Protocol
Все экспериментальные процедуры были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета McLean Hospital мимо. Примечание: Следующий протокол описывает единый подход к CPP и опорно-двигательного аппарата сенсибилизации, многие детали которого отличаются от других успешных протоколов (например, свето- против тестирования темно-фазный, подряд против перемежающейся дозирования и т.д.). Новички, возможно, пожелает начать с этими протоколами, или просто использовать их в качестве проводников, адаптируя изменения из литературы, основанной на экспериментальной вопрос (ы) под рукой. Автоматизированные методы измерений описаны; Однако, можно использовать Неавтоматизированная средства для каждого анализа (т.е., видеозапись, ручной выигрыше).
1. кондиционером Место Предпочтение
- Оборудование и установка комнаты:
- Ручка подопытных мышей в течение 1-3 мин каждый день, по крайней мере 3-5 дней до испытания.
Примечание: Никогда не ручкой мыши могут найти удаление из камеры Stressful, которые могут мешать или изменить кондиционирования. - Получить четыре или более трехкамерный CPP аппараты, предпочтительно оснащенных photobeams для автоматизированного сбора данных 18. Убедитесь, что каждая камера имеет два больших, visually- и тактильно-отчетливые камер, подключенных к меньшим, нейтральной камеру через двери, которые могут быть подняты / снижены для управления доступом. Крышки на каждой камере должен открыть для вставки / удаления мышей и монтироваться с небольшими индивидуально управляемыми (реостатом) огней (по одному на камеру).
Примечание: CPP конструкции камеры различаются и могут быть приобретены на коммерческой основе или построены исследователями. Для "сбалансированный" дизайна, рекомендуемую схему на единицу больше камера с белыми стенами и полом из проволочной сетки, а другой с черными стенами и бар пол. Средней камеры должны иметь серые стены и твердый серый плексигласа пол. В целях объяснения, эти камеры будут называться "белый", "черный" и "средний".Крышки должны быть четкими оргстекла. Альтернативные конфигурации отсек (одно- или двухкамерные) также возможны и обсуждаются в другом месте (см Обсуждение). - Настройка комнате, как это будет во время тестирования: выключить или установить верхний свет в тусклой обстановке и закройте дверцу. Используйте легкий метр внутри каждой камеры и установить крышку фары так, чтобы средние камеры немного ярче (15-20 лк), чем черно-белых камер (6-10 люкс) в целях противодействия мышей от проводить время там.
Примечание: Если среднее время, проведенное в середине находится столько же или больше, чем в черных или белых камер, дальнейшее увеличение освещения контраст, описанные на стадии 1.1.3. В качестве альтернативы, использовать менее привлекательным пол на середину. (Например, ~ 220 отверстий диаметром 0,5 см, равномерно в течение 6 х 3,5 х ¼ "плексигласа), но избежать этого камеру отвращение. Pilot любые изменения для того, чтобы снижается в среднем времени не из-за снижения общего объема исследований (пересечений) , - пrogram автоматизированного сбора данных ( "процедура", рис 1а) или вручную собирать данные в соответствии со следующими параметрами. Набор испытания, чтобы начать на первый перерыв пучка в любом испытательной камере. Набор сессий "тест" на 20 мин в длину и отслеживать потраченное время и лучевые разрывы в каждой камере. SET "кондиционирования" сеансы составит 30 мин долго и (необязательно) для измерения перерывы пучка в каждой камере. Установить все лампочки в камере, чтобы осветить в ходе судебного процесса.
- Подготовьте полный объем раствора кокаина, необходимого для эксперимента в руке. Растворите кокаина HCl в 0,9% NaCl (физиологический раствор), основываясь на конечной концентрации на объеме инъекции 0,1 мл / 10 г веса тела (например, при дозе 5 мг / кг, концентрация раствора 0,5 мг / мл). Vortex смесь в течение 30-45 сек, стерильный фильтр (шприцевые фильтры 0,2 мкм) и хранить при комнатной температуре.
- Ручка подопытных мышей в течение 1-3 мин каждый день, по крайней мере 3-5 дней до испытания.
- Тестирование:
Примечание: Общее график CPP является предтестового, кондиционирование, иЗатем Послетестовое. Дотестовое может быть отделен от кондиционирования 1-3 дней; Однако, кондиционирование и пост-тест день должен проходить на последовательных дней (рис 2А). Такие сроки должны храниться одинаков для всех когорт в том же эксперименте.- Тест во легкой фазы животных с использованием того же устройства для каждого животного через дней.
- Каждое испытание день (т.е., результаты тестов и кондиционирования дней), переместить мышь к поведенческому прихожей и позволить им сидеть спокойно в своих клетках в течение 1-1,5 часов до суда. Выберите место, где мыши могут быть перемещены быстро от их клетке в аппарат, с минимальным ущербом, когда начинается судебный процесс. Включите все оборудование, так что любые шумы, связанные с испытанием (например, оборудование Вентиляторы) присутствуют.
- Тщательно очистить каждый аппарат (внутренние стены, полы и лотки) с легкой, спирта, гликоля по Ethernet или аммиак основе дезинфицирующее салфетки до и после каждой мыши (используйте Сэмае тип пылесоса в течение всего эксперимента). Не пренебрегайте полы нижние.
- Проверьте, что свет в комнате установлены надлежащим образом (в выключенном состоянии или серым цветом) в начале каждого дня.
- Перейти к следующему в соответствии с будь то "тест" или "кондиционирование" день:
- На Пробные дни 1 и 6 (то есть, до и пост-тесты), поместите между камерные двери в открытом положении (рис 2В).
- Загрузите компьютерную программу "тест" и введите животных идентификаторы (рис 1а), то выдать команду начать (рисунок 1b), если это применимо.
- Осторожно опустите каждую мышь в средней камере ее установленного аппарата, обращенной к задней стенке, и мягко закройте крышку. После загрузки все камеры, оставить комнату тестирования и снизить уровень шума.
- Оставьте мышей внутри каждой аппарата до испытаний для всех мышей не закрыли / закончился (рис 1C). Экспорт пробные данные.
<LI> Незадолго до или после предварительных испытаний, взвесить животных. Используйте эти веса для расчетов доз во время выдержки.
- Для того, чтобы подготовиться к кондиционирования испытаний, вычислить предтестовое "предпочтение" Каждая мышь в самых черных и белых камер путем вычитания время, проведенное в каждой из них от другого (например, "черный минус белый" и "белый минус черный"; см Рисунок 3, Колонны 9 & 10).
- Так мышей с сильными начальными предпочтений сделать балансировки трудно, установить приемлемый предел привилегированных баллов (например, <33% от общего времени Trial) и исключить мышей, которые превысит его из расчетов. Используйте либеральную предел (<66% от общего времени Trial), чтобы максимизировать включение при потертость, вероятно после завершения тестирования (например, из-за офф-мишени хирургических манипуляций).
Примечание: Мыши, превышающие предел еще могут быть проверены, с попыткой сохранить свои предтестового предпочтения сбалансированным. Позже, тHESE мыши могут быть исключены из анализа, если это необходимо, чтобы сбалансировать предварительно тестов. Если крайние предтестового уклоны (т.е.> 800 сек) непропорционально влияют одну группу, рассмотреть изменяя среду кондиционирования и / или с использованием других анализов. - Выберите черный или белый камеру как камеры наркотиков сопряжения для каждой мыши, тем временем суммирования соответствующих предтестового привилегированные счеты в каждой группе со следующими приоритетами в виду:
Примечание: Позаботьтесь, чтобы сбалансировать показатели между группами в пределах каждой когорты, а также через любые предыдущие когорт.- Сделать суммы для всех групп, как эквивалент, насколько это возможно.
- Сделать суммы как можно ближе к нулю, насколько это возможно (т.е. выбрать предпочтительный сторону для некоторых мышей и неосновного стороне для других). Если вблизи нулевой суммой невозможно для любого заданного группы, подрегулировать все остальные точно соответствовать лучший получаемый оценки предельной группы, отдавая предпочтение слегка отрицательной групповой подводит надположительным.
- Столько, сколько это возможно, сохранить назначений черный против белого и предпочтительным по сравнению с не-предпочтительных камер для спариваний наркотиков даже в пределах каждой группы.
- Как это не всегда можно встретить вышеуказанных целей, корректировать любые отклонения от решений противоположные балансировочные соображения в более поздних когорт; Однако, старайтесь избегать получения когорты с дико различными средними предварительного тестирования предпочтений.
- На Conditioning дни 2-5, поместите между камерные двери в закрытом положении (рис 2С).
- Подготовьте отдельные шприцы с кокаином (Дни 2 & 4) или физиологический раствор (дни 3 & 5) раствор, как описано в стадии 1.1.5 и на основе веса тела, измеренных при предварительных испытаний.
Примечание: Доза должна быть выбрана с учетом экспериментальных ожиданий, соображений, изложенных во введении, и потенциальных последствий пола и потолка. Часто лучше проводить независимые эксперименты с использованием по меньшей мере двух различных доз. - Нагрузка "сonditioning "компьютерные программные и введите идентификаторы животных (рис 1а), то выдать команду начать (рисунок 1b), если это применимо.
- Скрафф и впрыснуть каждую мышь (IP), сразу опуская их в соответствующий черный или белый камере с присвоенными им аппарата, обращенной к задней стенке, а затем мягко закройте крышку. После загрузки все камеры, оставить комнату тестирования и снизить уровень шума.
- Удалить мышей от их камеры как можно ближе к точно 30 мин, как это осуществимо (т.е. первый мышей удаляются от своих камерах в то время как другие мыши все еще кондиционирование). Удалить животных как можно тише, без введения шума.
- Выбор метода анализа. Либо вычитания время, затраченное на солевом-парные стороне во время пост-теста время от провел на кокаином в паре стороне во время пост-теста (кокаина - солевого, сек) или использовать время, проведенное в камере послетестовым наркотиков в пареминус время предварительного тестирования тратится на камеру с наркотиками в паре.
Примечание: при использовании первого метода, также участок линейные графики среднего времени, проведенного в середине, saline- и наркотиками в паре камер в течение до и после испытаний для каждой группы. По сравнению с предварительных испытаний, пост-тест должен показать увеличенное время в стороне от наркотиков в паре и снижение затрат времени на солевой парные стороны (рисунок 6, внизу, и обсуждение по мотивам). - В зависимости от характера и количества сравниваемых групп, использовать Т-тест, одно- или двухсторонний ANOVA, при необходимости, возможно, с ретроспективном анализе, чтобы проанализировать любой из приведенных выше оценок вычитания.
Примечание: Кокаин привилегированные счеты имеют тенденцию быть переменная, и, кроме того, может быть отрицательным (т.е. указать отвращение к стороне лекарственно-парные). Мыши, которые показывают отвращение не должны быть удалены (если они не являются статистические выбросы), так как это результат нормальный и, вероятно, важно определить различия между грдов в. Ожидать нужно размеров проб от 12 до 30 животных в каждой группе, в зависимости от размера эффекта лечения.
2. Опорно-двигательный сенсибилизация
- Оборудование и установка комнаты
- Получить 4 х 8 (ХхУ) photobeam массив (внешние размеры 11,5 "х 20"). Построить с открытым верхом камера из черного плексигласа (внутренними размерами 22 1/6 "х 13 ¾" х 9 3/8 ") для размещения массива (фиг.4А).
- Подготовьте комнату тестирования так, чтобы красный свет (потолочного или настенного) могут быть использованы в ходе тестирования.
- Подготовьте отдельные программные мероприятия для ежедневных привыкания и нагнетательных испытаний.
- Набор привыкания испытания, чтобы быть 30-60 мин и нагнетательных испытаний, чтобы быть между 60-120 мин (рис 5б). Рекомендуемая длина для каждого 60 мин. Держите длину пробную согласуется по нескольким когорт в том же эксперименте.
- Набор испытания, чтобы начать RecoВИДЕОЗАПИСЬ на первый перерыв пучка, что происходит после того, как сигнал начала была инициирована (5В). Для испытания впрыска, установить стартовый сигнал, так что коробки могут быть запущены индивидуально (не в унисон), если это возможно.
- Набор перерывы света должны быть записаны в пользовательских "бункеров", предпочтительно от 5 мин каждый (5В).
- Подготовьте полный объем раствора кокаина, необходимого для эксперимента в руке. Растворите кокаина HCl в 0,9% NaCl (физиологический раствор), основываясь на конечной концентрации на объеме инъекции 0,1 мл / 10 г веса тела (например, при дозе 5 мг / кг, концентрация раствора 0,5 мг / мл). Vortex смесь в течение 30-45 сек, стерильный фильтр (шприцевые фильтры 0,2 мкм) и хранить при комнатной температуре.
- тестирование
Примечание: На начальном этапе тестирования проходит в течение 10-11 дней подряд. Мыши получали два ежедневных испытаний: привыкание (инъекции бесплатный) и инъекции. Администрирование физиологический раствор в течение первых трех до Fнаши дни (см Обсуждение для важности солевым привыкания) и кокаин в течение следующих семи использующие ту же дозу (например., 15 мг / кг / день).- Каждый день, акклиматизироваться мышей в их клетках в поведенческих приемной в течение 30 мин до 1 ч.
- Подготовьте чистые стандартные мыши размером Прозрачный акриловый жилищные клетки с чрезвычайно тонким слоем свежего постельного белья (например, сосновые стружки, щепа), так чтобы не затенять photobeams, если это потребуется (рис 4C & D).
- Место клетки против оси Y. массива photobeam ближайшем одном конце, так что пять пучки равномерно расположенные вдоль ее длины. Ось Х лучи не используются в этом тесте (фиг 4C & D).
- Возьмите мышей от их родной клетке, в случайном порядке, шкирку и взвесьте. Удалите каждую мышь от весовой лодке базе хвоста (с поддержкой) и место непосредственно в их назначенной опорно-двигательного аппарата клетки. Накройте каждую клетку со стандартным фильтром верхней крышке.
- Подготовьте отдельные шприцы WIth солевой раствор или раствор кокаина, как описано в шаге 2.1.7, на основе веса тела текущего дня. Начните с дозы 15 или 20 мг / кг, и рассмотрим второй эксперимент с использованием более высокую или более низкую дозу (см Обсуждение для соответствующих факторов).
- После привыкания испытания закончились для всех клеток, загрузите программу впрыска.
- По одному, удалить мышей от их тест клетке, шкирку и дать их инъекции (IP). Перед возвращением мышь до своей испытательной клетке, быстро инициировать сигнал начала этой клетке (рис 5C, внизу).
- После того как все испытания инъекций закончились, вернуться мышей в их клетки и их жилищного комнате.
- При желании, позволяют мышей пройти ряд периодов абстиненции и проблем с наркотиками, такими как: той же дозе в качестве оригинального, половина дозы, двойной дозы, затем солевым, позволяя за семь дней до же дозы вызов и от трех до семи дней до каждого дополнительного вызова. Независимо от выбора проблем, maintaiп похожие периоды абстиненции через когорт в пределах эксперимента.
Примечание: Если оригинал доза является высокой (например, 30 мг / кг или выше), дважды доза должна быть пропущена или заменена более низкой дозе. Солевой задача показывает любую условную активацию двигательную со стороны кокаином в паре среды в одиночку, так и в процессе, количество сенсибилизированной передвижения, что является кокаиновой зависимостью (см Обсуждение).
- Статистический анализ
- Выберите часть (ы) каждом испытании, которое будет использоваться для анализа. Большинство кокаин-индуцированной локомоция грызунов наступает в течение первого ~ 15-30 мин после инъекции препарата. В зависимости от задействованных переменных, рассматривает возможность проведения кумулятивного передвижение нескольких временных окон (например, первый 15, 30, 60 и / или 120 мин) или сосредоточиться на независимых сегментов суда.
- Используя временные рамки выбранного, суммировать перерывы луча для каждого животного в день для привыкания и нагнетательных испытаний отдельно, а затемverage сумм для каждой группы. Участок означает и стандартные ошибки среднего (SEM) в линейный график по всем дням. Как лечение может измениться, как мышей реагировать на препарат рано и / или в конце каждого ежедневного испытании, также построить средние перерывы группа пучков с 5-минутным бункера в течение каждого ежедневного проб.
Примечание: Построение среднесуточные активности для привыкания и нагнетательных испытаний (например, первые 15 мин) делает его искусственно показаться, что передвижение гасится инъекции физиологического раствора, но помните, что деятельность имеет (скорее всего) снизился до этого уровня к концу привыкания каждый день , - Анализ последовательных солевые и лекарственного лечения дней отдельно, используя повторных измерений (RM) ANOVAs имеющий внутри-субъектов фактор день / время и в том числе любые между субъектами-факторов в конструкции, в зависимости от обстоятельств. Используйте Т-тест или однофакторного дисперсионного анализа для исследования групповых различий в день 1 кокаина (острое воздействие) и многовариантный ANOVA для вызовов. При необходимости, следовать significancе с тестами после временной или однофакторного ANOVA,.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Представительные результаты анализа CPP показаны на рисунке 6, используя дикого типа мышей C57BL / 6N примерно девять-недельного возраста. Дизайн исследования был 2 х 3 смешанные факториала, с внутри-подвергает переменной Test (до и после) и между-подвергает переменную лечения (физиологический раствор и кокаин 5 и 10 мг / кг). RM ANOVA показали значительное взаимодействие между Диагностика и лечение (F 2,20 = 3,68, р <0,05), что было интерпретировано вместо значительных основных эффектов, наблюдаемых как для теста (F 1,20 = 9,86, р <0,01) и Лечение (F 1,20 = 4,37; р <0,05). Подать сравнения специальных показал, что ни одна из групп не отличались друг от друга в ходе предварительных испытаний. В пост-теста, 5 мг / кг и 10 мг / кг существенно не отличаются друг от друга; Однако, обе группы показали значительно большую предпочтение камере кокаином паре, чем физиологический раствор только контрольной группе (Тьюки: 5 мг / кг, р <0,5; 10 мг / кг, р &# 60; 0,01). Кроме того, Бонферрони постфактум тесты показали, что оба 5 (р <0,05) и 10 (р <0,05) мг / кг группы показали большее предпочтение для кокаина в паре стороне сразу после обучения по сравнению с предварительных испытаний, в то время как физиологический -saline группа не показали никаких изменений от пре- к пост-теста.
Представительные результаты анализа локомоторной показаны на фиг.7А и В с использованием дикого типа мышей C57BL / 6N управления однопометница из серии отдельных экспериментов, которые были ранее опубликованных 18. После акклиматизации к засоленных инъекций в течение 3-4 дней, мышам одной инъекции кокаина (IP) на 5, 10, 15 или 30 мг / кг в день в течение семи дней. После семи- или 14-дневного периода отмены, каждая группа получила кокаин вызов по первоначальной дозы, то после дальнейших (переменной) периоды абстиненции, некоторые получили дополнительные проблемы кокаина на других дозах, как показано. Для целей демонстрации эффекта дозы кокаина на locomOTOR сенсибилизация в настоящей публикации, четыре различные группы дозы были объединены в 4 х 7 смешанной факторного дизайна, с течение-подвергает переменную день (первые 7 инъекций кокаина) и между-субъектов фактор дозы. RM ANOVA показали значительное взаимодействие между дозой и день (F 18,276 = 12,53, р <0,0001), который был интерпретирован вместо значительных основных эффектов, которые наблюдались также и для Дня (F 6276 = 18,25, р <0,0001) и доза ( F 3,46 = 22,63, р <0,0001). Тьюки постфактум анализы показали значительные общие различия между 5 и 15 мг / кг (р <0,0001), 5 и 30 мг / кг (р <0,0001), и 10 и 15 мг / кг (р <0,01). Обнаружен ряд существенных различий, когда группы были сравнены каждый день. Отметить различия День 1 Кокаин (5 против 30 мг / кг, р <0,01; 10 против 30 мг / кг, р <0,05; 15 против 30 мг / кг, р <0,01) и День 7 Кокаин ( 5 против 10 мг / кг, р <0,05; 5 против 15 мг / кг, р <0,0001; 10 против, 15 мг / кг, р <0,01; 15 против 30 мг / кг, р <0,0001). На фиг.7С показывает макет фигуры, иллюстрирующие основные аспекты двигательной сенсибилизации, что может отличаться групп лечения количество. В то время как эти признаки показаны независимо здесь, можно также наблюдать разницу в их комбинации.
Рисунок 1. Мед PC CPP управления основным сессия. (А) По умолчанию дисплея, открытого значок сессия (красная коробка), и диалоговое окно открытая сессия (вставка). Выберите "пользовательский файла" и использовать окно папки, чтобы перейти в папку данных и имя сессии. Выберите соответствующую программу из "процедуры" выпадающего списка. Для каждой коробке в использовании, проверьте номер ящика и введите необходимую информацию в условии, эксперимент, и групповых ящиков. (B) Нагрузка дисплей камеры, начать значок сигнала (синяя коробка), и отправить знакдиалоговое окно аль (вставка). После того как все данные камеры введен, выберите камеры, которые будут загружены и выдача сигнала запуска. Камеры теперь будет вызвана лучевой перерыва для запуска таймера сеанса и сбора данных. (С) закончилась дисплей сессия. Как каждая камера завершает назначенный программу, площадь сбора данных (зеленый ящик) станет статичным и информация Камера площадь (Orange Box) покажет камеры как "закрыты". Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Рисунок 2. Конфигурация камеры CPP. (А) Образец экспериментальная линия времени. Дотестовое сопровождается ежедневной переменного кокаина (серый) и солевым раствором (белый) сессий кондиционирования. Пост-тест проводится 24hrs после последней сессии кондиционирования. ( Б) Открытое конфигурации камера для использования в пред- и пост-тестовых сессий. Обратите внимание, что между камерные двери в поднятом / открытом положении. (C) Закрытое конфигурации камера для использования в сессиях кондиционирования. Обратите внимание, что ручные двери опускается, не имея доступа между камерами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Рисунок 3. Сбалансированные расчеты конструкции CPP. Пример, показывающий расчеты и цели при балансировке предварительно тестов в CPP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
ig4.jpg "/>
Рисунок 4. Локомоторная палата Конфигурация. (А) Внешний камера состоит из черного непрозрачного коробке, внутри которой антенная решетка плотно прилегает (B). Корпус / коробка ботинка размера камеры должны быть заполнены тонким слоем подстилки (C) и размещают таким образом, что лучи равномерно распределены вдоль длинной оси (D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Рисунок 5. Опорно-двигательный палата Компьютер Операция. (А) По умолчанию Компьютерная программа. Начать новую базу данных сеанса (Blue Box и вставка). Переименовать файл и каталог для каждого эксперимента (синий суб-вставка). Создать новый сеанс (красный флажок и вставка) с уникальным идентификатором. Редактировать Сессия (красный вставка) и антер информация идентификатора животных на вкладке камеры (зеленый ящик и вставка) и настроить старт / стоп управления для каждого типа сеанса (Orange Box). (B) Выберите надлежащий контроль старт-стоп для каждого типа сеанса. Установите длину интервала 300 секунд (в течение 5 мин бен) и 12 интервалов в каждой фазе (в течение 1 часа сессии). Для привыкания сессий (слева), камеры будут срабатывать, чтобы начать в унисон (вручную включить этап ... Все в Unison) и начнет мониторинг за деятельность сразу после первого перерыва пучка. Для инъекций сессий (справа), камеры будут срабатывать индивидуально (вручную включить этап ... индивидуально экранные кнопки) и начнет мониторинг для деятельности сразу после первого перерыва пучка. Оба типа сеанс закончится, если общее время фазы истек для каждой камеры индивидуально. (C) После начала сеанса, привыкания сессий может быть запущен, нажав кнопку "начать все" (вверху). Обратите внимание, что после того, как Triggтч, все камеры будут ждать первого перерыва пучка, чтобы начать сеанс. Для сеансов инъекций, каждая камера может быть запущен самостоятельно (дно). Обратите внимание, что после срабатывания отдельных камер (в то время как животное находится вне камеры для инъекций), камеры будут ждать первого перерыва пучка, чтобы начать сеанс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Рисунок 6. Результаты представитель CPP. (Вверх) В CPP, мыши показали значительное предпочтение камере ранее сопряженное с кокаином (5 или 10 мг / кг), в то время как мыши, которые получали физиологический раствор спариваний в обеих камерах не разработать любой предпочтение. Колонка аббревиатуры обозначают значительные различий между группами из меченого бар по сравнению с отмеченным группы в то же тестирования Tiмне указать. (Внизу) Построив время, проведенное в кокаиновой против солевым паре камер во время до и после испытаний, увеличивается в кокаином в паре стороне можно увидеть в 5 и 10 мг / кг групп в которые за счет времени провел в обоих солевым раствором в паре и средних камер. В противоположность этому, не было никаких разительных отличий времени, проводимого в любом камере между до и после испытаний в контрольной группе физиологический. Данные приведены как среднее ± SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Рисунок 7. Представитель результаты опорно-двигательного сенсибилизации (А) полезных перерывов света в течение первых 20 мин каждой ежедневной суда в течение четырех отдельных доз:. 5, 10, 15 и 30 мг / кг у мышей дикого типа с последующим-же, наполовину дважды дозаг соленых проблемы, модифицированные из (18). Все группы получали вызовы же дозах любым из них (10, 15, 30 мг / кг) или два (5 мг / кг) недель после последней экспозиции кокаина. Некоторые группы получали дополнительные проблемы, которые проводились при различных периодов абстиненции. (Б) Участок данных локомоторных (перерывы пучок света), суммированных по 5-мин бункера для ежедневных испытаний в течение 15 мг / кг кокаина сенсибилизации эксперимента. (C) иллюстрации, показывающие различия в двигательной сенсибилизации для двух групп лечения, которые в основе которых лежат (слева) различий острую реакцию кокаина, (в середине) разница в скорости сенсибилизация или (справа) различия в максимальной сенсибилизации. Данные приведены как среднее ± SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол демонстрирует способы условного место предпочтений и локомоторной сенсибилизации, каждый из которых может быть использован средним лаборатории для оценки аспектов поведенческой пластичности медикаментозного. Как и в большинстве поведенческих тестов, существуют дополнительные соображения достойные Помимо основного протокола. Во-первых, каждый из этих методов может быть задумана как имеющие две фазы: индукцию и экспрессию. "Индукция" охватывает развитие поведения-за CPP это происходит во время кондиционирования, а также для сенсибилизации это начальный период (как правило, подряд) воздействия препарата. "Выражение" для CPP является пост-тест, в то время как для сенсибилизации она может быть определена как вызов наркотиков данного либо после снятия или просто в качестве последнего последовательного воздействия.
Стоит рассмотреть вопрос об ограничении манипуляций с одним из этих фаз по сравнению с другой, чтобы лучше разбора своих потенциальных эффектов. Вирусы с временно ограниченной эффективности (например, HSV) или наркотиков со-управлений / предварительной обработки (например, агонисты / антагонисты) являются полезными в таких усилиях. При таком подходе может быть дополнительно необходимо использовать сжатые протоколы, так что определенная фаза будет лучше совпадают с вирусной экспрессии. Для CPP, можно провести методом кондиционирования двухдневный, как мы описали ранее 37. Специально для опорно-двигательного аппарата сенсибилизации, изменения в период вывода между индукцией и выражения в сочетании с этими методами, может раскрыть процессы, вовлеченные в поддержании или стабильность поведения. Кроме того, такие подходы могут быть использованы для изучения феномена перекрестной сенсибилизации, где сенсибилизированные поведение индуцированного с помощью одного препарата, но может быть выражено путем воздействия на другое лекарство. Так кросс-сенсибилизация не происходит между всеми сенсибилизирующим злоупотреблением наркотиками, может вызывать сенсибилизированные поведение, которое несколько отличается от оригинала, и не обязательно двунаправленнаялюбой заданный набор препаратов, его экспертиза может предложить уникальные возможности понять, где и как различные препараты влияют пластичность мозга и функции.
Правильное толкование CPP, в частности, зависит от исключения альтернативных объяснений результатам. Данные, полученные в трехкамерный аппарата должны быть дополнительно изучены перед определением вычитание от времени, проведенного в солевом-парные стороне от кокаина в паре стороне сразу после обучения, как предпочтения, так как увеличение предпочтением в сторону наркотиков в паре, что результаты исключительно из-за снижения времени, затраченного в солевом-парные камеры, вероятно непригодным для такой интерпретации. Средней камеры позволяет этого результата, поскольку мышь может изменить время, проведенное там вместо камеры с наркотиками в паре. Это также можно наблюдать повышенное время, проведенное в сторону лекарственной паре за счет средней камеры вместо физиологического раствора в паре стороне; возможно, этот результат может все еще быть приемлемо interpreTed как увеличение предпочтения наркотиков. Включение третьем отсеке обеспечивает нейтральный камеру, которая позволяет объективную размещение животного во пред- и пост-тестовых сессий 41. Хотя это и полезно для решения первичного размещения уклоны, способствующих тест-дневных оценкам, третья камера не требуется для кондиционирования. Альтернативные конструкции CPP, которые показывают два различных отделений или одного отсека с различными конфигурациями стимулирования рассматриваются в других 41-42.
Любой дефицит в месте предпочтение препарата также должно сопровождаться оценкой как способность к обучению контекстные ассоциации и общую функцию вознаграждения. Есть целый ряд корректировок, которые могут быть внесены в парадигме CPP, которые могут помощником в интерпретации измененной предпочтения, в том числе модификации выпукло ПСК (наркотиков) путем увеличения (или уменьшения) количества спариваний или с помощью более высокую или низкую препарат дозировать. CPP может быть выполнена с использованием приемлемое FOOD (например, с высоким содержанием жира, сахарозы) или социальные взаимодействия, чтобы оценить, является ли наблюдаемое изменение относится только к препарату или имеет отношение к природным наград; без CPP подходы полезны для этой цели включают внутричерепное самостимуляция, предпочтение сахарозу, и / или аппетитивных задач подход. Тем не менее, все эти варианты различаются по своей способности адекватного решения нужный вопрос. Пищевая основе СРР может быть особенно полезным, так как нормальная реакция продемонстрировать способность к обучению и образованию соответствующих контекстных ассоциаций с естественным вознаграждение. Дополнительные элементы управления для оценки способности к обучению включает задачи, которые полагаются на контекстной обучения / памяти (контекстная страх кондиционирования и CPA). CPA имеет то преимущество, что работать аналогично CPP, часто в тех же камерах, заменив аппетитивную препарат с аверсивного опыта (например, литий хлорид инъекции). Животные, которые показывают дефициты в CPP, но нормальный CPA, демонстрируют способность к образованию соответствующего контекстную связьы, что свидетельствует о нарушения в CPP наркотиков, скорее всего, относятся к наградить (препарат-специфических или иным образом). Одно предостережение для CPA с использованием хлорида лития, чтобы рассмотреть этот препарат является ли известная лечения для любого состояния, которые могут быть смоделированы с помощью экспериментальных животных. Например, лечение лития было показано, чтобы противодействовать дефицита обучения в мышиной модели Fragile X 43, которая будет в тупик этот метод управления.
В дополнение к классическим парадигмы CPP, есть потенциальные расширения пользователи могут оказаться полезными, например, тестирование исчезновения ученого наркотиков контекстного ассоциации и ее восстановление после CPP. Условных рефлексов (CRS), когда она будет создана, может сохраняться в течение длительных периодов 19,20, когда животные оставляют в покое. Несмотря на относительную сохранением ЧР, он может быть эффективно потушен с помощью повторных презентаций CS (контекста) в отсутствие ПСК (лекарственной). Два метода исчезновения CPP появляются в освещеннойтературы: повторное воздействие тест без инъекций 21 или повторно спариваний ранее лекарственной паре бок с автомобиля 22. Исчезновение процессы отражают новые знания, в отличие от "Отучиться" оригинального кондиционирования, идея эффективного нашло свое отражение "восстановление". Восстановление классически вызваны повторного воздействия на ПСК, которая производит восстановление ЧР. В контексте CPP, одна инъекция препарата учебного вызовет животных, чтобы показать место предпочтение. Интересно, что многие не-учебные сигналы наркотиков может также производить восстановлении CPP, в том числе грунтовки с альтернативными препаратами 22 и различных стрессовых 23-26. Исчезновение и восстановительные эксперименты представляют особый интерес для области наркозависимости как модели медикаментозного лечения и рецидивов. Вмешательства, которые улучшают скорость исчезновения и / или уменьшить величину восстановления может быть ценным мишенью для человека фармакотерапии.
(например, 27-29). Примечательно, однако, контекстно-независимым сенсибилизация ясно было продемонстрировано в других исследованиях (например, 30-32). Экспериментальные данные, которые могут способствовать ли контекстно-зависимыми увеличение сенсибилизации наблюдается включают дозу препарата, продолжительность воздействия, должны ли быть перевезено любая группа для вывода памятие сенсибилизация и некоторые аспекты предварительного воздействия испытательной камере; Однако, эти детали остаются несколько неясными. Один из способов определения вклада контекстной сенсибилизации, чтобы дать солевое вызов следующей наркотиков сенсибилизации 33. Применение описанного парадигмы минимизирует вклад контекстно-зависимой сенсибилизации, что подтверждается очень небольшим активации локомоторной в предыдущих исследованиях при солевом вызов. Контекстная вклад в сенсибилизации был рассмотрен в ряде работ, часто в том числе обсуждений, отличных от двигательной активности 34 поведения.
Чтобы ограничить загрязнение активации медикаментозного и сенсибилизации с двигательной стимулирующего воздействия, вызванные новой среде, мышей приспособиться к инъекции физиологического раствора в течение трех-четырех дней в начале каждого эксперимента. Как можно видеть на фиг.7, мышей обычно показывают пониженную двигательную между первым иПоследнее солевой акклиматизации день. Кроме того, у мышей заметно спокойнее и проще в обращении и придать последним физиологическим воздействием. Предыдущие работы протестировали несколько штаммов и генотипов мышей, используя эту парадигму и не видят особого дисперсию в солевом акклиматизации активности в них; Однако, можно иногда наблюдать очень сильные гиперактивность фенотипы, связанные с конкретным генотипом, которые не преодолены с помощью этого метода. В этих случаях, может быть желательно, чтобы выполнить несколько солевых дней акклимационный (до локомоции плато на гиперактивного группы), а затем нормализуют гиперактивный группу с контрольной группой с использованием впрыска день данные последней солевые. Хотя это и не идеальный, это позволяет более разумной сравнения эффектов препарата на передвижения между этими группами. Другие варианты, которые могут смягчить крайнюю гиперактивность являются продлить привыкания длину пробную перед инъекцией каждый день по одному до 5 ч, и / или использовать более длинные пробы инъекций (2 - 4 ч) еACH день.
Есть дополнительные соображения, которые важны для интерпретации поведения опорно-двигательного аппарата. Как показано на фиг.7С, наблюдаемые различия между группами могут быть объясняется главным образом различиями в острой реакции локомоторной, скорость сенсибилизации в течение нескольких дней, максимальный предел сенсибилизации, или некоторую комбинацию этих факторов. Разбор вклад этих факторов в отдельности может быть полезным. Для этой цели, острая локомоторную реакцию можно статистически анализировали в покое. Тогда скорость сенсибилизации может быть оценена с помощью программы, способной подгонки кривой и процесса нормализации ставка дисконтирования любые острые различия опорно-двигательного аппарата. Измененные максимальная сенсибилизация обычно раскрывается в РМ ANOVA за последовательных дней воздействием наркотиков, где последующие день за днем сравнения апостериорных являются существенными в дни после ответы группы имеют плато. Следует помнить, что максимальная сенсибилизация не может быть определенадля любой группы, которая поддерживает линейный отклик двигательную над воздействием наркотиков дни, такие как изображается на рисунке 7С (середина; синяя линия). В таком случае, воздействие лекарственного средства может быть продлен, чтобы попытаться определить максимальную чувствительность.
Наконец, это правило, лучше, чтобы сравнить сенсибилизацию между группами с использованием, по меньшей мере два первичных дозы препарата, выполняемые в отдельных когорт животных. Различия в любой из вышеперечисленных аспектов активации опорно-двигательного аппарата, при одной дозе или оба, должны быть использованы, чтобы направлять дальнейшее тестирование, чтобы исключить другие объяснения, в том числе изменений в развитии стереотипии. Повторное воздействие некоторых лекарств, таких как кокаин и амфетамин, не только производит сенсибилизированной передвижение в зависимости от дозы, но и повышает чувствительность конкурирующих поведенческих стереотипов. Эти стереотипии становятся особенно явной при высоких дозах, таких, что локомоторная сенсибилизация часто частично или полностью закрыт, но снова показал при введенииболее низкая доза. По этой причине, "дефицит" в опорно-двигательной сенсибилизации в одной экспериментальной группе может фактически отражает повышенная чувствительность к наркотиков индуцированных развития стереотипии. Оценка стереотипии может быть сложным, но есть ряд опубликованных шкал 35 и других подходов 36. Используя как общее стереотипии масштаб и оценку определенного поведения рекомендуется, так как опубликованные ранее 18.
В заключение, ряд поведенческих тестов были разработаны в животных моделях, в попытке разобрать сложность человеческого наркомании. Кондиционером место предпочтение, опорно-двигательного сенсибилизация два основных испытания широко используется в грызунов и, соответственно, они могут быть особенно полезны при оценке раннего награду лекарственной связано и упорной пластичности, вызванной повторного использования. Есть ряд соображений по проектированию и интерпретации каждого типа исследования, что делает его пристаthwhile внимательно рассмотреть экспериментальные цели и предыдущий литературу при планировании этих оценок.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Авторы благодарят Karen Dietz и Шари Бирнбаум для предыдущего входа на поведенческих конструктивных соображений и Лорен Peca за помощь поведенческим тестированием. Авторы также признательность за щедрую поддержку Фонда Simons (грант Фонд Саймонса Инициатива изучения аутизма, чтобы КХО), NIDA (DA008277, DA027664 и DA030590 к КХО, F32DA027265 к LNS и F32DA036319 к RDP), Фонд FRAXA исследовательского и Элеоноры и Miles Программа по Шору стипендий (стипендий поддержка LNS), и программа стипендий Джон Kaneb (общение поддержка MT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cocaine Hydrochloride USP | Mallinckrodt Pharmaceuticals | 0406-1520 | Purchase and use (Schedule II controlled substance) for research purposes requires compliance and licensure according to state and federal law. |
| Conditioned Place Preference, Three Compartment Apparatus with Manual Doors and Lights for Mouse | Med-Associates Inc. | MED-CPP-MS & MED-CPP-3013 | Our laboratory has used these boxes; however, many alternative boxes are available & acceptable. |
| PAS-Home Cage Activity Monitoring Photobeam Arrays | San Diego Instruments | 2325-0223 & 7500-0221 | Our lab houses these arrays inside of custom built chambers, as described in the text. There are alternatives available. |
| Disposable Sani-Cloth disenfecting wipes | PDI | 13872 |
References
- National Institute on Drug Abuse. Drug Facts: Understanding Drug Abuse and Addiction. www.drugabuse.gov. , Available from: http://www.drugabuse.gov/publications/drugfacts/understanding-drug-abuse-addiction (2012).
- Kasanetz, F., et al. Transition to addiction is associated with a persistent impairment in synaptic plasticity. Science. 328 (5986), 1709-1712 (2010).
- Beach, H. D.
- van der Kooy, D. Chapter 13, Place Conditioning: A simple and effective method for assessing the motivational properties of drugs. Methods of Assessing the Reinforcing Properties of Abused Drugs. Bozarth, M. A. , 229-240 (2012).
- Carlezon, W. A. Place conditioning to study drug reward and aversion. Methods Mol Med. 84, 243-249 (2003).
- Prus, A. J., James, J. R., Rosecrans, J. A. Chapter 4, Conditioned Place Preference. Methods of Behavior Analysis in Neuroscience. Buccafusco, J. J. , (2009).
- Tzschentke, T. M. Measuring reward with the conditioned place preference (CPP) paradigm: update of the last decade. Addict Biol. 12 (3-4), 227-462 (2007).
- Aguilar, M. A., Rodrìguez-Arias, M., Miñarro, J. Neurobiological mechanisms of the reinstatement of drug-conditioned place preference. Brain Res Rev. 59 (2), 253-277 (2009).
- Feduccia, A. A., Duvauchelle, C. L. Novel apparatus and method for drug reinforcement. JoVE. (42), (2010).
- Brabant, C., Quertemont, E., Tirelli, E. Influence of the dose and the number of drug-context pairings on the magnitude and the long-lasting retention of cocaine-induced conditioned place preference in C57BL/6J mice. Psychopharmacology. 180 (1), 33-40 (2005).
- Pliakas, A. M., Carlson, R. R., Neve, R. L., Konradi, C., Nestler, E. J., Carlezon, W. A. Altered responsiveness to cocaine and increased immobility in the forced swim test associated with elevated cAMP response element-binding protein expression in nucleus accumbens. J Neurosci. 21 (18), 7397-7403 (2001).
- Knackstedt, L. A., Samimi, M. M., Ettenberg, A. Evidence for opponent-process actions of intravenous cocaine and cocaethylene. Pharmacol Biochem Behav. 72 (4), 931-936 (2002).
- Post, R. M., Rose, H. Increasing effects of repetitive cocaine administration in the rat. Nature. 260 (5553), 731-732 (1976).
- Marin, M. T., Cruz, F. C., Planeta, C. S. Cocaine-induced behavioral sensitization in adolescent rats endures until adulthood: lack of association with GluR1 and NR1 glutamate receptor subunits and tyrosine hydroxylase. Pharmacol Biochem Behav. 91 (1), 109-114 (2008).
- Henry, D. J., White, F. J. The persistence of behavioral sensitization to cocaine parallels enhanced inhibition of nucleus accumbens neurons. J Neurosci. 15 (9), 6287-6299 (1995).
- Hope, B. T., Simmons, D. E., Mitchell, T. B., Kreuter, J. D., Mattson, B. J. Cocaine-induced locomotor activity and Fos expression in nucleus accumbens are sensitized for 6 after repeated cocaine administration outside the home cage. Eur J Neurosci. 24 (3), 867-875 (2006).
- Shuster, L., Yu, G., Bates, A. Sensitization to cocaine stimulation in mice. Psychopharmacology. 52 (2), 185-190 (1977).
- Smith, L. N., Jedynak, J. P., Fontenot, M. R., Hale, C. R., Dietz, K. C., Taniguchi, M., Thomas, F. S., Zirlin, B. C., Birnbaum, S. G., Huber, K. M., Thomas, M. J., Cowan, C. W. Fragile X mental retardation protein regulates synaptic and behavioral plasticity to repeated cocaine administration. Neuron. 82 (3), 645-658 (2014).
- Mueller, D., Stewart, J. Cocaine-induced conditioned place preference: reinstatement by priming injections of cocaine after extinction. Behav Brain Res. 115 (1), 39-47 (2000).
- Sakoori, K., Murphy, N. P. Maintenance of conditioned place preferences and aversion in C57BL6 mice: effects of repeated and drug state testing. Behav Brain Res. 160 (1), 34-43 (2005).
- Bardo, M. T., Neisewander, J. L., Miller, J. S. Repeated testing attenuates conditioned place preference with cocaine. Psychopharmacologia. 89 (2), 239-243 (1986).
- Itzhak, Y., Martin, J. L. Cocaine-induced conditioned place preference in mice: induction, extinction and reinstatement by related psychostimulants. Neuropsychopharmacology. 26 (1), 130-134 (2002).
- Kreibich, A. S., Blendy, J. A. cAMP response element-binding protein is required for stress but not cocaine-induced reinstatement. J Neurosci. 24 (30), 6686-6692 (2004).
- Briand, L. A., Blendy, J. A. Not all stress is equal: CREB is not necessary for restraint stress reinstatement of cocaine-conditioned reward. Behav Brain Res. 246, 63-68 (2013).
- Redila, V. A., Chavkin, C. Stress-induced reinstatement of cocaine seeking is mediated by the kappa opioid system. Psychopharmacology. 200 (1), 59-70 (2008).
- Do Couto, R. ibeiro, Aguilar, B., A, M., Manzanedo, C., Rodriguez-Arias, M., Armario, A., Minarro, J. Social stress is as effective as physical stress in reinstating morphine-induced place preference in mice. Psychopharmacology. 185 (4), 459-470 (2006).
- Post, R. M., Lockfeld, A., Squillace, K. M., Contel, N. R. Drug-environment interaction: context dependency of cocaine-induced behavioral sensitization. Life sciences. 28 (7), 755-760 (1981).
- Badiani, A., Browman, K. E., Robinson, T. E. Influence of novel versus home environments on sensitization to the psychomotor stimulant effects of cocaine and amphetamine. Brain Res. 674 (2), 291-298 (1995).
- Li, Y., Acerbo, M. J., Robinson, T. E. The induction of behavioural sensitization is associated with cocaine-induced structural plasticity in the core (but not shell) of the nucleus accumbens. Eur J Neurosci. 20 (6), 1647-1654 (2004).
- Partridge, B., Schenk, S. Context-independent sensitization to the locomotor-activating effects of cocaine. Pharmacol Biochem Behav. 63 (4), 543-548 (1999).
- Le Foll, B., Diaz, J., Sokoloff, P. Increased dopamine D3 receptor expression accompanying behavioral sensitization to nicotine in rats. Synapse. 47 (3), 176-183 (2003).
- Heidbreder, C. A., Babovic-Vuksanovic, D., Shoaib, M., Shippenberg, T. S. Development of behavioral sensitization to cocaine: influence of kappa opioid receptor agonists. J Pharmacol Exp Ther. 275 (1), 150-163 (1995).
- Tirelli, E., Michel, A., Brabant, C. Cocaine-conditioned activity persists for a longer time than cocaine-sensitized activity in mice: implications for the theories using Pavlovian excitatory conditioning to explain the context-specificity of sensitization. Behav Brain Res. 165 (1), 18-25 (2005).
- Anagnostaras, S. G., Schallert, T., Robinson, T. E. Memory processes governing amphetamine-induced psychomotor sensitization. Neuropsychopharmacology. 26 (6), 703-715 (2002).
- Spangler, R., Zhou, Y., Schlussman, S. D., Ho, A., Kreek, M. J. Behavioral stereotypies induced by 'binge' cocaine administration are independent of drug-induced increases in corticosterone levels. Behav Brain Res. 86 (2), 201-204 (1997).
- Kelley, A. E. Measurement of rodent stereotyped behavior. Curr Protoc Neurosci. Chapter 8, Unit 8.8 (2001).
- Taniguchi, M., Carreira, M. B., Smith, L. N., Zirlin, B. C., Neve, R. L., Cowan, C. W. Histone deacetylase 5 limits cocaine reward through cAMP-induced nuclear import. Neuron. 73 (1), 108-120 (2012).
- Zangen, A., Solinas, M., Ikemoto, S., Goldberg, S. R., Wise, R. A. Two brain sites for cannabinoid reward. J Neurosci. 26 (18), 4901-4907 (2006).
- Huston, J. P., de Souza Silva, M. A., Topic, B., Müller, C. P. What's conditioned in conditioned place preference. Trends Pharmacol Sci. 34 (3), 162-166 (2013).
- Schechter, M. D., Calcagnetti, D. J. Trends in place preference conditioning with a cross-indexed bibliography; 1957-1991. Neurosci Biobehav Rev. 17, 21-41 (1993).
- Bevins, R. A., Cunningham, C. L. Chapter 9, Place Conditioning: A Methodological Analysis. Tasks and Techiniques: A sampling of methodologies for the investigation of animal learning, behavior, and cognition. Anderson, M. , 99-110 (2006).
- Hitchcock, L. N., Cunningham, C. L., Lattal, K. M. Cue configuration effects in the acquisition of a cocaine-induced place preference. Behav Neurosci. 128 (2), 217-227 (2014).
- Liu, Z. -H., Chuang, D. M., Smith, C. B. Lithium amerliorates phenotypic deficits in a mouse model of fragile X syndrome. Int J Neuropscyhopharmacol. 14 (5), 618-630 (2011).
- Bardo, M. T., Rowlett, J. K., Harris, M. J. Conditioned place preference using opiate and stimulant drugs: A meta-analysis. Neurosci Biobehav Rev. 19 (1), 39-51 (1995).
