Abstract
Mottakelighet for nevron celledød knyttet til neurodegenerering og iskemi er overmåte økte i alderen hjernen, men mekanismene som er ansvarlig er dårlig kjent. Eksitotoksisitet, en prosess som antas å bidra til neuron skade indusert av begge fornærmelser, medieres ved aktivering av glutamatreseptorer som fremmer innstrømning av Ca 2+ og mitokondrielle Ca 2+ overbelastning. En vesentlig endring i intracellulær Ca 2+ homeostase eller ombygging av intracellulær Ca 2+ homeostase kan favorisere nevron skader i gamle nerveceller. For å undersøke Ca 2+ ombygging i aldring har vi brukt levende celle bildebehandling i langsiktige kulturer av rotte hippocampus nevroner som ligner i noen aspekter i alderen nevroner in vivo. For dette formål, hippocampus celler er, i første omgang, fersk spredt fra nye født rotte hippocampi og belagt på poli-D-lysin belagt, dekkglass. Deretter kulturer blir holdt i kontrollerte medier i flere dager eller flere weeks for å undersøke unge og gamle nevroner, henholdsvis. For det andre er dyrkede nerveceller lastet med fura2 og underkastet målinger av cytosoliske Ca 2+ konsentrasjon ved hjelp av digital bildebehandling fluorescens-forholdet. For det tredje, er dyrkede nerveceller transfektert med plasmider som uttrykker en tandem med lav affinitet aequorin og GFP målrettet til mitokondriene. Etter 24 timer er aequorin inne celler rekonstituert med coelenterazine og nevroner er utsatt for bioluminescens avbildning for overvåking av mitokondrielle Ca 2+ konsentrasjon. Denne tre-trinns prosedyre tillater overvåking av cytosolisk og mitokondrielle Ca 2+ responser til relevante stimuli som for eksempel glutamat-reseptor-agonist NMDA og sammenligne hvorvidt disse og andre responser blir påvirket ved aldring. Denne fremgangsmåten kan gi ny innsikt med hensyn til hvordan aldring påvirker cytosoliske og mitokondrielle Ca 2+ respons på utvalgte stimuli, samt testing av utvalgte medikamenter for å forebygge celle neurondødsfall i aldersrelaterte sykdommer.
Introduction
Eksitotoksisitet er en av de viktigste mekanismer som bidrar til neuronal skade og celledød i nevrologiske fornærmelser slik som iskemi, og i visse nevrodegenerative sykdommer slik som Alzheimers sykdom 1. Denne typen neurotoksisitet er hovedsakelig mediert av glutamat virker på Ca 2+ -permeable, ionotrope NMDA reseptorer (NMDAR) 2. Eksponering av dyrkede neuroner overfor glutamat kan føre til eksitotoksisitet 3, noe som fører til neuronal apoptose 4. Vi og andre har tidligere rapportert at sårbarheten for neuronal NMDA-indusert apoptose kan endre seg med utvikling av in vitro og aldring 5-8.
Det er allment akseptert at en økning i cytosol-fri Ca2 + konsentrasjon ([Ca2 +] cyt) fører til celler aktivering. Men hvis denne økningen er for høy og / eller vedvarende nok, kan det utløse celledød 9. Videre har det vært foreslåttsom eksitotoksisitet krever mitokondrielle Ca 2+ opptak 10, ettersom behandle nerveceller med en mitokondriell uncoupler beskyttet neuroner mot glutamat-indusert celledød 11. Dersom mitokondrier ta opp for mye av Ca 2+, kan åpningen av mitokondriell permeabilitet overgangen pore forekomme, som fører til frigivelse av cytokrom c og andre pro-apoptotiske faktorer, og induserer apoptose. Vi har nylig vist at denne mitokondrielle Ca 2+ opptak er direkte relatert til den aldersavhengig følsomhet for eksitotoksisitet, ved å måle NMDA-indusert mitokondrielle Ca 2+ opptaket i enkelt hippocampale neuroner 5, en fremgangsmåte som er rapportert i denne artikkelen. Hippocampus, som er involvert i fysiologiske prosesser som læring, hukommelse og andre kognitive prosesser 12, er svært sårbare for aldring og nevrodegenerative lidelser 13. Det er foreslått at det etter flere uker i vitro, kultiverthippocampus nevroner viser en rekke typiske kjennetegn ved alderen nevroner 14. Følgelig kan langsiktige dyrkede hippocampus nevroner gi en helhetlig modell for å undersøke Ca 2 + medierte mekanismer for forbedret excitotoxicity i aldring.
Det overordnede målet med metoden som presenteres er derfor å undersøke vesentlige endringer i intracellulær Ca 2+ homeostase eller Ca 2+ ombygging i den aldrende hjernen inkludert differensial Ca 2+ responser utløst av NMDA reseptor agonister i et langsiktig dyrkede hippocampus nevroner . Fremgangsmåten omfatter en detaljert beskrivelse av kulturen i rotte hippocampus-neuroner og overvåking av cytosoliske og mitokondrielle Ca 2+ konsentrasjon av fluorescens og bioluminescens avbildning i individuelle neuroner, respektivt. Fluorescens avbildning av cytosoliske Ca 2+ i dyrkede nerveceller er en standard prosedyre. Imidlertid er denne metode mindre pålitelige for subcellular Ca 2+ målinger inkludert mitokondrielle Ca 2+. Grunner til dette kan være mangel på riktig målretting av syntetiske prober og upassende affinitet for Ca 2 + konsentrasjoner som kan endre i mitokondriene fra lav mikrometer nivå selv til mM nivå. Bruken av Ca 2+ prober basert på proteiner som for eksempel aequorin, har tillatt målretting til subcellulære organeller og bruk av derivater ulike Ca 2+ slektskap med forskjellige coelenterazines eller muterte sonder mangler spesifikk Ca 2+ bindingsseter 15. På denne måte kan bioluminescens avbildning av celler som uttrykker mitokondrier rettede aequorin tillate overvåking av mitokondrielle Ca 2 + konsentrasjoner i de enkelte neuroner. Likevel kan denne fremgangsmåten krever bruk av fotontelling kameraer eller ultrasensitive CCD-kameraer for bioluminescens avbildning 16-18. Denne metoden kan gi nye resultater som bør bekreftes i flere etablsvekket hjernens aldring modeller som, for eksempel, hjerneskiver fra gamle dyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etikk Uttalelse: Prosedyrer som involverer dyr fag har blitt håndtert i henhold til protokoller godkjent av Valladolid Universitetet dyr boliger anlegget etter avtale med den europeiske konvensjonen 123 / Europarådet og direktiv 86/609 / EEC.
1. kort og lang sikt Culture of Rat hippocampus nevroner
- Utarbeidelse av poly-D-lysin belagt, 12 mm dekkglass.
- Sterilisere 12 mm diameter dekkglass i etanol i minst 24 timer. La dem tørke under sterile betingelser.
- Fordel glassene på en strimmel parafilm i en petriskål. Dekke overflaten av hvert dekkglass med 200 ul av 1 mg / ml poly-D-lysin. Tillate behandling av O / N.
- Den neste dag vaske objektglassene med dobbelt destillert sterilt vann hvert 15 min i 90 min under sterile betingelser.
- Fyll en fire godt multidish plate med 500 mL av Neurobasal Kultur Medium per brønn. Neurobasal Culture Medium bør suppleres med10% føtalt bovint serum, 2% B27, 1 ug / ml gentamicin og 2 mM L-glutamin.
- Plasser Dekk i multidish plate. Opprettholde dem i en fuktet 37 ° C og 5% CO2 inkubator inntil bruk.
- Isolering av hippocampus nerveceller fra neonatale rotter.
- Forbered 1,8 ml papain oppløsning (direkte kjøpes) i hetteglass (20 ul / ml) under sterile betingelser: å oppnå en sluttkonsentrasjon på 20 ul / ml legge seg rundt 40 mL papain i 1,8 ml Hanks pluss 0,6% BSA (ul bør beregnes avhengig av leverandørforhold). Hank 's 0,6% BSA ble fremstilt ved å blande 85 ml HBSS medium med 15 ml 4% bovint serum albumin (BSA, fremstilt løsning av 4 g av BSA i 100 ml HBSS). Forberede den i et sterilt hette.
- Inkuber papain i Hanks pluss 0,6% BSA i 30 minutter ved 37 ° C før bruk. Filtrer løsningen ved hjelp av et 0,22 um filter før bruk.
- Forbered Hams F-12 medium ved å legge DulbeccosModifiserte Eagles medium pulver (13.5 g per liter) i 900 ml dobbeltdestillert sterilt vann. Deretter legger 6 g HEPES og 336 mg NaHCO3 og justere pH til 7,42 med NaOH 4 N. Legg sterilt vann for å oppnå en 1 l løsning og filtrere det ved hjelp av et 0,20 um polyetersulfon (PES) flaske toppfilter. Bære denne prosessen i en steril hette. Endelig mette løsning med CO 2 under sterile forhold før bruk. Butikkløsninger ved 4 ºC og bruke dem kjølt.
- Avlive nyfødte (P0) rotteunger ved halshogging og vaske hodet i sterile HBS medium. Åpne skallen ved hjelp av steril saks. Ekstraher hjernen med en spatel og vask den raskt i Hams F-12 medium.
- Lage et diagonalt kutt ved hjelp av en skalpell i hver halvkule (figur 1B), og føre den til en petriskål som inneholder Hams F-12 medium.
- Kast hjernehinnene nøye med hjelp av disseksjon tang og under et forstørrelsesglass. <li> Identifisere hippocampus i en karakteristisk konkav plassering over cortex bruker forstørrelsesglass. Deretter skille hippocampus fra hjernebarken ved å trekke forsiktig fra den ene kanten og fjerne det fra sin posisjon ved hjelp av øyet saks.
- Overfør hippocampus vevet til et 4-brønns plate som er fylt med steril Hanks medium som mangler Ca 2+ og Mg2 + pluss 0,6% BSA og vaske hippokampalt vev. Uten å fjerne media skjære vev i små biter (ca. 2 x 2 mm) ved bruk av det samme øyet saks.
- Overfør hippocampus stykker til et hetteglass med 1,8 ml pre-filtrert papain løsning. Så ruge dem ved 37 ºC med sporadisk, forsiktig risting. 15 min senere, tilsett 90 pl av DNase I-løsning (50 ug / ml endelig) og inkuberes i ytterligere 15 min.
- Overfør vevet til et 10 ml sentrifugerør og vask fragmentene med frisk Neurobasal Culture Medium. Skaff cellesuspensjonen ved å sende vevfragmenter gjennom en 5 ml plast pipette.
- Sentrifuger cellesuspensjon ved 160 xg i 5 minutter. Fjern supernatanten ved hjelp av en plast steril Pasteur-pipette og suspendere pelleten forsiktig med en 1 ml pipette automatisert i 1 ml Neurobasal Culture Medium.
- Måle celletetthet ved hjelp av en Neubauer tellekammer. Sett dekkglass over Neubauer kammeret. Tilsett 10 mL av cellesuspensjonen. Pass på at cellesuspensjonen kommer inn i kammeret jevnt og gjør ingen bobler. Tell antall celler i mikroskop og utfører tilsvarende beregninger for å oppnå en passende dråpe 40-80 ul inneholdende 30 x 10 3 celler. Det totale antall celler vil avhenge av antall dyr anvendt.
- I løpet av det fire-brønners plate inneholdende multidish 500 mL av Neurobasal Culture Medium stilles før og holdes i kuvøsen, platen rundt 30 x 10 3 celler i et fall på omtrent 50 ul til hver enkeltbrønn i multidish plate inneholdende en poly-D-lysin-belagte 12 mm diameter dekkglass.
- Opprettholde primær hippocampus celler i en fuktet 37 ºC og 5% CO 2 inkubator for 2-5 dager in vitro (DIV, kortsiktige, unge kulturer) eller> 15 DIV (Long-term, alderen kulturer) før eksperimenter uten å endre kulturen media.
2. Fluorescens Imaging av cytosolisk Ca 2+ Konsentrasjon
- Utarbeidelse av testløsninger for fluorescens bildebehandling.
- Tilbered en ekstern HEPES-bufret saltvann (HBS) inneholdende oppløsning, i mM: NaCl 145, KCl 5, 1 MgCl2, CaCl2 1, glukose 10, natrium-HEPES 10 (pH 7,42).
- Tilbered en ytre, Mg2 + -fri, HEPES-bufret saltvann (HBS) inneholdende oppløsning, i mM: NaCl 146, KCl 5, CaCl2 1, glukose 10 og 10 HEPES (pH 7,42).
- Løs NMDA i Mg2 + -fri, HEPES-bufret saltvann (HBS) ved en final konsentrasjon på 100 mikrometer og supplere den med 10 mm glysin.
- Tilbered en HBS oppløsning inneholdende KCl i stedet for NaCl ved å løse (i mM): 145 KCl, MgCl2 1, CaCl2 1, glukose 10 og 10 HEPES (pH 7,42).
- Lasting av hippocampus celler med fluorescerende kalsium probe fura2 / AM.
- Ta cellekulturen som inneholder Dekk av inkubatoren og vaske dem med HBS medium i RT ved å overføre dem til en ny fire godt multidish plate som inneholder 500 mL av HBS per brønn.
- Inkuber cellene med fura2 / AM-4 um (fremstilt på samme HBS-mediet) i 60 minutter ved romtemperatur (25 ° C) på et mørkt sted.
- Etter 60 min, vaske Dekk med fersk HBS medium.
- Opptaks fluorescens bilder av cytosolisk [Ca 2+] i dyrkede celler.
- Slå på lampen, mikroskop, perfusjon system, fluorescens kameraet og datamaskinen.
- Plasser glassene i et termostatstyrt plattform foråpne 12 mm dekkglass på scenen av invertert mikroskop og velge en mikroskopisk felt ved hjelp av en 40X objektiv (olje, NA: 1.3). Perfuse cellene med forvarmet (37 ° C) HBS medium i fravær eller nærvær av testsubstanser. Opprettholde flyten i en hastighet på ca 5-10 ml / min.
Merk: Celle perfusjon system for levende celler er montert i et termostatstyrt plattform for å åpne 12 mm dekkglass. 8-linjer gravitasjonsstyrt perfusjon system utstyrt med en ventilstiller anvendes for å perfuse løsningene. En vakuumpumpe er ansvarlig for å fjerne eventuelt overskudd av medium. Løsninger blir oppvarmet ved hjelp av en i-rør varmesystemet. - Fange et bakgrunnsbilde med lukkeren på begge eksitasjonsbølgelengdene.
- Epi-belyse celler vekselvis ved 340 og 380 nm. Record lys emittert ved 520 nm hvert 5-10 sekund med en fluorescens-kamera, som filtreres av et fura-2 dikroisk speil.
- Når opptaksperioden er ferdig, lagre hele sekvensen of bilder avgis ved 520 nm i datamaskinen for videre analyse.
- Analyse av innspilte fluorescerende bilder.
- Åpne forsøket filen. Bruke aquacosmos programvaren, klikk på "Ratio" og velg ønsket ratio rekkevidde. Beregn piksel for piksel-forholdet i de resulterende bilder for å oppnå en sekvens av bilder forhold.
- Trekk fra bakgrunnen ved å justere 'bakgrunn eliminering'. Trykk på 'start beregning ".
- Trykk 'alle tider sekvens "knappen og slette de gamle regioner av interesse (Rois). For kvantitativ analyse av individuelle celler, etablere nye regioner av interesse eller ROIs svarende til individuelle nevroner. Gjennomsnittlig alle ratio verdier i hver piksel tilsvarer hver ROI og hvert bilde for å få et opptak av forholdet fluorescens verdier for enkelt ROIs (celler).
- Tegne grafen til de enkelte innspillinger eksportere forholdet fluorescens verdier som svarer til hver ROI til en grafisk progrer.
- Foreta tilsvarende beregninger for å anslå størrelsen av økning i forholds fluorescences som reaksjon på hver stimulering ved hjelp av en egnet dataanalyse og grafiske programvare.
3. Bioluminesens Imaging av mitokondrie Ca 2+ Konsentrasjon
- Transfeksjon av dyrkede hippocampus nevroner med mitGAmut plasmid.
MERK: Cellene blir først transfektert med et plasmid inneholdende mitGAmut mitokondriene rettet sekvens og en mutert aequorin mangler en Ca2 + bindingssete fusjonert til grønt fluorescerende protein (GFP). Denne konstruksjonen detekterer store økninger i mitokondrielle Ca 2+ opptak og muliggjør identifisering av transfekterte celler ved GFP fluorescens. Plasmidet ble utviklet og vennlig levert av P. brulet og medarbeidere 18 (CNRS, Paris).- Forbered Neurobasal TF, som inneholder Neurobasal Kultur Medium, mangler fetal bovine serum, B27, gentamici og 2 mM L-glutamin.
- Forbered 50 ul Neurobasal TF pluss 2,5 mL transfeksjon reagens i hetteglass (løsning A). Forbered 50 ul Neurobasal TF pluss 4 mikrogram mitGAmut plasmid i hetteglass (Solution B). Legg forsiktig løsning B i løpet av oppløsning A. Tillat blanding i løpet av 20 minutter, uten risting.
- Overfør glassene inneholder hippocampus nevroner til nye multidish plater som inneholder 200 mL av fersk Neurobasal TF.
- Legg dråpe for dråpe 100 ul løsning A + B over hver dekkglass. Inkuber i 30 min. Fjern mediet. Vask gang cellene med fersk Neurobasal TF. Returner glassene til den opprinnelige Neurobasal Kultur Medium.
- Dyrkings nevroner i ytterligere 24 timer ved 37 ° C og 5% CO2 etter transfeksjon for å tillate effektiv ekspresjon og målretting av sonden.
- Utarbeidelse av testløsninger for Bioluminescens bildebehandling.
- Forbered HBS løsninger som inneholder NMDA 100 mikrometer eller 145 mM KCl somovenfor (trinn 2.1). Forbered HBS oppløsning inneholdende 10 mM Ca2 + plus digitonin 100 uM.
- Tilberedning av mitokondrier målrettede aequorin med coelenterazine n.
- Overfør Dekkglass inneholdende transfektert hippocampale neuroner i et fire-brønners plate inneholdende 200 ul HBS.
- Tilsett 4 mL av coelenterazine n (200 uM) for å 200 ul HBS i en endelig konsentrasjon på 4 mM, og bland forsiktig. Inkuber i 2 timer ved romtemperatur (25 ° C) og i mørket.
- Opptaks Bioluminescens bilder av mitokondrie [Ca 2+].
- Slå på mikroskopet, lampen, perfusjonssystemet, bioluminescens kameraet og datamaskinen.
- Overfør rekonstituert Dekk til en termostatstyrt (37 ° C) perfusjon kammeret og perfuse kontinuerlig med forvarmet HBS-oppløsning ved en hastighet på 5-10 ml / min.
- Ved hjelp av en 40X objektiv (olje, NA: 1,3), velge en mikroskopisk felt som inneholder celler som uttrykker enpoaequorins som vist ved fluorescensemisjonen forbundet med ekspresjon av grønt fluorescerende protein (GFP) med FITC-filter. En typisk feltet kan inneholde 1-2 transfekterte celler. Fange GFP fluorescens bildet, ved hjelp av en CCD-kamera.
- Slå av mikroskop lys. Fjern det dikroiske holdige boks plassert i lysbanen. Slå av eksitasjon lys og lukke mørk-boks for stummende mørke.
- Perfuse celler på 5-10 ml / min med HBS medium med eller uten testløsningene forvarmet ved 37 ° C.
- Capture fotoniske utslipps bilder hver 10 sek med et foton-telling kamera håndteres med en bildeprosessor.
- Ved slutten av hvert forsøk, permeabilisere cellene med 0,1 mM digitonin i 10 mM CaCl2 i HBS for å frigjøre alle de gjenværende fotoniske utslipp.
Merk: Disse fotoniske utslippene må legges opp for å anslå de totale fotoniske utslipp, en verdi som kreves for kalibrering i Ca 2+ konsentrasjoner <./ li> - Oppbevares Bioluminescens bilder i datamaskinen med GFP forbundet fluorescens bilde tatt før foton telling bildebehandling.
- Analyse av Bioluminescens bilder som gjenspeiler mitokondrie [Ca 2+].
- Kvantifisere fotoniske utslipp ved hjelp av spesiell programvare. Fotoniske utslipp kan bli omdannet til fri mitokondrielle Ca 2+ konsentrasjon ([Ca2 +] mit) ved anvendelse av algoritmen beskrevet av Brini et al., 15.
- Åpne eksperimentet og GFP fluorescens bildet. Utvalgte regioner av interesse (ROIs) ved hjelp av spesiell programvare ved å tegne formen av de transfekterte celler i henhold til fluorescens bilder tatt ved begynnelsen av forsøket.
- Lim de samme Rois på hvert bilde. Totalt fotoniske utslipp i hvert ROI er beregnet med spesiell programvare for å oppnå luminescens emisjonsverdi (L) for hver celle ved hvert punkt i tid.
- Legg opp alle fotoniske emissioner i Bioluminescens bilder, inkludert de som er oppnådd etter digitonin permeabilization, ved hjelp av spesiell programvare, for å oppnå et biolumine bilde som inneholder alle de fotoniske utslipp.
- Eksport verdier av fotoniske utslipp for hver region av interesse for en spesifikk programvare for beregninger. For å gjøre dette, klikk på "Graf" for å beregne Bioluminescens verdiene for hver ROI på hver gang. Velg "totalverdi" og "bruker strøm ROI til alle bildene. Trykk 'beregne'. Lagre 'txt.file' og eksportere data til et regneark. For hver ROI, [Ca 2+] mit beregnes ved hjelp av følgende algoritme:
[Ca 2+] (M) = [R + (R · K TR) - 1] / [K R - (R · K R)];
hvor,
R = [L / (L total λ)] 1 / n
L er den luminescens som avgis ved tidspunktet for målingen i hver region av interesse.
L totale erden totale luminescens som gjenstår etter tilsetning av de tellinger som er tilstede i vevet på det tidspunktet ved måletidspunktet for hver region av interesse. λ, K TR, K R og n er konstanter hvis verdier er avhengig av kombinasjonen av aequorin (villtype eller mutert) og coelenterazin brukes (villtype eller n type) samt innspillingen temperatur 16. For kombinasjonen brukes her (mutert AEQ og coelenterzine n), ved 37 ºC, vi brukt følgende verdier: K R = 8,47 x 10 7, K TR = 165,6 x 10 3, n = 1204 og λ = 0138.
- Foreta tilsvarende beregninger for å estimere størrelsen på de stiger i bioluminescens som reaksjon på hver stimulus ved hjelp av en egnet dataanalyse og grafiske programvare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her beskriver vi en enkel metode for å vurdere Ca 2+ ombygging og virkningene av NMDA for cytosoliske og mitokondrielle [Ca2 +] i alderen nerveceller. Figur 1 viser skjematisk fremgangsmåten for isolering og dyrking av hippocampus neuroner fra neonatale rotter. Før du starter, må vi forberede sterile, poly-D-lysin belagte, dekkglass og finne dem i en 4-godt parabolen. Deretter blir neonatale rotter drept og hjernen fjernes. Etter isolering av hippocampus, er vevet forsiktig dispergert ved hjelp av papain. Isolerte celler ble vasket og sådd ut på belagte dekkglass. Deretter celler dyrkes i 2-5 DIV eller> 15 DIV å få unge eller gamle kulturer, henholdsvis, og som brukes for Ca 2 + bildebehandling eksperimenter.
Ved å bruke den ovennevnte strategi, er det mulig å ha både unge og gamle nerveceller fra samme prøve som skal testes, for eksempel om NMDA induserer forskjellige effekter på cytosolisk [Ca2 +] i ung Cultures enn i eldre kulturer. Figur 2 viser at NMDA 100 uM induserer større økninger i cytosolisk [Ca2 +] i eldre kulturer enn i unge kulturer. Likeledes NMDA induserer celledød i gamle neuroner, men ikke i små neuroner 5. I de tilfeller hvor Ca 2+ responser er meget høy, kan lignende forsøk utføres med Ca 2+ prober med mindre affinitet for Ca 2+ for å unngå metning fargestoff som for eksempel fura4F 5. På samme måte er det også mulig å finne ut om hvilende nivåer av cytosoliske [Ca2 +] er forskjellige. Dessuten kan kombinasjonen av denne protokoll med kvantitativ immunfluorescens ved å bruke antistoffer som er spesifikke for NMDAR subenheter tillate korrelere endringer i respons med forskjeller i ekspresjon av NMDA-reseptorsubenheter forutsatt at spesifikke antistoffer er tilgjengelige 5. Målinger av cytosoliske [Ca2 +] kan også brukes for å vurdere andre relevante parameteretrs inkludert Ca 2+ lagre innhold, hvile permeabilitet til Ca 2+, Ca 2+ clearancehastighet og deres mulige forskjeller mellom unge og eldre nevroner.
På en lignende måte, er det også mulig å teste effekten av slike stimuli på mitokondrie [Ca2 +]. Figur 3 viser et eksempel på biolumine avbildning av hippokampale neuroner transfektert med mitokondrier rettede aequorin. Offentliggjøring av fotoniske utslipp etter stimulering er en funksjon av veksten i mitokondrie [Ca 2+] oppnådd. Legg merke til at NMDA-indusert økning i mitokondrie [Ca 2+] er mye større i alderen nevroner enn hos yngre hippocampus nevroner, der NMDA øker knapt fotoniske utslipp. Disse resultatene kan bidra til å forklare hvorfor NMDA induserer apoptose bare i alderen neuroner, men ikke i unge kulturer av celler i hippocampus 5. På samme måte er det mulig å teste flere forskjeller i mitokondrieCa 2+ håndtering mellom unge og eldre nevroner bruker protokoller spesielt utviklet for å teste, for eksempel, Ca 2+ exit fra mitokondrier, mitokondrie Ca 2+ opptak i permeabiliserte nevroner og mitokondriell Ca 2+ opptak indusert av Ca 2+ utgivelse fra intracellulære butikker. Dessuten kan denne metode benyttes til å teste for legemidler som påvirker mitokondrielle Ca 2+ overbelastning som kan være av interesse for neurobeskyttelse mot eksitotoksisitet.
Figur 1: Prosedyre for isolering av primær rotte hippocampus-neuroner (A) Poly-D-lysin, 12 mm glassbelagt Dekkglass fremstilles i en petriskål, og til slutt overført til en 4-brønners skål.. (B) Dorsal riss av en rottehjerne. Den stiplede linjen viser hvor snittet skal gjøres. (C) Innhenting somuspension av primære hippocampus nevroner celler. Etter fjerning av hippocampus, er en cellesuspensjon oppnådd. Deretter blir cellene sådd ut i fire-brønns skåler inneholdende poly-D-lysin-belagte dekkglass. (D) Bright felt bilde som viser primære rotte hippocampus nevroner i kultur. Bar representerer 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2:. NMDA øker cytosolisk [Ca 2+] i hippocampus nevroner kort og lang sikt dyrkede hippocampus nevronene ble lastet med fura2 / AM og utsatt for fluorescens bildebehandling. Bildene viser representative lyse felt og pseudocolor bilder (Ratio F340 / F380) av kortsiktig (A) og langsiktig (B 2+] (pseudocolor skalaer er vist nederst). Spor viser representative, encellede innspillinger av cytosolisk [Ca 2+] i respons til 100 mikrometer NMDA i kortsiktig (A) og langsiktig (B) dyrkede hippocampus nevroner. Merk at cytosolisk [Ca 2+] øker er mye større på lang sikt enn på kort sikt dyrkede nerveceller. Bar representerer 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3:. NMDA induserer mitokondrie Ca 2+ overbelastning i hippocampus nevroner Cultured hippocampus Neurons ble transfektert med lav affinitet, mitokondrier rettet aequorin kondensert til GFP, inkubert med 4 mM coelenterazine og underkastet bioluminescens avbildning av mitokondriell [Ca2 +]. Bildene viser fluorescens (GFP) og akkumulerte fotoniske utslipp (aequorin Bioluminescens) bilder av representative kort- (A) og langsiktig (B) dyrkede hippocampus nevroner. Luminescens intensitet er kodet i pseudocolor (1 til 16 fotoniske utslipp per piksel). Opptak viser utgivelsen av fotoniske utslipp (uttrykt som mitokondrie [Ca 2+]) i kort- (A) og langsiktig (B) dyrkede hippocampus nevroner. NMDA 100 mikrometer økt mitokondriell [Ca 2+] i alderen nevroner, men ikke hos unge dyrkede hippocampus nevroner. Bar representerer 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. </ a>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ombygging av intracellulær Ca 2+ homeostase i den aldrende hjernen har vært knyttet til kognitiv tap, økt mottakelighet for iskemisk skade, excitotoxicity og neurodegenerering. For å undersøke denne hypotesen in vitro, Ca 2+ bildebehandling prosedyrer er tilgjengelige. Dessverre, levedyktige kulturer av gamle hippocampus nevroner er ikke pålitelige. Nylig har det blitt observert at langtidskulturer av rotte-hippocampus-neuroner til stede mange av de typiske kjennetegnene ved aldring in vivo inkludert ROS akkumulering, dannelse av Lipofuscin granulater, heterochromatic brennpunkter, aktivering av pJNK og p53 / p21 trasé, kolesterol tap, og forandrer tettheten av Ca2 + kanaler og NMDA-reseptorer 14. Følgelig kan Ca 2+ bildebehandling eksperimenter i unge og gamle kulturer av rotte hippocampus nevroner gi ny innsikt av Ca 2+ ombygging i den aldrende hjernen. En tilstand som er avgjørende for dyrking hippocampal nevroner i det lange løp er to fold. For det første er det viktig å plate cellene ved en meget lav densitet som nevnt ovenfor. For det andre, blir cellene dyrket i medium supplert Neurobasal uten endring av medium. Denne tilnærmingen muliggjør nærværet av gliaceller, men unngår deres altfor vekst. Den skjematiske for en slik kultur er vist i figur 1.
Fluorescens bildebehandling med syntetiske Ca 2+ prober tillater overvåking av cytosolisk [Ca 2+] i enkelte nevroner 19. Bruken av denne tilnærmingen hos unge og eldre nevroner tillater overvåking av endringer i svarene med alderen på kultur. For eksempel Figur 2 viser typiske lyse felt og Ca 2+ bilder av økninger i [Ca 2+] cyt indusert av NMDA hos unge nevroner og nerveceller fra alderen kulturer. Legg merke til at svarene i alderen nevroner er mye større enn hos yngre nevroner. Imidlertid er denne fremgangsmåten ikke er pålitelig for [Ca 2+] Målinger innenfor subcellulære organeller som, for eksempel, mitokondriene, hvor [Ca2 +] kan variere fra under pM til over mM nivå. I slike tilfeller, proteinbasert, mitokondrier målrettede prober har blitt utviklet som, for eksempel, aequorin. Denne sonden er spesielt interessant siden sin affinitet for Ca 2+ kan finjustert for å overvåke svært lave eller svært høye [Ca 2+] som de nådde inne mitokondriene i hvile og stimulert forhold, henholdsvis. Nærmere bestemt, er det mulig å velge enten villtypen aequorin eller en mutert aequorin uten Ca 2+ bindingsseter for å modifisere affiniteten. Finjustering oppnås når ulike coelenterazines (villtype, h, n) brukes i kombinasjon med ulike aequorins 17. Imidlertid, mens anvendelse av fluorescens for Ca 2+ avbildning er utbredt, overvåking bioluminescens er ikke enkelt, og kan kreve fotontelling kameraer. Heldigvis aequorinsonder, som den som brukes her, har blitt forbedret til co-express GFP 18 noe som gjør dem mer stabile, i stand til å frigjøre mer fotoniske utslipp og tillater enkel identifisering av transfekterte celler av GFP forbundet fluorescens. Suksess i bioluminescens avbildning i neuroner avhenger ikke bare effektiviteten av fotontelling kamera som brukes, men også av effektiviteten av transfeksjon av mitochondria målrettede probe. I tilfelle av hippokampale neuroner, kan en enkel kjemisk transfeksjon fungere dersom et høyt følsomt fotontelling kamera som er tilgjengelig. Figur 2 viser eksempler på lysfelt, GFP fluorescens og Bioluminescens bilder av unge og eldet i kultur hippocampus-neuroner. Også vist er økningene i mitokondrie [Ca 2+] indusert av NMDA registrert i transfekterte hippocampus nevroner. Legg merke til at virkningen av NMDA er mye større i alderen dyrkede neuroner enn i små neuroner. I andre tilfeller, effektiviteten av transfecsjon kan økes ved å bruke virusavledede vektorer 16,18. Alternativt, er utvikling av transgene mus som bærer protein-baserte, subcellulære Ca 2 + sondene en ny mulighet for fremtidige nærmer seg, kanskje til og med in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Culture Medium | Gibco | 21103-049 | |
| HBSS medium | Gibco | 14170-088 | |
| Ham's F-12 medium | Gibco | 31330-038 | |
| DNase I (from bovine pancreas) | Sigma | D5025-15KU | |
| Fetal Bobine Serum | Lonza | DE14-801E | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-032 | |
| 12 mm glass coverslips | Labolan | 0111520/20012 | |
| Papain | Worthington | LS003127 | |
| 4-well multidish plaques | Nunc | 176740 | |
| Petry dishes | JD Catalan s.l. | 2120044T | |
| Sterile pipettes | Fisher Scientific | 431030 | |
| Fura2-AM | Life Technologies | F1201 | |
| Lipofectamine2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
| Coelenterazine n | Biotium | BT-10115-2250 uG | |
| Digitonin | Sigma | D5628 | |
| NMDA | Sigma | M3262 | |
| Glycine | Sigma | 50046 | |
| Zeiss Axiovert S100 TV microscope | Carl Zeiss Inc. | ||
| Xcite ilumination system | EXFO | ||
| ORCA ER fluorescence camera | Hamamatsu | ||
| VIM photon counting CCD camera | Hamamatsu | ||
| VC-8 valve controller | Warner Instruments | ||
| SH-27B heating system | Warner Instruments | ||
| Aquacosmos Software | Hamamatsu Photonics |
References
- Sattler, R., Tymianski, M. Molecular mechanisms of glutamate receptor-mediated excitotoxic neuronal cell death. Molecular Neurobiology. 24 (1-3), 107-129 (2001).
- MacDermott, A. B., Mayer, M. L., Westbrook, G. L., Smith, S. J., Barker, J. L. NMDA-receptor activation increases cytoplasmic calcium concentration in cultured spinal cord neurones. Nature. 321 (6069), 519-522 (1986).
- Choi, D. W., Maulucci-Gedde, M., Kriegstein, A. R. Glutamate neurotoxicity in cortical cell culture. The Journal of Neuroscience. 7 (2), 357-368 (1987).
- Kure, S., Tominaga, T., Yoshimoto, T., Tada, K., Narisawa, K. Glutamate triggers internucleosomal DNA cleavage in neuronal cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 179 (1), 39-45 (1991).
- Calvo, M., Sanz-Blasco, S., Caballero, E., Villalobos, C., Nunez, L. Susceptibility to excitotoxicity in aged hippocampal cultures and neuroprotection by non-steroidal anti-inflammatory drugs: role of mitochondrial calcium. Journal of Neurochemistry. 132 (4), 403-417 (2015).
- Liu, Y., et al. NMDA receptor subunits have differential roles in mediating excitotoxic neuronal death both in vitro and in vivo. The Journal of Neuroscience. 27 (11), 2846-2857 (2007).
- Zhou, M., Baudry, M. Developmental changes in NMDA neurotoxicity reflect developmental changes in subunit composition of NMDA receptors. The Journal of Neuroscience. 26 (11), 2956-2963 (2006).
- Brewer, L. D. Increased vulnerability of hippocampal neurons with age in culture: temporal association with increases in NMDA receptor current, NR2A subunit expression and recruitment of L-type calcium channels. Brain Research. 1151, 20-31 (2007).
- Berridge, M. J. Calcium signalling remodelling and disease. Biochemical Society Transactions. 40 (2), 297-309 (2012).
- Stout, A. K., Raphael, H. M., Kanterewicz, B. I., Klann, E., Reynolds, I. J. Glutamate-induced neuron death requires mitochondrial calcium uptake. Nature Neuroscience. 1 (5), 366-373 (1998).
- Pivovarova, N. B., et al. Excitotoxic calcium overload in a subpopulation of mitochondria triggers delayed death in hippocampal neurons. The Journal of Neuroscience. 24 (24), 5611-5622 (2004).
- Morris, R. G., Garrud, P., Rawlins, J. N., O'Keefe, J. Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions. Nature. 297 (5868), 681-683 (1982).
- Geinisman, Y., Detoledo-Morrell, L., Morrell, F., Heller, R. E. Hippocampal markers of age-related memory dysfunction: behavioral, electrophysiological and morphological perspectives. Progress in Neurobiology. 45 (3), 223-252 (1995).
- Sodero, A. O., Weissmann, C., Ledesma, M. D., Dotti, C. G. Cellular stress from excitatory neurotransmission contributes to cholesterol loss in hippocampal neurons aging in vitro. Neurobiology of Aging. 32 (6), 1043-1053 (2011).
- Brini, M., et al. Transfected aequorin in the measurement of cytosolic Ca2+ concentration ([Ca2+]c). A critical evaluation. The Journal of Biological Chemistry. 270 (17), 9896-9903 (1995).
- Villalobos, C., Alonso, M. T., Garcìa-Sancho, J. Bioluminescence imaging of calcium oscillations inside intracellular organelles. Methods in Molecular Biology. 574, 203-214 (2009).
- Villalobos, C., et al. Redistribution of Ca2+ among cytosol and organella during stimulation of bovine chromaffin cells. FASEB Journal. 16, 343-353 (2002).
- Rogers, K. L., et al. Visualization of local Ca2+ dynamics with genetically encoded bioluminescent reporters. The European Journal of Neuroscience. 21 (3), 597-610 (2005).
- Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM. Journal of Visualized Experiments. (23), 1067 (2009).
