Protocol
Alla experimentella förfaranden har godkänts av McLean Hospital Institutional Animal Care och användning kommittén. OBS: Följande protokoll beskriver en enda strategi för CPP och rörelse sensibilisering, många detaljer som skiljer sig från andra framgångsrika protokoll (t.ex. ljus- kontra mörk fasprovning, rad kontra intermittent dosering, etc.). Nybörjare kanske vill börja med dessa protokoll, eller helt enkelt använda dem som guider, anpassar förändringar från litteraturen baserad på den experimentella frågan (s) till hands. Automatiserade mätmetoder beskrivs; Det är dock möjligt att använda icke-automatiska metoder för varje analys (dvs, videoinspelning, hand poäng).
1. miljöbetingad preferens
- Utrustning och Rums Set-Up:
- Handtag experimentella möss för 1-3 minuter varje dag, under åtminstone 3-5 dagar före testning.
OBS: Aldrig handtag möss kan finna avlägsnas från kammaren stressful, som kan störa eller ändra konditione. - Skaffa fyra eller fler tre-chambered CPP apparater, företrädesvis utrustade med photobeams för automatiserad datainsamling 18. Se till att varje kammare har två större, visually- och taktilt-distinkta kammare ansluter till en mindre, neutral kammaren via dörrar som kan höjas / sänkas för att kontrollera åtkomsten. Lock på varje kammare bör öppna för insättning / borttagning av möss och monteras med små, individuellt styrbara (dimbara) ljus (en per kammare).
OBS: CPP kammar mönster varierar och kan köpas kommersiellt eller konstrueras av forskare. För "balanserad" utformning, är en rekommenderad ordning en större kammare med vita väggar och trådgaller golv och den andra med svarta väggar och bar golv. Den mellersta kammare ska ha grå väggar och fast grå plexiglas golv. För förklaring ändamål, kommer dessa avdelningar att kallas "vit", "svart" och "mitt".Lock ska vara klar plexiglas. Alternativa fackkonfigurationer (en- eller två kammare) är också möjliga och diskuteras på annat håll (se diskussion). - Ställ in rummet eftersom det blir under testningen: stänga av eller sätta lampor till dimmest inställningen och stänga dörren. Använd en ljusmätare i varje kammare och sätta locket ljus så att mellankammare är något ljusare (15-20 lux) än svartvita kammare (6-10 lux) för att avskräcka möss från att spendera tid där.
OBS: Om den genomsnittliga tid som tillbringas i mitten är lika mycket eller mer än i de svarta eller vita kammare, ytterligare öka belysningen kontrasten beskrivs i steg 1.1.3. Alternativt kan du använda mindre tilltalande golv för mitten. (T.ex. ~ hål diameter 220 0,5 cm, jämnt fördelade i 6 x 3,5 x ¼ "Plexiglas), men undvika att göra denna kammare obehaglig. Pilot några ändringar för att säkerställa att minskningar i mitten tid inte beror på minskningar i total utforskning (korsningar) . - Program insamling automatiserade uppgifter ( "förfarandet" Figur 1A) eller manuellt samla in data enligt följande parametrar. Ställ försök att starta på den första strålen avbrott i antingen konditioneringskammare. Som "test" sessioner att vara 20 minuter i längd och att spåra tid och balk avbrott i varje kammare. Som "konditionering" sessioner att vara 30 minuter lång och (eventuellt) för att mäta balk avbrott i varje kammare. Ställ alla kammar lampor för att lysa under rättegången.
- Förbered full volym av kokain lösning som krävs för experimentet till hands. Lös kokain HCl i 0,9% NaCl (saltlösning), basera den slutliga koncentrationen på en injektionsvolym av 0,1 ml / 10 g kroppsvikt (t.ex. för en dos av 5 mg / kg, är lösningen koncentration 0,5 mg / ml). Vortex blandningen i 30-45 sekunder, sterilt filter (0,2 um sprutfilter) och förvara vid rumstemperatur.
- Handtag experimentella möss för 1-3 minuter varje dag, under åtminstone 3-5 dagar före testning.
- Testning:
OBS: Den allmänna tidsplan för CPP är pre-test, luftkonditionering, ochdå POST-TEST. Förtest kan separeras från konditionering med 1-3 dagar; emellertid bör konditioneringen och post-testdagen äga rum på varandra följande dagar (Figur 2A). Denna timing bör vara densamma för alla kohorter i samma experiment.- Test under djurens lättfas användning av samma utrustning för varje djur över dagar.
- Varje försök dag (dvs, tester och konditione dagar), flytta möss till beteende förrum och låta dem sitta ostört i deras hem burar för 1-1,5 timmar före försöket. Välj en plats där möss kan flyttas snabbt från sin bur till apparaten, med minimal störning, när rättegången börjar. Slå på all utrustning så att eventuella ljud i samband med testet (t.ex. utrustning fläktar) är närvarande.
- Rengör varje apparat (innerväggar, golv och brickor) med mild, alkohol-, glykoleter eller ammoniakbaserade desinficerande våtservetter före och efter varje mus (använd same typ av renare hela experimentet). Inte försumma golvsidor.
- Kontrollera att rums ljus sätts på lämpligt sätt (off eller nedtonade) i början av varje dag.
- Fortsätt med följande beroende på om det är ett "test" eller "konditionering" dag:
- På Testdagar 1 och 6 (dvs före och efter test), placera mellankammardörrar i öppet läge (figur 2B).
- Ladda "test" datorprogram och ange djur ID (Figur 1A), sedan utfärda startkommando (Figur 1B), i förekommande fall.
- Försiktigt lägre varje mus i mittkammaren av sin tilldelade apparat, mot bakväggen och mjukt stäng locket. När alla kamrarna är laddade, lämna provningsrummet och minimera buller.
- Lämna möss i varje apparat tills prövningar för alla möss har stängt / avslutade (Figur 1C). Export försöksdata.
<li> Precis före eller efter pre-test, väga djuren. Använd dessa vikter för dosberäkningar under konditioneringen.
- För att förbereda för försök konditione, beräkna varje mus pre-test "preferens" för de svarta och vita kammare genom att subtrahera tid i var och en av dessa från andra (det vill säga, "svarta minus vita" & "vita minus svart", se figur 3, Kolumner 9 & 10).
- Eftersom möss med starka inledande inställningar gör balansering svårt, fastställa en acceptabel gräns för preferens poäng (t.ex. <33% av den totala försökstiden) och omfattar alla möss som överstiger den från beräkningar. Använd en liberal gräns (<66% av den totala försökstiden) för att maximera integration när avgången är sannolikt efter provning är klar (t.ex. på grund av off-target kirurgiska manipulationer).
OBS: Möss som överskrider gränsen kan fortfarande testas, med ett försök att hålla sina förtest preferenser balanserad. Senare, tessa möss kan uteslutas från analysen, om nödvändigt, för att balansera pre-provresultat. Om extrema förtest fördomar (dvs> 800 sek) oproportionerligt påverka en grupp, överväga att ändra de miljöer ring och / eller med hjälp av andra analyser. - Välj svart eller vit kammare som läkemedlet ning kammare för varje mus, samtidigt summera motsvarande förtest preferens poäng inom varje grupp med följande prioriteringar i åtanke:
OBS: Var noga med att balansera poäng mellan grupper inom varje kohort liksom över eventuella tidigare årskullar.- Gör summor för alla grupper som likvärdiga som möjligt.
- Gör de belopp som så nära noll som möjligt (dvs. välja önskad sida för vissa möss och icke-önskad sida för andra). Om en nära-noll summa är omöjligt för en viss grupp, och justera alla andra att bättre matcha de bästa erhållas betyg för begränsande grupp, gynnar svagt negativ grupp summerar överpositiv.
- Så mycket som möjligt, hålla uppdrag av svart mot vitt och föredras jämfört med icke-föredragna kammare för läkemedelsliga även inom varje grupp.
- Eftersom det inte alltid är möjligt att uppfylla ovanstående mål, korrigera eventuella avvikelser genom att göra motsatta balanserings överväganden i senare kohorter; Men försök att undvika att producera kohorter med vilt olika genomsnittliga förtest preferenser.
- På Conditioning Days 2-5, placera mellan kammardörrar i stängt läge (figur 2C).
- Förbered enskilda sprutor med kokain (vecka 2 & 4) eller saltlösning (Dagar 3 & 5) lösning, som beskrivs i steg 1.1.5 och baserat på kroppsvikt mätt vid förtest.
OBS: Dos bör väljas med avseende på experimentella förväntningar, överväganden som nämns i inledningen, och potentiella golv och tak effekter. Det är ofta bäst att genomföra oberoende experiment med hjälp av åtminstone två olika doser. - Load "conditioning "datorprogram och lägga in djur ID (Figur 1A), sedan ge startkommando (Figur 1B), i förekommande fall.
- Scruff och injicera varje mus (ip), omedelbart sänka dem i rätt svart eller vitt kammare deras tilldelade apparaten mot bakväggen, sedan mjukt stäng locket. När alla kamrarna är laddade, lämna provningsrummet och minimera buller.
- Ta bort möss från sin kammare så nära exakt 30 minuter som möjligt (dvs är den första möss ur sina kammare medan andra möss är fortfarande konditionering). Ta bort djur så tyst som möjligt, utan att införa buller.
- Välj en analysmetod. Antingen subtrahera tid på saltlösning parade sidan under eftertestet från tid på kokain-parade sidan under eftertestet (kokain - saltlösning, sek) eller använd tiden i efterprovläkemedels parade kammareminus förtest tid på läkemedels parade kammare.
OBS: Om du använder den första metoden, även tomt linjediagram av genomsnittlig tid i mitten, saline- och drog parade kamrar under för- och eftertester för varje grupp. Jämfört med pre-test bör eftertestet visar ökad tid i läkemedels parade sidan och minskad tid i saltlösning parade sidan (se figur 6, botten, och diskussion för förklaring). - Beroende på naturen och antalet grupper som jämförs, använder en t-test, en eller två-vägs ANOVA, i förekommande fall, möjligen med post-hoc-analys för att analysera något av de ovan presenterade subtraktion poäng.
OBS: Kokainpreferens poäng tenderar att vara variabel, och dessutom, kan vara negativa (dvs indikerar aversion mot den läkemedels parade sidan). Möss som visar motvilja ska inte tas bort (om de inte är statistiska extremvärden), eftersom detta resultat är normalt och troligen viktigt att fastställa skillnader mellan grOj då. Räkna med att behöva provstorlekar av 12 till 30 djur per grupp, beroende på effektstorleken av behandlingen.
2. motoriskt Sensibilisering
- Utrustning och Rums Set-Up
- Skaffa en 4 x 8 (X x Y) photobeam array (yttermått 11,5 "x 20"). Konstruera en öppen topp kammare tillverkad av svart plexiglas (innermått 22 1/6 "x 13 ¾" x 9 3/8 ") för att inrymma array (Figur 4A).
- Förbered testrum så att en röd lampa (tak- eller väggmonterad) kan användas under testning.
- Bered separata programsessioner för dagliga tillvänjning och injektions prövningar.
- Ställ tillvänjning försök att vara mellan 30-60 min och injektions försök att vara mellan 60-120 min (figur 5B). Den rekommenderade längd för varje är 60 min. Håll provlängd konsekvent över flera kohorter inom samma experiment.
- Uppsättning försök att starta recording på den första balk brott som förekommer efter det att startsignalen har initierats (figur 5B). För injektionen rättegång, ställa in startsignalen, så att lådor kan startas individuellt (ej unisont), om det är möjligt.
- Ställ balk pauser för att registreras i användardefinierade "fack", företrädesvis 5 minuter vardera (figur 5B).
- Förbered full volym av kokain lösning som krävs för experimentet till hands. Lös kokain HCl i 0,9% NaCl (saltlösning), basera den slutliga koncentrationen på en injektionsvolym av 0,1 ml / 10 g kroppsvikt (t.ex. för en dos av 5 mg / kg, är lösningen koncentration 0,5 mg / ml). Vortex blandningen i 30-45 sekunder, sterilt filter (0,2 um sprutfilter) och förvara vid rumstemperatur.
- Testning
OBS: Den inledande fasen av att testa löper under 10-11 dagar i följd. Möss får två dagliga prövningar: tillvänjning (injektion fritt) och injektion. Administrera saltlösning för de tre första fvåra dagar (se diskussion för betydelsen av saltlösning tillvänjning), och kokain för nästa sju med samma dos (eg., 15 mg / kg / dag).- Varje dag, acklimatisera mössen i sina hemmaburar till beteende förrum i 30 min till 1 h.
- Förbered ren standard mus stora klar akryl bostads burar med ett extremt tunt skikt av nytt strö (t.ex. tallflis), så att inte skymma photobeams, i förekommande fall (Figur 4C & D).
- Place burar mot Y-axeln för photobeam array nära den ena änden, så att fem strålar är åtskilda jämnt längs dess längd. X-axelbalkar används inte i detta test (figur 4C & D).
- Ta möss från sina hem bur, i slumpmässig ordning, nackskinnet och väga dem. Ta bort varje mus från väger båten basen av sin svans (med stöd) och placera direkt i deras tilldelade rörelse bur. Täck varje bur med ett standardfilter-lock.
- Förbereda enskilda sprutor wed saltlösning eller kokain lösning, som beskrivs i steg 2.1.7, baserat på den aktuella dagens kroppsvikter. Börja med en dos av 15 eller 20 mg / kg, och överväga ett andra experiment med hjälp av en högre eller lägre dos (se diskussion för relevanta faktorer).
- När tillvänjnings försök har avslutats för alla burar, ladda injektionsprogrammet.
- En i taget, ta bort möss från deras test bur, nackskinnet och ge sitt injektion (ip). Innan han återvände musen till prov bur, snabbt initiera startsignalen för den bur (Figur 5C, botten).
- Efter alla injektions studier har avslutats, åter möss till sina hem burar och deras bostadsrummet.
- Om så önskas, tillåter möss genomgå en serie av karenstider och drog utmaningar, såsom följande: samma dos som original, halv dos, dubbel dos, sedan saltlösning, vilket gör sju dagar före utmaningen samma dos och 06:57 dagar före varje ytterligare utmaning. Oavsett val av utmaningar, upprätthåln liknande karenstid över kohorter inom ett experiment.
OBS: Om den ursprungliga dosen är hög (t.ex., 30 mg / kg eller högre), bör den dubbel dos hoppas över eller ersättas med en lägre dos. Saltlösnings utmaning avslöjar någon rade lokomotorisk aktivering genom den kokain-parade miljö ensam, och i processen, mängden sensibiliserade locomotion som är kokain-beroende (se diskussion).
- Statistisk analys
- Välj den del (ar) av varje försök som kommer att användas för analys. Mest kokain-inducerad förflyttning hos gnagare inträffar inom de första ~ 15-30 minuter efter läkemedelsinjektion. Beroende på inblandade variabler, överväga att analysera kumulativ förflyttning för flera tidsfönster (t.ex. de första 15, 30, 60 och / eller 120 min) eller fokusera på oberoende segment av försöket.
- Använda tidsramen valt summera balk raster för varje djur på dagen för tillvänjning och injektion försök separat och sedan enverage summorna för varje grupp. Plot innebär och standardavvikelser från medelvärdet (SEM) i ett linjediagram över alla dagar. Som behandlingar kan ändra hur möss svarar på läkemedlet tidigt och / eller i slutet av varje daglig rättegång, också rita genomsnittliga grupp balk pauser med 5-min bin under loppet av varje daglig prövning.
OBS: Rita daglig aktivitet medelvärden för tillvänjning och injektions prövningar (t.ex. första 15 min) gör det artificiellt verkar som förflyttning dämpas av saltlösning injektion, men kom ihåg att aktivitet har (troligen) sjönk till denna nivå i slutet av tillvänjning varje dag . - Analysera rad saltlösning och missbruksbehandling dagar separat med hjälp av upprepade mätningar (RM) ANOVA med inom-ämnen faktor dag / tid och inklusive eventuella mellan-ämnen faktorer i konstruktionen, när så är lämpligt. Använd en t-test eller One-Way ANOVA att undersöka gruppskillnader på dag ett av kokain (akut exponering), och en multivariat ANOVA för utmaningar. Vid behov följer significance med post-hoc-test eller Univariat ANOVA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representativa resultat från CPP-analysen visas i figur 6 med användning av vildtyp C57BL / 6N-möss vid ungefär nio veckors ålder. Studiedesignen var en 2 x 3 blandad fakulteten, med en variabel inom-ämnena Test (före och efter) och en mellan-ämnen variabel av behandling (saltlösning och kokain 5 och 10 mg / kg). En RM ANOVA visade en signifikant interaktion mellan test och behandling (F 2,20 = 3,68, p <0,05), vilket tolkades i stället för signifikant huvud effekter som observerats för både Test (F 1,20 = 9,86, p <0,01) och behandling (F 1,20 = 4,37, p <0,05). Post hoc jämförelser visade att ingen av grupperna skiljer sig från varandra under pre-testet. På post-test, 5 mg / kg och 10 mg / kg skilde sig inte signifikant från varandra; dock båda grupperna uppvisade signifikant större preferens för kokain-parade kammare än den saltlösnings endast kontrollgruppen (Tukeys: 5 mg / kg, p <0,5; 10 mg / kg, s &# 60; 0,01). Dessutom Bonferroni post hoc test visade att både 5 (p <0,05) och 10 (p <0,05) mg / kg-grupper visade större preferens för kokain-parade sidan vid eftertest jämfört med före testet, medan saltlösningen -saline gruppen visade ingen förändring från före till efter-test.
Representativa resultat från en motorisk analys visas i Figur 7A & B med användning av vildtyp C57BL / 6N kullkontrollmöss från en serie av separata experiment som tidigare har publicerats 18. Efter acklimatisering till saltlösningsinjektioner under 3-4 dagar, fick mössen en kokain injektion (ip) vid 5, 10, 15 eller 30 mg / kg per dag under sju dagar. Efter en sju eller 14-dagars ångerrätt, fick varje grupp en kokain utmaning vid den ursprungliga dosen, sedan efter ytterligare (variabel) karenstider, några fick ytterligare kokain utmaningar på andra doser, som visas. För att demonstrera effekten av dosen kokain på locomOTOR sensibilisering i den aktuella publikationen har de fyra olika dosgrupper kombineras till en 4 x 7 blandad faktoriell design, med en inom utsätter variabel av Day (första 7 kokaininjektioner) och en mellan-patienter faktor dos. En RM ANOVA visade en signifikant interaktion mellan dos och dag (F 18.276 = 12,53, p <0,0001), vilket tolkades i stället för betydande viktigaste effekterna som också observerades för både dag (F 6276 = 18,25, p <0,0001) och Dos ( F 3,46 = 22,63, p <0,0001). Tukeys post hoc-analyser visade signifikanta övergripande skillnader mellan 5 och 15 mg / kg (p <0,0001), 5 och 30 mg / kg (p <0,0001), och 10 och 15 mg / kg (p <0,01). Ett antal betydande skillnader observerades när grupperna jämfördes varje dag. Noteras här finns skillnader för Dag 1 Kokain (5 vs 30 mg / kg, p <0,01; 10 vs. 30 mg / kg, p <0,05; 15 vs. 30 mg / kg, p <0,01) och dag 7 Kokain ( 5 vs 10 mg / kg, p <0,05; 5 vs. 15 mg / kg, p <0,0001; 10 vs. 15 mg / kg, p <0,01; 15 jämfört med 30 mg / kg, p <0,0001). Figur 7C visar mock figurer som illustrerar de viktigaste aspekterna av rörelse allergi som kan skilja mängd behandlingsgrupperna. Medan dessa funktioner illustreras oberoende här, är det även möjligt att observera skillnader i kombinationer därav.
Figur 1. Med PC CPP grundläggande sessionskontroll. (A) Standard skärm, ikon offentligt sammanträde (röd ruta) och offentligt sammanträde dialogrutan (infälld). Välj "custom filnamn" och använd mappfönster för att navigera till datamappen och namnge sessionen. Välj lämpligt program från "förfarande" rullgardinsmenyn. För varje ruta i bruk, kryssrutan nummer och ange relevant information i ämnet, experiment och gruppboxar. (B) Lastkammardisplay, ikonen för signal (blue box), och skicka teckendialog al ruta (infälld). När alla kammar data har matats in, välja kammare som ska läsas och frågan startsignal. Chambers kommer nu att utlösas av balk paus för att starta sessionen timer och samla in data. (C) Ended sessions display. När varje kammare avslutar utsedda programmet kommer datainsamlingsområdet (green box) blir statisk och kammaren informationsområdet (orange ruta) visar kammare som "stängd". Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. CPP kammarkonfiguration. (A) Prov experimentell tidslinje. Förtest följs av daglig alternerande kokain (grå) och saltlösning (vit) konditionering sessioner. Post-testet utförs 24 timmar efter den sista konditionesessionen. ( B) konfiguration öppen kammare för användning i pre- och post-testsessioner. Observera att mellan kammar dörrarna är i det upphöjda / öppet läge. (C) konfiguration sluten kammare för användning i sessioner konditione. Observera att manuella dörrar sänks, utan tillgång mellan kamrarna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Balanserad konstruktionsberäkningar för CPP. Exempel visar beräkningar och mål när balansering före provresultat i CPP. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
ig4.jpg "/>
Figur 4. motoriskt kammarkonfiguration. (A) Ytter kammare består av svart opak låda inuti vilken strålen uppsättningen passar tätt (B). Bostäder / skokartong storlek kammare ska fyllas med ett tunt lager av strö (C) och linje så att strålarna jämnt fördelade längs den långa axeln (D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. motoriskt avdelningen datordrift. (A) Standard datorprogram. Starta ny session databas (blue box och infälld). Byt namn filer och kataloger för varje experiment (blå under infälld). Skapa ny session (röd ruta och infälld) med unik identifierare. Redigera Session (röd infälld) och enter djuridentifieringsinformation på fliken kammaren (green box och infälld) och ställa in start / stoppreglage för varje typ session (orange ruta). (B) Välj lämplig start stopp kontroll för varje typ session. Ställ intervall längd till 300 sekunder (5 minuter bin) och 12 intervall per fas (för 1 timme session). För tillvänjningssessioner (vänster), kommer kammare triggas att börja unisont (manuellt aktivera fas ... Allt i Unison) och kommer att börja övervakning för aktivitet omedelbart efter den första strålen paus. För injektion sessioner (höger), kommer kammare triggas individuellt (manuellt aktivera fas ... Individuellt Skärmknappar) och kommer att börja övervakning för aktivitet omedelbart efter den första strålen paus. Båda sessionstyper kommer att avslutas när den totala tiden fasen har löpt ut för varje kammare för sig. (C) När sessionen har startats, kan tillvänjningssessioner startas genom att välja "börja" -knappen (överst). Observera att efter Triggering kommer alla kammare väntar på första strålen paus för att börja sessionen. För injektion sessioner, kan varje kammare startas oberoende (botten). Observera att efter utlösning individuella kammare (medan djur är ut ur kammaren för injektion), kommer kammare väntar den första strålen paus för att börja sessionen. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Representativa CPP resultat. (Top) I CPP, möss visade signifikant preferens för en kammare tidigare parat med kokain (antingen 5 eller 10 mg / kg), medan möss som fick saltlösning liga i båda kamrarna inte utveckla någon preferens. Kolumn förkortningar markerar signifikanta mellan grupperna skillnader från den märkta bar jämfört med noterade gruppen på samma tester tijag påpeka. (Längst ned) Genom att rita tiden i kokain- kontra saltlösning parade kamrar under för- och eftertester, kan ökningar i kokain parade sida ses i 5 och 10 mg / kg grupper som är på bekostnad av tid bringade i både de saltlösnings parade och mellersta kamrarna. I motsats härtill fanns det inga slående skillnader i tid som tillbringas i varje kammare mellan för- och eftertester i saltlösningskontrollgruppen. Data presenteras som medelvärde ± SEM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7. Representativa rörelse sensibilisering resultat (A) Ackumulerade balk pauser för första 20 minuter varje dag prov för fyra separata doser. 5, 10, 15 och 30 mg / kg i vildtyp möss följt av samma-, halv- dubbel~~POS=TRUNC dos end saltlösning utmaningar, modifierade från (18). Alla grupper fick samma dos utmaningar antingen en (10, 15, 30 mg / kg) eller två (5 mg / kg) veckor efter den sista kokain exponering. Vissa grupper fick ytterligare utmaningar, som utfördes vid varierande karenstider. (B) Rita av rörelseapparaten data (balk pauser) summeras med 5-min bin för dagliga studier under 15 mg / kg kokain sensibilisering experiment. (C) illustrationer som visar skillnader i rörelse sensibilisering för två behandlingsgrupper som främst drivs av (vänster) akut kokainsvarsskillnader, (mitten) en allergi Differens eller (höger) skillnader i maximal sensibilisering. Data presenteras som medelvärde ± SEM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll visar metoder för miljöbetingad preferens och rörelse sensibilisering, som var och en kan användas av den genomsnittliga labbet att utvärdera aspekter av läkemedelsinducerad beteende plasticitet. Som med de flesta beteendetester, finns det ytterligare värdiga överväganden utöver grund protokollet. För det första kan var och en av dessa tekniker uppfattas som att ha två faser, induktion och expression. "Induktion" omfattar utveckling av beteende för CPP det inträffar under konditioneringen, och för sensibilisering är den inledande perioden av (vanligtvis i följd) läkemedelsexponering. "Expression" för CPP är eftertestet, medan det för sensibilisering det kan definieras som ett läkemedel utmaning ges antingen efter tillbakadragande eller helt enkelt som den sista i rad exponering.
Det är värt att överväga att begränsa manipulationer till en av dessa faser kontra den andra bättre tolka deras potentiella effekter. Virus med tidsmässigt begränsad effektivitet (t.ex., HSV) eller drog co-förvaltningar / förbehandlingar (t.ex. agonister / antagonister) är användbara i sådana ansträngningar. När du tar detta synsätt kan det vara ytterligare nödvändigt att använda komprimerade protokoll så att en viss fas kommer bättre att sammanfalla med viral uttryck. För CPP, är det möjligt att genomföra en två-dagars konditionering metod, som vi har beskrivit tidigare 37. Speciellt för rörelse sensibilisering, kan förändringar i karenstiden mellan induktion och uttryck i kombination med dessa metoder, avslöja processer som arbetar med underhåll eller stabiliteten i beteendet. Dessutom kan sådana tillvägagångssätt användas för att studera fenomenet korssensibilisering, där en sensibiliserad beteende induceras med användning av ett läkemedel, men kan uttryckas genom exponering för ett annat läkemedel. Eftersom korssensibilisering inte uppstår mellan alla sensibiliserande droger av missbruk, kan framkalla en sensibiliserade beteende som skiljer sig något från originalet, och inte nödvändigtvis dubbelriktad förvarje given uppsättning av droger, kan dess undersökning ger unika möjligheter att förstå var och hur olika läkemedel påverkar hjärnans plasticitet och funktion.
Korrekt tolkning av CPP, i synnerhet beror på att utesluta alternativa förklaringar av resultaten. Data som genereras i en tre-kammar apparat bör granskas ytterligare innan de definierar subtraktion av tiden i saltlösning parade sidan från kokain-parade sida vid efter provet som föredrar, eftersom en ökning av en preferens för läkemedels parade sida som resulterar enbart från en minskning av tiden i saltlösning parade kammare är sannolikt olämpliga för en sådan tolkning. Mittkammaren möjliggör detta resultat eftersom musen kan förändra tid det i stället för den läkemedels parade kammaren. Det är även möjligt att observera ökad tid tillbringas i det läkemedels parade sida på bekostnad av den mellersta kammaren i stället för den saltlösnings parade sidan; utan tvekan, kan detta resultat fortfarande vara acceptabelt tolkted som en ökning av drog preferens. Införandet av tredje facket ger en neutral kammare som tillåter opartisk placering av djuret under före och efter testsessioner 41. Även användbar för att ta itu med initiala placerings fördomar bidrar till test dag poängen är den tredje kammaren inte krävs för konditionering. Alternativa CPP mönster som presenterar två olika avdelningar eller en enda avdelning med olika stimulans konfigurationer diskuteras någon annanstans 41-42.
Alla underskott på plats preferens för ett läkemedel ska också åtföljas av bedömningar av både förmåga att lära kontextuella föreningar och allmän belöning funktion. Det finns ett antal justeringar som kan göras till CPP paradigm som kan medhjälpare i tolkningen av förändrade preferenser, inklusive modifiering av framträdande av UCS (läkemedel) genom att öka (eller minska) antalet parningar eller använda högre eller lägre läkemedel dos. CPP kan utföras med användning palatable food (t.ex. hög fetthalt, sackaros) eller social interaktion för att bedöma huruvida den observerade förändringen är specifik för läkemedel eller är relevant för naturliga belöningar, icke-CPP närmar användbara för detta ändamål inkluderar intrakraniell självstimulering, sackaros preferens, och / eller aptitskapande inflygnings uppgifter. Men alla dessa alternativ varierar i sin förmåga att på lämpligt sätt ta itu med den önskade frågan. Mat-baserade CPP kan vara särskilt fördelaktigt eftersom normala svar visa förmåga att lära sig och bilda lämpliga kontextuella föreningar med en naturlig belöning. Ytterligare kontroller för att bedöma inlärningsförmåga omfattar uppgifter som förlitar sig på innehålls inlärning / minne (kontextuella rädsla konditionering och CPA). CPA har fördelen av att vara på liknande sätt som CPP, ofta i samma kammare, som ersätter den aptitskapande läkemedlet med en aversiv erfarenhet (t.ex. litiumklorid injektion). Djur som visar underskott i CPP, men normal CPA, visa förmåga att bilda lämplig kontextuell förenings, vilket tyder på att försämringar i läkemedels CPP troligen avser att belöna (läkemedel specifika eller på annat sätt). En varning för CPA använder litiumklorid att tänka på är om detta läkemedel är en känd behandling för alla tillstånd som kan modelleras av försöksdjur. Till exempel, har litiumbehandling visat sig motverka inlärningssvårigheter i musmodell av fragilt X 43, vilket skulle förblanda detta styrförfarande.
Förutom den klassiska CPP paradigm, det finns potentiella förlängningar användare kan ha nytta av, till exempel testa utrotning av den lärde läkemedels sammanhang föreningen och dess återställande efter CPP. Rade svar (CRS), en gång etablerade, kan upprätthållas under långa tidsperioder 19,20 när djur lämnas ostörda. Trots den relativa varaktigheten av CR, kan den effektivt släckas genom upprepade presentationer av CS (kontext) i frånvaro av UCS (läkemedel). Två CPP utrotning metoder visas i Litratur: upprepas testet exponering utan injektion 21 eller återliga av tidigare läkemedels parade sida med fordonet 22. Utrotning processer speglar nya lärande, i motsats till "unlearning" av den ursprungliga luftkonditionering, en idé effektivt visats genom "återanställning." Återanställning är klassiskt utlöses av åter exponering för UCS, som producerar återvinning av CR. I samband med CPP, kommer en enda injektion av utbildningen drogen orsaka djuren att visa preferens. Intressant många icke-utbildning läkemedels ledtrådar kan också producera återställande av CPP, inklusive priming med alternativa läkemedel 22 och en mängd olika faktorer 23-26. Utrotning och återanställning experiment är av särskilt intresse för narkotikamissbruk fältet som modeller för läkemedelsbehandling och återfall. Insatser som förbättrar graden av utrotning och / eller minska omfattningen av återanställning kan vara värdefulla mål för mänskliga läkemedelsbehandling.
(t.ex. 27-29). Anmärkningsvärt har dock kontextoberoende sensibilisering tydligt visats i andra studier (t.ex. 30-32). Experimentella detaljer som kan bidra till huruvida en situationsberoende ökning av allergi är observer inkluderar läkemedelsdos, exponeringstid, om någon grupp måste transporteras för test of sensibilisering och vissa aspekter av pre-exponering för testkammaren, Men dessa detaljer fortfarande något oklar. En metod för att bestämma bidraget av kontextuella sensibilisering är att ge en koksalt utmaning efter läkemedels sensibilisering 33. Användningen av den beskrivna paradigm minimerar bidraget av kontextberoende sensibilisering vilket framgår av mycket lite lokomotorisk aktivering i tidigare studier vid saltlösning utmaning. Den kontextuella bidrag till sensibilisering har granskats i ett antal artiklar, ofta med diskussioner om andra än rörelseaktivitet 34 beteenden.
För att begränsa förorening av läkemedelsinducerad aktivering och sensibilisering med rörelsestimulerande effekter som induceras av en ny omgivning, möss acklimatiserades till saltlösningsinjektioner under tre till fyra dagar i början av varje försök. Såsom kan ses i figur 7, möss visar typiskt reducerad locomotion mellan den första ochsista koksalt acklimatisering dag. Dessutom mössen är märkbart lugnare och lättare att hantera och injicera genom den sista saltlösningsexponering. Tidigare arbeten har testat flera stammar och genotyper av möss med användning av detta paradigm och ser inte mycket variation i saltlösning acklimatisering aktivitet över dem; emellertid är det möjligt att då och då observera mycket starka hyperaktivitet fenotyper associerade med vissa genotyper som inte övervinna genom att använda denna metod. I dessa fall kan det vara önskvärt att utföra flera salt Acklimatisering dagar (tills locomotion platåer i det hyperaktiva grupp), och sedan normalisera den hyperaktiva gruppen med kontrollgruppen med användning av injektion dag uppgifter förra saltlösning. Även om inte idealiskt, möjliggör det en mer rimlig jämförelse av effekterna av ett läkemedel på locomotion mellan dessa grupper. Andra alternativ som kan dämpa extrem hyperaktivitet är att förlänga tillvänjning provlängd före injektion varje dag med en till fem timmar, och / eller använda längre injektions prövningar (2-4 timmar) earje dag.
Det finns ytterligare överväganden som är viktiga för tolkningen av rörelsebeteende. Som visas i figur 7C, kan observerade gruppskillnader primärt drivas av skillnader i den akuta rörelsesvaret, graden av sensibilisering över dagar, den maximala gränsen för allergi, eller en kombination av dessa faktorer. Parsning av bidragen från dessa faktorer för sig kan vara till hjälp. För detta ändamål kan den akuta lokomotorsvar vara statistiskt analyseras ensam. Då kan bedömas graden av sensibilisering med hjälp av ett program som kan kurvan montering och en hastighet normaliseringsprocess som diskonterar några akuta rörelseapparaten skillnader. Förändrad maximal sensibilisering brukar avslöjas i en RM ANOVA över de på varandra följande läkemedel exponeringsdagar, där uppföljande dag-för-dag efter hoc jämförelser är betydande på dagar efter grupp svar har nått sitt tak. Man bör vara medveten om att maximal sensibilisering inte kan fastställasför någon grupp som har en linjär rörelse svar över drogexponeringsdagar, såsom skildras i figur 7C (mitten, blå linje). I ett sådant fall, kan läkemedelsexponering förlängas för att försöka bestämma maximal sensibilisering.
Slutligen är det oftast bäst att jämföra sensibilisering mellan grupper med minst två primära läkemedelsdoser som utförs i separata grupper av djur. Skillnader i någon av ovanstående aspekter av rörelseaktivering, vid en dos eller båda, ska användas för att styra ytterligare tester för att utesluta andra förklaringar, bland annat förändringar i utvecklingen av stereotypi. Upprepad exponering för vissa läkemedel, såsom kokain och amfetamin, inte bara producerar sensibiliserade förflyttning i en dosberoende sätt, men sensibiliserar också konkurrerande stereotypa beteenden. Dessa stereotypier bli särskilt öppen vid höga doser, så att rörelse sensibilisering ofta helt eller delvis skyms, men avslöjade igen vid administrering aven lägre dos. Av denna anledning kan ett "underskott" i lokomotorisk sensibilisering i en experimentgrupp faktiskt återspeglar ökad känslighet för den läkemedelsinducerad utveckling av stereotypier. Bedömningen av stereotypi kan vara en utmaning, men det finns ett antal publicerade skalor 35 och andra metoder 36. Med hjälp av både en allmän stereotypi skala och en bedömning av specifika beteenden rekommenderas, som tidigare 18 publicerade.
Sammanfattningsvis har ett antal beteendetester utvecklats i djurmodeller i ett försök att tolka komplexa mänskliga missbruk. Miljöbetingad preferens och rörelse sensibilisering finns två grundläggande tester används i stor utsträckning i gnagare och respektive, kan de vara särskilt användbara vid bedömningen av tidig läkemedelsutveckling associerade belöning och ihållande plasticitet induceras av upprepad användning. Det finns ett antal överväganden för utformning och tolkning av varje typ av studie, vilket gör det Worthwhile att noga överväga de experimentella mål och tidigare litteratur när man planerar dessa bedömningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Författarna tackar Karen Dietz och Shari Birnbaum för föregående ingång på beteendekonstruktionsöverväganden och Lauren Peca för hjälp med beteendetestning. Författarna erkänner också generöst stöd av Simons Foundation (Simons Foundation Autism Research Initiative bidrag till CWC), NIDA (DA008277, DA027664 och DA030590 till CWC, F32DA027265 till LNS och F32DA036319 till RDP), den FRAXA Research Foundation och Eleanor och Miles Shore Fellowship Program (gemenskap stöd till LNS), och John Kaneb Fellowship Program (gemenskap stöd till MT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cocaine Hydrochloride USP | Mallinckrodt Pharmaceuticals | 0406-1520 | Purchase and use (Schedule II controlled substance) for research purposes requires compliance and licensure according to state and federal law. |
| Conditioned Place Preference, Three Compartment Apparatus with Manual Doors and Lights for Mouse | Med-Associates Inc. | MED-CPP-MS & MED-CPP-3013 | Our laboratory has used these boxes; however, many alternative boxes are available & acceptable. |
| PAS-Home Cage Activity Monitoring Photobeam Arrays | San Diego Instruments | 2325-0223 & 7500-0221 | Our lab houses these arrays inside of custom built chambers, as described in the text. There are alternatives available. |
| Disposable Sani-Cloth disenfecting wipes | PDI | 13872 |
References
- National Institute on Drug Abuse. Drug Facts: Understanding Drug Abuse and Addiction. www.drugabuse.gov. , Available from: http://www.drugabuse.gov/publications/drugfacts/understanding-drug-abuse-addiction (2012).
- Kasanetz, F., et al. Transition to addiction is associated with a persistent impairment in synaptic plasticity. Science. 328 (5986), 1709-1712 (2010).
- Beach, H. D.
- van der Kooy, D. Chapter 13, Place Conditioning: A simple and effective method for assessing the motivational properties of drugs. Methods of Assessing the Reinforcing Properties of Abused Drugs. Bozarth, M. A. , 229-240 (2012).
- Carlezon, W. A. Place conditioning to study drug reward and aversion. Methods Mol Med. 84, 243-249 (2003).
- Prus, A. J., James, J. R., Rosecrans, J. A. Chapter 4, Conditioned Place Preference. Methods of Behavior Analysis in Neuroscience. Buccafusco, J. J. , (2009).
- Tzschentke, T. M. Measuring reward with the conditioned place preference (CPP) paradigm: update of the last decade. Addict Biol. 12 (3-4), 227-462 (2007).
- Aguilar, M. A., Rodrìguez-Arias, M., Miñarro, J. Neurobiological mechanisms of the reinstatement of drug-conditioned place preference. Brain Res Rev. 59 (2), 253-277 (2009).
- Feduccia, A. A., Duvauchelle, C. L. Novel apparatus and method for drug reinforcement. JoVE. (42), (2010).
- Brabant, C., Quertemont, E., Tirelli, E. Influence of the dose and the number of drug-context pairings on the magnitude and the long-lasting retention of cocaine-induced conditioned place preference in C57BL/6J mice. Psychopharmacology. 180 (1), 33-40 (2005).
- Pliakas, A. M., Carlson, R. R., Neve, R. L., Konradi, C., Nestler, E. J., Carlezon, W. A. Altered responsiveness to cocaine and increased immobility in the forced swim test associated with elevated cAMP response element-binding protein expression in nucleus accumbens. J Neurosci. 21 (18), 7397-7403 (2001).
- Knackstedt, L. A., Samimi, M. M., Ettenberg, A. Evidence for opponent-process actions of intravenous cocaine and cocaethylene. Pharmacol Biochem Behav. 72 (4), 931-936 (2002).
- Post, R. M., Rose, H. Increasing effects of repetitive cocaine administration in the rat. Nature. 260 (5553), 731-732 (1976).
- Marin, M. T., Cruz, F. C., Planeta, C. S. Cocaine-induced behavioral sensitization in adolescent rats endures until adulthood: lack of association with GluR1 and NR1 glutamate receptor subunits and tyrosine hydroxylase. Pharmacol Biochem Behav. 91 (1), 109-114 (2008).
- Henry, D. J., White, F. J. The persistence of behavioral sensitization to cocaine parallels enhanced inhibition of nucleus accumbens neurons. J Neurosci. 15 (9), 6287-6299 (1995).
- Hope, B. T., Simmons, D. E., Mitchell, T. B., Kreuter, J. D., Mattson, B. J. Cocaine-induced locomotor activity and Fos expression in nucleus accumbens are sensitized for 6 after repeated cocaine administration outside the home cage. Eur J Neurosci. 24 (3), 867-875 (2006).
- Shuster, L., Yu, G., Bates, A. Sensitization to cocaine stimulation in mice. Psychopharmacology. 52 (2), 185-190 (1977).
- Smith, L. N., Jedynak, J. P., Fontenot, M. R., Hale, C. R., Dietz, K. C., Taniguchi, M., Thomas, F. S., Zirlin, B. C., Birnbaum, S. G., Huber, K. M., Thomas, M. J., Cowan, C. W. Fragile X mental retardation protein regulates synaptic and behavioral plasticity to repeated cocaine administration. Neuron. 82 (3), 645-658 (2014).
- Mueller, D., Stewart, J. Cocaine-induced conditioned place preference: reinstatement by priming injections of cocaine after extinction. Behav Brain Res. 115 (1), 39-47 (2000).
- Sakoori, K., Murphy, N. P. Maintenance of conditioned place preferences and aversion in C57BL6 mice: effects of repeated and drug state testing. Behav Brain Res. 160 (1), 34-43 (2005).
- Bardo, M. T., Neisewander, J. L., Miller, J. S. Repeated testing attenuates conditioned place preference with cocaine. Psychopharmacologia. 89 (2), 239-243 (1986).
- Itzhak, Y., Martin, J. L. Cocaine-induced conditioned place preference in mice: induction, extinction and reinstatement by related psychostimulants. Neuropsychopharmacology. 26 (1), 130-134 (2002).
- Kreibich, A. S., Blendy, J. A. cAMP response element-binding protein is required for stress but not cocaine-induced reinstatement. J Neurosci. 24 (30), 6686-6692 (2004).
- Briand, L. A., Blendy, J. A. Not all stress is equal: CREB is not necessary for restraint stress reinstatement of cocaine-conditioned reward. Behav Brain Res. 246, 63-68 (2013).
- Redila, V. A., Chavkin, C. Stress-induced reinstatement of cocaine seeking is mediated by the kappa opioid system. Psychopharmacology. 200 (1), 59-70 (2008).
- Do Couto, R. ibeiro, Aguilar, B., A, M., Manzanedo, C., Rodriguez-Arias, M., Armario, A., Minarro, J. Social stress is as effective as physical stress in reinstating morphine-induced place preference in mice. Psychopharmacology. 185 (4), 459-470 (2006).
- Post, R. M., Lockfeld, A., Squillace, K. M., Contel, N. R. Drug-environment interaction: context dependency of cocaine-induced behavioral sensitization. Life sciences. 28 (7), 755-760 (1981).
- Badiani, A., Browman, K. E., Robinson, T. E. Influence of novel versus home environments on sensitization to the psychomotor stimulant effects of cocaine and amphetamine. Brain Res. 674 (2), 291-298 (1995).
- Li, Y., Acerbo, M. J., Robinson, T. E. The induction of behavioural sensitization is associated with cocaine-induced structural plasticity in the core (but not shell) of the nucleus accumbens. Eur J Neurosci. 20 (6), 1647-1654 (2004).
- Partridge, B., Schenk, S. Context-independent sensitization to the locomotor-activating effects of cocaine. Pharmacol Biochem Behav. 63 (4), 543-548 (1999).
- Le Foll, B., Diaz, J., Sokoloff, P. Increased dopamine D3 receptor expression accompanying behavioral sensitization to nicotine in rats. Synapse. 47 (3), 176-183 (2003).
- Heidbreder, C. A., Babovic-Vuksanovic, D., Shoaib, M., Shippenberg, T. S. Development of behavioral sensitization to cocaine: influence of kappa opioid receptor agonists. J Pharmacol Exp Ther. 275 (1), 150-163 (1995).
- Tirelli, E., Michel, A., Brabant, C. Cocaine-conditioned activity persists for a longer time than cocaine-sensitized activity in mice: implications for the theories using Pavlovian excitatory conditioning to explain the context-specificity of sensitization. Behav Brain Res. 165 (1), 18-25 (2005).
- Anagnostaras, S. G., Schallert, T., Robinson, T. E. Memory processes governing amphetamine-induced psychomotor sensitization. Neuropsychopharmacology. 26 (6), 703-715 (2002).
- Spangler, R., Zhou, Y., Schlussman, S. D., Ho, A., Kreek, M. J. Behavioral stereotypies induced by 'binge' cocaine administration are independent of drug-induced increases in corticosterone levels. Behav Brain Res. 86 (2), 201-204 (1997).
- Kelley, A. E. Measurement of rodent stereotyped behavior. Curr Protoc Neurosci. Chapter 8, Unit 8.8 (2001).
- Taniguchi, M., Carreira, M. B., Smith, L. N., Zirlin, B. C., Neve, R. L., Cowan, C. W. Histone deacetylase 5 limits cocaine reward through cAMP-induced nuclear import. Neuron. 73 (1), 108-120 (2012).
- Zangen, A., Solinas, M., Ikemoto, S., Goldberg, S. R., Wise, R. A. Two brain sites for cannabinoid reward. J Neurosci. 26 (18), 4901-4907 (2006).
- Huston, J. P., de Souza Silva, M. A., Topic, B., Müller, C. P. What's conditioned in conditioned place preference. Trends Pharmacol Sci. 34 (3), 162-166 (2013).
- Schechter, M. D., Calcagnetti, D. J. Trends in place preference conditioning with a cross-indexed bibliography; 1957-1991. Neurosci Biobehav Rev. 17, 21-41 (1993).
- Bevins, R. A., Cunningham, C. L. Chapter 9, Place Conditioning: A Methodological Analysis. Tasks and Techiniques: A sampling of methodologies for the investigation of animal learning, behavior, and cognition. Anderson, M. , 99-110 (2006).
- Hitchcock, L. N., Cunningham, C. L., Lattal, K. M. Cue configuration effects in the acquisition of a cocaine-induced place preference. Behav Neurosci. 128 (2), 217-227 (2014).
- Liu, Z. -H., Chuang, D. M., Smith, C. B. Lithium amerliorates phenotypic deficits in a mouse model of fragile X syndrome. Int J Neuropscyhopharmacol. 14 (5), 618-630 (2011).
- Bardo, M. T., Rowlett, J. K., Harris, M. J. Conditioned place preference using opiate and stimulant drugs: A meta-analysis. Neurosci Biobehav Rev. 19 (1), 39-51 (1995).
