di otto transgeni 43. Inoltre, Castano et al. Pubblicato un approccio per l'induzione di progenitori neuronali dalle cellule ematopoietiche umane utilizzando Sox2- e c-myc-Sendai virus 44. Il protocollo descritto permette la generazione rapida ed efficiente di cellule neurali da CD133 + cellule del sangue del cordone. Tuttavia, quando applicato per la conversione di cellule mononucleari del sangue periferico adulto protocollo ceduto bassa efficienza e la capacità di espansione delle linee cellulari generate era molto limitata 44. Pertanto, l'unico studio pubblicato con cellule del sangue periferico nel sistema umano finora 44 mostra chiaramente le limitazioni di questo particolare tipo di cellula in esperimenti di conversione diretta. Poiché la disponibilità di cellule specifiche del paziente è cruciale per la sostituzione delle cellule autologhe, il tipo cellulare preferito rappresentano ancora fibroblasti adulti, che possono essere facilmente ricavati tramite una biopsia cutanea come descritto nel nostro studio.
Il overexprefissione di transgeni necessari per transdifferenziazione è stato per lo più raggiunto da vettori virali integrativi 26,33,34. Ciò ostacola l'applicabilità delle linee cellulari derivate per applicazioni biomediche poiché l'integrazione dei virus nel genoma dell'ospite potrebbe portare a mutagenesi inserzionale o riattivazione indesiderato dei transgeni 7,8. Transdifferenziazione in PNG senza transgene sovraespressione ma sulla base di un trattamento chimico è stata descritta per fibroblasti umani 45. Tuttavia, in questo studio erano presenti solo in uno stato transitorio queste cellule precursori come lo scopo dello studio era la generazione di cellule mature Schwann 45. Recentemente, altri approcci senza transgene basati sull'applicazione dei virus di Sendai sono stati descritti per la conversione diretta di fibroblasti umani in NPC 23,44 e sembrano essere la strategia preferibile ad oggi. Per derivare NPC espandibili che possono essere successivamente differenziati in lignaggi neuronali e gliali,applichiamo sovraespressione di tutti Yamanaka-fattori da virus Sendai assieme inattivazione termica del virus 23 nonché induzione neurale aggiunta di piccole molecole ai terreni di coltura 22,31 con importanti modifiche come descritto nel seguito.
Anche se, nelle nostre mani, il protocollo è efficacemente lavorando con molte linee fibroblasti testati, esiste una tendenza evidente che la conversione diretta di cellule di fibroblasti da vecchi donatori esibendo un povero risultato potenziale proliferativo in una bassa efficienza di generazione INPC. Abbiamo osservato formanti colonia rendimenti fino al 0,2% dopo una efficienza di trasduzione virale di oltre il 90% come giudicato da infezione di cellule con un solo e successiva Oct4 colorazione. Questa efficienza è di circa 3 volte superiore a quello precedentemente pubblicato 23.
L'applicazione precisamente corretta di MOI virale ottimale è fondamentale. Batch alla variabilità dei lotti a Sendai titolo viraledeve essere preso in considerazione. Da quando il virus è di solito acquisito commercialmente, rispettivo informazioni possono essere trovate sulla homepage del produttore. Si consiglia di utilizzare un relativamente basso MOI di 3 per gli esperimenti di transdifferenziazione.
Aggiunta di LIF umana nelle nostre mani è fondamentale per il rinnovamento di sé delle linee INPC stabiliti come è stato descritto per la differenziazione delle cellule umane pluripotenti in PNG 31. Senza aggiunta di LIF, cellule iniziano a differenziarsi già due giorni dopo il ritiro in modo non reversibile.
Colture cellulari dopo l'infezione viene eseguita a 39 ° C e non con 37 ° C condizioni standard di coltura cellulare. Questo aumento della temperatura inizia già un giorno dopo l'infezione e porta ad un calore inattivazione del virus Sendai. La cultura a 39 ° C fino al giorno 14 dopo l'infezione è essenziale per la generazione di colonie neuroepiteliale.
Difatti, a volte le colonie INPC venire più tardi di quanto descritto nella sezione del protocollo. Nella nostra esperienza, finché le cellule rimangono proliferative possono essere policlonale diversi passaggi e isolati mediante prelievo manuale. Le linee cellulari stabilizzate da quelle colonie presentano caratteristiche analoghe a quelle descritte per prime colonie che si verificano.
Durante frazionamento di linee cellulari stabilizzate è importante non per inizializzare una troppo piccolo numero di cellule in quanto richiedono contatti cellula-cellula o segnali paracrini a proliferare bene. Se le cellule sono seminate in troppo bassa proliferazione densità cesserà. In questo caso, le cellule possono essere salvate da replating su un piatto di coltura cellulare con una superficie inferiore a riavviare la proliferazione.
Per differenziazione gliale di iNPCs è molto importante seminare le cellule in un'alta densità e dividerli quando la piastra è quasi confluenti. Se le cellule sono divisi troppo presto, si osserverà il differenziamento prevalentemente neuronale.
content "> Il processo descritto in questo manoscritto nasconde il potenziale per essere applicate in modo semi o completamente automatizzato, che sarebbe necessario per raggiungere il potenziale biomedico desiderato, tra cui modelli di malattia e terapia di sostituzione cellulare. Automation consentirebbe inoltre in termini di costi scale-up efficiente e parallelizzazione della generazione di cellule progenitrici neurali.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare tutti i membri della cellula formativa e medicina rigeneratrice Group dell'Università di Würzburg per utili suggerimenti e Martina Gebhardt, nonché Heike Arthen per un eccellente supporto tecnico. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (ED79 / 1-2), il Ministero dell'Istruzione e della Ricerca tedesco BMBF (01 GN 0813), i bavaresi Research Network pluripotenti indotte cellule staminali "forIPS" e la "Stiftung Sibylle Assmus ". La figura 1 è stata prodotta utilizzando Servier medica Arte, disponibile da www.servier.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Astrocyte media | ScienCell | 1801 | |
| B27 | LifeTechnologies | 17504-044 | |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| Biopsy Punch | pfm medical | 48301 | |
| cAMP | Sigma | A6885 | |
| CHIR99021 | Axon medchem | 1386 | |
| Collagenase Type2 | Worthington Biochemical | LS004177 | |
| Dispase | PAN | P10-032100 | |
| DMEM | LifeTechnologies | 41966-029 | |
| DMEM F12 | LifeTechnologies | 11320-033 | |
| DMSO | Roth | 4720 | |
| DPBS | LifeTechnologies | 14190-094 | |
| EGF | Life Technologies | PHG0313 | |
| FCS | Biochrom AG | 50115 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| Gentamicin | Sigma | G1397 | |
| GFAP-antibody | Dako | Z0334 | |
| GlutaMAX | LifeTechnologies | 35050-038 | |
| hLIF | Peprotech | 300-05 | |
| Insulin | Seralab | GEM-700-112-P | |
| Ki67-antibody | NeoMarkers | RM-9106-S | |
| L-Glutamine | LifeTechnologies | 25030-024 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| N2 | LifeTechnologies | 17502-048 | |
| Nestin-antibody | R&D Systems | MAB1259 | |
| Neurobasal | LifeTechnologies | 21103-049 | |
| Non-essential amino acids | LifeTechnologies | 11140-050 | |
| NSC freezing media | Sigma | C6295 | |
| Oct4-antibody | Santa Cruz | sc9081 | |
| Pax6-antibody | Covance | PRB-278P | |
| SB431542 | Invivogen | inh-sb43 | |
| Sendai virus: CytoTune Sendai Reprogramming Kit | LifeTechnologies | A1378001 | |
| Sodiumpyruvate | Life Technologies | 11360-039 | |
| Sox1-antibody | R&D Systems | AF3369 | |
| Sox2-antibody | R&D Systems | MAB2018 | |
| T3 | Santa Cruz | sc-205725 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| TUJ1-antibody | Covance | MMS-435P-250 | |
| Vitamin C | Sigma | A4544 | |
| Y27632 | Calbiochem | CAS 146986-50-7 | |
| β-Mercaptoethanol | LifeTechnologies | 21985023 |
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