Protocol
모든 실험 절차는 맥린 병원 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 참고 : 다음 프로토콜은 다른 성공적인 프로토콜 (예를 들어, 라이트 - 대 어두운 상 시험, 연속 대 간헐적 투여 등)과 다른 많은 세부있는 CPP와 전위의 민감성에 하나의 접근 방법을 설명합니다. 초보자는 손에서 실험 질문 (들)을 기반으로 문헌에서 변화 적응, 이러한 프로토콜로 시작하거나 가이드로 사용하실 수 있습니다. 자동화 된 측정 방법이 설명되어 있습니다; 그러나, 각각의 분석 (예를 들어, 비디오 녹화, 손 득점) 비 자동화 된 수단을 사용할 수있다.
1. 에어컨 장소 환경 설정
- 장비 및 객실 설정 :
- 시험을하기 전에 적어도 3-5일를 들어, 1-3 분 매일 실험 쥐를 처리합니다.
참고 :-처리하지 마십시오 마우스는 챔버 헤어 구조 강화에서 제거를 찾을 수 있습니다ssful, 방해하거나 에어컨을 변경할 수있다. - 바람직하게는 자동화 된 데이터 수집 (18) photobeams을 갖춘 네 개 이상의 세 챔버 CPP 장치를 얻습니다. 확인 각 챔버가 제기 될 수있다 문을 통해 작은, 중간 챔버에 연결하는 두 개의 큰하여 시각 및 촉각-별개의 챔버를 가지고 / 액세스를 제어 할 수 낮췄다. 각 챔버의 뚜껑은 마우스의 삽입 / 제거 열립니다 작은, 개별적으로 제어 (디밍) 등 (챔버 당 하나)에 장착 될 수있다.
주 : CPP 챔버 설계는 다양하고 시판 구입 또는 연구자에 의해 구성 될 수있다. "균형 잡힌"디자인, 추천 방식은 하나의 큰 흰 벽과 와이어 그리드 바닥 챔버와 검은 색 벽과 바 바닥으로 다른 것입니다. 중간 챔버는 회색 벽과 단단한 회색 플렉시 유리 바닥이 있어야합니다. 설명을 목적으로,이 챔버 "는"흰색 "블랙"및 "중간이라고한다."뚜껑은 명확 플렉시해야한다. 다른 구획 구성 (1 또는 2 챔버) (토론 참조) 다른 곳도 가능하고 논의한다. - 설치는 테스트 중에있을 것 같은 방 : 전원을 끄거나 가장 어두운 설정으로 머리 위의 조명을 설정하고 문을 닫습니다. 중간 챔버가 시간을 보내는에서 쥐를 억제하기 위해 검은 색과 흰색 실 (6 ~ 10 룩스)보다 (15 ~ 20 룩스) 약간 밝게되도록 각 챔버 내부의 빛 측정기를 사용하고 뚜껑 등을 설정합니다.
주 : 중간 소비 된 평균 시간만큼 또는 검은 색 또는 흰색의 챔버보다 크면, 상기 단계 1.1.3에 기재된 조명 콘트라스트를 증가시킨다. 또한, 중간 덜 매력적인 바닥을 사용합니다. 하지만, 그 중간 시간에 감소하기 위해이 챔버 어떤 변화 혐오. 파일럿을 피하기 총 탐험 감소로 인해 수 없습니다 (횡단) (예를 들면은, ~ 220 0.5 cm 직경의 구멍이 균일하게 6 × 3.5 X ¼ "플렉시 글라스에 간격) . - 피자동화 된 데이터 수집 ( "절차"그림 1A)를 rogram 또는 수동으로 다음과 같은 매개 변수에 따라 데이터를 수집합니다. 설정 시험 중 하나를 조절 실에서 제 1 빔 휴식에 시작합니다. 설정 "테스트"세션의 길이는 20 분 할하고 각 챔버에 소요되는 시간 및 빔 휴식을 추적 할 수 있습니다. 설정 "조절"세션은 각 실에 빔 나누기를 측정 (옵션) 30 분 길이 될 수 있습니다. 재판 중 조명 모든 실 등을 설정합니다.
- 손에 실험에 필요한 코카인 솔루션의 전체 볼륨을 준비합니다. 0.1 ml / 10 g 체중의 주입량에 최종 농도로써 0.9 %의 NaCl (생리 식염수)에 코카인 염산을 용해 (5 ㎎ / ㎏의 투여 량에 대해, 예를 들면 용액의 농도는 0.5 ㎎ / ㎖ 임). RT에서 소용돌이 30 ~ 45 초 동안 혼합, 살균 필터 (0.2 μm의 주사기 필터) 및 저장.
- 시험을하기 전에 적어도 3-5일를 들어, 1-3 분 매일 실험 쥐를 처리합니다.
- 테스트 :
참고 : CPP의 일반 타임 라인은 PRE-TEST, 컨디셔닝 및다음 POST-TEST. 예비 시험 1 내지 3 일까지 에어컨으로부터 분리 될 수있다; 그러나, 에어컨 및 사후 테스트 일 연속 일 (그림 2A)에 개최한다. 이 타이밍은 동일한 실험에서 모든 집단에 대해 동일하게 유지되어야한다.- 일간에 걸쳐 각 동물에 동일한 장치를 이용하여 동물의 광 위상 동안 시험.
- 각 시험 날 (즉, 테스트 및 컨디셔닝 일), 행동 대기실에 마우스를 이동하고 재판 전에 1.5 시간 동안 자신의 홈 새장에 그대로 앉아 할 수 있습니다. 재판이 시작되면 마우스가 최소한의 중단, 장치에 자신의 케이지에서 신속하게 이동할 수있는 위치를 선택합니다. 시험 (예를 들면, 장비 팬)와 관련된 잡음이 존재 있도록 모든 장비의 전원을 켭니다.
- 철저하게 각 장치 (내부 벽, 바닥과 트레이) 경도와 청소, 알코올, 글리콜 에테르 - 또는 암모니아 기반 소독 이전과 이후 물티슈 각 마우스 (SAM을 사용하여실험을 통해 청소기의 전자 형). 방치 바닥 밑바닥하지 마십시오.
- 확인의 객실 조명은 하루의 시작 부분에 (해제 또는 흐리게) 적절하게 설정된다.
- 를 진행합니다 다음은 "테스트"또는 "조화"하루 여부에 따라 :
- 시험 일 1과 6 일 (즉, 사전 및 사후 검사)는 개방 위치 (그림 2B)에 간 실 문을 배치합니다.
- (해당되는 경우) 다음 (그림 1B)를 시작 명령을 발행, "테스트"컴퓨터 프로그램을로드하고 동물 ID를 (그림 1A)를 입력합니다.
- 다시 벽에 직면 할당 된 장치의 중간 챔버로 각 마우스 조심스럽게 이하, 부드럽게 뚜껑을 닫습니다. 모든 챔버가로드되면, 검사실두고 잡음을 최소화한다.
- 각 장치 내부에 마우스를 남겨 모든 쥐에 대한 실험 (그림 1C)를 종료 / 닫을 때까지. 내보내기 시험 자료.
<리> 직전에 또는 사전 테스트에 따라, 동물의 무게. 에어컨 동안 선량 계산이 가중치를 사용합니다.
- (즉, "블랙 마이너스 화이트"& "흰색 마이너스 블랙"다른에서 이들 각각에 소요되는 시간을 뺀 흑백 챔버 각 마우스의 사전 테스트 "기본 설정"을 계산, 조절 시험을 준비하기 위해; 참조 그림 3, 열 9 & 10).
- 강력한 초기 설정으로 마우스 어렵게 균형을 확인하기 때문에, (예를 들어, <총 시험 시간의 33 %) 선호도 점수에 대한 허용 한계를 설정하고 계산에서 초과 마우스를 제외합니다. 마찰 가능성이있을 때 테스트가 완료된 후 (때문에 오프 대상 수술 조작에, 예를) 포함을 극대화하기 위해 자유 제한 (<총 시험 시간의 66 %)를 사용합니다.
주 : 한계를 초과 마우스는 여전히 자신의 균형을 사전 테스트 환경을 유지하기위한 시도로, 테스트를 할 수있다. 나중에, t필요한 경우 HESE 마우스는 사전 테스트 점수를 균형, 분석에서 제외 될 수있다. 극단적 인 사전 테스트 바이어스 (즉,> 800 초) 불균형 한 그룹에 영향을 미칠 경우, 컨디셔닝 환경을 변경 및 / 또는 다른 분석을 사용하는 것이 좋습니다. - 각 마우스에 대한 약물 페어링 실 같은 검은 색 또는 흰색 실을 선택, 그 사이에 마음에 다음과 같은 우선 순위와 각 그룹 내에서 대응하는 사전 테스트 환경 점수를 합산 :
주 : 각 집단 내에서뿐만 아니라 이전의 집단에서 집단 간의 점수의 균형을주의하십시오.- 가능한 한 동등한 모든 그룹에 대한 금액을 확인합니다.
- 가능한 제로 (즉, 일부 마우스 및 다른 사람에 대한 비 바람직한 측면의 바람직한면을 선택)에 가까운 금액을 확인합니다. 거의 제로 합이 주어진 그룹 불가능한 경우 약간 마이너스 그룹 위에 합산 선호 밀접 제한 기위한 최선 얻어지는 점수 맞게 다른 모든 재조정양.
- 만큼 가능한, 흰색, 심지어 각 그룹 내에서 약물 짝 비 선호 챔버 대 바람직 대 블랙의 할당을 유지합니다.
- 그것을 상기 목표를 달성하는 것이 항상 가능한 것은 아니기 때문에, 이후의 코호트 대향 균형을 고려함으로써 편차를 보정; 그러나, 격렬하게 서로 다른 평균 사전 테스트 환경과 동료를 생산하지 않도록하려고합니다.
- 컨디셔닝 일 2-5에서 폐쇄 위치 (그림 2C)에서 인터 실의 문을 배치합니다.
- 코카인 개별 주사기를 준비 (일 2 & 4) 또는 식염수 단계 1.1.5에 설명하고 사전 테스트에서 측정 된 체중을 기반으로 (일 3 & 5) 솔루션.
참고 : 용량은 실험의 기대에 관해서는, 소개에서 언급 한 고려 사항 및 잠재적 인 바닥과 천장 효과를 선택해야합니다. 또한, 적어도 두 개의 다른 투여 량을 사용하여 독립적 인 실험을 수행하는 것이 최상이다. - 로드 "C해당되는 경우 onditioning "컴퓨터 프로그램을 입력 동물 ID를 (그림 1A)를 선택한 다음, (그림 1B)를 시작 명령을 실행합니다.
- 목덜미는 부드럽게 뚜껑을 닫고 즉시 다시 벽에 직면 할당 된 장치의 적절한 검은 색 또는 흰색 챔버로 저하, 각 마우스 (IP)을 주입합니다. 모든 챔버가로드되면, 검사실두고 잡음을 최소화한다.
- (다른 마우스는 여전히 에어컨 동안 즉, 첫 번째 쥐가 자신의 방에서 제거)로 가능한 정확하게 30 분에 자신의 챔버에서 쥐가 가까이 제거합니다. 소음을 도입하지 않고, 조용히 가능한 한 동물을 제거합니다.
- 분석의 방법을 선택합니다. 어느 시점부터 사후 테스트 중에 식염수 쌍 측에 소요 빼기 시간은 사후 테스트 (코카인 - 식염수, 초) 동안 코카인 쌍 측에 지출 또는 사후 테스트의 약물 쌍 챔버에서 보낸 시간을 사용마이너스 사전 테스트 시간은 약물 쌍의 챔버에 보내었다.
참고 : 첫 번째 방법을 사용하는 경우, 평균 시간도 플롯 선 그래프는 각 그룹에 대한 사전 및 사후 시험 중에 중간, 생리 식염수와 약물 쌍 실에서 보냈다. 사전 테스트에 비해 사후 테스트는 약물 쌍의 측면에서 증가 된 시간을 표시하고 식염수 쌍 측 (설명을 그림 6, 바닥 및 토론 참조)에 소요되는 시간을 감소해야한다. - 자연 및 그룹의 개수에 따라 비교되는 것은, t 시험을 사용하여, 1 또는 2 웨이 ANOVA, 상기 제시 감산 스코어를 분석 할 가능성 사후 분석 적절.
주 : 코카인 기본 점수 변수 경향, 또한, (즉, 약물 - 쌍이 측면 혐오 나타냄) 네가티브 일 수있다. 이 결과는 GR 사이의 차이를 결정하는 정상 및 가능성이 중요하기 때문에 혐오감을 표시 마우스는, (그들은 통계적 이상치하지 않는 한) 제거 할 수 없습니다한다oups. 치료 효과의 크기에 따라 그룹별로 12-30 동물의 샘플 크기를 필요로 할 것으로 예상된다.
2. 운동력이 과민성
- 장비 및 룸 설정
- 4 × 8 (X x 및 y) photobeam 배열 (외부 치수 11.5 "× 20")을 얻었다. 블랙 플렉시 유리로 만들어진 오픈 얹어 실 구축 (내부 크기를 22 1/6 "X 13 ¾"X 9 3/8 ") 배열 (그림 4A)를 수용 할 수.
- 레드 라이트 (천장에 또는 벽에 설치)를 테스트하는 동안 사용할 수 있도록 테스트 룸을 준비합니다.
- 매일 습관화 및 사출 시험을위한 별도의 프로그램 세션을 준비합니다.
- 설정 요법 이니 시험은 60-120 분 (그림 5B) 사이에 30 ~ 60 분, 주입 실험 사이 여야합니다. 각각의 권장 길이는 60 분입니다. 같은 실험에서 여러 동료 일관성 재판 길이를 유지합니다.
- 설정 시험은 RECO을 시작합니다시작 신호 (그림 5B) 개시 후 발생하는 제 1 빔 휴식시 rding. 주입 시험의 경우, 가능하면 박스 (하지 일체) 개별적으로 시작할 수 있도록하는 시작 신호를 설정합니다.
- 집합 빔 나누기 "빈"사용자 정의에 기록되는, 바람직하게는 5 분마다 (도 5b).
- 손에 실험에 필요한 코카인 솔루션의 전체 볼륨을 준비합니다. 0.1 ml / 10 g 체중의 주입량에 최종 농도로써 0.9 %의 NaCl (생리 식염수)에 코카인 염산을 용해 (5 ㎎ / ㎏의 투여 량에 대해, 예를 들면 용액의 농도는 0.5 ㎎ / ㎖ 임). RT에서 소용돌이 30 ~ 45 초 동안 혼합, 살균 필터 (0.2 μm의 주사기 필터) 및 저장.
- 테스트
주 : 시험의 초기 단계는 10 ~ 11 일 연속 실행됩니다. 습관화 (사출 무료) 및 사출 : 마우스는 두 매일 재판을받을 수 있습니다. F에 처음 세에 대한 식염수를 관리같은 용량 (예., 15 ㎎ / ㎏ / 일)를 사용하여 다음 7에 대한 우리의 일 (식염수 습관화의 중요성에 대한 토론을 참조), 코카인.- 매일, 1 시간 30 분 동안 행동 대기실에 자신의 홈 케이지에서 마우스를 적응.
- 신선한 침구 (예를 들면, 소나무 칩)의 매우 얇은 층으로 깨끗 표준 마우스 크기의 명확한 아크릴 주택 새장을 준비하지 모호한 photobeams하기 위해, 해당되는 경우 (그림 4C & D).
- 다섯 빔의 길이를 따라 균등하게되도록 한쪽 끝 근처 photobeam 배열의 Y 축에 대한 장소 케이지. X 축 광선이 시험 (도 4C 및 D)에서 사용되지 않는다.
- 임의의 순서로, 목덜미에, 자신의 홈 케이지에서 마우스를 가져다 무게. 직접 할당 된 운동 케이지에 자신의 (지원) 꼬리와 장소의 시설에 의하여 무게 보트에서 각 마우스를 제거합니다. 표준 필터 상단 뚜껑 각 케이지를 커버.
- w 개별 주사기를 준비당일의 체중에 기초하여, 단계 2.1.7에서 설명 된 바와 같이 i 번째 코카인이나 생리 식염수 용액. 15 또는 20 ㎎ / ㎏의 투여 량으로 시작하고, 더 높거나 더 낮은 투여 량을 사용하여 두 번째 실험을 고려 (관련 요소에 대한 논의 참조).
- 습관화 시험은 모든 새장을 위해 종료되면, 사출 프로그램을로드합니다.
- 한번에 한 그들의 시험 케이지 목덜미에서 쥐를 제거 및 주입 (IP)을 얻었다. 그 테스트 케이지에 마우스를 반환하기 전에 신속하게 케이지 (그림 5C, 아래)의 시작 신호를 시작합니다.
- 모든 주입 시험이 종료 한 후, 자신의 홈 케이지 및 주택 방에 마우스를 반환합니다.
- 7 일 동일한 복용량 도전 전에 3 내지 7을 있도록 식염수 후 원래의 절반 용량 이중 용량, 동일 량 : 원하는 경우, 마우스는 다음과 같은 인출 기간 및 약물 도전 일련 받도록 허용 각각의 추가 도전하기 전에 일. 무엇이든 도전의 선택을, maintai실험 집단 내에서 N과 유사한 금단 기간.
주 : 원래 투여 량은 높은 (예를 들어, 상기 30 ㎎ / ㎏ 또는) 인 경우, 이중 용량 스킵 또는 저용량으로 대체되어야한다. 식염수 도전 형 코카인 쌍이 환경에 의한 조절 된 운동 활성을 계시하고, 그 과정에서, 코카인 의존 민감화 운동력의 양 (설명을 참조).
- 통계 분석
- 분석에 사용되는 각 시험의 부분 (들)을 선택합니다. 설치류 가장 코카인 유발 운동은 제 ~ 15-30 분 후 약물 주입 내에 일어난다. 여러 시간 윈도우 (예를 들면, 제 15, 30, 60 및 / 또는 120 분)에 대한 누적 운동을 분석, 관련 변수를 고려 따라 또는 재판의 독립적 인 부분에 초점을 맞 춥니 다.
- 프레임이 선택된 시간을 사용하여, 별도로 다음 습관화 및 주입 시험을 위해 하루 각 동물에 대한 빔 휴식을 요약각 그룹에 대한 합계 verage. 플롯을 의미하고 모든 일 선 그래프의 평균 (SEM)의 표준 오차. 치료 마우스, 초기 및 / 또는 후기 각 매일 시험에서 약물에 반응하는 방법을 변경할 수있는 바와 같이 각 매일 재판의 과정을 통해 5 분 빈에 의해 평균 그룹 빔 나누기를 플롯.
참고 : 습관화 및 주입 시험을위한 일상 활동 평균 (예를 들어, 처음 15 분) 플로팅는 인위적으로 그 운동이 생리 식염수 주입에 의해 약화되어 나타납니다,하지만 (대부분) 그 활동이 기억 요법 이니의 마지막 하루가이 수준으로 감소한다 . - 개별적으로 반복 측정은 (RM) ANOVAs가 적절하게 설계의 모든 간 주제 요소를 포함한 일 / 시간의 내 - 과목 요인을 갖고 사용하여 연속 식염수와 약물 치료 일을 분석합니다. 코카인 (급성 노출)의 1 일에 그룹의 차이, 그리고 도전에 대한 다변량 분산 분석을 조사하기 위해 t 검정 또는 편도 ANOVA를 사용합니다. 적절한 경우, significanc를 수행사후 검사 또는 단 변량 ANOVAs와 전자.
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Representative Results
CPP 분석의 대표적인 결과는 대략 세의 구주를 야생형 C57BL / 6N 마우스를 사용하여 그림 6에 표시됩니다. 연구 설계 시험 (전후)의 내 - 과목 변수로, 2 × 3 혼합 요인이었고,이 치료 (생리 식염수와 코카인 5, 10 ㎎ / ㎏)의 변수를 사이에-과목. RM ANOVA 두 시험에서 관찰 유의 한 주 효과 대신에 해석 된 테스트 및 치료 (F 2,20 = 3.68, P <0.05) 사이에 유의 한 상호 작용을 보여 주었다 (F 1,20 = 9.86을, P <0.01) 및 치료 (F 1,20 = 4.37, P <0.05). 사후 비교는 그룹 중에 사전 검사 중에 서로 차이가없는 것으로 나타났다. 사후 테스트에서, 5 ㎎ / ㎏, 10 mg을 / kg은 서로 유의 한 차이가 없었다; 10 ㎎ / ㎏, P & 5 ㎎ / ㎏, P <0.5 : 그러나, 두 그룹은 식염수 전용 대조군보다 코카인 쌍 챔버에 대한 훨씬 더 선호 (Tukey에의했다# 60; 0.01). 또한, 본 페로 니 사후 시험 보여 주었다 모두 5 (p <0.05), 염수 중에 열 (p <0.05) ㎎ / ㎏ 군은 사전 테스트에 비해 시험 후에서 코카인 쌍이 측보다 선호했다 -saline 그룹은 사전에서 사후 테스트에 변화가 없었다.
전위의 분석에서 대표 결과는 이전에 18 게시 된 별도의 일련의 실험에서 야생형 C57BL / 6N의 한배의 새끼 제어 마우스를 사용하여도 7a & B에 표시됩니다. 3-4일에 대한 식염수 주입에 적응 한 후, 마우스는 이레 동안 하루에 5, 10, 15, 30 ㎎ / ㎏에 하나의 코카인 주입 (IP)을 받았다. 일곱 또는 14 일 철수 기간 후, 각 그룹 그림과 같이 다음 추가 (변수) 철수 기간 후, 일부는 다른 용량에서 추가 코카인 도전을 받아 원래의 용량으로 코카인 도전을 받았다. locom 코카인 투여의 효과를 입증 할 목적으로OTOR 현재 발행물의 과민성, 네 가지 투여 그룹으로, 4 × 7 혼합 요인 설계로 결합 된 내-과목의 날 (첫 번째 7 코카인 주사)의 변수 및 투여 량의 간 주제 요인. RM ANOVA 대신도 모두 날 관찰되었다 유의 한 주 효과의 해석 된 용량과 날 사이에 상당한 상호 작용 (F 18276 = 12.53, P <0.0001)를 보였다 (F 6,276 = 18.25, P <0.0001) 및 용량 ( F 3,46 = 22.63, P <0.0001). Tukey에의 사후 분석은 5, 15 ㎎ / ㎏ (P <0.0001), 5, 30 ㎎ / ㎏ (P <0.0001), 10 및 15 ㎎ / ㎏ (P <0.01) 사이에 상당한 전반적인 차이를 보였다. 그룹이 매일 비교했을 때 유의 한 차이의 수는 관찰되었다. 그리고 7 일 코카인 (1 일 코카인 (, 10 대 30 ㎎ / ㎏, P <0.05 15 대 30 ㎎ / ㎏, P <0.01 5 대 30 ㎎ / ㎏, P <0.01)에 대한 차이는 여기에 주목 5 대 10 ㎎ / ㎏, P <0.05 5 대 15 ㎎ / ㎏, P <0.0001 10 대. 15 ㎎ / ㎏, P <0.01; 15 대 30 ㎎ / ㎏, P <0.0001). 그림 7c는 양 치료군 다를 수 있습니다 전위의 감작의 주요 측면을 설명하는 모의 수치를 보여줍니다. 이러한 기능은 독립적으로 여기에 도시되어 있지만, 이들의 조합의 차이를 관찰 할 수있다.
그림 1. 메드 PC CPP 기본 세션 제어. (A) 기본 디스플레이, 오픈 세션 아이콘 (빨간색 상자), 오픈 세션 대화 상자 (삽입). "사용자 정의 파일 이름"을 선택하고 데이터 폴더로 이동하여 세션의 이름을 폴더 창을 사용합니다. "절차"드롭 다운 목록에서 해당 프로그램을 선택합니다. 사용의 각 상자, 상자 번호를 확인하고 제목, 실험 및 그룹 상자에 관련 정보를 입력합니다. (B)로드 실 디스플레이는 신호 아이콘 (파란색 상자)을 시작하고 로그인을 보내알 대화 상자 (삽입). 일단 모든 실 데이터가 입력 된 선택 챔버는로드 문제가 신호를 시작합니다. 챔버는 현재 세션 타이머를 시작하고 데이터를 수집하는 빔 브레이크에 의해 트리거 될 것이다. (C) 종단 세션이 표시됩니다. 각 챔버는 지정된 프로그램을 완료, 데이터 수집 영역 (녹색 상자) 정적이 될 것와 같이 챔버 정보 영역 (오렌지 박스) 챔버를 보여줄 것이다 "고." 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
2. CPP 챔버 구성을 그림. (A) 샘플 실험 타임 라인. 사전 테스트는 매일 교대 코카인 (회색)과 식염수 (흰색) 에어컨 세션옵니다. 시험 후 마지막 컨디셔닝 세션 후 24 시간을 실시한다. ( 사전 및 사후 테스트 세션에서 사용하기위한 B) 열기 챔버 구성. 인터 실의 문이 제기 / 열려있는 위치에 있습니다. (C) 에어컨 세션에 사용되는 폐쇄 챔버 구성. 수동 문 챔버 사이에 접근 저하되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
CPP. 예 계산 및 목표 CPP에 미리 시험 점수의 균형을 보여주는 그림 3. 균형 잡힌 설계 계산. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
ig4.jpg "/>
그림 4. 운동력 회의소 구성. (A) 외부 챔버 빔 배열이 딱 맞는 (B)하는 내부 블랙 불투명 한 상자로 구성되어 있습니다. 빔이 균일하게 장축 (D)를 따라 분포되도록 주택 / 신발 상자 크기의 챔버 침구의 얇은 층 (C) 가득 정렬되어야한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. 운동력 상공 회의소 컴퓨터 작동. (A) 기본 컴퓨터 프로그램. 새로운 세션 데이터베이스 (파란색 상자와 삽입)을 시작합니다. 각 실험 (파란색 하위 삽입)에 대한 파일 및 디렉토리의 이름을 바꿉니다. 고유 식별자와 새로운 세션 (빨간색 상자 및 삽입)를 만듭니다. 편집 세션 (빨간색 삽입) 및 EN터 동물 식별자 챔버 탭의 정보 (녹색 상자와 삽입) 및 각 세션 유형 (오렌지 박스)에 대한 제어를 시작 / 정지를 설정합니다. (B) 각 세션의 유형에 적합한 기동 정지 제어를 선택한다. 삼백초에 간격 길이를 설정하고 12 간격 상당 (1 시간 세션) (5 분 빈)입니다. 습관화 세션 (왼쪽)의 경우, 챔버는 (수동 단계 ... 유니슨의 모든 사용) 일제히 시작 트리거되고 제 1 빔 휴식 후 즉시 활동에 대한 모니터링을 시작합니다. 사출 세션 (오른쪽)의 경우, 챔버가 개별적으로 트리거됩니다 (수동 ... 개별 화면 버튼을 상 사용) 즉시 제 1 빔 휴식 후 활동에 대한 모니터링을 시작합니다. 전체 상 시간이 개별적으로 각 챔버에 대한 만료되면 두 세션 유형은 종료됩니다. 세션이 시작되면 (C)는, 습관화 세션은 "모두 시작"버튼 (상단)을 선택하여 시작할 수 있습니다. 트리 그 후 그 주를 끄기, 모든 챔버 세션을 시작하는 제 1 빔 휴식에 들어 기다리고있을 것입니다. 사출 세션의 경우, 각 챔버는 독립적으로 (아래)를 시작할 수 있습니다. (동물 주입 챔버에서있는 동안) 개별 챔버를 유발 한 후, 챔버 세션을 시작하기 위해 제 1 빔 휴식에 들어 대기 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
두 챔버에 식염수 짝을받은 마우스는 어떤 환경을 개발하지 않은 상태에서 그림 6. 대표 CPP 결과. (상위) CPP에서, 마우스는 이전에 코카인 (중 5 또는 10 ㎎ / ㎏)와 짝을 챔버에 대한 상당한 선호도를 보였다. 열 약어는 동일한 테스트 TI에서 언급 한 그룹에 비해 표시 줄에서 중요한 집단 간 차이를 나타낸다나를 가리 킵니다. 사전 및 사후 시험 동안 염수 쌍이 챔버 대 코카인에 소요되는 시간을 플롯 팅함으로써 (아래)는 코카인 쌍의 측면의 증가는 시간의 비용이다 5 및 10 ㎎ / ㎏ 군에서 알 수있는 모두 식염수 쌍의 중간 챔버에 보냈다. 대조적으로, 식염수 대조군 전후 테스트 챔버 사이에서 필요한 시간에는 현저한 차이가 없었다. 으로 표시하고 데이터 ± SEM을 의미한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7. 대표 전위의 증감 결과 (A) 네 별도의 투여에 대한 각 매일 시험의 처음 20 분 동안 누적 빔 나누기 :. 같, 반 뒤에 야생형 마우스에 5, 10, 15, 30 ㎎ / ㎏ 두 번 투여(18)에서 수정 D 식염수 도전. 모든 그룹은 지난 코카인 노출 다음과 같은 용량의 과제 중 하나 (10, 15, 30 ㎎ / ㎏) 또는 두 개의 (5 ㎎ / ㎏) 주를 받았다. 일부 그룹은 변수 철수 기간에 수행되었다 더 도전을 받았다. (B) 15 ㎎ / ㎏ 코카인 과민성 실험 기간 동안 매일 시험을 위해 5 분 빈에 의해 합산 된 운동 데이터 (빔 나누기)의 플롯. (C) 주로 (왼쪽) 급성 코카인 응답의 차이, (중간) 감작 률의 차이 또는 최대 과민성에 (오른쪽)의 차이에 의해 구동되는 두 치료 그룹에 대한 전위의 민감성의 차이를 보여주는 그림입니다. 으로 표시하고 데이터 ± SEM을 의미한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 약물 유발 행동 가소성의 양상을 평가하기 위해 평균 랩에 의해 사용될 수있는 각각의 조건화 된 장소 선호도 전위의 증감에 대한 방법을 설명한다. 대부분의 행동 테스트와 마찬가지로, 기본 프로토콜 이외의 추가 가치 고려 사항이 있습니다. 우선, 이들 기술들 각각은 두 단계, 유도 식을 갖는 것으로 생각할 수있다. "유도"행동을 위해 컨디셔닝 동안 발생 CPP의 개발을 포함하고, 감작 대 (일반적 연속) 약물 노출의 초기 기간이다. 과민성에 대한이 철수 한 후 또는 단순히 마지막 연속 노출로 어느 특정 약물 문제로 정의 할 수 있습니다 동안 CPP에 대한 "식", 사후 테스트입니다.
더 나은 자신의 잠재적 영향을 분석 할 수있는 다른 대 다음 단계 중 하나에 제한 조작을 고려하는 가치가있다. 일시적으로 제한 효과와 바이러스 (예를 들어, HSV) 또는 약물의 공동 정부 / 전처리 (예를 들어, 작용제 / 길항제는) 이러한 노력에 유용하다. 이 방법을 고려하면, 특정의 위상은 더 바이러스 발현과 일치되도록, 압축 프로토콜을 사용하는 것이 더 필요하다. CPP를 들어, 우리는 이전에 설명 된 것처럼 37, 이틀 조절 방법을 수행 할 수있다. 특히 전위의 증감에 대한 유도 및 이러한 방법과 함께 발현 사이 인출 기간에있어서의 변화는 행동의 유지 또는 안정성에 관련된 프로세스를 발견 할 수있다. 또한, 이러한 접근 방식은 하나의 증감 거동을 이용하여 약물 유도 되나 다른 약물에 대한 노출에 의해 표현 될 수 크로스 민감성의 현상을 연구하는데 사용될 수있다. 교차 과민성 불량 모든 민감 약물간에 발생하지 않기 때문에, 원본과 다소 차이가 증감 행동을 유도 할 수 있으며, 필요에 대한 양방향 일하지 않습니다약물의 특정 세트는, 그 시험은 어디에서 뇌의 가소성과 기능에 미치는 영향을 다른 약물 이해하는 독특한 기회를 제공 할 수 있습니다.
CPP의 적절한 해석은, 특히, 연구 결과의 대안적인 설명을 배제에 따라 달라집니다. 세 챔버 장치에서 생성 된 데이터는 또한 약물 쌍 측에 대한 선호가 증가하기 때문에, 환경 설정 등의 사후 테스트에서 코카인 쌍 측면에서 생리 식염수 쌍 측에서 보낸 시간의 뺄셈을 정의하기 전에 자세히 조사해야 그 식염수 쌍 챔버에서 보낸 시간의 감소에서 유일 결과는 해석에 대한 가능성이 부적합합니다. 시간을 변경할 수 마우스가 약물 쌍 챔버 대신이 보낸 이후 중간 챔버는이 결과 수 있습니다. 대신 식염수 쌍의 측면의 중간 챔버 희생 약물 쌍의 측면에서 소요 시간의 증가를 관찰 할 수도있다; 틀림없이,이 결과는 여전히 허용 가능 interpre 수있다약물 선호도의 증가로 테드. 세 번째 구획의 포함은 사전 및 사후 테스트 세션 41시 동물의 편견 배치를 할 수있는 중립적 인 챔버를 제공한다. 시험 당일 점수에 기여 초기 배치 편견을 해결하는 데 유용하지만, 세 번째 챔버는 조절이 필요하지 않습니다. 두 가지 구획이나 다양한 자극 구성으로 하나의 구획을 특징으로 대체 CPP 디자인은 다른 곳에서 41-42 논의된다.
약물 장소 환경의 모든 적자는 상황에 맞는 단체 및 일반 보상 기능을 배울 수있는 두 능력의 평가를 동반해야한다. CPP 패러다임 이루어질 수 조정의 숫자가 있음을 수의 증가 (또는 감소) 짝의 개수 또는 높거나 낮은 약물을 사용하여 UCS (약물)의 돌출 수정 포함 변화된 환경의 해석 측근 정량. CPP는 입맛에 FO를 사용하여 수행 될 수있다OD (예를 들어, 고지방, 설탕) 또는 사회적 상호 작용은 관찰 된 변화는 약물에 고유 한 자연 보상과 관련이 있는지 여부를 평가하기 위해; 비 CPP는이를 위해 유용한 두개 자기 자극 수크로오스 선호도 및 / 또는 appetitive 접근 작업을 포함 접근한다. 그러나 이러한 모든 옵션을 적절하게 원하는 문제를 해결하는 능력에 따라 다릅니다. 정상 응답이 자연 보상과 적절한 문맥 연결을 배우고 형성 할 수있는 능력을 보여 주 이후 식품 기반의 CPP는 특히 도움이 될 수 있습니다. 학습 능력을 평가하기위한 추가 컨트롤은 상황에 맞는 학습 / 메모리 (상황 별 두려움 컨디셔닝 및 CPA)에 의존하는 작업을 포함한다. CPA는 혐오 경험 (예를 들어, 염화 리튬 주입)으로 appetitive 약물 교체 종종 동일한 챔버에서와 마찬가지로 CPP에 실행되는 이점이있다. CPP 적자 있지만 정상 CPA 표시 동물들은 적절한 문맥 관계를 형성하는 능력을 입증약물 CPP의 손상 가능성이 가장 높은 보상 (마약 관련 또는 기타)과 관련이 있음을 나타냅니다의. CPA 고려해야 염화 리튬을 사용하는 한 가지주의 약물이 실험 동물에 의해 모델링 될 수있는 조건에 대한 공지의 처리 여부이다. 예를 들어, 리튬이 처리 제어 방법을 혼동 할 유약 X (43)의 마우스 모델에서 학습 결손을 방해하는 것으로 나타났다.
고전 CPP 패러다임뿐만 아니라, 같은 시험 학습 된 약물 컨텍스트 협회의 멸종과 CPP 후의 회복으로 사용자가 유용하게 사용할 수있는 잠재적 인 확장이있다. 동물 방해받지 않고 방치하면 조건 반응 (CR이)가 일단 확립 19,20 장시간 동안 유지 될 수있다. CR의 상대 지속에도 불구하고, 효과적으로 UCS (약물)의 부재 CS (컨텍스트)의 반복에 의해 발표 소멸 될 수있다. 두 CPP 멸종 방법은 점등에 표시erature : 사출 (21) 또는 차량 22 이전에 약물 쌍 측의 재 페어링없이 반복 테스트 노출. 원래 에어컨, 효과적으로를 통해 입증 아이디어의 "unlearning"에 반대 멸종 프로세스는, 새로운 학습을 반영 "복직." 복직은 고전적인 CR의 복구를 생산하는 UCS에 다시 노출에 의해 트리거됩니다. CPP의 맥락에서, 훈련 약물의 단일 주입 동물은 장소 환경 설정을 표시하게됩니다. 흥미롭게도 많은 비 훈련 약물 단서는 다른 약물 (22)와 프라이밍 및 스트레스 23-26의 다양한 포함 CPP의 복직을 생성 할 수 있습니다. 멸종과 복직 실험은 약물 치료와 재발의 모델과 약물 중독 분야에 특히 관심이다. 소멸 속도를 향상 및 / 또는 회복의 크기를 줄일 개입 인간 약물 요법을위한 유용한 표적 일 수있다.
(예를 들어, 27-29). 그러나 특히, 문맥 무관 감작 분명히 다른 연구들 (예를 들어, 30-32)에서 입증되었다. 과민성의 상황에 따라 증가가 관찰 여부에 기여할 수있다 실험 자세한 내용은 그룹 테스트 O를위한 전송해야하는지 여부, 약물 복용, 노출의 길이를 포함F와 감작 테스팅 챔버에 미리 노출 특정 측면; 그러나, 이러한 세부 사항이 다소 불분명 남아 있습니다. 문맥 감작 기여도를 결정하는 하나의 방법은 약 33 감작 다음 염수 도전을 제공하는 것이다. 기술 패러다임의 사용은 식염수 문제시 이전의 연구에서 거의 전위의 활성화에 의해 입증 상황에 따라 증감의 기여도를 최소화 할 수 있습니다. 과민성에 상황에 맞는 기여는 자주 운동 활성 (34) 이외의 행동의 토론을 포함, 논문의 숫자에 검토되고있다.
새로운 환경에 의한 영향을 자극 된 운동으로 약물 - 유도 활성화 및 민감성의 오염을 제한하기 위해, 마우스를 각 실험의 시작 3-4일 식염수 주사에 적응된다. 도 7에서 알 수있는 바와 같이, 마우스는 일반적으로 제 간의 감소 된 운동을 보여마지막 생리 식염수 순응 날입니다. 또한, 상기 마우스는 마지막 생리 식염수에 의해 노광 처리 및 주입 띄게 고요하고 쉽다. 이전 작품이 패러다임을 사용하여 여러 균주와 마우스의 유전자형을 테스트 한 그들에 걸쳐 염분 적응 활동에 많은 차이가 표시되지 않습니다; 그러나, 때때로,이 방법을 이용하여 극복되지 않는 특정 유전자형과 관련된 매우 강력한 충동 성 표현형을 관찰 할 수있다. 이러한 경우에서, (과민 그룹 운동 고원까지) 여러 식염수 순응 일을 수행 한 후 마지막으로 염수 주입 일 데이터를 이용하여 대조군에 과민 그룹을 정규화하는 것이 바람직 할 수있다. 적합하지 않지만,이 그룹 사이에 운동에 약물의 효과를보다 합리적인 비교 가능하다. 극단적 인 과잉 행동을 완화 할 수있는 다른 옵션은 5 시간에 의해 매일 주입하기 전에 요법 이니 재판 길이를 확장 할 수 있습니다, 및 / 또는 이상 주입 실험을 사용 (2 - 4 시간) 전자ACH 일.
전위의 행동의 해석에 중요한 추가 고려 사항이 있습니다. 도 7c에 도시 된 바와 같이, 관찰 그룹 차이 급성 된 운동에 응답하여 불균형에 의해 주로 구동 될 수 있고, 일 감작 비율 증감의 최대 한계, 또는 이러한 요소의 조합. 이러한 요인의 기여를 구문 분석 개별적으로 도움이 될 수 있습니다. 이를 위해, 급성 된 운동 반응은 통계적으로 만 해석 될 수있다. 이어서 감작 속도 커브 피팅 및 급성 전위의 차이를 할인해 레이트 정규화 처리 할 수있는 프로그램을 사용하여 평가할 수있다. 변경된 최대 감작은 일반적으로 그룹의 응답이 plateaued 후 후속 매일 매일 사후 비교는 일에 중요 연속 약물 노출 일 동안 RM ANOVA로 드러났습니다. 하나는 최대 민감성 판별 할 수없는 것을 알고 있어야(푸른 줄 가운데)와 같은 그림 7c에 묘사 등의 약물 노출 일에 걸쳐 선형 전위의 응답을 유지하는 그룹. 이러한 경우, 약물 노출은 최대 시도 증감을 결정하도록 확장 될 수있다.
마지막으로, 그것은 동물의 별도의 집단에서 수행 적어도 두 개의 주된 약물 투여 량을 사용하여 그룹 사이에 과민 반응을 비교하기 위해 일반적으로 가장 좋습니다. 하나 또는 둘 모두에서 투여 된 운동 활성의 상기 양태의 임의의 차이는, 상동증 개발의 변경을 포함하는 다른 설명을 배제하기 위해 상기 실험을 안내하는 데 사용되어야한다. 코카인, 암페타민과 같은 일부 약물에 반복 노출뿐만 아니라, 용량 의존적으로 민감화 운동을 생성 할뿐만 아니라 전형적인 동작을 민감하게 경쟁. 이 stereotypies는 전위의 민감성은 종종 부분적으로 또는 완전히 가려되도록 고용량,에서 특히 명백한되고 있지만, 투여에 다시 공개낮은 복용량. 이러한 이유로, 한 실험군에서 전위의 증감에 "적자"실제로 stereotypies의 약물 유발 개발 높아진 민감도를 반영 할 수있다. 상동증의 평가는 어려울 수 있지만, 문서 (35) 및 스케일 (36)의 다른 방법들이있다. 이전 18 공표 한 일반 상동증 규모와 특정 행동에 대한 평가를 모두 사용하면 좋습니다.
결론적으로, 행동 시험 번호 중독 인간의 복잡도를 분석하기위한 시도 동물 모델이 개발되었다. 조건화 된 장소 선호도와 전위의 감작은 두 가지 기본 검사가 널리 각각 그들은 초기 약물 관련 보상의 평가 및 반복 사용에 의한 영구 소성에 특히 유용 할 수있다, 설치류에서 사용하고 있습니다. 이 디자인과 연구의 각 유형의 해석을위한 고려 사항의 수는 있습니다 그것은 법과 만들기이러한 평가를 계획 할 때주의 깊게 실험 목표와 이전의 문학을 고려 thwhile.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
저자는 행동 테스트에 대한 도움말은 카렌 디 에츠와 샤리 번바움 행동 설계 고려 사항에 이전 입력 및 로렌 PECA 감사합니다. 저자는 또한 시몬스 재단 (CWC에 시몬스 재단 자폐증 연구 이니셔티브 부여), NIDA (DA008277, DA027664 및 DA030590 CWC, RDP에 LNS에 F32DA027265 및 F32DA036319에), FRAXA 연구 재단과 엘레과 마일의 관대 한 지원을 인정 해안 원정대 프로그램 (LNS에 교제 지원), 그리고 존 Kaneb 원정대 프로그램 (MT에 교제 지원).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cocaine Hydrochloride USP | Mallinckrodt Pharmaceuticals | 0406-1520 | Purchase and use (Schedule II controlled substance) for research purposes requires compliance and licensure according to state and federal law. |
| Conditioned Place Preference, Three Compartment Apparatus with Manual Doors and Lights for Mouse | Med-Associates Inc. | MED-CPP-MS & MED-CPP-3013 | Our laboratory has used these boxes; however, many alternative boxes are available & acceptable. |
| PAS-Home Cage Activity Monitoring Photobeam Arrays | San Diego Instruments | 2325-0223 & 7500-0221 | Our lab houses these arrays inside of custom built chambers, as described in the text. There are alternatives available. |
| Disposable Sani-Cloth disenfecting wipes | PDI | 13872 |
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