Summary
דור של תאי גזע pluripotent מושרה מספק סיכויים מרתקים לגזירה של השתלות אוטולוגית. עם זאת, ההתקדמות במדינת pluripotent מחדש בידול מייגע עדיין מעכבת תרגום קליני. כאן אנו מתארים את הגזירה של fibroblasts אדם הבוגר וההמרה הישירה שלהם לתאים עצביים מושרה ובידול שלאחר מכן לשושלות עצביות.
Abstract
דור של תא מושרה גזע pluripotent (iPSCs) מfibroblasts העור המבוגר ובידול שלאחר מכן לתאים סומטיים מספק סיכויים מרתקים לגזירה של השתלות אוטולוגית שלעקוף מחסומי histocompatibility. עם זאת, ההתקדמות במדינת pluripotent ובידול מלא שלאחר מכן לשושלות הרצויות נותרת מחסום לתרגום הקליני של טכנולוגית iPSC בגלל חוסר היציבות הפוטנציאלית והגנומי neoplastic הנלווה. לאחרונה, אנו ואחרים הראו כי תאים סומטיים לא יכולים להיות מומרים לiPSCs אלא גם לסוגים שונים של תאי גזע סומטיים multipotent רק באמצעות גורמים מוגדרים, ובכך לעקוף את ההתקדמות דרך מדינת pluripotent. בפרט, ההמרה הישירה של פיברובלסטים אנושיים לתאים עצביים מושרה (iNPCs) מבשרת את האפשרות של מקור תא אוטולוגי חדשני ליישומים שונים כגון החלפת תא, מודלים מחלהוהקרנת סמים. כאן אנו מתארים את הבידוד של fibroblasts העיקרי אדם המבוגר על ידי ביופסיה של עור וההמרה הישירה היעילה שלהם לiNPCs על ידי ביטוי בזמן המוגבל של Oct4, Sox2, Klf4, כמו גם ג-Myc. מושבות neuroepithelial Sox2 חיובי מופיעות לאחר 17 ימים של אינדוקציה וניתן להקים קווי iNPC ביעילות על ידי בידוד והרחבה חד שבטיים. התאמה מדויקת של ריבוי הנגיפי של זיהום ותוספת של גורם המעכב לוקמיה בשלב האינדוקציה מייצגת גורמים קריטיים להשגת יעילות המרה של עד 0.2%. עד כה, יכולים להיות מורחבים קווי iNPC מטופל ספציפי ליותר מ -12 קטעים ואחיד להציג תכונות מורפולוגיות ומולקולריות של תאי גזע / עצביים, כגון הביטוי של Nestin וSox2. יכולים להיות מובחנים קווי iNPC לתוך הנוירונים והאסטרוציטים כמו להישפט על ידי צביעה נגד Tuj1 וGFAP, בהתאמה. לסיכום, אנו מדווחים פרוטוקול חזק לגזירה וחמורההמרת CT של fibroblasts האנושי לתאים עצביים ביציבות להרחבה שעשויה לספק מקור סלולארי ליישומים ביו-רפואיים כגון החלפה אוטולוגית עצבית תא ומודלים מחלה.
Introduction
בשינה 2006 יאמאנאקה ועמיתים יכולים להראות בפעם הראשונה את האפשרות של תכנות מחדש של תאים סומטיים למצב pluripotent 1. dedifferentiation זו הושג על ידי ביטוי יתר של ארבעה גורמי שעתוק Oct4, Sox2, Klf4, ו- c-Myc בfibroblasts עכברי. מה שנקרא תאים שנוצרו מושרה גזע pluripotent (iPSCs) להראות שקילות פונקציונליות לתאי גזע עובריים (ESCs) ולכן יכולים להיות מובחנים לכל סוגי התאים של האורגניזם הבוגר. שנה אחת מאוחר יותר תכנות מחדש לiPSCs גם יכולה להיות מושגת על fibroblasts אדם 2. ניסויים במודלים של בעלי חיים מראים כי תאים נגזר iPSC יכולים בדרך כלל לשמש לטיפול בתאי החלפה, למשל, במחלות (PD) פרקינסון 3-5. עם זאת, כמה מגבלות הקשורות לשימוש בiPSCs מייצגות מחסומים למימוש המלא של הפוטנציאל הטיפולי שלהם. קודם כל, תכנות מחדש של תאים למצב ולאחר מכן pluripotentבקרת איכות היא בדרך כלל זמן רב ותהליך לא יעיל המניבים בנהלי תרבית תאים נרחבים ובכך יקרים. שנית, iPSCs צריך להיות מחדש מובחן לסוג הרצוי תא עניין לפני היישום ביו-רפואי ובהסתברות של תאי pluripotent שייר באוכלוסייה המובחנת נמלי פוטנציאל סרטני משמעותי ובכך מציג גבוה לאחר השתלת תאי 6 סיכון. שלישית, תהליך תכנות מחדש מושגת בדרך כלל על ידי גרימת גורמי תכנות מחדש על ידי זיהום lenti- או retroviral. השילוב של וירוסים אלה לתוך הגנום המארח עלול להוביל לmutagenesis insertional ו / או הפעלה מחדש בלתי מבוקרת של transgenes 7,8. מערכות שאינן אינטגרטיבית פותחו כדי לספק את גורמי תכנות מחדש כדי למקד תאים, אשר למזער את הסיכון של mutagenesis insertional והפעלה מחדש transgene. דוגמאות לגישות ללא transgene אלה הן תכנות מחדש של תאים באמצעות הלא שילובAdeno או וירוס סנדאי 9,10, וקטורים מבוססי DNA 11 או היישום של שיטות ללא DNA, כמו transfection של mRNA הסינתטי 12 או התמרה של חלבונים רקומביננטי 13,14. שיטה מבטיחה נוספת לגזירה של iPSC ללא transgene היא השימוש במבני תכנות מחדש lentiviral-שונה loxP והמחיקה הבאה של transgenes באמצעות מערכת רקומבינציה Cre-loxP DNA 15,16.
גישה פשוטה יותר ליצירת תאים עצביים לטיפול בתחליפי תא מייצג המרה ישירה של fibroblasts לתוך הנוירונים לאחר mitotic 17-20. Vierbuchen et al. דיווח כי ביטוי יתר של שעתוק גורמי תוצאות Ascl1, Brn2 וMyt1l בדור של נוירונים 20% מfibroblasts עכברי 17. בשינה 2011 ניתן היה לראות, כי אותו שלושת גורמי השעתוק בשילוב עם ביטוי יתר של NeuroD1 לאפשר transdifferentiation של fibroblasts אדם לneuהנוירונים 19. נוירונים אדם מושרה גם יכולים להיות שנוצרו על ידי ביטוי יתר של Ascl1 וNgn2 תחת SMAD- הכפול ועיכוב GSK3β- 20. יש לציין, המרה ישירה של fibroblasts לתוך הנוירונים יוצרת אוכלוסייה הלא-שגשוג, לאחר mitotic תאים שאינו מאפשרת התרחבות וbiobanking נוספות.
לאחרונה, ההמרה הישירה של פיברובלסטים לאוכלוסיית תאי גזע / עצבי מתרבות דווחה 21-26. למען הבהירות, כל אלו סוגי התא יהיה בשם כמו תאים מושרה עצביים אב (iNPCs) בדוח זה. האן et al. ביטוי יתר Brn4, Sox2, ג-Myc וKlf4 ליצור iNPCs. כמו עמיתיהם תא גזע עצבי שמקורם בתאים או רקמות ראשוניות או pluripotent iNPCs אלה tripotential ויכול להיות מובחן לתוך הנוירונים, האסטרוציטים וoligodendrocytes 21. הקבוצה שלנו דיווחה על פרוטוקול המרה מעט שונה מעורב ביטוי יתר של Sox2, Klf4, ו- c-Myc ומושרה Oct4 ביטוי במשך 5 ימים בלבד. עם גישה זו אנו יכולים ליצור iNPCs יציבות מתרבות מfibroblasts העוברי והבוגר עכברי כי התערוכה השתקה מוחלטת של תכנות מחדש גורמי 22. בניגוד לiPSCs, iNPCs אינו מציג פוטנציאל סרטני לאחר השתלת 27. אנחנו השתמשנו להמיר תאים בהצלחה במודל חיה של demyelination, חולדות חסרות מיאלין, הוכחה כי iNPCs קליני שימושי 22. עד אז, NPCs יכול להיות שנוצר רק מתאי גזע pluripotent או רקמה עצבית העיקרית 28-32. iNPCs הם תאים ביציבות להרחבה שניתן cryopreserved והם מסוגלים להתמיין לתאי עצב, האסטרוציטים וoligodendrocytes. מאמץ רב נעשה כדי להתאים את פרוטוקול ההמרה הישיר מעכבר לתאים אנושיים 23,26,33,34. בשינה 2012 פורסם כי ביטוי יתר של Sox2 הגורם היחיד בfibroblasts מספיק כדי ליצור עכברי וiNPCs אדם
מספר מחקרים מראים פונקציונלי הסלולרית של NSCs או העמיתים המובחנים שלהם במודלים של בעלי החיים שונים מחלה. אבות עצביים מתאי גזע pluripotent אנושיים הושתלו בעכברי מודל של הפרעת neuroinflammatory טרשת נפוצה 35,36. התחולה של תאים עצביים הנגזר hESC בEAE (Encephalomyelitis אוטואימוניות ניסיוני) -mice הוצג לראשונה בשנת 2008 35. תאים עצביים מבשרים multipotent הוזרקו לתוך החדרים של מוח עכבר, ותוצאת ההשתלהאד בהפחתה של סימנים קליניים של EAE. קים et al. נוצר מבשרי oligodendroglial מhESCs ומושתלים אלו intracerebroventricularly לEAE-עכברים. למרות השתלות לא שרדו במשך יותר מ -10 ימים, עכברים הראו שיפור משמעותי בתפקוד והפחתה של תאים חיסוניים מעודדי דלקת בחומר הלבן 36 נוירולוגיות. טיפול בתאי גזע גם יושם לpreclinically המיקוד של מחלת פרקינסון כNPCs יכול להיות מועסק בהצלחה במודלים של בעלי החיים בהתאמה. לשם כך, ובתאים נגזרו גם מרקמת המוח העוברי 37 מובחנות מתאי גזע pluripotent 38-40 או בתאי גזע mesenchymal 41 היו בשימוש. בשנת 2012 הראינו כי iNPCs העכבר מסוגל לייצר חלבון proteolipid, מרכיב חלבון המיאלין הגדול, לאחר ההשתלה לתוך מוחם של חולדות המיאלין לקוי (MD) 22. על ידי שניסוי ההוכחה של עיקרון applicabil הטיפוליity של iNPCs הוכח ראשית ואישר בקרוב על ידי מחקר אחר 32. עם זאת, את מלוא הפוטנציאל של שימוש הטיפולי של iNPCs האנושי נשאר כדי להיחקר.
כאן אנו מראים תהליך חזק ומשולב של גזירה (i) של תאים ראשוניים אדם מחולים מבוגרים באמצעות ביופסיה של עור, המרה ישירה של fibroblasts אדם למצב עצבי וכן (iii) את היכולת של iNPCs (ii) ללהיות מובחן לתוך עצבי ושושלות גליה. שימוש בפרוטוקול זה יעזור לזרז את דור של תאים אנושיים אוטולוגית עבור יישומים טיפוליים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Fibroblasts האדם ששמש במחקר זה התקבל מביופסית עור לאחר קבלת הסכמה מדעת ואישור אתי על ידי ועדת האתיקה של האוניברסיטה וורצבורג, גרמניה (דו"ח אתי לא: 96/11 מיום 2011/10/06).
1. ביופסיה
- לחטא את העור של מטופל. הרדימי חלק עור שהביופסיה תילקח מ( מעדיף אזור חשוף לשמש פחות) באמצעות 0.5-1 מיליליטר hydrochloride mepivacaine intracutaneously ולהכין ביופסיה של עור באמצעות אגרוף ביופסיה 3 מ"מ סטרילי, לשטוף ביופסיה עם DPBS + μl 1 / 1ml גנטמיצין ולהסיר שומן. יש לשטוף את ביופסית פעמיים עם DPBS + גנטמיצין, לשאוב DPBS ביופסיה לחלוטין וכיסוי עם Dispase השני (2.4 U / ml) ודגירה 16-18 שעות ב 4 מעלות צלזיוס.
- לשאוב Dispase לחלוטין, לשטוף פעמיים עם DPBS ולהסיר עור עם פינצטה. לשטוף ביופסית פעמיים עם DPBS, להוסיף 2 מיליליטר Collagenase סוג 2 (500 U / CDU מיליליטר), ההעברה בצינור 15 מיליליטר ולהוסיף Collagenaנפח כולל של עד 5 מיליליטר SE. דגירה של 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- צנטריפוגה 5 דקות ב 180 XG ולהשליך supernatant לאחר מכן. גלולה גלולה ב 10 מיליליטר DMEM-FCS-גנטמיצין-תקשורת (FCS 10%, μl 1 / מיליליטר גנטמיצין) ו צנטריפוגות שוב במשך 5 דקות ב 180 x גרם. בטל supernatant וגלול גלול ב 1.5 מיליליטר DMEM-FCS-גנטמיצין-מדיה. העברה לT25 בקבוק תרבות רקמה חסיד ולדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- שינוי תקשורת בכל 3 ימים.
- לאחר כ 2 שבועות, כאשר תאים ומחוברות סביב חלקי עור, תאים מפוצלים באמצעות טריפסין / EDTA (0.05%): תאים לשטוף פעם אחת עם DPBS, דגירה 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 לאחר תוספת של 2 מיליליטר טריפסין / EDTA (0.05%), להוסיף 2 מיליליטר של DMEM-FCS-גנטמיצין-מדיה, להעביר לצינור 15 מיליליטר ו צנטריפוגות ב 180 XG במשך 5 דקות; להשליך גלולה supernatant והגלולה בכמות המתאימה של DMEM-FCS-גנטמיצין-מדיה.
- להרחיב עוד יותר את התאים על ידי שינוי הבינוני כל 3 rיום ד ופיצול כפי שתואר לעיל, כאשר תאים ומחוברות; תוספת של גנטמיצין ניתן לעצור לאחר מעבר 2.
- לפני השימוש בתאים לניסויי המרה ישירים, לוודא שלא לכלול זיהום mycoplasma על ידי מבחני סטנדרטיים.
- כאשר תאים הורחבו, ייתכן ישירות להתחיל המרה או להקפיא את תאים באמצעות 10% ו 90% DMSO FCS. תאים צריכים להיות מאוחסנים ב-80 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים ולאחר מכן הועברו לחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.
- להכנת המרה, לשטוף תאי פעם אחת עם DPBS, לשאוב DPBS ולהוסיף 2.5 מיליליטר טריפסין / EDTA (0.05%). שמור במשך 5 דקות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. בקבוק ברז בעדינות כדי לנתק את התאים, גלול ב2.5 מיליליטר של תקשורת פיברובלסטים (DMEM כולל. FCS L-Glu + 10% + 1% + 1% פירובט נתרן NEAA) ולהעביר עד 15 מיליליטר צינור. צנטריפוגה ב 180 XG במשך 5 דקות ולשאוב supernatant. תאי Resuspend ב 1 מיליליטר תקשורת פיברובלסטים ופיפטה מעלה ומטה כדי ליצור השעיה תא בודדת. </ Li>
- לספור את מספר התאים באמצעות תא פוקס-Rosenthal- או נויבאואר-תא ספירה וצלחת 3 x 10 4 תאים לכל גם 24 היטב צלחת. דגירה O / N ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
2. זיהום של fibroblasts האדם עם וירוס סנדאי וTransdifferentiation
הערה: כדי להבטיח את הבטיחות, יש את השלבים הבאים בטיפול וירוס שיש לבצע בארון ביולוגי בטיחות וזרימה למינרית, ועם ציוד מתאים אישי בטיחות, במיוחד מסכת מנתחים, כדי למנוע חשיפה של רירית.
- לעבור לתאים 100 μl תקשורת פיברובלסטים (שלב 1.9). להפשיר aliquots של Oct4-, Klf4-, Sox2- ווירוס c-myc-סנדאי וresuspend כל וירוס ב 1 מיליליטר תקשורת פיברובלסטים. להוסיף כל וירוס עם משרד הפנים של 3 תאים (כייל נגיף משתנה ממגרש למגרש, אבל aliquot אחד מכל וירוס יכול בדרך כלל לשמש לזיהום של 10 בארות של 24 גם צלחת) ומערבבים בעדינות. דגירה O / N ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2
- לאחר 24 שעות לשאוב הבינוני ולהוסיף 500 μl של תקשורת neuroinduction (1: 1 DMEM / F-12: Neurobasal, 1x N2, 1x B27, 1% Glutamax, 10 ng / ml hLIF, 3 מיקרומטר CHIR99021, 2 מיקרומטר SB431542) ו תרבות ב 39 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 מעתה והלאה. לשנות את התקשורת בכל יום אחר.
- ביום 6 לאחר ההדבקה להכין 6-גם צלחות מצופים laminin: לדלל laminin ל1 מיקרוגרם / מיליליטר בDPBS, להוסיף 1 מיליליטר של תמיסה על 6 גם צלחות ולשמור על 4 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות.
- ביום 7 לאחר ההדבקה לפצל את התאים באמצעות DPBS / EDTA: לשאוב התקשורת לשטוף תאים פעם אחת עם DPBS, ולאחר מכן להוסיף 500 μl של DPBS / EDTA ודגירה של 10 דקות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- הוסף 500 μl של DMEM / F12 ולהסיר השעיה מצלחת בצינור 15 מיליליטר ו צנטריפוגות ב 180 XG במשך 5 דקות.
- לשאוב supernatant ו resuspend גלולה ב 1.5 מיליליטר של תקשורת neuroinduction, צלחת על 6 גם צלחות מצופים laminin ולהוסיף Y27632 מעכב ROCK בconce סופיntration של 10 מיקרומטר לתאים, התרבות ב 39 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- לשנות את התקשורת בכל יום אחר.
- מיום 14 אחרי תרבות זיהום התאים על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. מושבות neuroepithelial יתבררו סביב יום 17 לאחר זיהום על ידי מיקרוסקופ לעומת שלב. הם צריכים להיות גדולים מספיק כדי להיות הרים סביב יום 20 לאחר הדבקה.
3. בידוד של מושבות המשוערות iNPC
- יום אחד לפני הבחירה, מעיל אחד 48 היטב צלחת עם laminin: לדלל laminin ל1 מיקרוגרם / מיליליטר בDPBS, להוסיף 300 μl של פתרון על צלחות ולשמור על 4 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. יום אחד מאוחר יותר לשאוב laminin מצלחות ולהוסיף 200 μl של תקשורת neuroinduction לבארות.
- שטוף את 6 DPBS 2 מיליליטר היטב צלחות המכילות מושבות להיות נטלו פעם אחת עם DPBS ולהוסיף לכל גם 6 היטב צלחת. פיק המושבות מכאני: לגרד סביב מושבות באמצעות מחט דקה להיפטר סביב תאים; להגדיר את 2001; pipetman l על 50 μl ולבחור את המושבות באמצעות הטיפים פיפטה בהתאמה.
- העבר את המושבה כל אחת ולאחת 48 היטב צלחת מצופה laminin וליצור השעיה תא בודדת מכאני על ידי pipetting למעלה ולמטה 10 פעמים. להוסיף Y27632 מעכב ROCK בריכוז סופי של 10 מיקרומטר לתאים.
- לגדול תאים על 48 היטב הצלחת על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עבור 2 ימים. לשנות את התקשורת בכל יום שני עד תאים להגיע 80-90% confluency (3 כ -. 4 ימים).
4. הרחבה וקריו שימור iNPCs
- Passaging והרחבת iNPCs
- לשאוב את המדיום ולשטוף את התאים עם DPBS. לשאוב את DPBS ולהוסיף 200 DPBS μl / EDTA והדגירה של 10 דקות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, להוסיף 200 μl של DMEM / F12 ולהסיר השעיה מצלחת בשפופרת 15 מיליליטר, צנטריפוגות ב 180 XG במשך 5 דקות .
- לשאוב supernatant ו resuspend גלולה ב 0.5 מיליליטר של neuroiתקשורת nduction (שלב 2.2), צלחת על 12 גם צלחות מצופים laminin ולהוסיף Y27632 מעכב ROCK בריכוז סופי של 10 מיקרומטר לתאים, תרבות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. לאחר תאים מגיעים 80-90% confluency הם יכולים להיות גם הרחיבו עוד יותר או קפוא למטה כדלקמן.
- הקפאה של iNPCs
- לשאוב את המדיום ולשטוף את התאים עם DPBS. לשאוב DPBS ולהוסיף DPBS 300μl / EDTA ודגירה של 10 דקות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, להוסיף 300 μl של DMEM / F12 ולהסיר השעיה מצלחת בשפופרת 15 מיליליטר, צנטריפוגות ב 180 XG במשך 5 דקות.
- לשאוב supernatant ו resuspend גלולה ב 0.5 מיליליטר של מדיום הקפאת המל"ל המסחרי. העברת השעיה לבקבוקוני הקפאה ולשים במכל הקפאת תאים. חנות ב -80 ° C עבור 2 ימים, ולאחר מכן להעביר לחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.
5. בידול של iNPCs
- בידול לנוירוןשושלת אל
- תרבות תאים על צלחות מצופים laminin כפי שתוארו לעיל. שינוי תקשורת לנוירו-diff-מדיה (DMEM / F-12, 1x N2, 1x B27, 300 ng / ml מחנה, 200 מיקרומטר C ויטמין, 10 ng / ml BDNF, 10 ng / ml GDNF) כאשר תאים הם כ -70% מחוברות. שינוי תקשורת בכל יום אחר במשך שלושה שבועות. האם תאים לא לפצל במהלך התמיינות.
- אחרי שלושה שבועות תאים צריכים להביע Tuj1 הסמן העצבי. כדי לזכות בנוירונים בוגרים יותר ותת עצביים להמשיך בידול עד 3 חודשים.
- בידול כלפי שושלת גליה
- שינוי תקשורת לתקשורת אינדוקציה גליה (1: 1 DMEM / F-12: Neurobasal, 1x N2, 1x B27, β-mercaptoethanol 10 מיקרומטר, 100 מיקרומטר חומצות אמינו לא חיוניות, 1.5 המ"מ L- גלוטמין, אינסולין 5 מיקרוגרם / מיליליטר, T3 40 ng / ml) כולל 20 ng / ml EGF לגרום להתמיינות לתאים מבשר גליה. הסר מחצית התקשורת ולהחליף ידי תקשורת טרי בכל יום אחר למשך כ 2 שבועות. בתקופה זו יש לפצל תאים1: 3 בנוכחות של Y27632 מעכב ROCK 10 מיקרומטר כאשר מגיע confluency 100%.
- לאחר 2 שבועות להבדיל תאים נוספים להאסטרוציטים: כאשר תאים תקשורת שינוי כמעט ומחוברות לתקשורת astrocyte זמינה מסחרית, לשנות תקשורת כל יום שני. לאחר כ -7 ימי תאים מתחילים להביע סמני astrocyte (למשל, GFAP). אם תאים מקבלים מחוברות 100% במהלך פרוטוקול הבידול, לפצל אותם ביחס של 1: 2 בנוכחות של Y27632 מעכב ROCK 10 מיקרומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כאן אנו מציגים תיאור של תהליך משולב המאפשר יצירה של תאים מושרה עצביים אב (iNPCs) מfibroblasts האדם שהתקבלו על ידי ביופסיה מעור תוך פחות מ 8 שבועות (איור 1). iNPCs מטופל-specifc יכול להיות מובחן יותר לתוך שושלות עצביות וגליה ונמל פוטנציאל אדיר לטיפול בתחליפי תא ומודלים מחלה.
זיהום של fibroblasts עם Oct4-, Klf4-, Sox2- וסנדאי ג-myc- וירוסי 23 ותרבות בתנאי neuroinductive תקשורת 22,31 הביאו לשינוי של מורפולוגיה של פיברובלסטים וההופעה הבאה של מושבות 17 ימים לאחר ההדבקה (איור 2). ניתן להרחיב שורות תאים חד שבטיים שנוצרו וכתם חיובי לסמנים של תאי גזע עצביים כמו Sox2, Sox1, Nestin, vimentin, Otx2 וPax6, כמו גם עבור סמן התפשטות Ki67, ואילו הם אינם מבטאים את pluripotency-הסמן קשור Oct4 (איור 3).
יתר על כן, על ידי תוספת של גורמי גדילה עצביים לתקשורת ותרבות תא יכולים להיות מובחנים התאים העצביים לנוירונים. על ידי יישום פרוטוקול בידול המבוסס על יזרעאל ואח '. 42 ובידול סופי שלאחר מכן עם שורות תאי תקשורת האינדוקציה astrocyte יכולים גם להיות מובחנים לשושלות גליה כמו להישפט על ידי ניתוח של שינויים מורפולוגיים טיפוסיים וצביעה נגד חלבון חומצי גליה fibrillary (GFAP) (איור 4 ).
איור 1. ייצוג סכמטי של פרוטוקול שלושת שלבים שיושם במחקר זה. פיברובלסטים יכול להיות מבודד מחולים על ידי ביופסיה והרחיב. שורות תאים אלה לאחר מכן ניתן להמיר ישירות לתוך תאים מושרה multipotent עצביים אב (iNPCs) ומוהרחיב noclonally. קווי iNPC יכולים לשמש לאחסון לטווח ארוך (biobanking לשימוש חוזר או סטנדרטי) או שהם יכולים להיות מובחנים לשושלות עצביות וגליה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. מורפולוגי ניתוחים של המרה ישירה של fibroblasts האנושי לתאים עצביים הנגרמים באמצעות מיקרוסקופ לעומת שלב () fibroblasts אדם שלושה ימים לאחר הדבקה עם OKSM -. וירוס סנדאי ויומיים לאחר תוספת של מדיום neuroinduction. תאים להראות מורפולוגיה כמו פיברובלסטים-טיפוסית. (ב) שבעה ימים שלאחר תאי דלקת עם מופע עד מורפולוגיה השתנתה. תאים מפוצלים כדי להפחית confluency באותו היום. עשרה יום (ג)לאחר זיהום ים רק תאים עם מורפולוגיה השתנתה נוכחים. (ד) ניתן למצוא מושבות כמו neuroepithelial-קטנות ראשונה 17 ימים לאחר ההדבקה. מושבות אלה להגדיל בגודל (E), וניתן למצוא תאי התבגרות (F) שלושה ימים לאחר מכן. תאים נאספים ביום 21 לאחר זיהום ושורות תאים להרחבה יכולים להיות שנוצרו מהם (GI). שיבוטים שונים מוצגים בקטע 1 (G), מעבר 3 (H) והקטע 10 (I) לאחר הקטיף, בהתאמה. סרגל = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. ניתוח של ביטוי עצבי תאי גזע סמן גנטי של cel העצבי שנוצרקווי l. מכתים נוגדן של שורות תאים לאחר 10 קטעים גילו כי תאים להביע סמני תא גזע העצביים Sox1, Sox2 (), כמו גם Nestin וPax6 (B). תאים הם שליליים עבור Oct4 סמן pluripotency מציין היעדר pluripotency (C). רוב תאי כתם חיובי עבור הסמן Ki67, אשר מציג מדינת שגשוג גבוהה (C). בר סולם = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. ניתוח של NPCs ביים לאחר התמיינות לשושלות עצביות וגליה. () כדי להשיג iNPCs מפרט העצבי הובדלו לשבעה ימים בנוכחות BDNF, GDNF, ויטמין C ומחנה. (ב) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן אנו מראים את הבידוד והמרה ישירה של fibroblasts האנושי לתאים עצביים ללא transgene להרחבה וצאצאיהם המובחנים כבסיס משוער לטיפול בתאים-החלפה או יישום בהקרנת סמים ניתוחים. המרת שושלת ישירה של תאים סומטיים לNPCs הושגה על ידי ביטוי בכפייה של שעתוק שושלת ספציפית גורמי 26,33,34. עם זאת, במקרים רבים fibroblasts העוברי שימש לניסויי transdifferentiation 33,34. עבור יישומים ביו השימוש בתאים אלה הוא לא כדאי כמקור תא זה מונע את השימוש הקליני לטיפול בתחליפי תא אוטולוגית. לאחרונה, מחקרים שפורסמו, המתארים את הדור של תאים עצביים מבשר בקלות רבה יותר נגיש רקמות, כגון תאי hematopoietic 43,44. הדור המוצלח של שורות תאי גזע עצביות tripotent יכול להיות מוצג לתאי B-נגזר דם עכברי ידי overexpr מושרהesion של שמונה transgenes 43. יתר על כן, Castano et al. פורסם גישה לאינדוקציה של אבות עצביים מתאי אדם hematopoietic באמצעות Sox2- וc-myc-סנדאי וירוס 44. הפרוטוקול מתואר מאפשר דור מהיר ויעיל של תאים עצביים מתאי דם טבורי CD133 +. עם זאת, כאשר הגיש בקשה להמרה של תאי דם היקפי mononuclear המבוגרים הפרוטוקול הניב יעילות נמוכה ויכולת הרחבת שורות תאים שנוצרו הייתה מוגבלת מאוד 44. כך, המחקר שפורסם רק בתאי דם היקפיים במערכת האנושית לתאריך 44 מראה בבירור את המגבלות של סוג תא המסוים הזה בניסויי המרה ישירים. מאז הזמינות של תאי חולה ספציפי חיונית להתחדשות תאי אוטולוגי, סוג התא המועדף עדיין מייצג fibroblasts המבוגר, אשר ניתן להפיק בקלות באמצעות ביופסית עור כפי שתואר במחקר שלנו.
Overexpression של transgenes הדרוש לtransdifferentiation יש בעיקר הושג על ידי וקטורים ויראליים אינטגרטיבית 26,33,34. זה מעכב את תחולתה של שורות תאים נגזרו עבור יישומים ביו מאז השילוב של הווירוסים לתוך הגנום המארח עלול להוביל לmutagenesis insertional או הפעלה מחדש לא רצויה של transgenes 7,8. Transdifferentiation לNPCs ללא ביטוי יתר transgene אבל מבוסס על טיפול כימי תואר לפיברובלסטים אנושיים 45. עם זאת, במחקר זה תאים המבשר אלה נכחו רק במצב חולף כמטרת המחקר הייתה הדור של תאים הבוגרים שוואן 45. לאחרונה, גישות ללא transgene אחרים המבוססות על יישום של וירוס סנדאי תוארו להמרה הישירה של פיברובלסטים אנושיים לNPCs 23,44 ונראה שהטקטיקה המועדפת למועד. לגזור NPCs הרחבה שיכולה להיות מובחנת בהמשך לשושלות עצביות וגליה,אנחנו מיישמים את ביטוי יתר של כל יאמאנאקה-הגורמים על ידי וירוס סנדאי יחד עם איון חום של וירוס 23 כמו גם זירוז עצבי על ידי תוספת של מולקולות קטנות לתקשורת והתרבות 22,31 עם שינויים חשובים כפי שתואר בחלק הבא.
אמנם, בידיים שלנו, פרוטוקול יעילות עבודה עם קווי פיברובלסטים רבים נבדקו, יש נטייה ברורה שההמרה הישירה של תאי פיברובלסטים מתורמים ותיקים מציגה תוצאת פוטנציאל שגשוג עניה ביעילות נמוכה של דור iNPC. אנו נצפו מושבה להרכיב את יעילות של עד 0.2% לאחר יעילות התמרה ויראלית של יותר מ -90% כלהישפט על ידי זיהום של תאים עם Oct4 הכתמה בלבד ולאחר מכן. יעילות זו על 3 פעמים גבוהה יותר מאשר בעבר פורסם 23.
היישום בדיוק המתואם של משרד הפנים נגיפיים מותאם הוא קריטי. אצווה לשונות אצווה בכייל נגיף סנדאייש להילקח בחשבון. מאז הווירוס בדרך כלל נרכש מסחרי, ניתן למצוא מידע הרלוונטי בדף הבית של היצרן. אנו ממליצים להשתמש במשרד פנים נמוכים יחסית של 3 ניסויי transdifferentiation.
תוספת של LIF אדם בידיים שלנו היא חיונית להתחדשות העצמית של קווי iNPC הוקמו כפי שתואר להתמיינות של תאי pluripotent אדם ל -31 NPCs. ללא תוספת של LIF, תאים מתחילים להבחין כבר בימים לאחר הנסיגה באופן בלתי-הפיך.
תא התרבות לאחר ההדבקה מתבצעת ב 39 מעלות צלזיוס ולא באמצעות 37 ° תנאי תרבית תאים סטנדרטיים C. עלייה בטמפרטורה זו מתחילה כבר יום אחד לאחר ההדבקה ומובילה לחום-איון של וירוס סנדאי. התרבות ב 39 מעלות צלזיוס עד 14 יום לאחר ההדבקה היא חיונית לדור של מושבות neuroepithelial.
למעשה, לפעמים מושבות iNPC לבוא תאוחרנה מהמתואר בסעיף הפרוטוקול. מניסיוננו, כל עוד התאים נשארים שגשוג הם יכולים להיות passaged polyclonally ומבודד על ידי קטיף ידני. שורות התאים הוקמו ממושבות אלה להראות נכסים דומים כפי שתוארו למושבות מתרחשות מוקדם.
במהלך הפיצול של שורות תאים הוקמו חשוב לא לזרע מספר קטן מדי של תאים כפי שהם דורשים קשר תא אל תא או אותות אוטוקריני להתרבות גם. אם תאים הם זורעים במדי התפשטות צפיפות נמוכה תחדל. במקרה זה, תאים יכולים להינצל על ידי replating על צלחת תרבית תאים עם משטח קטן יותר מחדש ליזום התפשטות.
לבידול גליה של iNPCs זה מאוד חשוב לזרע התאים בצפיפות גבוהה ולפצל אותם כאשר הצלחת היא כמעט ומחוברות. אם תאים מפוצלים מוקדם מדי, בידול בעיקר עצבי יקויימו.
תוכן "> התהליך המתואר בכתב היד הזה מטפח את הפוטנציאל להיות מיושם באופן למחצה או אוטומטי לחלוטין, שיהיה דרוש כדי להשיג את הפוטנציאל ביו-רפואי הרצוי, כוללים דוגמנות מחלה וטיפול בתחליפי תא. אוטומציה תאפשר גם כדאית בהיקף של עד יעיל וקבלה של הדור של תאים עצביים.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
ברצוננו להודות לכל החברים של תאי הגזע ורפואת רגנרטיבית הקבוצה מאוניברסיטת וירצבורג להצעות מועילות והרטינה גבהרט כמו גם הייקה Arthen לתמיכה טכנית מעולה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מדויטשה Forschungsgemeinschaft DFG (ED79 / 1-2), המשרד הגרמני לחינוך והמחקר BMBF (01 GN 0813), תאי מחקר בוואריה רשת המושרה pluripotent גזע "forIPS" ו" Stiftung Sibylle Assmus ". איור 1 הופק באמצעות אמנות רפואיות servier, זמינות מwww.servier.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Astrocyte media | ScienCell | 1801 | |
| B27 | LifeTechnologies | 17504-044 | |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| Biopsy Punch | pfm medical | 48301 | |
| cAMP | Sigma | A6885 | |
| CHIR99021 | Axon medchem | 1386 | |
| Collagenase Type2 | Worthington Biochemical | LS004177 | |
| Dispase | PAN | P10-032100 | |
| DMEM | LifeTechnologies | 41966-029 | |
| DMEM F12 | LifeTechnologies | 11320-033 | |
| DMSO | Roth | 4720 | |
| DPBS | LifeTechnologies | 14190-094 | |
| EGF | Life Technologies | PHG0313 | |
| FCS | Biochrom AG | 50115 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| Gentamicin | Sigma | G1397 | |
| GFAP-antibody | Dako | Z0334 | |
| GlutaMAX | LifeTechnologies | 35050-038 | |
| hLIF | Peprotech | 300-05 | |
| Insulin | Seralab | GEM-700-112-P | |
| Ki67-antibody | NeoMarkers | RM-9106-S | |
| L-Glutamine | LifeTechnologies | 25030-024 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| N2 | LifeTechnologies | 17502-048 | |
| Nestin-antibody | R&D Systems | MAB1259 | |
| Neurobasal | LifeTechnologies | 21103-049 | |
| Non-essential amino acids | LifeTechnologies | 11140-050 | |
| NSC freezing media | Sigma | C6295 | |
| Oct4-antibody | Santa Cruz | sc9081 | |
| Pax6-antibody | Covance | PRB-278P | |
| SB431542 | Invivogen | inh-sb43 | |
| Sendai virus: CytoTune Sendai Reprogramming Kit | LifeTechnologies | A1378001 | |
| Sodiumpyruvate | Life Technologies | 11360-039 | |
| Sox1-antibody | R&D Systems | AF3369 | |
| Sox2-antibody | R&D Systems | MAB2018 | |
| T3 | Santa Cruz | sc-205725 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| TUJ1-antibody | Covance | MMS-435P-250 | |
| Vitamin C | Sigma | A4544 | |
| Y27632 | Calbiochem | CAS 146986-50-7 | |
| β-Mercaptoethanol | LifeTechnologies | 21985023 |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Cai, J., Yang, M., Poremsky, E., Kidd, S., Schneider, J. S., Iacovitti, L. Dopaminergic neurons derived from human induced pluripotent stem cells survive and integrate into 6-OHDA-lesioned rats. Stem Cells Dev. 19 (7), 1017-1023 (2010).
- Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson’s disease. Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).
- Rhee, Y. H., et al. Protein-based human iPS cells efficiently generate functional dopamine neurons and can treat a rat model of Parkinson disease. J Clin Invest. 121 (6), 2326-2335 (2011).
- Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448 (7151), 313-317 (2007).
- Soldner, F., et al. Parkinson’s disease patient-derived induced pluripotent stem cells free of viral reprogramming factors. Cell. 136 (5), 964-977 (2009).
- Sommer, C. A., Stadtfeld, M., Murphy, G. J., Hochedlinger, K., Kotton, D. N., Mostoslavsky, G. Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 27 (3), 543-549 (2009).
- Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27, 2667-2674 (2009).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, 348-362 (2009).
- Montserrat, N., et al. Simple generation of human induced pluripotent stem cells using poly-beta-amino esters as the non-viral gene delivery system. J Biol Chem. 286 (14), 12417-12428 (2011).
- Warren, L., Nu, Y., Wang, J., Guo, X. Feeder-free derivation of human induced pluripotent stem cells with messenger RNA. Sci Rep. 2, 657 (2012).
- Bosnali, M., Edenhofer, F.
- Zhou, H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins. Cell Stem Cell. 4 (5), 381-384 (2009).
- Awe, J. P., et al. Generation and characterization of transgene-free human induced pluripotent stem cells and conversion to putative clinical-grade state. Stem Cell Res Ther. 4 (4), 87 (2013).
- Kadari, A., et al. Excision of viral reprogramming cassettes by Cre protein transduction enables rapid, robust and efficient derivation of transgene-free human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res Ther. 5 (2), 47 (2014).
- Vierbuchen, T., Ostermeier, A., Pang, Z. P., Kokubu, Y., Südhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
- Caiazzo, M., et al. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476 (7359), 224-227 (2011).
- Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476 (7359), 220-223 (2011).
- Ladewig, J., et al. Small molecules enable highly efficient neuronal conversion of human fibroblasts. Nat Methods. 9 (6), 575-578 (2012).
- Han, D. W., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into neural stem cells by defined factors. Cell Stem Cell. 10 (4), 465-472 (2012).
- Thier, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).
- Lu, J., et al. Generation of integration-free and region-specific neural progenitors from primate fibroblasts. Cell Rep. 3 (5), 1580-1591 (2013).
- Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Südhof, T. C., Werning, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (7), 2527-2532 (2012).
- Tian, C., et al. Direct conversion of dermal fibroblasts into neural progenitor cells by a novel cocktail of defined factors. Curr Mol Med. 12 (2), 126-137 (2012).
- Zhu, S., et al. Small molecules enable OCT4-mediated direct reprogramming into expandable human neural stem cells. Cell Res. 24 (1), 126-129 (2014).
- Hemmer, K., et al. Induced neural stem cells achieve long-term survival and functional integration in the adult mouse brain. Stem Cell Reports. 3 (3), 423-431 (2014).
- Conti, L., et al. Niche-independent symmetrical self-renewal of a mammalian tissue stem cell. PLoS Biol. 3 (9), e283 (2005).
- Elkabetz, Y., Panagiotakos, G., Al Shamy,, Socci, G., Tabar, N. D., Studer, V., L, Human ES cell-derived rosettes reveal a functional distinct early neural stem cell stage. Genes Dev. 22 (2), 152-165 (2008).
- Koch, P., Opitz, T., Steinbeck, J. A., Ladewig, J., Brüstle, O. A rosette-type self-renewing human ES cell-derived neural stem cell with potential for in vitro instruction and synaptic integration. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (9), 3225-3230 (2009).
- Li, W., et al. Rapid induction and long-term self-renewal of primitive neural precursors from human embryonic stem cells by small molecule inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (20), 8299-8304 (2011).
- Reinhardt, P., et al. Derivation and expansion using only small molecules of human neural progenitors for neurodegenerative disease modeling. PLoS One. 8 (3), c59252 (2013).
- Ring, K. L., et al. Direct reprogramming of mouse and human fibroblasts into multipotent neural stem cells with a single factor. Cell Stem Cell. 11 (1), 100-109 (2012).
- Zou, Q., et al. Direct conversion of human fibroblasts into neuronal restricted progenitors. J Biol Chem. 289 (8), 5250-5260 (2014).
- Aharonowiz, M., Einstein, O., Fainstein, N., Lassmann, H., Reubinoff, B., Ben-Hur, T. Neuroprotective effect of transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursor in an animal model of multiple sclerosis. PLoS One. 3 (9), e3145 (2008).
- Kim, H., et al. Immunomodulation by transplanted human embryonic stem cell-derived oligodendroglial progenitors in experimental autoimmune encephalomyelitis. Stem Cells. 30 (12), 2810-2829 (2012).
- Kondoh, T., Pundt, L. L., Blount, J. P., Conrad, J. A., Low, W. C. Transplantation of human fetal tissue from spontaneous abortions to a rodent model of Parkinson’s disease. Cell Transplant. 5 (1), 69-75 (1996).
- Takagi, Y., et al. Dopaminergic neurons generated from monkey embryonic stem cells function in a Parkinson primate model. J Clin Invest. 115 (1), 102-109 (2005).
- Kikuchi, T., et al. Survival of human induced pluripotent stem cell-derived midbrain dopaminergic neurons in the brain of a primate model of Parkinson’s disease. J Parkinson’s Dis. 1 (4), 395-412 (2011).
- Kirkeby, A., et al. Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions. Cell Rep. 1 (6), 703-714 (2012).
- Dezawa, M., et al. Specific induction of neuronal cells from bone marrow stromal cells and application for autologous transplantation. J Clin Invest. 113, 1701-1710 (2004).
- Izrael, M., et al. Human oligodendrocytes derived from embryonic stem cells: Effect of noggin on phenotypic differentiation in vitro and on myelination in vivo. Mol Cell Neurosci. 34 (3), 310-323 (2007).
- Cassady, J. P., et al. Direct lineage conversion of adult mouse liver cells and B lymphocytes to neural stem cells. Stem Cell Rep. 3 (6), 948-956 (2014).
- Castano, J., et al. Fast and efficient neural conversion of human hematopoietic cells. Stem Cell Rep. 3 (6), 1118-1131 (2014).
- Thoma, E. C., et al. Chemical conversion of human fibroblasts into functional Schwann cells. Stem Cell Rep. 3 (4), 539-547 (2014).
