Protocol
Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal Comitato Istituzionale cura degli animali e Usa McLean Hospital. NOTA: La seguente protocollo descrive un approccio unico al CPP e locomotore sensibilizzazione, molti dettagli di cui differiscono da altri protocolli di successo (ad esempio, luce- vs test scuro fase, consecutiva contro somministrazione intermittente, etc.). Novizi possono desiderare iniziare con questi protocolli, o semplicemente usarli come guide, adattando alterazioni dalla letteratura sulla base del presupposto dell'esperimento (s) a portata di mano. sono descritti metodi di misurazione automatizzati; tuttavia, è possibile utilizzare non automatizzato per ogni saggio (cioè, registrazione video, mano scoring).
1. place-preference
- Attrezzature e locale di installazione:
- Maniglia topi sperimentale per 1-3 minuti ogni giorno, per almeno 3-5 giorni prima del test.
NOTA: Non manico topi possono trovare rimozione dalla camera di stressful, che possono interferire con o alterare condizionata. - Ottenere quattro o più apparati CPP tre camerata, preferibilmente dotati di photobeams per la raccolta automatica dei dati 18. Assicurarsi che ogni camera ha due camere grandi, visually- e tattilmente-distinte che collegano ad una camera più piccola, neutro tramite porte che può essere sollevato / abbassato per controllare l'accesso. Coperchi in ciascuna camera dovrebbero aprire per l'inserimento / rimozione di topi e di essere montato con le luci di piccole dimensioni, controllabili singolarmente (dimmerabili) (uno per camera).
NOTA: CPP disegni da camera variano e possono essere acquistati in commercio o costruiti dai ricercatori. Per il motivo "bilanciata", un regime raccomandato è una camera grande con pareti bianche e pavimenti griglia metallica e l'altra con pareti nere e pavimenti bar. La camera centrale dovrebbe avere pareti grigie e solido pavimento in Plexiglass grigio. Per facilitare la descrizione, queste camere saranno indicati come "bianco", "nero" e "middle".I coperchi devono essere chiare Plexiglass. configurazioni alternative vano (uno o due da camera) sono anche possibili e discusso altrove (vedi la discussione). - Imposta la stanza come sarà durante i test: spegnere o impostare plafoniere per l'impostazione minima e chiudere la porta. Utilizzare un misuratore di luce all'interno di ogni camera e impostare le luci coperchio in modo che le camere medie sono leggermente più brillante (15-20 lux) di camere in bianco e nero (6-10 lux), al fine di scoraggiare i topi da passare il tempo lì.
NOTA: Se il tempo medio trascorso in mezzo è tanto o più che nelle camere bianche o nere, aumentare ulteriormente il contrasto di illuminazione descritto al punto 1.1.3. In alternativa, utilizzare pavimenti meno attraente per la metà. (Ad esempio, ~ 220 fori di diametro 0,5 cm, distribuiti uniformemente in 6 x 3.5 x ¼ "plexiglass), ma evitare di fare questa camera di avversione. Pilota alterazioni per garantire che diminuisce nel tempo di mezzo non sono causa di diminuzioni di esplorazioni totali (incroci) . - Programma raccolta automatizzata dei dati ( "procedura" Figura 1A) o raccogliere manualmente i dati in base ai seguenti parametri. Set prove per iniziare alla prima pausa trave in entrambi i camera di condizionamento. Impostare le sessioni di "test" per essere 20 minuti di lunghezza e per monitorare il tempo trascorso e del fascio si rompe in ciascuna camera. Impostare le sessioni di "condizionamento" di essere 30 minuti lungo e (opzionalmente) per misurare le interruzioni del fascio in ciascuna camera. Impostare tutte le luci della camera per illuminare durante il processo.
- Preparare pieno volume di soluzione di cocaina necessaria per l'esperimento a portata di mano. Sciogliere cocaina HCl in 0,9% NaCl (soluzione fisiologica), basando la concentrazione finale in un volume di iniezione di 0,1 ml / 10 g di peso corporeo (ad esempio, per una dose di 5 mg / kg, la concentrazione della soluzione è di 0,5 mg / ml). miscela vortex per 30-45 secondi, filtro sterile (0,2 micron filtri per siringa) e conservare a temperatura ambiente.
- Maniglia topi sperimentale per 1-3 minuti ogni giorno, per almeno 3-5 giorni prima del test.
- test:
NOTA: La timeline generale per CPP è pre-test, condizionata epoi post-test. Il pre-test può essere separato dalla condizionamento da parte di 1-3 giorni; tuttavia, condizionata e il giorno post-test dovrebbe aver luogo nei giorni consecutivi (Figura 2A). Questa temporizzazione deve essere mantenuto lo stesso per tutte le coorti nello stesso esperimento.- Test durante fase leggera degli animali con la stessa apparecchiatura per ogni animale di tutti giorni.
- Ogni giorno di prova (ad esempio, i test e giorni di condizionamento), spostare topi per l'anticamera del comportamento e consentire loro di sedersi indisturbati nelle loro gabbie casa per 1-1,5 ore prima del processo. Scegliere una posizione dove i topi possono essere spostati rapidamente da loro gabbia all'apparato, con il minimo disturbo, quando inizia il processo. Accendere tutte le apparecchiature in modo che eventuali rumori connessi con il test (ad esempio, ventilatori Tecnica) sono presenti.
- Pulire accuratamente ogni apparato (pareti interne, pavimenti e vassoi) con lieve, alcool, glicole-Ethernet o a base di ammoniaca disinfezione salviette prima e dopo ogni topo (utilizzare il same il tipo di detergente per tutto l'esperimento). Non trascurare pavimentazione inferiori.
- Controllare che le luci della stanza siano impostati in modo appropriato (spento o in grigio) all'inizio di ogni giornata.
- Procedere con la seguente seconda che si tratta di un "test" o giorno "condizionamento":
- On Trial giorni 1 e 6 (vale a dire, il pre e post-test), posizionare le porte inter-camera in posizione aperta (Figura 2B).
- Caricare il programma informatico "test" e inserire gli ID degli animali (Figura 1A), quindi emettere un comando di avvio (Figura 1B), se applicabile.
- Delicatamente inferiore ogni topo nella camera di metà del suo apparato assegnato, di fronte alla parete di fondo, e dolcemente chiudere il coperchio. Una volta che tutte le camere sono stati caricati, lasciare la sala prove e ridurre al minimo il rumore.
- Lascia i topi all'interno di ogni apparato fino a quando le prove per tutti i mouse hanno chiuso / finito (Figura 1C). dati degli studi di esportazione.
<li> Appena prima o dopo il pre-test, pesare gli animali. Utilizzare questi pesi per il calcolo della dose durante il condizionamento.
- Al fine di prepararsi per le prove di condizionamento, calcolare pre-test "preferenza" di ogni mouse per le camere in bianco e nero dal tempo trascorso in ciascuno di questi dall'altro (cioè, "nero meno nero" e "bianco minus bianco" sottraendo; vedere Figura 3, Colonne 9 e 10).
- Dal momento che i topi con forti preferenze iniziali rendono difficile il bilanciamento, stabilire un limite accettabile per i punteggi di preferenza (ad esempio, <33% del tempo di prova totale) ed escludere i topi che superano da calcoli. Utilizzare un limite liberale (<66% del tempo di prova totale) per massimizzare l'inclusione quando logoramento è probabile che dopo il test è completo (ad esempio, a causa di off-bersaglio manipolazioni chirurgiche).
NOTA: I topi che superano il limite può ancora essere testati, con un tentativo di mantenere le loro preferenze pre-test equilibrata. Più tardi, ttopi hese possono essere esclusi dalla analisi, se necessario, per bilanciare i punteggi pre-test. Se estremi pregiudizi pre-test (ad esempio,> 800 sec) colpiscono in modo sproporzionato un gruppo, considerare alterando gli ambienti di condizionamento e / o utilizzando altri saggi. - Scegli la camera di bianco o nero come la camera di droga abbinamento per ogni mouse, nel frattempo sommando i corrispondenti punteggi di preferenza pre-test all'interno di ogni gruppo con le seguenti priorità in mente:
NOTA: Fare attenzione a bilanciare i punteggi tra i gruppi all'interno di ciascuna coorte, nonché attraverso qualsiasi coorti precedenti.- Rendere le somme per tutti i gruppi come equivalenti possibile.
- Rendere le somme il più vicino possibile allo zero (cioè, scegliere il lato preferito per alcuni topi e il lato non preferito per gli altri). Se un quasi-somma zero è impossibile per qualsiasi dato gruppo, ri-regolare tutti gli altri a corrispondere al meglio alla miglior punteggio ottenibile per il gruppo di limitazione, favorendo gruppo leggermente negativo riassume soprapositivo.
- Per quanto possibile, mantenere le assegnazioni di nero contro bianco e preferita rispetto a camere non preferite per abbinamenti di droga anche all'interno di ogni gruppo.
- Poiché non è sempre possibile per raggiungere gli obiettivi di cui sopra, correggere eventuali deviazioni rendendo opposte considerazioni di bilanciamento in coorti successive; tuttavia, cercare di evitare la produzione di coorti con selvaggiamente diverse preferenze media pre-test.
- Su condizionata giorni 2-5, posizionare porte inter-camera in posizione chiusa (Figura 2C).
- Preparare singole siringhe con la cocaina (giorni 2 e 4) o soluzione salina (giorni 3 e 5) soluzione, come descritto al punto 1.1.5 e sulla base del peso corporeo valutate al pre-test.
NOTA: dose deve essere scelto in relazione alle aspettative sperimentali, considerazioni di cui in premessa, e potenziali effetti pavimento e soffitto. Spesso è meglio per condurre esperimenti indipendenti utilizzando almeno due dosi differenti. - Load "cID animale onditioning programma per elaboratore "e inserire (Figura 1A), quindi emettere un comando di avvio (Figura 1B), se applicabile.
- Scruff e iniettare ogni topo (ip), subito li abbassamento nella camera di bianco o nero appropriata del loro apparato assegnato di fronte alla parete di fondo, poi dolcemente chiudere il coperchio. Una volta che tutte le camere sono stati caricati, lasciare la sala prove e ridurre al minimo il rumore.
- Rimuovere i topi da loro camera come vicino esattamente 30 min fattibile (cioè, il primo topi vengono rimossi dalla loro camere mentre altri topi sono ancora condizionata). Rimuovere gli animali il più silenziosamente possibile, senza introdurre rumore.
- Scegliere un metodo di analisi. In entrambi i casi il tempo sottrarre trascorso sul lato salina-accoppiato durante la post-test da tempo trascorso sul lato cocaina accoppiato durante la post-test (la cocaina - salina, sec) o utilizzare il tempo trascorso nella camera di droga abbinato post-testmeno il tempo di pre-test speso per la camera di droga-accoppiato.
NOTA: se si usa il primo metodo, anche grafici lineari trama del tempo medio trascorso nel mezzo, camere saline- e droga-accoppiato durante i pre e post-test per ogni gruppo. Rispetto al pre-test, il post-test dovrebbe mostrare un aumento del tempo nel lato droga abbinato ed è diminuito il tempo trascorso nel lato salina-accoppiato (vedi figura 6, in basso, e discussione per la spiegazione). - A seconda della natura e del numero di gruppi a confronto, utilizzare un t-test, uno o due Way ANOVA, a seconda dei casi, possibilmente con l'analisi post-hoc, per analizzare uno dei punteggi sottrazione sopra presentato.
NOTA: cocaina punteggi di preferenza tendono ad essere variabile, e, inoltre, possono essere negativi (ad esempio, indicare l'avversione al lato della droga-accoppiato). I topi che mostrano l'avversione non devono essere rimossi (a meno che siano valori erratici statistici), dal momento che questo risultato è normale e probabilmente importanti per determinare le differenze tra grOups. Prevedono la necessità dimensioni del campione di 12 a 30 animali per gruppo, a seconda delle dimensioni effetto del trattamento.
2. locomotore Sensibilizzazione
- Attrezzature e Camera Set-Up
- Ottenere un 4 x 8 (X x Y) Fotocellule serie (dimensioni esterne 11.5 "x 20"). Costruire una camera decappottabile in plexiglas nero (dimensioni interne 22 1/6 "x 13 ¾" x 9 3/8 ") per ospitare l'array (Figura 4A).
- Preparare la sala prove in modo che una luce rossa (a soffitto ea parete) può essere utilizzato durante il test.
- Preparare sessioni programma separato per assuefazione e iniezione prove quotidiane.
- Impostare prove di assuefazione ad essere tra i 30-60 min e iniezione prove per essere compreso tra 60-120 min (Figura 5B). La lunghezza raccomandata per ciascuna è di 60 min. Mantenere la lunghezza di prova consistente in più coorti all'interno dello stesso esperimento.
- Set prove per iniziare recording sulla prima pausa trave che si verifica dopo il segnale di avvio è stata avviata (Figura 5B). Per il processo di iniezione, impostare il segnale di avvio in modo che scatole possono essere avviati singolarmente (non all'unisono), se possibile.
- Impostare le interruzioni del fascio da registrare in definiti dall'utente "bidoni", preferibilmente di 5 minuti ciascuno (Figura 5B).
- Preparare pieno volume di soluzione di cocaina necessaria per l'esperimento a portata di mano. Sciogliere cocaina HCl in 0,9% NaCl (soluzione fisiologica), basando la concentrazione finale in un volume di iniezione di 0,1 ml / 10 g di peso corporeo (ad esempio, per una dose di 5 mg / kg, la concentrazione della soluzione è di 0,5 mg / ml). miscela vortex per 30-45 secondi, filtro sterile (0,2 micron filtri per siringa) e conservare a temperatura ambiente.
- analisi
NOTA: La fase iniziale di test viene eseguito per 10-11 giorni consecutivi. I topi ricevono due prove quotidiane: assuefazione (senza iniezione) e l'iniezione. Somministrare soluzione salina per i primi tre di fi nostri giorni (vedi la discussione per importanza di assuefazione fisiologica), e la cocaina per i prossimi sette utilizzando la stessa dose (ad es., 15 mg / kg / die).- Ogni giorno, ambientarsi topi nelle loro gabbie a casa per l'anticamera comportamentale per 30 minuti a 1 ora.
- Preparare pulito radura gabbie abitative acrilico del mouse di dimensioni standard, con un sottilissimo strato di lettiera fresca (ad esempio, i chip di pino), in modo da non oscurare photobeams, se del caso (Figura 4C & D).
- Inserire gabbie contro l'asse Y della matrice photobeam vicino ad una estremità, in modo che cinque travi sono distanziati in modo uniforme lungo la sua lunghezza. Travi asse X non vengono utilizzati in questo test (Figura 4C & D).
- Prendere i topi dalla loro gabbia casa, in ordine casuale, collottola e pesare. Rimuovere ogni topo dalla barca pesare dalla base della loro coda (con il supporto) e posto direttamente nella loro gabbia motorio assegnato. Coprire ogni gabbia con un coperchio del filtro-top standard.
- Preparare singole siringhe wesimo salina o soluzione di cocaina, come descritto al punto 2.1.7, sulla base del peso corporeo del giorno corrente. Iniziare con una dose di 15 o 20 mg / kg, e prendere in considerazione un secondo esperimento usando una dose maggiore o minore (vedi la discussione di fattori rilevanti).
- Una volta che gli studi di assuefazione hanno finito per tutte le gabbie, caricare il programma di iniezione.
- Uno alla volta, togliere i topi dalla loro gabbia di prova, collottola e dare il loro iniezione (ip). Prima di tornare il mouse per la sua gabbia di prova, avviare rapidamente il segnale di partenza per quella gabbia (Figura 5C, in basso).
- Dopo tutte le prove di iniezione sono finiti, tornare topi per loro gabbie casa e la loro camera abitazioni.
- Se lo si desidera, consentire topi sottoposti ad una serie di periodi di sospensione e sfide droga, come il seguente: stessa dose originale, metà dose, doppia dose, poi salina, permettendo sette giorni prima della sfida stessa dose e 06:57 giorni prima di ogni ulteriore sfida. Qualunque sia la scelta di sfide, eseguire manutenzione sun periodi di sospensione simili in tutta coorti all'interno di un esperimento.
NOTA: Se la dose iniziale è elevato (ad esempio, 30 mg / kg o superiore), la doppia dose deve essere saltato o sostituita con una dose inferiore. La sfida salina rivela alcuna attivazione locomotoria condizionata dall'ambiente cocaina-abbinato sola, e nel processo, la quantità di locomozione sensibilizzata che la cocaina-dipendente (vedi Discussione).
- Analisi statistica
- Scegliere la porzione (s) di ogni prova che verrà utilizzato per l'analisi. La maggior parte locomozione indotta dalla cocaina nei roditori si verifica entro il primo ~ 15-30 minuti dopo l'iniezione di droga. A seconda variabili coinvolte, considera di analisi locomozione cumulativo per più finestre di tempo (ad esempio, la prima 15, 30, 60 e / o 120 min) o concentrarsi su spezzoni indipendenti del processo.
- Utilizzando il tempo cornice scelta, sommare le pause del fascio per ciascun animale al giorno per le prove di adattamento e di iniezione separatamente e poi unverage le somme per ogni gruppo. Trama significa e gli errori standard della media (SEM) in un grafico a linee su tutti i giorni. Come trattamenti possono alterare come topi rispondono al farmaco precoce e / o in ritardo in ogni prova quotidiana, anche tracciare pause medi fascio gruppo da 5 min bin nel corso di ogni prova quotidiana.
NOTA: Tracciare le medie attività giornaliere per prove di adattamento e di iniezione (ad esempio, prima 15 min) fa apparire artificialmente che locomozione viene smorzata mediante iniezione di soluzione salina, ma ricordate che l'attività ha (molto probabilmente) rifiutato a questo livello entro la fine di assuefazione ogni giorno . - Analizzare giorni saline e trattamento farmacologico consecutivi separatamente utilizzando misure ripetute (RM) ANOVA avere il fattore entro soggetti del giorno / ora e compresi eventuali fattori tra soggetti nella progettazione, a seconda dei casi. Utilizzare un t-test o One-Way ANOVA per indagare le differenze di gruppo il giorno 1 di cocaina (esposizione acuta), e una ANOVA multivariata per le sfide. Se del caso, seguire significance con i test post-hoc o Univariata ANOVA.
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Representative Results
Risultati rappresentativi del dosaggio CPP sono mostrate in Figura 6 con wild-type topi C57BL / 6N a circa nove settimane di età. Il disegno dello studio era un fattoriale misto 2 x 3, con una variabile entro soggetti di prova (pre e post) e tra soggetti variabile del trattamento (soluzione salina e cocaina 5 e 10 mg / kg). Una RM ANOVA ha mostrato una significativa interazione tra test e trattamento (F 2,20 = 3.68, p <0,05), che è stato interpretato in luogo dei principali effetti significativi osservati sia Test (F 1,20 = 9.86, p <0.01) e Trattamento (F 1,20 = 4.37, p <0,05). I confronti post hoc hanno mostrato che nessuno dei gruppi diversa l'uno dall'altro durante il pre-test. Al post-test, il 5 mg / kg e 10 mg / kg non differivano significativamente tra loro; tuttavia, entrambi i gruppi mostravano significativamente maggiore preferenza per la camera di cocaina accoppiato rispetto al gruppo di controllo salina sola (di Tukey: 5 mg / kg, p <0,5; 10 mg / kg, p &# 60; 0,01). Inoltre, i test di Bonferroni post hoc hanno dimostrato che sia il 5 (p <0.05) e 10 (p <0.05) / gruppi mg kg mostrato una maggiore preferenza per il lato cocaina accoppiato al post-test rispetto al pre-test, mentre la soluzione salina gruppo -saline non ha mostrato alcun cambiamento dal pre al post-test.
Risultati rappresentativi del dosaggio locomotoria sono mostrati in Figura 7A & B usando wild-type topi di controllo littermate C57BL / 6N da una serie di esperimenti separati che sono stati precedentemente pubblicati 18. Dopo acclimatazione alle iniezioni saline per 3-4 giorni, i topi hanno ricevuto una iniezione di cocaina (ip) a 5, 10, 15 o 30 mg / kg al giorno per sette giorni. A seguito di un periodo di sospensione di sette o 14 giorni, ogni gruppo ha ricevuto una sfida di cocaina alla dose iniziale, poi dopo ulteriori periodi di sospensione (variabili), alcuni hanno ricevuto sfide cocaina aggiuntivi in altre dosi, come illustrato. Al fine di dimostrare l'effetto della dose cocaina LOCOMotor sensibilizzazione nella pubblicazione corrente, i quattro diversi gruppi di dosaggio sono stati combinati in un disegno misto-fattoriale 4 x 7, con una entro soggetti variabili del giorno (primi 7 iniezioni di cocaina) e di un fattore tra soggetti di Dose. Una RM ANOVA ha mostrato una significativa interazione tra dose e Day (F 18.276 = 12.53, p <0,0001), che è stato interpretato invece di effetti principali significativi che sono stati anche osservati sia per il giorno (F 6.276 = 18.25, p <0,0001) e la dose ( F 3,46 = 22.63, p <0,0001). Tukey post hoc analisi ha mostrato differenze complessive significative tra 5 e 15 mg / kg (p <0,0001), 5 e 30 mg / kg (p <0,0001), e 10 e 15 mg / kg (p <0.01). sono stati osservati un certo numero di differenze significative quando i gruppi sono stati confrontati ogni giorno. Nota che qui ci sono differenze per il giorno 1 di cocaina (5 vs 30 mg / kg, p <0.01; 10 vs 30 mg / kg, p <0.05; 15 vs 30 mg / kg, p <0.01) e 7 ° giorno (cocaina 5 vs 10 mg / kg, p <0,05; 5 vs. 15 mg / kg, p <0.0001; 10 vs. 15 mg / kg, p <0,01; 15 vs 30 mg / kg, p <0,0001). La figura 7C mostra figure finte che illustrano i principali aspetti di sensibilizzazione locomotoria che possono differire gruppi quantità di trattamento. Mentre queste caratteristiche sono illustrate in modo indipendente qui, è anche possibile osservare differenze nei loro combinazioni.
Figura 1. Med PC CPP controllo di sessione di base. (A) del display di default, l'icona sessione aperta (scatola rossa), e la finestra di dialogo sessione aperta (nel riquadro). Selezionare "il nome del file custom" e la finestra della cartella utilizzare per accedere alla cartella dei dati e il nome della sessione. Selezionare il programma appropriato dall'elenco a discesa "Procedura". Per ogni casella in uso, controllare il numero di scatola e inserire le informazioni pertinenti in scatole soggetto, esperimento, e di gruppo. (B) Display camera di carico, avviare icona del segnale (blue box), e inviare il segnola finestra di dialogo al (nel riquadro). Una volta che tutti i dati da camera è stato inserito, selezionare le camere da caricare e questione iniziano segnale. Camere saranno ora essere innescato da fascio-break per avviare il timer sessione e raccogliere i dati. (C) Display sessione si è conclusa. Come ogni camera completa il programma designato, l'area di raccolta dei dati (riquadro verde) diventerà statico e l'area delle informazioni da camera (scatola arancione) mostrerà le camere come "chiuso". Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Configurazione camera di CPP. (A) del campione linea del tempo sperimentale. Pre-test è seguito da cocaina giornaliera alternata (grigio) e sessioni di condizionamento salina (bianco). Dopo la prova è effettuata 24 ore dopo l'ultima sessione di condizionamento. ( B) la configurazione a camera aperta per l'utilizzo in sessioni di pre e post-test. Si noti che le porte inter-camera sono in posizione sollevata / aperto. (C) Configurazione locale chiuso per l'uso in sessioni di condizionamento. Si noti che le porte manuali sono abbassate, senza accesso tra le camere. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. calcoli di progettazione bilanciati per CPP. Esempio di calcolo e gli obiettivi quando equilibra i punteggi pre-test in CPP. Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 4. locomotore Camera di configurazione. (A) camera esterna si compone di scatola nero opaco al cui interno la matrice del fascio si adatta perfettamente (B). Camere di dimensioni cassaforma / scarpa devono essere riempiti con un sottile strato di biancheria da letto (C) e allineati in modo che le travi sono uniformemente distribuite lungo l'asse lungo (D). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. locomotore Camera Computer Operation. Programma per computer (A) di default. Inizia nuovo database sessione (scatola blu e nel riquadro). Rinominare il file e directory per ogni esperimento (blu sub-riquadro). Creare nuova sessione (scatola rossa e nel riquadro) con identificativo univoco. Modifica Session (riquadro rosso) e enter informazioni di identificazione degli animali nella scheda camera (scatola verde e nel riquadro) e impostare start / stop di controllo per ogni tipo di sessione (scatola arancione). (B) Selezionare il controllo start stop appropriata per ogni tipo di sessione. Impostare la lunghezza dell'intervallo di 300 secondi (per 5 minuti bin) e 12 intervalli per fase (per 1 sessione di un'ora). Per le sessioni di assuefazione (a sinistra), le camere saranno attivati per avviare all'unisono (abilitare manualmente Phase ... Tutto in Unison) e inizieranno il monitoraggio per l'attività immediatamente dopo la prima pausa fascio. Per le sessioni di iniezione (a destra), le camere saranno attivati individualmente (abilitare manualmente Phase ... Individualmente Pulsanti schermo) e inizierà il monitoraggio per l'attività immediatamente dopo la prima pausa fascio. Entrambi i tipi di sessione si concluderà quando il tempo è scaduto fase totale per ogni camera singolarmente. (C) Una volta che la sessione è stata avviata, sessioni di assuefazione può essere avviato selezionando il pulsante "start all" (in alto). Si noti che dopo triggEring, tutte le camere saranno in attesa di pausa primo fascio di iniziare la sessione. Per le sessioni di iniezione, ciascuna camera può essere avviato indipendentemente (in basso). Si noti che dopo l'attivazione singole camere (mentre animale è fuori della camera per iniezione), le camere saranno in attesa per il primo break fascio di iniziare la sessione. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6. Risultati rappresentativi CPP. (Top) In CPP, i topi hanno mostrato significativa preferenza per una camera precedentemente associato con la cocaina (5 o 10 mg / kg), mentre i topi che hanno ricevuto abbinamenti salini in entrambe le camere non hanno sviluppato alcuna preferenza. abbreviazioni Colonna denotano differenze significative tra i gruppi della barra con l'etichetta rispetto al gruppo notato allo stesso ti testsegnalo. (Inferiore) Con il tempo trascorso in cocaina rispetto camere saline-accoppiato durante il pre e post test tracciato, aumenti il lato cocaina accoppiato può essere visto in gruppi 5 e 10 mg / kg pari a scapito del tempo trascorso in entrambe le camere saline-abbinato e medie. Al contrario, non vi erano differenze notevoli in tempo trascorso in ogni camera tra pre e post test nel gruppo di controllo salina. I dati presentati come media ± SEM. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 7. Risultati rappresentativi locomotore di sensibilizzazione (A) pause fascio cumulativi per i primi 20 minuti di ogni prova al giorno per quattro dosi separate:. 5, 10, 15 e 30 mg / kg nei topi wild-type seguita da stesso-, mezza pensione , doppia dose did sfide saline, modificati rispetto (18). Tutti i gruppi ricevuto sfide stessa dose sia uno (10, 15, 30 mg / kg) o due (5 mg / kg) settimane dopo l'ultima esposizione cocaina. Alcuni gruppi hanno ricevuto ulteriori sfide, che sono stati eseguiti in periodi di sospensione variabili. (B) Trama dei dati locomotore (interruzioni del fascio) sommati per 5 min bin per le prove al giorno nel / kg esperimento cocaina sensibilizzazione 15 mg. (C) Illustrazioni che presentano differenze di locomotore sensibilizzazione per due gruppi di trattamento che sono principalmente guidati da (a sinistra) le differenze di risposta acuta da cocaina, (Centro) una differenza di tasso di sensibilizzazione o differenze di sensibilizzazione massima (a destra). I dati presentati come media ± SEM. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo illustra metodi place preference e locomotore sensibilizzazione, ciascuno dei quali può essere utilizzato dal laboratorio media di valutare aspetti della plasticità comportamentale indotta da farmaci. Come con la maggior parte dei test comportamentali, ci sono altre considerazioni degne di là del protocollo di base. Innanzitutto, ciascuna di queste tecniche può essere concepito come avente due fasi, l'induzione ed espressione. "Asincrono" comprende lo sviluppo del comportamento per CPP si verifica durante il condizionamento e per la sensibilizzazione è il periodo iniziale di (tipicamente consecutivi) esposizione al farmaco. "Expression" per CPP è il post-test, mentre per la sensibilizzazione può essere definita come una sfida farmaco somministrato sia dopo ritiro o semplicemente come l'ultima esposizione consecutivo.
Vale la pena di considerare manipolazioni limitano ad una di queste fasi contro l'altro per analizzare meglio i loro effetti potenziali. I virus con efficacia temporalmente limitato (ad esempio, HSV) o farmaci co-amministrazioni / pre-trattamenti (ad esempio, agonisti / antagonisti) sono utili in tali sforzi. Quando questo approccio, può essere inoltre necessario utilizzare protocolli compressi in modo che una fase particolare sarà meglio coinciderà con espressione virale. Per CPP, è possibile effettuare un metodo di condizionamento di due giorni, come abbiamo descritto in precedenza 37. Soprattutto per locomotore di sensibilizzazione, i cambiamenti nel periodo di sospensione tra il induzione e l'espressione combinata con questi metodi, possono scoprire i processi coinvolti nella manutenzione o la stabilità del comportamento. Inoltre, tali approcci possono essere utilizzati per studiare il fenomeno della sensibilizzazione incrociata, in cui un comportamento sensibilizzate viene indotta utilizzando un farmaco ma può essere espresso mediante esposizione ad un farmaco diverso. Dal cross-sensibilizzazione non si verifica tra tutti i farmaci sensibilizzanti di abuso, può suscitare un comportamento sensibilizzati che si differenzia un po 'dall'originale, e non è necessariamente bidirezionale perun dato insieme di farmaci, l'esame può offrire opportunità uniche per capire dove e come i diversi farmaci influenzano la plasticità e la funzione del cervello.
La corretta interpretazione del CPP, in particolare, dipende da escludere spiegazioni alternative dei risultati. I dati generati in un apparato a tre a camera dovrebbero essere ulteriormente esaminati prima di definire la sottrazione di tempo trascorso nel lato salina-accoppiato dal lato della cocaina-abbinato al post-test come preferenza, dal momento che un aumento di una preferenza per il lato droga associato che risulta solo da una diminuzione del tempo trascorso nella camera salina-accoppiato è probabile inadatti tale interpretazione. La camera centrale permette di questo risultato in quanto il mouse può alterare il tempo trascorso lì al posto della camera di droga abbinato. È anche possibile osservare aumento del tempo trascorso nel lato droga accoppiato a spese della camera centro trascurando lato salina-accoppiato; probabilmente, questo risultato può essere ancora accettabile interpreta come un aumento della preferenza di droga. L'inclusione di terzo scomparto offre una camera neutro che consente il posizionamento imparziale dell'animale durante il pre e post-test sessioni di 41. Anche se utile per affrontare i pregiudizi posizionamento iniziale che contribuiscono alla punteggi dei test-day, la terza camera non è richiesto per il condizionamento. Alternative disegni CPP che dispongono di due compartimenti distinti o un unico vano con le configurazioni di stimolo svariate sono discussi altrove 41-42.
Qualsiasi deficit nel posto preferenza per un farmaco deve anche essere accompagnato da valutazioni di entrambe le capacità di apprendere associazioni contestuali e funzione generale ricompensa. Ci sono una serie di aggiustamenti che può essere fatto al paradigma CPP che possono aiutante nell'interpretazione di preferenza alterata, compresa la modifica la rilevanza del sistema UCS (farmaco) aumentando (o diminuendo) il numero di coppie o utilizzando farmaci maggiore o minore dose. CPP può essere eseguita utilizzando fo appetibileod (ad esempio, alto contenuto di grassi, saccarosio) o le interazioni sociali per valutare se il cambiamento osservato è specifico di droga o è rilevante per ricompense naturali; non CPP approcci utili per questo scopo includono intracranica auto-stimolazione, la preferenza di saccarosio, e / o le attività di avvicinamento appetitive. Tuttavia, tutte queste opzioni variano nella loro capacità di affrontare in modo adeguato la questione desiderato. Alimenti a base di CPP può essere particolarmente utile in quanto le risposte normali dimostrano una capacità di apprendere e formare associazioni contestuali appropriate con una ricompensa naturale. Ulteriori controlli per valutare la capacità di apprendimento sono le attività che si basano su contestuale apprendimento / memoria (la paura contestuale condizionata e CPA). CPA ha il vantaggio di essere eseguito in modo simile a CPP, spesso negli stessi alloggiamenti, sostituendo il farmaco appetitiva un'esperienza avversivo (ad esempio, cloruro di litio iniezione). Gli animali che mostrano deficit nella CPP, ma CPA normale, dimostrano una capacità di formare appropriata associazione contestuales, che indica che i danni in CPP droga molto probabilmente si riferiscono a premiare (o in altro modo specifico per farmaco). Una cautela per CPA utilizzando cloruro di litio da considerare è se questo farmaco è un trattamento conosciuto per qualsiasi condizione che può essere modellato da animali da esperimento. Ad esempio, il trattamento litio ha dimostrato di contrastare deficit di apprendimento nel modello murino di X fragile 43, che confondere questo metodo di controllo.
Oltre al classico paradigma CPP, ci sono potenziali estensioni gli utenti possono trovare utili, come i test estinzione dell'associazione droga contesto imparato e la sua reintegrazione dopo CPP. Risposte condizionate (CRS), una volta stabilita, può essere mantenuta per lunghi periodi 19,20 quando gli animali vengono lasciati indisturbati. Nonostante la relativa persistenza della CR, può essere efficacemente estinto presentazioni ripetuti del CS (contesto) in assenza del UCS (farmaco). Due metodi di estinzione CPP appaiono nel literature: esposizione test ripetuto senza iniezione 21 o ri-accoppiamenti del lato in precedenza droga in coppia con veicolo 22. I processi di estinzione riflettono nuovo apprendimento, in contrapposizione a "disimparare" del condizionamento originale, un'idea efficace dimostrato attraverso la "reintegrazione". Ripristino è classicamente innescato da ri-esposizione al UCS, che produce il recupero del CR. Nel contesto di CPP, una singola iniezione del farmaco formazione causerà animali per mostrare posto preferenza. È interessante notare che molti spunti di droga non di formazione possono anche produrre reintegrazione del CPP, tra cui priming con farmaci alternativi 22 e una varietà di fattori di stress 23-26. esperimenti di estinzione e ripristino sono di particolare interesse per il settore della tossicodipendenza come modelli di trattamento farmacologico e la ricaduta. Gli interventi che migliorano il tasso di estinzione e / o ridurre la grandezza di ripristino potrebbero essere bersagli preziosi per terapie farmacologiche umani.
(ad esempio, 27-29). In particolare però, sensibilizzazione indipendenti dal contesto è stato chiaramente dimostrato in altri studi (per esempio, 30-32). dettagli sperimentali che possono contribuire a se un aumento dipendente dal contesto in sensibilizzazione è osservabile includono la dose di droga, durata dell'esposizione, se un gruppo deve essere trasportato per il test of sensibilizzazione e taluni aspetti della pre-esposizione alla camera di prova; tuttavia, questi dati rimangono poco chiari. Un metodo per determinare il contributo della sensibilizzazione contestuale è quello di dare una sfida soluzione salina dopo la sensibilizzazione di droga 33. L'uso del paradigma descritto minimizza il contributo di sensibilizzazione dipendente dal contesto come dimostrano poco attivazione locomotoria in precedenti studi su sfida salina. Il contributo contestuale di sensibilizzazione è stata rivista in un certo numero di documenti, spesso anche discussioni di comportamenti diversi da attività locomotoria 34.
Per limitare la contaminazione di attivazione indotta da farmaci e sensibilizzazione con locomotore stimolanti effetti indotti da un nuovo ambiente, i topi sono acclimatati iniezioni di soluzione salina per tre o quattro giorni all'inizio di ogni esperimento. Come si vede in figura 7, topi mostrano tipicamente ridotta locomozione tra il primo eultimo giorno di acclimatazione salina. Inoltre, i topi sono notevolmente più calmo e più facili da maneggiare e iniettare dalla ultima esposizione salina. opere precedenti hanno testato più ceppi e genotipi di topi utilizzando questo paradigma e non vedere molto varianza nella attività di acclimatazione salina su di essi; tuttavia, è possibile osservare occasionalmente molto forti fenotipi iperattività associati a particolari genotipi che non sono superati con questo metodo. In questi casi, può essere desiderabile eseguire diversi giorni di acclimatazione saline (fino plateau locomozione nel gruppo iperattivo), e quindi normalizzare il gruppo iperattivo al gruppo di controllo usando i dati giorno ultima iniezione di soluzione salina. Mentre non ideale, permette una più ragionevole confronto degli effetti di un farmaco sulla locomozione tra questi gruppi. Altre opzioni che può contribuire a rispondere estrema iperattività sono di estendere la lunghezza del processo assuefazione prima dell'iniezione ogni giorno da uno a 5 ore, e / o utilizzare le prove di iniezione più lunghi (2-4 ore) egiorno ach.
Ci sono altre considerazioni che sono importanti per l'interpretazione del comportamento motorio. Come illustrato nella figura 7C, le differenze di gruppo osservati possono essere orientati principalmente dalla disparità nella risposta locomotoria acuta, il tasso di sensibilizzazione per giorni, il limite massimo di sensibilizzazione, o una combinazione di questi fattori. L'analisi del contributo di questi fattori individualmente può essere utile. A questo scopo, la risposta locomotoria acuta può essere analizzato statisticamente solo. Allora il tasso di sensibilizzazione può essere valutata utilizzando un programma in grado di adattamento della curva e di un processo di normalizzazione tasso che eventuali differenze locomotore acuti. sensibilizzazione massima Altered di solito è rivelato in una RM ANOVA nei giorni di esposizione di droga consecutivi, in cui i confronti post-hoc giorno per giorno di follow-up sono significativi nei giorni dopo le risposte del gruppo hanno stabilizzato. Uno dovrebbe essere consapevole del fatto che la sensibilizzazione massima non può essere determinatoper qualsiasi gruppo che mantiene una risposta locomotoria lineare su giorni di esposizione di droga, come raffigurato nella figura 7C (al centro, linea blu). In tal caso, l'esposizione farmaco può essere esteso per cercare di determinare sensibilizzazione massima.
Infine, è in genere migliore per confrontare sensibilizzazione tra i gruppi che utilizzano almeno due dosi di droga primaria eseguiti in coorti separate di animali. Le differenze di nessuno degli aspetti di cui sopra di attivazione locomotoria, in una sola dose o entrambi, devono essere utilizzati per guidare ulteriori test per escludere altre spiegazioni, comprese le modifiche nello sviluppo di stereotipia. Ripetuta esposizione ad alcune droghe, come la cocaina e anfetamine, non solo produce locomozione sensibilizzati in modo dose-dipendente, ma sensibilizza anche in competizione comportamenti stereotipati. Questi stereotipie diventano particolarmente evidente a dosi elevate, in modo tale che locomotore sensibilizzazione è spesso oscurato parzialmente o completamente, ma ha rivelato ancora una volta con la somministrazione diuna dose più bassa. Per questo motivo, un "deficit" di locomotoria sensibilizzazione in un gruppo sperimentale può realmente riflettere accresciuta sensibilità allo sviluppo farmaco-indotta di stereotipie. La valutazione delle stereotipie può essere difficile, ma ci sono un certo numero di parametri pubblicati 35 e altri approcci 36. Utilizzando sia una scala di stereotipia generale e una valutazione dei comportamenti specifici si raccomanda, come pubblicato in precedenza 18.
In conclusione, una serie di test comportamentali sono stati sviluppati in modelli animali nel tentativo di analizzare la complessità della dipendenza umana. Conditioned place preference e locomotore sensibilizzazione sono due test di base ampiamente utilizzati nei roditori e, rispettivamente, possono essere particolarmente utili nella valutazione del primo premio di droga associata e la plasticità persistente indotta da un uso ripetuto. Ci sono una serie di considerazioni per la progettazione e l'interpretazione di ogni tipo di studio, il che rende Worthwhile di considerare attentamente gli obiettivi sperimentali e la letteratura precedente quando si pianifica queste valutazioni.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Karen Dietz e Shari Birnbaum per la precedente input su considerazioni di progettazione comportamentali e Lauren Peca per un aiuto con test comportamentali. Gli autori riconoscono anche il generoso sostegno della Simons Foundation (Simons Fondazione Initiative Autism Research Grant a CWC), NIDA (DA008277, DA027664, e DA030590 a CWC, F32DA027265 a LNS e F32DA036319 a RDP), la Fondazione FRAXA ricerca e Eleanor e Miles Shore Fellowship Program (supporto borsa di studio a LNS), e il John Kaneb Fellowship Program (supporto borsa di studio per MT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cocaine Hydrochloride USP | Mallinckrodt Pharmaceuticals | 0406-1520 | Purchase and use (Schedule II controlled substance) for research purposes requires compliance and licensure according to state and federal law. |
| Conditioned Place Preference, Three Compartment Apparatus with Manual Doors and Lights for Mouse | Med-Associates Inc. | MED-CPP-MS & MED-CPP-3013 | Our laboratory has used these boxes; however, many alternative boxes are available & acceptable. |
| PAS-Home Cage Activity Monitoring Photobeam Arrays | San Diego Instruments | 2325-0223 & 7500-0221 | Our lab houses these arrays inside of custom built chambers, as described in the text. There are alternatives available. |
| Disposable Sani-Cloth disenfecting wipes | PDI | 13872 |
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