Protocol
Alle experimentellen Verfahren wurden von der McLean Krankenhaus Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt. HINWEIS: Das folgende Protokoll beschreibt einen einzigen Ansatz für CPP und Bewegungssensibilisierung, viele Details, die unterscheiden sich von anderen erfolgreichen Protokolle (zB Licht- gegen Dunkelphasen-Tests, in Folge gegen intermittierende Verabreichung, etc.). Anfänger können mit diesen Protokollen zu beginnen wollen, oder einfach als Führer verwenden, Änderungen aus dem auf der Versuchs Frage (n) bei der Hand basiert Literatur anzupassen. Automatisierte Messmethoden werden beschrieben; jedoch ist es möglich, nicht-automatisierte Mittel für jeden Test zu verwenden (dh, Videoaufzeichnung, hand-scoring).
1. konditionierten Platzpräferenz
- Ausrüstung und Room Set-Up:
- Griff Versuchsmäusen für 1-3 min jeden Tag, für mindestens 3-5 Tage vor dem Test.
HINWEIS: Niemals Griff Mäusen kann die Entfernung aus der Kammer stre findenssful, das kann stören oder Anlage verändern. - Erhalten Sie vier oder mehr Drei-Kammer-CPP Apparaturen, vorzugsweise ausgestattet mit Lichtstrahlen für die automatisierte Datenerfassung 18. Stellen Sie sicher, dass jede Kammer hat zwei größere, seh- und taktil-verschiedene Kammern auf einen kleineren, neutral Kammer verbindet über Türen, die angehoben / abgesenkt werden kann Zugang zu kontrollieren. Deckel auf jeder Kammer sollte für Einfügen / Entfernen von Mäusen öffnen und mit kleinen, einzeln steuerbare (dimmbar) Beleuchtung (einer pro Kammer) montiert werden.
HINWEIS: CPP Kammer Designs variieren und können im Handel oder konstruiert, indem Forscher erworben werden. Für die "ausgewogene" Design, eine empfohlene Regelung ist eine größere Kammer mit weißen Wänden und Drahtgitterboden und das andere mit schwarzen Wänden und Balken Boden. Die mittlere Kammer sollte grauen Wänden haben und solide grau Plexiglas Boden. Für Erklärungszwecke werden diese Kammern als "weiß" bezeichnet werden, "schwarz" und "Mitte".Deckel sollte klar Plexiglas sein. Alternative Fach-Konfigurationen (Ein- oder Zweikammer) sind ebenfalls möglich und diskutiert anderswo (siehe Diskussion). - Richten Sie den Raum, wie es während der Prüfung sein wird: abschalten oder eingestellt Deckenbeleuchtung an die dunkelste Einstellung und die Tür schließen. Verwenden Sie einen Belichtungsmesser in jeder Kammer und legen Sie die Deckel Lichter, so dass Mitte Kammern etwas heller sind (15-20 Lux) als Schwarz-Weiß-Kammern (6-10 Lux), um Mäuse zu entmutigen von Zeit dort zu verbringen.
HINWEIS: Wenn die durchschnittliche Zeit, in der Mitte verbraucht, wie viel oder mehr als in den schwarzen oder weißen Kammern, erhöhen die Beleuchtungskontrast 1.1.3 in Schritt beschrieben. Alternativ können Sie auch weniger attraktiv Bodenbelag für den Mittel. (ZB ~ 220 0,5 cm Durchmesser Löcher, gleichmäßig in 6 x 3,5 x ¼ "Plexiglas Abstand), aber verhindern, dass diese Kammer aversiven. Pilot jede Änderung, um sicherzustellen, dass in der Mitte der Zeit abnimmt sind nicht wegen insgesamt Erkundungen (Kreuzungen) auf ein Absinken . - Program automatisierte Datenerfassung ( "Verfahren", 1A) oder manuell sammeln Daten entsprechend den folgenden Parametern. Set-Studien auf dem ersten Strahl Bruch in einer Konditionierungskammer zu starten. Stellen Sie "Test" Sitzungen 20 Minuten lang sein und Zeit investiert und Strahl Pausen in jeder Kammer zu verfolgen. Set "Konditionierung" Sitzungen zu 30 Minuten lang und (optional) Strahl bricht in jeder Kammer zu messen. Stellen Sie alle Kammer leuchtet während der Studie zu beleuchten.
- Bereiten voller Lautstärke von Kokain Lösung für das Experiment zur Hand erforderlich. Auflösen Kokain HCl in 0,9% NaCl (Kochsalzlösung), um die Endkonzentration auf einem Injektionsvolumen von 0,1 ml / 10 g Körpergewicht basieren (beispielsweise für eine Dosis von 5 mg / kg, Lösungskonzentration beträgt 0,5 mg / ml). Vortex Mischung für 30-45 sec, Sterilfilter (0,2 & mgr; m Spritzenfilter) und lagern bei RT.
- Griff Versuchsmäusen für 1-3 min jeden Tag, für mindestens 3-5 Tage vor dem Test.
- Testen:
HINWEIS: Die allgemeine Zeitplan für CPP ist PRE-TEST, Konditionierung unddann nach dem Test. Der Pre-Test kann von Anlage von 1-3 Tagen getrennt werden; jedoch Anlage und der Post-Test-Tag sollte an aufeinander folgenden Tagen nehmen (2A). Diese Zeitsteuerung sollte dieselbe für alle Kohorten im gleichen Experiment gehalten werden.- Test während der Lichtphase der Tiere der gleichen Vorrichtung für jedes Tier über Tage verwenden.
- Jeder Versuch Tag (dh, Tests und Anlage Tage), bewegen Mäuse auf die Verhaltens Vorraum und es ihnen ermöglichen, in ihre Käfige für 1 bis 1,5 Stunden vor dem Versuch ungestört sitzen. Wählen Sie einen Ort, wo Mäuse können schnell aus ihrem Käfig zu dem Gerät, mit minimaler Unterbrechung bewegt werden, wenn der Prozess beginnt. Schalten Sie alle Geräte so, dass alle Geräusche mit dem Test verbunden (zB Gerätelüfter) vorhanden sind.
- Reinigen Sie jedes Gerät (Innenwände, Fußböden und Böden) mit einem milden, alkohol-, Glykol-Ether-oder Ammoniakbasis Reinigungstücher vor und nach jeder Maus (mit dem same Art von Reinigungsmittel während des Experiments). Vernachlässigen Sie nicht Bodenbelag Unterseiten.
- Überprüfen Sie, dass die Raumbeleuchtung entsprechend gesetzt (ausgeschaltet oder gedimmt) zu Beginn eines jeden Tages.
- Fahren Sie mit der folgenden, je nachdem ob es sich um eine "Test" oder "Konditionierung" Tag:
- On Trial Tage 1 und 6 (dh die Pre- und Post-Tests), legen Sie die Zwischenkammer-Türen in der offenen Position (2B).
- Legen Sie die "Test" Computerprogramm und geben Sie Tier-IDs (1A), dann erteilen Startbefehl (1B), falls zutreffend.
- Sanft unteren jede Maus in die Mittelkammer der zugeordneten Vorrichtung, die Rückwand gegenüber, und leise den Deckel schließen. Nachdem alle Kammern geladen werden, lassen Sie die Testraum und Rauschen zu minimieren.
- Lassen Mäuse in jedem Gerät, bis Studien für alle Mäuse haben geschlossen / beendet (1C). Export-Studie.
<li> Kurz vor oder nach der Pre-Test, wiegen die Tiere. Verwenden Sie diese Gewichte für Dosisberechnungen während der Konditionierung.
- Damit Anlage Prüfungen vorzubereiten, berechnen jeder Pre-Test "Präferenz" der Maus für die Schwarz-Weiß-Kammern, die durch Zeit in jedem dieser von der anderen (dh "schwarz minus weiß" und "weiß minus schwarz" verbrachte subtrahiert, siehe Abbildung 3, Spalten 9 und 10).
- Da Mäuse mit starker Anfangseinstellungen schwierig abzugleichen, um eine akzeptable Grenze für Vorzugs Noten (zB <33% der gesamten Testzeit) etablieren und schließen Mäuse, die es aus Berechnungen übersteigen. Verwenden Sie einen liberalen Grenze (<66% der gesamten Testzeit) die Aufnahme zu maximieren, wenn Abrieb wahrscheinlich ist, nachdem die Tests abgeschlossen sind (zB aufgrund von Off-Target-chirurgische Manipulationen).
HINWEIS: Mäuse, denen das Limit überschreiten, können noch getestet werden, mit dem Versuch, ihre Pre-Test-Einstellungen im Gleichgewicht zu halten. Später tiese Mäuse können von der Analyse ausgeschlossen werden, falls notwendig, vorgeTestErgebnissen auszugleichen. Wenn extreme Pre-Test-Verzerrungen (dh> 800 sec) überproportional einer Gruppe beeinflussen, sollten Sie die Anlage Umgebungen zu verändern und / oder mit anderen Tests. - Wählen Sie die schwarze oder weiße Kammer als Medikament Paarung Kammer für jede Maus, mittlerweile Summieren der entsprechenden Vortest Vorlieben Noten innerhalb jeder Gruppe mit den folgenden Prioritäten zu beachten:
HINWEIS: Achten Sie darauf, Werte zwischen Gruppen innerhalb jeder Kohorte sowie über etwaige frühere Kohorten auszugleichen.- Nehmen Sie die Summen für alle Gruppen als gleichwertig wie möglich.
- Nehmen Sie die Summen so nahe wie möglich bei Null (dh wählen die bevorzugte Seite für einige Mäuse und der nicht bevorzugten Seite für andere). Wenn ein Nahe-Null-Summe für einen bestimmten Gruppe nicht möglich ist, neu zu justieren alle anderen zu eng um das beste erhältliche Punktzahl für den Grenz Gruppe entsprechen, Begünstigung leicht negativ Gruppe fasst überpositiv.
- So viel wie möglich, halten Zuweisungen von Schwarz gegen Weiß und bevorzugt im Vergleich zu nicht bevorzugten Kammern für Drogen Paarungen auch innerhalb jeder Gruppe.
- Da es nicht immer möglich ist, die oben genannten Ziele zu erreichen, korrigieren Sie alle Abweichungen von gegenläufigen Ausgleichs Überlegungen in späteren Kohorten zu machen; aber versuchen Kohorten mit extrem unterschiedlichen durchschnittlichen Pre-Test-Einstellungen zu vermeiden, produzieren.
- Auf Anlage Tage 2-5, legen Zwischenkammer-Türen in der geschlossenen Position (2C).
- Bereiten einzelnen Spritzen mit Kokain (Tag 2 & 4) oder Kochsalzlösung (Tage 3 & 5) Lösung, wie in Schritt 1.1.5 und basierend auf dem Körpergewicht bei Pre-Test gemessen.
HINWEIS: Die Dosis sollte in der Einleitung, und potenzielle Boden und Decke genannten Effekte im Hinblick auf experimentelle Erwartungen Erwägungen gewählt werden. Oft ist es am besten an unabhängige Experimente durchführen unter Verwendung von mindestens zwei verschiedenen Dosierungen. - Load "conditioning "Computerprogramm und geben Sie Tier-IDs (1A), geben dann Befehl starten (1B), falls zutreffend.
- Scruff und jede Maus (ip) injiziert, sie sofort in die entsprechende schwarze oder weiße Kammer der ihnen zugewiesenen Gerät Absenken der Rückwand gegenüber, dann leise den Deckel schließen. Nachdem alle Kammern geladen werden, lassen Sie die Testraum und Rauschen zu minimieren.
- Entfernen Mäuse vor ihrer Kammer so nahe genau 30 min wie möglich (dh die erste Mäuse aus ihren Kammern entfernt werden, während andere Mäuse noch Anlage sind). Entfernen Tiere so leise wie möglich, ohne Lärm einzuführen.
- Wählen Sie eine Methode der Analyse. Entweder subtrahieren Zeit auf der Kochsalzlösung gepaart Seite während der Post-Test von Zeit aufgewendet auf der Kokain-gekoppelten Seite während der Post-Test (Kokain - Kochsalzlösung, s) oder die Zeit, in der Post-Test-Arzneimittel-gepaart Kammer verbracht verwendenminus der Pre-Test-Zeitaufwand für die drogen gepaart Kammer.
Hinweis: Wenn die erste Methode, die auch Handlungsstrang Graphen der durchschnittliche Verweildauer in der Mitte, saline- und drogen gepaart Kammern während der Pre- und Post-Tests für jede Gruppe. Im Vergleich zu den vor der Prüfung sollte der Post-Test zeigen eine erhöhte Zeit in der Drogen gepaart Seite und sank Zeit in der Kochsalzlösung gepaart Seite ausgegeben (siehe Bild 6, unten und Diskussion für nähere Informationen). - In Abhängigkeit von der Art und Anzahl der verglichenen Gruppen, mit einem t-Test, Ein- oder Zweiweg-Varianzanalyse, soweit angemessen, gegebenenfalls mit Post-hoc-Analyse, zu analysieren, eine der oben dargestellten Subtraktion Partituren.
HINWEIS: Cocaine bevorzugt Partituren neigen variabel zu sein, und darüber hinaus kann negativ sein (dh, zeigen Abneigung gegen das Medikament gepaarten Seite). Mäuse, die Abneigung zeigen, sollten nicht entfernt werden (es sei denn, sie statistische Ausreißer sind), da diese Resultat normal und wahrscheinlich wichtiger ist es, Unterschiede zwischen gr auf die Bestimmungoups. Erwarten Sie, um Stichprobengrößen von 12 bis 30 Tieren pro Gruppe müssen, abhängig von der Effektstärke der Behandlung.
2. Locomotor Sensibilisierung
- Ausrüstung und Room Set-Up
- Besorgen Sie sich einen 4 x 8 (X x Y) photobeam Array (Außenmaße 11,5 "x 20"). Konstruieren Sie einen oben offenen Kammer aus schwarzem Plexiglas (Innenmaße 22 1/6 "x 13 ¾" x 9 3/8 ") zur Unterbringung der Array (4A).
- Bereiten Sie die Testraum, so dass ein rotes Licht (Decken- oder Wandmontage) können während des Tests verwendet werden.
- Bereiten separates Programm Sitzungen für die tägliche Gewöhnung und Spritzversuche.
- Eingestellt Gewöhnungsversuche zwischen 30-60 min und Spritzversuche zu sein zwischen 60-120 min (5B) zu sein. Die empfohlene Länge für jeweils 60 min. Halten Versuch Länge konsistent über mehrere Jahrgänge im gleichen Experiment.
- Set Studien Reco zu startenrding auf dem ersten Strahl Bruch, der das Startsignal erfolgt, nachdem eingeleitet wurde (5B). Für die Injektion Versuch, setzen Sie das Startsignal, so dass Boxen einzeln gestartet werden kann (nicht im Gleichklang), wenn möglich.
- Set Strahl bricht aufgezeichnet in benutzerdefinierten "Bins", vorzugsweise jeweils 5 min (5B) zu werden.
- Bereiten voller Lautstärke von Kokain Lösung für das Experiment zur Hand erforderlich. Auflösen Kokain HCl in 0,9% NaCl (Kochsalzlösung), um die Endkonzentration auf einem Injektionsvolumen von 0,1 ml / 10 g Körpergewicht basieren (beispielsweise für eine Dosis von 5 mg / kg, Lösungskonzentration beträgt 0,5 mg / ml). Vortex Mischung für 30-45 sec, Sterilfilter (0,2 & mgr; m Spritzenfilter) und lagern bei RT.
- Testen
HINWEIS: Die erste Phase der Prüfung für 10 bis 11 aufeinanderfolgenden Tagen läuft. Die Mäuse erhalten täglich zwei Studien: Gewöhnung (spritzfrei) und Injektion. Verwalten Kochsalzlösung für die ersten drei bis funsere Tage (Beiträge zu Bedeutung der Salz Gewöhnung sehen), und Kokain für die nächsten sieben die gleiche Dosis mit (z. B. 15 mg / kg / Tag).- Jeden Tag akklimatisieren Mäuse in ihre Käfige zur Verhaltens Vorraum für 30 min bis 1 h.
- Bereiten sauber Standard-Maus-Größe klaren Acryl-Gehäuse Käfige mit einer extrem dünnen Schicht von frischem Bettzeug (zB Kiefer-Chips), so dass nicht obskuren Lichtstrahlen, falls zutreffend (4C & D).
- Ort Käfige gegen die Y-Achse der photobeam Array nahe einem Ende, so dass fünf Strahlen beabstandet sind gleichmäßig entlang seiner Länge. X-Achsen-Balken werden in diesem Test (4C & D) verwendet.
- Nehmen Mäuse aus ihren eigenen Käfig, in zufälliger Reihenfolge, Genick und gewogen. Entfernen Sie jede Maus vom wiegen Boot durch die Basis ihres Schwanzes (mit Unterstützung) und Ort direkt in den ihnen zugewiesenen Bewegungs Käfig. Cover jede Käfig mit einem Standard-Filter-Deckel.
- Bereiten einzelnen Spritzen with Kochsalzlösung oder Kokain, wie in Schritt 2.1.7 beschrieben, bezogen auf das Körpergewicht des aktuellen Tages. Beginnen Sie mit einer Dosis von 15 oder 20 mg / kg, und betrachten einen zweiten Versuch mit einer höheren oder niedrigeren Dosis (siehe Beiträge zu relevanten Faktoren).
- Sobald Gewöhnung Studien für alle Käfige beendet haben, den Einspritz Programm laden.
- Einer nach dem Entfernen Mäuse aus ihren Testkäfig, Genick und geben ihre Injektion (ip). Bevor Sie die Maus an seinen Testkäfig zurückkehrte, initiieren schnell das Startsignal für den Käfig (5C, unten).
- Nachdem alle Spritzversuche beendet haben, kehren Mäuse in ihre Heimatkäfige und ihre Wohnraum.
- Falls gewünscht, lassen Mäuse eine Reihe von Wartezeiten und Drogen Herausforderungen, wie die folgenden zu unterziehen: gleiche Dosis wie original, halbe Dosis, Doppel-Dosis, dann Kochsalzlösung, so dass sieben Tage vor dem gleichen Dosis Herausforderung und drei Minuten vor sieben Tage vor jeder zusätzliche Herausforderung. Unabhängig von der Wahl der Herausforderungen, der Wartung desn ähnlich Wartezeiten über Kohorten innerhalb eines Experiments.
HINWEIS: Wenn die ursprüngliche Dosis hoch (beispielsweise 30 mg / kg oder darüber) ist, sollte der doppelten Dosis mit einer niedrigeren Dosis ausgelassen oder ersetzt werden. Die Salz Herausforderung zeigt jede Anlage Bewegungs Aktivierung durch den Kokain-gekoppelten Umwelt allein, und in den Prozess, die Menge der sensibilisierten Fortbewegung, die Kokain-abhängig (siehe Diskussion) ist.
- Statistische Analyse
- Wähle den Abschnitt (e) von jedem Versuch, die für die Analyse verwendet wird. Die meisten Kokain-induzierte Fortbewegung bei Nagern erfolgt innerhalb der ersten ~ 15-30 Minuten nach der Injektion von Medikamenten. Je nach beteiligten Variablen, betrachten die Analyse kumulative Fortbewegung für mehrere Zeitfenster (zB die ersten 15, 30, 60 und / oder 120 Minuten) oder konzentrieren sich auf unabhängige Segmente der Studie.
- Mit dem Zeitrahmen gewählt, fassen die Strahlpausen für jedes Tier am Tag für Gewöhnung und Spritzversuche getrennt und dann eineverage die Summen für jede Gruppe. Plot Mittelwerte und Standardfehler des Mittelwerts (SEM) in einem Liniendiagramm über alle Tage. Als Behandlungen verändern können, wie Mäuse auf das Medikament reagieren früh und / oder spät in jeder täglichen Versuch, zeichnen auch durchschnittliche Gruppenstrahl bricht durch 5-min bin im Laufe eines jeden täglichen Studie.
HINWEIS: Trägt man die tägliche Aktivität Durchschnittswerte für Gewöhnung und Spritzversuche (zB ersten 15 min) macht es erscheinen künstlich, dass die Fortbewegung von Kochsalzinjektion gedämpft, aber nicht vergessen, dass die Aktivität hat (wahrscheinlich) verringerte sich auf diesem Niveau bis zum Ende der Gewöhnung jeden Tag . - Analysieren aufeinanderfolgenden Kochsalzlösung und Drogentherapie Tage separat mit wiederholten Messungen (RM) ANOVAs mit der Innersubjektfaktor von Tag / Uhrzeit und einschließlich aller Zwischensubjektfaktoren bei der Gestaltung, als angemessen. Verwenden Sie einen t-Test oder One-Way ANOVA Gruppenunterschiede am Tag 1 von Kokain (akute Exposition) und einer multivariaten Varianzanalyse für die Herausforderungen zu untersuchen. Gegebenenfalls folgen significance mit Post-hoc-Tests oder Univariate ANOVAs.
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Representative Results
Repräsentative Ergebnisse aus der CPP-Test sind in Abbildung 6 Wildtyp C57BL / 6N Mäuse bei etwa 9 Wochen von Alter gezeigt. Das Studiendesign war eine 2 x 3 gemischt Fakultät, mit einem innerhalb Subjekt-Variable Test (Pre- und Post) und ein Zwischensubjekt variable Behandlung (Kochsalzlösung und Kokain 5 und 10 mg / kg). A RM ANOVA zeigten eine signifikante Wechselwirkung zwischen Test and Treatment (F 2,20 = 3,68, p <0,05), die an die Stelle der signifikanten Haupteffekte für beide Test (F 1,20 = 9,86, p <0,01) beobachtet wurde interpretiert und Behandlung (F 1,20 = 4,37, p <0,05). Post-hoc-Vergleiche zeigten, dass keine der Gruppen voneinander während der Pre-Test unterschied. Bei der post-Test, der 5 mg / kg und 10 mg / kg unterschieden sich nicht signifikant voneinander; Jedoch zeigten beide Gruppen deutlich höhere Präferenz für das Kokain gepaarten Kammer als der Kochsalzlösung-Kontrollgruppe nur (Tukey: 5 mg / kg, p <0,5; 10 mg / kg, p &# 60; 0,01). Darüber hinaus zeigte Post Bonferroni-Hoc-Tests, dass sowohl die 5 (p <0,05) und 10 (p <0,05) mg / kg Gruppen zeigte eine größere Vorliebe für die Kokain-gekoppelten Seite bei Post-Test im Vergleich zu Pre-Test, während die Salz -saline Gruppe zeigte keine Veränderung von prä- zu post-Test.
Repräsentative Ergebnisse aus den Bewegungs Assays sind in 7A & B Wildtyp C57BL / 6N littermate Kontrollmäusen aus einer Reihe von verschiedenen Experimenten unter Verwendung gezeigt, die zuvor 18 veröffentlicht wurden. Nach Akklimatisierung an Kochsalzinjektionen für 3-4 Tage erhielten die Mäuse eine Kokain Injektion (ip) bei 5, 10, 15 oder 30 mg / kg pro Tag für sieben Tage. Nach einer sieben oder 14-tägige Widerrufsfrist erhielt jede Gruppe eine Kokain Herausforderung bei der ursprünglichen Dosis, dann nach einer weiteren (variabel) Wartezeiten, einige zusätzliche Kokain Herausforderungen in anderen Dosen erhalten, wie dargestellt. Für den Zweck, die Wirkung von Kokain zeigt Dosis auf LOCOMotor Sensibilisierung in der aktuellen Publikation, die vier verschiedenen Dosisgruppen wurden in einem 4 x 7 Mixed-Fakultät Design vereinigt, mit einem innerhalb Subjekt-Variable Day (ersten 7 Kokain-Injektionen) und einen Zwischensubjektfaktor von der Dosis. Ein RM ANOVA zeigte eine signifikante Wechselwirkung zwischen Dosis und Tag (F 18.276 = 12,53, p <0,0001), die anstelle von signifikanten Haupteffekte interpretiert wurde, die auch für beide Tage (F 6276 = 18,25, p <0,0001) und Dosis beobachtet wurden ( F 3,46 = 22,63, p <0,0001). Tukey post hoc Analyse zeigte signifikante Unterschiede insgesamt zwischen 5 und 15 mg / kg (p <0,0001), 5 und 30 mg / kg (p <0,0001), und 10 und 15 mg / kg (p <0,01). Eine Reihe von signifikanten Unterschiede wurden beobachtet, wenn Gruppen jeden Tag verglichen. Der bekannte hier sind Unterschiede für Tag 1 Cocaine (5 vs. 30 mg / kg, p <0,01; 10 vs. 30 mg / kg, p <0,05; 15 vs. 30 mg / kg, p <0,01) und 7. Tag Kokain ( 5 vs. 10 mg / kg, p <0.05; 5 vs. 15 mg / kg, p <0,0001; 10 vs. 15 mg / kg, p <0.01; 15 vs. 30 mg / kg, p <0,0001). 7C zeigt Mock Figuren die wichtigsten Aspekte des Bewegungssensibilisierung darstellt, die Menge Behandlungsgruppen unterscheiden. Während diese Merkmale unabhängig hier dargestellt sind, ist es auch möglich, davon unterschiedlichen Kombinationen zu beobachten.
Abbildung 1. Med PC CPP Grundsitzungssteuerung. (A) Standard-Display, offene Sitzung Symbol (roter Kasten), und offene Sitzung Dialogfeld (kleines Bild). Wählen Sie "individuelle Dateinamen" und verwenden Ordnerfenster Datenordner und benennen Sie die Sitzung zu navigieren. Wählen Sie die entsprechende Programm aus dem "Verfahren" Drop-Down-Liste. Für jedes Feld im Einsatz, Box-Nummer überprüfen und relevante Informationen in Subjekt, Experiment ein und Gruppenfelder. (B) Lastkammer Display, Signalsymbol (blauer Kasten) beginnen, und senden Zeichenal Dialogfeld (kleines Bild). Sobald alle Kammer Daten eingegeben wurde, wählen Kammern Startsignal geladen und Ausgabe werden. Chambers wird nun Strahlpause ausgelöst werden, um die Session-Timer zu starten und Daten zu sammeln. (C) Ended Sitzungsanzeige. Da jede Kammer mit dem gewünschten Programm abgeschlossen ist, wird die Datensammelgebiet (green box) statisch geworden und die Kammer Informationsbereich (orange Box) wird Kammern zeigen als "geschlossen". Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. CPP Kammerkonfiguration. (A) Probenversuchszeitlinie. Pre-Test wird durch täglich wechselnde Kokain (grau) und Kochsalzlösung (weiß) Anlage Sitzungen gefolgt. Post-Test wird 24 Stunden nach der letzten Anlage Sitzung durchgeführt. ( B) Offene Kammer Konfiguration für den Einsatz in Pre- und Post-Test-Sessions. Beachten Sie, dass inter-Kammertüren in der angehobenen / geöffnet sind. (C) geschlossen Kammer Konfiguration für den Einsatz in Anlage Sitzungen. Beachten Sie, dass manuelle Türen abgesenkt werden, ohne Zugang zwischen den Kammern. Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Balanced Konstruktionsberechnungen für CPP. Beispielrechnungen und Ziele zeigt, wenn vor der Testergebnisse in CPP Ausgleich. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 4. Locomotor Kammerkonfiguration. (A) Außenkammer besteht aus schwarzen undurchsichtigen Box in der der Strahl-Array fest sitzt (B). Wohnen / Schuhkarton große Kammern sollte mit einer dünnen Schicht aus Einstreu (C) und ausgerichtet gefüllt werden, so dass Strahlen gleichmäßig entlang der Längsachse (D) verteilt sind. Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Locomotor Kammer Rechnerbetrieb. (A) Standard-Computerprogramm. Neue Sitzungsdatenbank (blauer Kasten und Kasten). Umbenennen von Dateien und Verzeichnissen für jedes Experiment (blaue Unter kleines Bild). Erstellen Sie neue Sitzung (rotes Feld und kleines Bild) mit eindeutigen Kennung. Sitzung bearbeiten (rot kleines Bild) und enter Tierkennungsinformationen in der Kammer Register (grüne Box und kleines Bild) und für jeden Sitzungstyp (Orange Box) Steuer stoppen Start / eingerichtet. (B) Wählen Sie die entsprechende Start-Stopp-Steuerung für jeden Sitzungstyp. Stellen Intervalllänge bis 300 Sekunden (5 Minuten bin) und 12 Intervalle pro Phase (1 Std Sitzung). Für Gewöhnung Sitzungen (links), wird Kammern ausgelöst werden im Gleichklang zu starten (manuell Phase aktivieren ... Alles in Unison) und beginnt mit der Überwachung für die Aktivität unmittelbar nach dem ersten Strahl Pause beginnen. Für die Injektion Sitzungen (rechts), wird Kammern einzeln angesteuert werden (manuell Phase aktivieren ... Individuell Bildschirm Tasten) und beginnt mit der Überwachung für die Aktivität unmittelbar nach dem ersten Strahl Pause beginnen. Beide Sitzungstypen wird enden, wenn die gesamte Phasenzeit für jede Kammer einzeln abgelaufen ist. (C) Sobald die Sitzung gestartet wurde, Gewöhnung Sitzungen können durch Auswahl des "start all" Knopf (oben) gestartet werden. Beachten Sie, dass nach triggEring, alle Kammern für erste Strahl Pause warten Sitzung zu beginnen. Injektionseinheiten können jede Kammer unabhängig voneinander gestartet werden (unten). Beachten Sie, dass nach einzelnen Kammern Triggerung (während Tier aus der Kammer zur Injektion ist), wird Kammern für den ersten Strahl Pause warten Sitzung zu beginnen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6. Repräsentative CPP Ergebnisse. (Top) In CPP, Mäuse zeigten eine signifikante Präferenz für eine Kammer zuvor mit Kokain gepaarten (entweder 5 oder 10 mg / kg), während Mäuse, die Kochsalzlösung Paarungen in beiden Kammern erhielten keinerlei Präferenz zu entwickeln. Spalte Abkürzungen bezeichnen signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen von dem markierten bar im Vergleich zu dem bekannten Gruppe am gleichen Test timir zeigen. (Unten) von Zeit in Kokain im Vergleich mit Kochsalzlösung gepaart Kammern während des Vor- und Nach-Tests ausgegeben Plotten Erhöhungen der Kokain gepaarten Seite in den 5 und 10 mg / kg Gruppen gesehen werden, die auf Kosten der Zeit sind verbrachte sowohl in der Kochsalzlösung gepaart und mittleren Kammern. Im Gegensatz dazu gab es keine markanten Unterschiede in der Zeit in jeder Kammer zwischen Pre- und Post-Tests in der Kochsalzkontrollgruppe ausgegeben. Die präsentierten Daten als Mittelwert ± SEM. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 7. Repräsentative Bewegungssensibilisierung Ergebnisse (A) Kumulative Strahlpausen für die ersten 20 Minuten von jeder täglichen Prüfung für vier separate Dosen. 5, 10, 15 und 30 mg / kg in Wildtyp-Mäusen, gefolgt von gleichgeschlechtlicher, Halb- doppelklicken Dosis eind Salz Herausforderungen, modifiziert nach (18). Alle Gruppen erhielten gleich Dosis Herausforderungen entweder ein (10, 15, 30 mg / kg) oder zwei (5 mg / kg) Wochen nach der letzten Exposition Kokain. Einige Gruppen erhielten weitere Herausforderungen, die mit variablen Wartezeiten durchgeführt. (B) Plot von Bewegungsdaten (Strahlen Pausen) summiert, um 5-min bin für den täglichen Prüfungen während der 15 mg / kg Kokain Sensibilisierung Experiment. (C) Illustrationen Unterschiede in Bewegungs Sensibilisierung für zwei Behandlungsgruppen zeigt, die durch die Anlage vorwiegend angetrieben werden (links) akute Kokain Antwort Unterschiede, (Mitte) eine Sensibilisierungsrate Differenz oder (rechts) Unterschiede in maximal Sensibilisierung. Die präsentierten Daten als Mittelwert ± SEM. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Dieses Protokoll zeigt, Methoden für konditionierte Platzpräferenz und Bewegungssensibilisierung, von denen jede durch die durchschnittliche Labor verwendet werden können Aspekte der Arzneimittel-induzierte Verhaltens Plastizität zu beurteilen. Wie bei den meisten Verhaltenstests gibt es zusätzliche würdigen Überlegungen über die grundlegenden Protokoll. Erstens kann jede dieser Techniken als mit zwei Phasen, Induktion und Expression konzipiert werden. "Induction" umfasst die Entwicklung des Verhaltens-für CPP es während Anlage auftritt, und für die Sensibilisierung ist es der Anfangszeitraum von (in der Regel in Folge) Drogen Expositionen. "Expression" für CPP ist die Post-Test, während für die Sensibilisierung kann es als Medikament Herausforderung entweder nach dem Herausziehen oder einfach als das letzte Mal in Folge Belichtung gegeben definiert werden.
Es lohnt sich, zu einer dieser Phasen im Vergleich zu anderen Grenz Manipulationen zu prüfen, um besser auf ihre möglichen Auswirkungen zu analysieren. Viren mit zeitlich begrenzten Wirksamkeit (zB HSV) oder Drogen Co-Verwaltungen / Vorbehandlungen (zB Agonisten / Antagonisten) sind bei diesen Bemühungen. Bei diesen Ansatz kann es weiterhin nötig sein, komprimierte Protokolle zu verwenden, so dass eine bestimmte Phase besser mit viralen Expressionszusammenfällt. Für CPP ist es möglich, eine zweitägige Konditionierungsverfahren durchzuführen, wie wir zuvor 37 beschrieben haben. Speziell für Bewegungssensibilisierung, Änderungen in der Wartezeit zwischen Induktion und Ausdruck mit diesen Methoden kombiniert, können Prozesse in der Instandhaltung oder die Stabilität des Verhaltens beteiligt aufzudecken. Darüber hinaus können diese Ansätze verwendet werden, um das Phänomen der Kreuzsensibilisierung zu studieren, wo ein sensibilisiertes Verhalten wird ein Medikament induziert verwendet, kann aber durch Bestrahlung mit einem anderen Medikament ausgedrückt werden. Seit Überkreuz-Sensibilisierung zwischen allen sensibilisierend Drogen tritt nicht kann, entlocken ein Verhalten sensibilisiert, die etwas von der ursprünglichen abweicht, und unbedingt bidirektional ist nicht fürjeder gegebenen Menge von Drogen, so kann seine Prüfung einzigartige Möglichkeiten bieten, wo und zu verstehen, wie verschiedene Medikamente Plastizität des Gehirns und die Funktion beeinträchtigen.
Die richtige Interpretation der CPP, insbesondere, hängt davon ab, alternative Erklärungen der Ergebnisse auszuschließen. Die Daten, die in einem Dreikammergerät sollte weiter vor Abzug der Zeit in der Kochsalzlösung gepaart Seite von der Kokain-gekoppelten Seite bei Post-Test als Präferenz ausgegeben Definition überprüft werden, da eine Erhöhung in einer Vorliebe für das Medikament gepaarten Seite, ausschließlich aus einer Abnahme in der Zeit ergibt sich die Kochsalzlösung gepaart Kammer verbracht wird wahrscheinlich ungeeignet für eine solche Auslegung. Die mittlere Kammer ermöglicht für dieses Ergebnis, da die Maus dort verbrachte Zeit anstelle des Drogen gepaart Kammer verändern können. Es ist auch möglich, erhöhte Zeit in dem Medikament gepaarten Seiten auf Kosten der mittleren Kammer anstelle der Kochsalzlösung-gepaarten Seiten verbracht zu beobachten; wohl, kann immer noch das Ergebnis akzeptabel Ausleted als eine Erhöhung der Arzneimittel Vorlieben. Die Einbeziehung der dritten Kammer bietet eine neutrale Kammer, die bei Pre- und Post-Testsitzungen 41 unvoreingenommene Platzierung des Tieres ermöglicht. Obwohl nützlich für die Adressierung anfänglichen Platzierung spannt einen Beitrag zur Test-Tag Partituren, wird die dritte Kammer nicht für Anlage erforderlich. Alternative CPP Entwürfe, die zeigen sich zwei Fächer oder ein einzelnes Fach mit unterschiedlichen Reizkonfigurationen werden an anderer Stelle 41-42 diskutiert.
Alle Defizit an Ort und Stelle Präferenz für ein Medikament sollte auch nach Einschätzungen der beiden Fähigkeit begleitet werden kontextbezogene Verbände und allgemeine Belohnungsfunktion zu lernen. Es gibt eine Reihe von Anpassungen, die an den CPP Paradigma gemacht werden kann, dass können Helfer bei der Interpretation der veränderten Vorlieben, einschließlich der Hervorspringen des UCS-Modifikation (Arzneimittel) durch Erhöhen (oder Verringern) der Anzahl der Paarungen oder mit höheren oder niedrigeren Arzneimittel Dosis. CPP kann mit schmackhafter fo durchgeführt werdenod (zB hohe Fett, Zucker) oder soziale Interaktionen zu beurteilen, ob die beobachtete Veränderung spezifisch für Arzneimittel oder ist relevant für natürliche Belohnungen; Nicht-CPP nähert sich für diesen Zweck nützlich intrakraniellen Selbststimulation, Saccharose bevorzugt, und / oder appetitive Ansatz Aufgaben gehören. Allerdings unterscheiden sich alle diese Optionen in ihrer Fähigkeit, ausreichend um die gewünschte Frage ehen. Lebensmittel-basierte CPP können besonders vorteilhaft, da normale Reaktionen eine Fähigkeit demonstrieren mit einem natürlichen Belohnung entsprechenden Kontext Vereinigungen zu lernen und zu bilden. Zusätzliche Kontrollen zur Bewertung der Lernfähigkeit sind Aufgaben, die auf kontextbezogene Lern / Speicher (kontextuellen Angstkonditionierung und CPA) verlassen. CPA hat den Vorteil, ähnlich wie CPP ausgeführt wird, oft in der gleichen Kammer, die mit einem Medikament appetitive aversive Erfahrung zu ersetzen (beispielsweise Lithiumchlorid-Injektion). Tiere, die Defizite in der CPP zeigen, aber normal CPA, demonstrieren die Fähigkeit, angemessen kontextuellen Vereinigung zu bilden,s, die in Beeinträchtigungen Medikament CPP wahrscheinlich belohnen beziehen sich auf (drogenspezifische oder anderweitig) gibt an, dass. Eine Warnung für CPA unter Verwendung von Lithiumchlorid zu prüfen ist, ob dieses Medikament eine bekannte Behandlung für jede Bedingung, die von den Versuchstieren modelliert werden kann. Zum Beispiel Lithium Behandlung wurde im Mausmodell von Fragile-X-43, Lerndefiziten entgegenwirken gezeigt, die dieses Steuerverfahren verwechseln würde.
Neben dem klassischen CPP Paradigma, gibt es potenzielle Erweiterungen Benutzer nützlich, wie Tests Aussterben der gelernt drogen Zusammenhang Verein und seine Wiedereinsetzung nach CPP finden kann. Anlage Reaktionen (CR), einmal etabliert, kann über einen längeren Zeitraum 19,20 beibehalten werden, wenn die Tiere ungestört gelassen werden. Trotz der relativen Persistenz der CR, kann sie wirksam durch wiederholte Präsentationen des CS (Kontext) in Abwesenheit des UCS (drug) gelöscht werden. Zwei CPP Aussterben Methoden werden in der literatur: wiederholte Testbelichtung ohne 21 Injektion oder Wieder Paarungen der zuvor drogen gepaart Seite mit Fahrzeug 22. Extinction Prozesse reflektieren neue Lernen, wie zu "Verlernen" des ursprünglichen Anlage gegenüber, einer Idee effektiv durch demonstriert "Wiedereinsetzung". Wiedereinsetzung ist klassisch ausgelöst durch Re-Exposition gegenüber der UCS, die Wiederherstellung des CR erzeugt. Im Zusammenhang mit der CPP, eine einzige Injektion des Trainings Medikament bewirkt, dass Tiere Platzpräferenz zu zeigen. Interessanter viele Nicht-Ausbildung Droge Hinweise können auch Wiedereinsetzung von CPP, einschließlich Grundierung mit alternativen Medikamenten 22 und einer Vielzahl von Stressfaktoren 23-26 erzeugen. Aussterben und Wieder Experimente sind von besonderem Interesse für die Drogenabhängigkeit Feld als Modelle der medikamentösen Behandlung und Rückfall. Interventionen, die die Rate des Aussterbens und / oder Verringerung der Größe der Wiedereinstellung verbessern könnten wertvolle Ziele für die menschliche pharmacotherapies sein.
(zB 27-29). Bemerkenswert ist jedoch, kontextunabhängigen Sensibilisierung hat eindeutig in anderen Studien nachgewiesen (zB 30-32). Experimentelle Details, ob ein Kontext-abhängige Zunahme der Sensibilisierung beitragen beobachtbar sind Medikamentendosis, Belichtungsdauer, ob irgendeine Gruppe für die Test o transportiert werden müssenf Sensibilisierung und bestimmte Aspekte von Pre-Exposition gegenüber der Testkammer; Allerdings bleiben diese Details etwas unklar. Eine Methode des Beitrags der kontextuellen Sensibilisierung bestimmen, ist eine Kochsalz Herausforderung Sensibilisierung 33 folgende Medikament zu geben. Die Verwendung der beschriebenen Paradigma minimiert den Beitrag der kontextabhängigen Sensibilisierung wie durch sehr wenig Bewegungsaktivierung in früheren Studien auf Salz Herausforderung belegt. Das Kontext Beitrag zur Sensibilisierung hat in einer Reihe von Papieren überprüft worden ist, oft mit Diskussion von Verhaltensweisen andere als die Bewegungsaktivität 34.
Zur Vermeidung von Verschmutzungen Arzneimittel-induzierte Aktivierung und Sensibilisierung mit den Bewegungs begrenzen Effekte induziert durch eine neue Umgebung Stimulierung werden die Mäuse zu Kochsalzinjektionen akklimatisiert für drei bis vier Tage zu Beginn jedes Experiments. Wie Mäusen typischerweise in Abbildung 7 zu sehen ist, zeigen reduzierten Fortbewegung zwischen dem ersten undletzte Salz Akklimatisierung Tag. Darüber hinaus sind die Mäuse merklich ruhigeren und leichter zu handhaben und durch die letzte Kochsalzbelichtungs injizieren. Vorherige Arbeiten haben mehrere Stämme und Genotypen von Mäusen mit diesem Paradigma getestet und nicht viel Varianz in Kochsalzlösung Akklimatisierung Aktivität über sie sehen; Allerdings ist es möglich, gelegentlich sehr starke Hyperaktivität Phänotypen mit bestimmten Genotypen assoziiert beobachten, dass diese Methode nicht überwinden verwenden. unter Zugrundelegung der zuletzt Kochsalzinjektion Tag Daten in diesen Fällen kann es wünschenswert sein, mehrere Kochsalzlösung Akklimatisierung Tag durchzuführen (bis Fortbewegung Plateaus in der hyperaktiven Gruppe) und dann auf die hyperaktiven Gruppe zur Kontrollgruppe zu normalisieren. Während nicht optimal, können sie für eine sinnvollen Vergleich der Wirkungen eines Arzneimittels auf die Fortbewegung zwischen diesen Gruppen. Weitere Möglichkeiten, die extreme Hyperaktivität zerstreuen kann die Gewöhnung Versuch Länge vor der Injektion jeden Tag mit ein bis fünf Stunden, und / oder eine längere Spritzversuche zu verlängern (2-4 h) each Tag.
Es gibt noch weitere Überlegungen, die bei der Auslegung des Bewegungsverhalten wichtig sind. Wie in 7C dargestellt ist, beobachtet Gruppenunterschiede in erster Linie von Unterschieden in der akuten Bewegungsantwort, die Rate der Sensibilisierung über Tage, die maximale Grenze der Sensibilisierung oder eine Kombination dieser Faktoren werden angetrieben. Parsen der Beitrag dieser Faktoren einzeln kann hilfreich sein. Zu diesem Zweck kann die akute Reaktion Bewegungs statistisch allein analysiert werden. Dann kann die Geschwindigkeit der Sensibilisierung beurteilt werden, um ein Programm, das Kurve mit Montage und einer Geschwindigkeit Normalisierungsprozess, die keine akuten Bewegungs Unterschiede diskontiert wird. Veränderte maximale Sensibilisierung ist in der Regel in einem RM ANOVA über die aufeinander folgenden Arzneimittelexposition Tagen offenbart, in dem Follow-up-Tag-für-Tag Post-hoc-Vergleiche signifikant sind an den Tagen nach der Gruppenantworten ein Plateau haben. Man sollte sich bewusst sein, dass die maximale Sensibilisierung kann nicht ermittelt werdenfür jede Gruppe, die eine lineare Bewegungsantwort über Arzneimittelexposition Tage, wie dargestellt in 7C unterhält (Mitte; blaue Linie). In einem solchen Fall kann Arzneimittelexposition verlängert maximale Sensibilisierung zu versuchen und zu bestimmen.
Schließlich ist es typischerweise am besten Sensibilisierung zwischen den Gruppen zu vergleichen in getrennten Kohorten von Tieren unter Verwendung von mindestens zwei primäre Arzneimitteldosen durchgeführt. Unterschiede in irgendeinem der obigen Aspekte der Bewegungsaktivierung, mit einer einzigen Dosierung oder beide sollten weitere Tests zur Führung verwendet werden, um andere Erklärungen auszuschließen, einschließlich Änderungen in der Entwicklung von Stereotypie. Wiederholte Exposition gegenüber einigen Arzneimitteln, wie Kokain und Amphetamin, produziert nicht nur sensibilisierte Fortbewegung in einer Dosis-abhängigen Weise, aber sensibilisiert auch stereotype Verhalten konkurrieren. Diese Stereotypien werden besonders offenkundig bei hohen Dosen, so dass Bewegungssensibilisierung ist oft ganz oder teilweise verdeckt, sondern offenbarte erneut bei der Verabreichung voneine geringere Dosis. Aus diesem Grund wird ein "Defizit" in Bewegungs Sensibilisierung in einer Versuchsgruppe kann tatsächlich erhöhte Empfindlichkeit gegenüber dem Arzneimittel-induzierte Entwicklung von Stereotypien reflektieren. Die Beurteilung der Stereotypie kann eine Herausforderung sein, aber es gibt eine Reihe von veröffentlichten Skalen 35 und andere Ansätze 36. Sowohl eine allgemeine Stereotypie Skala und eine Bewertung der spezifischen Verhaltensweisen Verwendung wird empfohlen, wie bereits 18 veröffentlicht.
Im Ergebnis wurden eine Reihe von Verhaltenstests wurde in Tiermodellen in einem Versuch entwickelt, um die Komplexität der menschlichen Sucht zu analysieren. Konditionierten Platzpräferenz und Bewegungssensibilisierung gibt zwei grundlegende Tests weit in Nagetieren verwendet, beziehungsweise können sie als besonders nützlich bei der Beurteilung der frühen Wirkstoff-assoziierten Belohnung und die anhaltende durch die wiederholte Verwendung induzierter Plastizität. Es gibt eine Reihe von Überlegungen für den Entwurf und Auslegung der einzelnen Art der Studie, so dass es worthwhile sorgfältig die experimentelle Ziele und bisherigen Literatur berücksichtigen, wenn diese Bewertungen Planung.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Die Autoren danken Karen Dietz und Shari Birnbaum zum vorherigen Eingangs auf Verhaltens Design-Überlegungen und Lauren Peca für die Hilfe bei Verhaltenstests. Die Autoren erkennen auch die großzügige Unterstützung der Simons Foundation (Simons Stiftung Autism Research Initiative Zuschuss zu CWC), NIDA (DA008277, DA027664 und DA030590 zu CWC, F32DA027265 zu LNS und F32DA036319 zu RDP), die FRAXA Forschungsgemeinschaft und Eleanor und Miles Shore Fellowship Program (Stipendium Unterstützung LNS) und die John Kaneb Fellowship Program (Stipendium Unterstützung MT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cocaine Hydrochloride USP | Mallinckrodt Pharmaceuticals | 0406-1520 | Purchase and use (Schedule II controlled substance) for research purposes requires compliance and licensure according to state and federal law. |
| Conditioned Place Preference, Three Compartment Apparatus with Manual Doors and Lights for Mouse | Med-Associates Inc. | MED-CPP-MS & MED-CPP-3013 | Our laboratory has used these boxes; however, many alternative boxes are available & acceptable. |
| PAS-Home Cage Activity Monitoring Photobeam Arrays | San Diego Instruments | 2325-0223 & 7500-0221 | Our lab houses these arrays inside of custom built chambers, as described in the text. There are alternatives available. |
| Disposable Sani-Cloth disenfecting wipes | PDI | 13872 |
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