Abstract
Modtagelighed for neuron celledød forbundet til neurodegeneration og iskæmi er overordentlig forøget i alderen hjernen, men mekanismer ansvarlige er dårligt kendt. Excitotoksicitet, en proces menes at bidrage til neuron skader induceret af begge fornærmelser, medieres ved aktivering af glutamatreceptorer, der fremmer Ca2 + indstrømning og mitokondriel Ca2 + overbelastning. En væsentlig ændring i intracellulær Ca2 + homøostase eller omformning af intracellulær Ca2 + homøostase kan begunstige neuron skader i gamle neuroner. Til undersøgelse Ca2 + remodeling i aldring har vi brugt levende celler i de lange kulturer af rotte hippocampale neuroner, der ligner i nogle aspekter alderen neuroner in vivo. Til dette formål hippocampus celler, i første omgang, frisk spredt fra nye født rotte hippocampi og belagt på poli-D-lysin coatede, dækglas. Så kulturer holdes i kontrollerede medier i flere dage eller flere weeks til undersøgelse unge og gamle neuroner, hhv. For det andet, dyrkes neuroner fyldt med fura2 og underkastet målinger af cytosolisk Ca2 + -koncentration brug af digital fluorescensforhold billedbehandling. For det tredje, dyrkes neuroner transficeret med plasmider, der udtrykker en tandem med lav affinitet aequorin og GFP målrettet til mitokondrier. Efter 24 timer er aequorin i celler rekonstitueres med coelenterazin og neuroner udsættes for bioluminescens billeddannelse til monitorering af mitokondrie Ca2 + -koncentration. Denne tretrins procedure tillader overvågning af cytosolisk og mitokondrie Ca2 + svar på relevante stimuli som for eksempel glutamatreceptoragonist NMDA og sammenligne, om disse og andre reaktioner påvirkes af aldring. Denne procedure kan give ny viden om, hvordan aldring indflydelse cytosol og mitokondrie Ca 2+ reaktioner på udvalgte stimuli samt afprøvning af udvalgte lægemidler til formål at forhindre neuron celledød i aldersrelaterede sygdomme.
Introduction
Excitotoksicitet er en af de vigtigste mekanismer, der bidrager til neuronal skade og celledød i neurologiske påvirkninger såsom iskæmi, og i nogle neurodegenerative sygdomme, såsom Alzheimers sygdom 1. Denne type af neurotoksicitet er primært medieret af glutamat handler om Ca 2 + -permeable, ionotrope NMDA-receptorer (NMDAR) 2. Eksponering af dyrkede neuroner til glutamat kan føre til excitotoksicitet 3, som forårsager neuronal apoptose 4. Vi og andre har tidligere rapporteret, at neuronal sårbarhed over for NMDA-induceret apoptose kan ændre sig med udvikling in vitro og aldrende 5-8.
Det er almindeligt accepteret, at en stigning i cytosol-fri Ca2 + -koncentration ([Ca2 +] cyt) fører til celler aktivering. Men hvis denne stigning er for høj og / eller vedvarende nok, kan det udløse celledød 9. Desuden er det blevet foreslåetat excitotoksicitet kræver mitokondrie Ca2 + uptake 10, eftersom det at behandle neuroner med en mitochondrial afkobler beskyttede neuroner mod glutamat-induceret celledød 11. Hvis mitokondrier fylder for meget Ca2 +, kan forekomme åbningen af mitokondrie permeabilitet overgangen pore, hvilket fører til frigivelse af cytochrom c og andre pro-apoptotiske faktorer, og inducere apoptose. Vi har for nylig vist, at denne mitochondrial Ca2 + optagelse direkte relateret til aldersbetinget følsomhed over for excitotoksicitet, ved direkte måling af NMDA-induceret mitokondrie Ca2 + optagelse i enkelte hippocampusneuroner 5, en fremgangsmåde, som er rapporteret i denne artikel. Hippocampus, der er involveret i fysiologiske processer såsom indlæring, hukommelse og andre kognitive processer 12, er meget sårbare over for aldring og neurodegenerative sygdomme 13. Det er blevet foreslået, at der efter flere uger in vitro, dyrkeshippocampale neuroner viser en række typiske kendetegn for alderen neuroner 14. Derfor kan langsigtede dyrkede hippocampusneuroner give en omfattende model til at undersøge Ca 2+ medierede mekanismer forbedret excitotoksicitet i aldring.
Det overordnede mål med den metode præsenteret, er derfor at undersøge væsentlige ændringer i intracellulær Ca2 + homøostase eller Ca2 + ombygning i den aldrende hjernen, herunder forskellen Ca 2+ reaktioner fremkaldt af NMDA receptor agonister i en langsigtet dyrkede hippocampusneuroner . Metoden indeholder en detaljeret beskrivelse af kulturen i rotte hippocampusneuroner og overvågning af cytosoliske og mitokondrie Ca 2 + koncentrationer ved fluorescens og bioluminescens billedbehandling i individuelle neuroner, hhv. Fluorescensimagografi af cytosoliske Ca2 + i dyrkede neuroner er en standard procedure. Men denne metode er mindre pålidelige til subcellulære Ca 2 + målinger herunder mitokondrie Ca2 +. Årsager til dette omfatte mangel på ordentlig målretning af syntetiske sonder og uhensigtsmæssig affinitet for Ca 2 + koncentrationer, som kan ændre sig i mitokondrier fra det lave pM niveau selv til mM niveau. Anvendelsen af Ca2 + prober baseret på proteiner som for eksempel aequorin, har gjort det muligt at målrette til subcellulære organeller og anvendelsen af derivater forskellige Ca2 + ved hjælp af forskellige affiniteter coelenteraziner eller muterede prober mangler specifik Ca2 + bindingssteder 15. På denne måde kan bioluminescens billeddannelse af celler, der udtrykker mitokondrier målrettet aequorin tillade overvågning af mitokondrielle Ca2 + koncentrationer i individuelle neuroner. Alligevel kan denne fremgangsmåde kræver anvendelse af foton tælle kameraer eller ultrafølsomme CCD-kameraer for bioluminescens imaging 16-18. Denne metode kan give nye resultater, der skal bekræftes i flere establfærdigvarer hjerne aldring modeller som for eksempel, hjerne skiver fra gamle dyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Statement: Procedurer, der involverer dyr fag er blevet håndteret i henhold til protokoller godkendt af Valladolid Universitet stalde facilitet efter aftale med / Europarådets europæiske konvention 123 og direktiv 86/609 / EØF.
1. Kort og Langsigtet Kultur i Rat hippocampusneuroner
- Fremstilling af poly-D-lysin belagt, 12 mm dækglas.
- Sterilisere 12 mm diameter dækglas i ethanol i mindst 24 timer. Lad dem tørre under sterile forhold.
- Fordel dækglassene på en strimmel af parafilm i en petriskål. Dække overfladen af hver dækglas med 200 pi 1 mg / ml poly-D-lysin. Tillad behandle O / N.
- Den næste dag vaskes dækglassene med dobbelt destilleret sterilt vand hver 15 min i 90 min under sterile betingelser.
- Fyld en fire-brønds multiplade plade med 500 pi Neurobasal Culture Medium per brønd. Neurobasal Kultur Medium bør suppleres med10% føtalt bovint serum, 2% B27, 1 ug / ml gentamicin og 2 mM L-glutamin.
- Placer dækglas i multiplade plade. Bevar dem i en fugtig 37 ºC og 5% CO2 inkubator indtil brug.
- Isolering af hippocampale neuroner fra neonatale rotter.
- Forbered 1,8 ml papain opløsning (købt direkte) i et hætteglas (20 ul / ml) under sterile betingelser: at opnå en endelig koncentration på 20 ul / ml tilsættes ca. 40 pi papain i 1,8 ml Hanks plus 0,6% BSA (skal beregnes pi afhængig af leverandørens forhold). Hanks 0,6% BSA fremstilles ved at blande 85 ml HBSS medium med 15 ml 4% bovint serumalbumin (BSA, fremstillet løse 4 g BSA i 100 ml HBSS). Forberede det i en steril hætte.
- Inkubér papain i Hanks plus 0,6% BSA i 30 minutter ved 37 ° C før brug. Opløsningen filtreres under anvendelse af et 0,22 um filter før brug.
- Forbered Hams F-12-medium ved tilsætning af DulbeccosModificerede Eagles medium pulver (13,5 g pr L) i 900 ml dobbelt destilleret sterilt vand. Derefter tilsættes 6 g HEPES og 336 mg NaHCO3 og pH justeres til 7,42 under anvendelse af NaOH 4 N. Tilføj sterilt vand med henblik på at opnå en 1 L opløsning og filtreres under anvendelse af en 0,20 um polyethersulfon (PES) flaske topfilter. Bære denne proces i en steril hætte. Endelig mætte løsning med CO2 under sterile forhold før brug. Butiksløsninger ved 4 ºC og bruge dem kølet.
- Aflive nyfødte (P0) rotteunger ved halshugning og vaske hovedet i sterilt HBS medium. Åbne kraniet ved hjælp af steril saks. Uddrag hjernen med en spatel og vaske det hurtigt i Hams F-12 medium.
- Lav et diagonalt snit ved hjælp af en skalpel i hvert halvkugle (figur 1B), og bære den til en petriskål indeholdende Hams F-12 medium.
- Kassér meninges omhyggeligt med hjælp af dissektion pincet og under en lup. <li> Identificer hippocampus i en karakteristisk konkave placering over cortex hjælp forstørrelsesglas. Derefter adskille hippocampus fra cortex ved at trække forsigtigt fra én grænse og fjerne den fra sin position ved hjælp øjet saks.
- Overfør hippocampus væv til en 4-brønds plade fyldt med sterilt Hanks medium, som manglede Ca 2+ og Mg 2+ plus 0,6% BSA og vask hippocampus væv. Uden at fjerne medierne skære væv i små stykker (ca. 2 x 2 mm) under anvendelse af samme øje saks.
- Overfør hippocampus stykker til et hætteglas indeholdende 1,8 ml forfiltreres papainopløsning. Så inkubere dem ved 37 ºC med lejlighedsvis, forsigtig omrystning. 15 min senere, tilsættes 90 pi DNase I-opløsning (50 ug / ml endelig) og inkuberes i 15 min yderligere.
- Overfør væv til en 10 ml centrifugerør og vaskes fragmenterne med frisk Neurobasal dyrkningsmedium. Opnå cellesuspension ved at passere vævsfragmenter gennem en 5 ml plastik pipette.
- Centrifuger cellesuspensionen ved 160 xg i 5 minutter. Fjern supernatanten under anvendelse af en plast steril Pasteur-pipette og suspenderer pellet forsigtigt med en 1 ml pipette automatiserede i 1 ml Neurobasal dyrkningsmedium.
- Mål celletæthed ved hjælp af en Neubauer tællekammer. Sæt dækglas over Neubauer kammer. Tilsæt 10 pi cellesuspension. Sørg cellesuspensionen kommer ind i kammeret ensartet og gøre ingen bobler. Tæl antallet af celler under mikroskop og udfører tilsvarende beregninger for at opnå en passende fald på 40-80 pi indeholdende 30 x 10 3 celler. Det totale antal celler vil afhænge af antallet af dyr, der anvendes.
- I de fire brønde multiplade plade indeholdende 500 pi Neurobasal Culture medium fremstillet før og holdes i inkubatoren, pladen omkring 30 x 10 3 celler i et fald på omkring 50 pi til hverbrønd af multiplade plade indeholdende en poly-D-lysin-overtrukne 12 mm diameter dækglas.
- Oprethold primære hippocampus celler i en fugtig 37 ºC og 5% CO2 inkubator i 2-5 dage in vitro (DIV, kortvarige, unge kulturer), eller> 15 DIV (Langsigtede, alderen kulturer) før eksperimenter uden at ændre kulturen medier.
2. fluorescensafbildning af Cytosoliske Ca2 + -koncentration
- Fremstilling af testopløsninger for fluorescensafbildning.
- Forbered en ekstern HEPES-bufret saltvand (HBS) indeholdende, i mM: NaCl 145, KCI 5, MgCl2 1, CaCI2 1, glucose 10, natrium-HEPES 10 (pH 7,42).
- Forbered en ekstern, Mg2 + -fri, HEPES-bufret saltvand (HBS) indeholdende, i mM: NaCl 146, KCI 5, CaCl2 1, glucose 10 og 10 HEPES (pH 7,42).
- Løs NMDA i Mg2 + -fri, HEPES-bufret saltvand (HBS) ved en final koncentration på 100 uM og supplere den med 10 pM glycin.
- Der fremstilles en opløsning indeholdende HBS KCI i stedet for NaCl ved at løse (i mM): KCI 145, MgCl2 1, CaCI2 1, glucose 10 og 10 HEPES (pH 7,42).
- Lastning af hippocampale celler med fluorescerende calcium probe fura2 / AM.
- Tag celle kultur indeholdende dækglas fra inkubatoren og vaske dem med HBS medium ved RT ved at overføre dem til en ny fire-godt multiskål plade indeholdende 500 pi HBS pr godt.
- Inkuber celler med fura2 / AM 4 pM (fremstillet på samme HBS medium) i 60 min ved RT (25 ºC) i et mørkt sted.
- Efter 60 minutter, vask dækglas med frisk HBS medium.
- Optagelse fluorescensbilleder af cytosoliske [Ca2 +] i dyrkede celler.
- Tænd lampen, mikroskop, perfusionssystem, fluorescens kamera og computer.
- Placer dækglassene i et termostateret platform foråbne 12 mm dækglas på scenen i omvendt mikroskop, og vælg en mikroskopisk felt ved hjælp af en 40X målsætning (olie, NA: 1.3). Perfundere celler kontinuerligt med foropvarmet (37 ° C) HBS medium i fravær eller nærvær af teststoffer. Opretholde flowet med en hastighed på ca. 5-10 ml / min.
Bemærk: Cell perfusionssystem til levende celler er monteret i et termostateret platform for åbne 12 mm dækglas. 8-linjer tyngdekraften drevne perfusion, der er udstyret med en ventil controller bruges til at perfundere løsningerne. En vakuumpumpe er ansvarlig for at fjerne eventuelt overskydende medium. Løsninger opvarmes ved hjælp af en i-rør varmesystemet. - Fang et baggrundsbillede med lukkeren lukket i begge excitationsbølgelængder.
- Epi-belyse celler skiftevis ved 340 og 380 nm. Optag lys, der udsendes ved 520 nm hver 5-10 sek med en fluorescens-kamera, som er filtreret af et Fura-2 dikroisk spejl.
- Når optagelsen periode er færdig, gemmer den komplette sekvens of billeder udsendes ved 520 nm i computeren til yderligere analyse.
- Analyse af indspillede fluorescerende billeder.
- Åbn eksperimentet fil. Ved hjælp af aquacosmos softwaren, skal du klikke på 'Ratio', og vælg det ønskede forhold rækkevidde. Beregn pixel for pixel-forhold i de resulterende billeder for at opnå en sekvens af forholdet billeder.
- Træk baggrunden ved at justere "baggrunden elimination". Tryk på 'begyndelse beregning «.
- Tryk på 'alle tider sekvens' knappen og slette de gamle områder af interesse (ROI'er). Til kvantitativ analyse af de enkelte celler, etablere nye områder af interesse, eller ROI'er, der svarer til de enkelte neuroner. Gennemsnitlige alle forholdsværdier i hver pixel svarer til hver ROI og hvert billede for at opnå en optagelse af forholdet fluorescens værdier for de enkelte ROI'er (celler).
- At tegne de enkelte optagelser eksportere forholdet fluorescens værdier svarende til hver ROI til en graftegning progrer.
- Foretag de tilsvarende beregninger til vurdering af størrelsen af de stigninger i forholdet fluorescenser som svar på hver stimulation ved hjælp af en passende dataanalyse og graftegning software.
3. Bioluminescens Imaging af mitokondrie Ca2 + Koncentration
- Transfektion af dyrkede hippocampale neuroner med mitGAmut plasmid.
BEMÆRK: Celler først transficeret med mitGAmut plasmid indeholdende et mitokondrier målrettet sekvens og en muteret aequorin mangler en Ca2 + bindingssted fusioneret til grønt fluorescerende protein (GFP). Denne konstruktion detekterer store stigninger i mitokondrie Ca2 + optagelse og muliggør identifikation af transficerede celler ved GFP-fluorescens. Plasmidet blev udviklet og stillet til rådighed af P. brulet og medarbejdere 18 (CNRS, Paris).- Forbered Neurobasal TF, indeholdende Neurobasal Culture Medium, mangler kalvefosterserum, B27, gentamici og 2 mM L-glutamin.
- Forbered 50 pi Neurobasal TF plus 2,5 pi transfektionsreagens i et hætteglas (opløsning A). Forbered 50 pi Neurobasal TF plus 4 ug mitGAmut plasmid i et hætteglas (opløsning B). Tilføj forsigtigt opløsning B i løbet af opløsning A. tillade blanding løbet af 20 minutter, uden at ryste.
- Overfør dækglassene indeholdende hippocampusneuroner til nye multiplade plader indeholdende 200 pi frisk neurobasalt TF.
- Tilføj dråbe for dråbe 100 pi af opløsning A + B over hver dækglas. Der inkuberes i 30 min. Fjern mediet. Der vaskes én gang celler med frisk neurobasalt TF. Retur dækglassene til den oprindelige Neurobasal dyrkningsmediet.
- Kultur neuroner i yderligere 24 timer ved 37 * C og 5% CO2 efter transfektion for at muliggøre effektiv ekspression og målretning af sonden.
- Udarbejdelse af test løsninger til bioluminescens billeddannelse.
- Forbered HBS opløsninger indeholdende NMDA 100 uM eller 145 mM KCI somovenfor (trin 2.1). Forbered HBS opløsning indeholdende 10 mM Ca2 + plus digitonin 100 uM.
- Rekonstituering af mitokondrier målrettet aequorin med coelenterazin n.
- Overfør dækglas indeholder transficerede hippocampusneuroner til en fire-brønds plade indeholdende 200 pi HBS.
- Tilføj 4 pi coelenterazine n (200 uM) til 200 pi HBS for en slutkoncentration på 4 uM og blandes forsigtigt. Inkuber i 2 timer ved stuetemperatur (25 ° C) og i mørke.
- Optagelse Bioluminescens billeder af mitokondrie [Ca2 +].
- Tænd mikroskopet, lampen, perfusionssystemet, bioluminescens kameraet og computeren.
- Overfør rekonstitueret dækglas til en termostateret (37 ºC) perfusionskammeret og perfundere kontinuerligt med forvarmet HBS opløsning ved en hastighed på 5-10 ml / min.
- Ved hjælp af en 40X mål (olie, NA: 1,3), vælg mikroskopisk felt, der indeholder celler, der udtrykker etpoaequorins som vist ved hjælp af fluorescens-emission i forbindelse med ekspression af grønt fluorescerende protein (GFP) under anvendelse af FITC-filtre. Et typisk område kan indeholde 1-2 transficerede celler. Fange GFP-fluorescens billedet, ved hjælp af et CCD-kamera.
- Sluk mikroskopet lys. Fjern dichroic-holdige boks ligger i lyset pathway. Sluk excitationslyset og lukke mørke-boks til komplet mørke.
- Perfundere celler ved 5-10 ml / min med HBS medium med eller uden testopløsninger pre-varmet ved 37 ºC.
- Capture fotoniske emission billeder hver 10 sek med en foton-optælling kamera håndteres med et billede processor.
- Ved afslutningen af hvert forsøg, permeabilisere celler med 0,1 mM digitonin i 10 mM CaCl2 i HBS for at frigive alle resterende fotoniske emissioner.
Bemærk: Disse fotoniske emissioner skal tilføjes op for at estimere de samlede fotoniske emissioner, en værdi der kræves for kalibrering i Ca 2 + koncentrationer <./ li> - Opbevar bioluminescens billeder i computeren med GFP tilhørende fluorescens, der optages før foton tælling billeddannelse.
- Analyse af bioluminescens billeder afspejler mitokondriske [Ca2 +].
- Kvantificere fotoniske emissioner ved hjælp af specifik software. Fotoniske emissioner kan omdannes til mitokondrie frie Ca2 + -koncentration ([Ca2 +] mit) under anvendelse af algoritmen beskrevet af Brini et al. 15.
- Åbn eksperimentet og GFP-fluorescens billede. Vælg områder af interesse (ROI'er) ved hjælp af en specifik software ved at tegne formen af de transficerede celler i overensstemmelse med fluorescens billeder taget ved begyndelsen af forsøget.
- Indsæt de samme ROI'er på hvert billede. Total fotoniske emissioner i hvert ROI beregnes med særlig software for at opnå værdien luminescens emission (L) for hver celle på hvert tidspunkt.
- Tilføj op alle de fotoniske emissioner i bioluminescens billeder, herunder dem opnået efter digitonin permeabilisering, anvendelse af den specifikke software, for at opnå en bioluminescens billede, der indeholder alle de fotoniske emissioner.
- Eksport værdier af fotoniske emissioner for hver region af interesse for en bestemt software til beregninger. For at gøre dette, skal du klikke på 'Graph "for at beregne bioluminescens værdier for hver ROI på hver gang. Vælg 'samlede værdi "og" bruge aktuelle ROI til alle billeder. Tryk på 'Beregn'. Gem 'txt.file «og eksportere data til et regneark. For hver ROI, [Ca2 +] mit beregnes ved hjælp af følgende algoritme:
[Ca2 +] (M) = [R + (R · K TR) - 1] / [K R - (R · K R)];
hvor,
R = [L / (L total λ)] 1 / n
L er luminescensen emitteret på tidspunktet for måling i hvert område af interesse.
L samlede tal erden samlede luminescens tilbage efter tilsætning af tællingerne er til stede i vævet på det tidspunkt på tidspunktet for måling for hver region af interesse. λ, K TR, K R og n er konstanter, hvis værdier afhænger af kombinationen af aequorin (vildtype eller muteret) og coelenterazin anvendes (vildtype eller n-type) samt temperaturen 16 optagelsen. For kombinationen anvendes her (muteret AEQ og coelenterzine n) ved 37 ºC, brugte vi følgende værdier: K R = 8,47 x 10 7, K TR = 165,6 x 10 3, n = 1.204 og λ = 0138.
- Foretag de tilsvarende beregninger til vurdering af størrelsen af de stigninger i bioluminescens som svar på hver stimulus ved hjælp af en passende dataanalyse og graftegning software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her beskriver vi en enkel metode til at vurdere Ca 2+ remodeling og virkningerne af NMDA om cytosoliske og mitokondriske [Ca2 +] i alderen neuroner. Figur 1 viser skematisk proceduren til isolering og dyrkning hippocampusneuroner fra neonatale rotter. Før du starter, er vi nødt til at forberede sterile, poly-D-lysin coatede, dækglas og finde dem i en 4-godt fad. Derefter neonatale rotter aflivet, og hjernen fjernes. Efter isolering af hippocampus, er væv omhyggeligt dispergeret ved anvendelse af papain. Isolerede celler vaskes og udpladet på overtrukne dækglas. Derefter dyrkes cellerne i 2-5 DIV eller> 15 DIV at få unge eller gamle kulturer, henholdsvis, og anvendes til Ca2 + billeddannelse eksperimenter.
Under anvendelse af ovennævnte strategi, er det muligt at have unge og gamle neuroner fra samme prøve at teste, for eksempel om NMDA fremkalder forskellige virkninger på cytosoliske [Ca2 +] i unge cultures end i ældre kulturer. Figur 2 viser, at NMDA 100 uM inducerer større stigninger i cytosoliske [Ca2 +] i ældre kulturer end hos yngre kulturer. Ligeledes NMDA fremkalder celledød i gamle neuroner, men ikke i unge neuroner 5. I tilfælde, hvor Ca2 + reaktioner er meget høj, kan lignende forsøg udføres med Ca2 + prober med mindre affinitet for Ca 2+ at undgå farvestof mætning lignende, for eksempel fura4F 5. På samme måde er det også muligt at se, om hvilende niveauer af cytosolisk [Ca2 +] er forskellige. Endvidere kan kombinationen af denne protokol med kvantitative immunofluorescens under anvendelse af antistoffer specifikke for NMDAR underenheder give korrelere ændringer i reaktionsevne med forskelle i ekspression af NMDA receptor-underenheder, forudsat at specifikke antistoffer er tilgængelige 5. Målinger af cytosole [Ca2 +] kan også anvendes til at vurdere andre relevante parameters herunder Ca2 + butik indhold, hvilende gennemtrængelighed for Ca2 +, Ca 2 + clearance og deres mulige forskelle mellem unge og ældre neuroner.
På en tilsvarende måde, er det også muligt at teste virkningerne af sådanne stimuli på mitokondriske [Ca2 +]. Figur 3 viser et eksempel på bioluminescens billeddannelse af hippocampusneuroner transficeret med mitokondrier målrettet aequorin. Frigivelse af fotoniske emissioner efter stimulering er en funktion af stigningen i mitokondrie [Ca2 +] opnået. Bemærk, at NMDA-inducerede stigninger i mitokondrie [Ca2 +] er meget større hos ældre neuroner end hos yngre hippocampale neuroner, hvor NMDA næppe øger fotoniske emissioner. Disse resultater kan bidrage til at forklare, hvorfor NMDA fremkalder apoptose kun alderen neuroner, men ikke i unge kulturer af hippocampale celler 5. På samme måde er det muligt at teste for yderligere forskelle i mitokondrieCa 2 + håndtering mellem unge og ældre neuroner benytter protokoller specielt designet til at teste, for eksempel, Ca2 + udgang fra mitokondrier, mitokondrie Ca2 + optagelse i permeabiliserede neuroner og mitokondrie Ca2 + optagelse induceret af Ca 2+ frigivelse fra intracellulære lagre. Desuden kunne denne metode bruges til at teste for narkotika påvirker mitokondrie Ca 2+ overbelastning, som kan være af interesse for neuroprotektion mod excitotoksicitet.
Figur 1: Fremgangsmåde til isolering af primære rotte hippocampale neuroner (A) Poly-D-lysin, 12 mm glas dækglas overtrukket fremstilles på en petriskål og endelig overført til en 4-brønds skål.. (B) Dorsal af en rottehjerne. Den stiplede linje angiver, hvor snittet skal foretages. (C) Indhentning somuspension af primære hippocampale neuronceller. Efter fjernelse af hippocampus, er en cellesuspension opnået. Så celler udplades i 4 brønde indeholdende poly-D-lysin-coatede dækglas. (D) lysfelt billede, der viser de primære rotte hippocampale neuroner i kultur. Søjle repræsenterer 10 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:. NMDA øger cytosoliske [Ca2 +] i hippocampale neuroner Kort- og langsigtede dyrkede hippocampale neuroner blev fyldt med fura2 / AM og underkastet fluorescensafbildning. Billeder viser repræsentative lyse felt og pseudofarve billeder (Ratio F340 / F380) af kortsigtede (A) og lang sigt (B [Ca2 +] (pseudofarve skalaer er vist nederst). Spor viser repræsentative, encellede optagelser af cytosoliske [Ca2 +] som svar på 100 uM NMDA i kortfristede (A) og lang sigt (B) dyrkede hippocampale neuroner. Bemærk, at cytosole [Ca2 +] stigninger er meget større i langsigtet end i korte dyrkede neuroner. Søjle repræsenterer 10 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:. NMDA inducerer mitokondrie Ca2 + overbelastning i hippocampusneuroner kulturperler hippocampus NEURons blev transficeret med lav affinitet, mitokondrier målrettet aequorin fusioneret til GFP, inkuberet med 4 pM coelenterazin og udsat for bioluminescens billeddannelse af mitokondrie [Ca2 +]. Billeder viser fluorescens (GFP) og akkumulerede fotoniske emissioner (aequorin bioluminescens) billeder af repræsentative kort- (A) og lang sigt (B) dyrkede hippocampusneuroner. Luminescensintensitet er kodet i pseudofarve (1 til 16 fotoniske emissioner per pixel). Optagelser viser udgivelsen af fotoniske emissioner (udtrykt som mitokondrie [Ca2 +]) i kort- (A) og lang sigt (B) dyrkede hippocampusneuroner. NMDA 100 pM øget mitokondriske [Ca2 +] i alderen neuroner, men ikke i unge dyrkede hippocampale neuroner. Søjle repræsenterer 10 um. Klik her for at se en større version af dette tal. </ a>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ombygningen af intracellulær Ca2 + homøostase i den aldrende hjernen er blevet relateret til kognitiv tab, øget følsomhed over for iskæmisk skade, excitotoksicitet og neurodegeneration. For at undersøge denne hypotese in vitro, er tilgængelige Ca2 + billeddannende procedurer. Desværre, levedygtige kulturer af gamle hippocampusneuroner ikke er pålidelige. For nylig er det blevet observeret, at langvarige kulturer af rottehippokampale neuroner foreliggende mange af de typiske kendetegn for ældning in vivo herunder ROS akkumulering, dannelse af lipofuscin granulat, heterochromatic foci, aktivering af pJNK og p53 / p21 veje, cholesterol tab, og ændrer tætheden af Ca 2+ kanaler og NMDA-receptorer 14. Følgelig kan Ca 2+ imaging eksperimenter i unge og gamle kulturer af rotte hippocampale neuroner give ny indsigt af Ca 2+ remodeling i den aldrende hjerne. En tilstand, der er afgørende for dyrkning hippocampal neuroner i det lange løb er to gange. For det første er det vigtigt at pladen cellerne ved en meget lav densitet som angivet ovenfor. For det andet, er celler dyrket i suppleret Neurobasal Medium uden at ændre mediet. Denne fremgangsmåde muliggør tilstedeværelsen af glia, men undgå deres alt for vækst. Den skematiske for en sådan kultur er vist i figur 1.
Fluorescensimagografi med syntetiske Ca2 + prober tillader overvågning af cytosoliske [Ca2 +] i individuelle neuroner 19. Brugen af denne fremgangsmåde i unge og ældre neuroner tillader overvågning af ændringer i besvarelserne med alderen i kultur. For eksempel Figur 2 viser typiske lysfelt og Ca 2+ billeder af stigninger i [Ca2 +] cyt induceret af NMDA hos unge neuroner og neuroner fra alderen kulturer. Bemærk, at svarene i alderen neuroner er meget større end hos unge neuroner. Men denne fremgangsmåde er ikke pålidelige for [Ca2 +] Målinger inden subcellulære organeller såsom for eksempel, mitokondrier, hvor [Ca2 +] kan variere fra under uM til over mM niveau. I de tilfælde, proteinbaserede, mitokondrier målrettet sonder er blevet udviklet som f.eks aequorin. Denne probe er særligt interessant, da dets affinitet til Ca 2+ kan fintunet til at overvåge meget lave eller meget høje [Ca 2+] som dem nået inde mitokondrier i hvile og stimulerede betingelser hhv. Specifikt er det muligt at vælge enten vildtype aequorin eller et muteret aequorin uden Ca2 + bindingssteder at ændre affiniteten. Finjustering opnås, når forskellige coelenteraziner (vildtype, H, N) anvendes i kombination med forskellige aequorins 17. Men mens brugen af fluorescens til Ca2 + billedbehandling er udbredt, overvågning bioluminescens er ikke ligetil og kan kræve foton optælling kameraer. Heldigvis aequorinprober, som den anvendes her, er blevet forbedret til at co-express GFP 18 gør dem mere stabile, i stand til at frigive mere fotoniske emissioner og tillader simpel identifikation af transficerede celler ved GFP forbundet fluorescens. Succes i bioluminescens imaging i neuroner afhænger ikke kun af effektiviteten af foton tælling anvendte kamera, men også på effektiviteten af transfektion af mitokondrierne målrettede probe. I tilfælde af hippocampale neuroner, kan en simpel kemisk transfektion anvendes under forudsætning af, at en høj følsom foton tælling kameraet er til rådighed. Figur 2 viser eksempler på lysfelt, GFP-fluorescens og bioluminescens billeder af unge og ældet i kultur hippocampale neuroner. Også vist er de stigninger i mitokondrie [Ca2 +] induceret af NMDA optaget i transficerede hippocampale neuroner. Læg mærke til, at effekten af NMDA er meget større i alderen dyrkede neuroner end hos yngre neuroner. I andre tilfælde, effektivitet transfecning kan forøges ved anvendelse af virus-afledte vektorer 16,18. Alternativt udviklingen af transgene mus, der huser proteinbaserede, subcellulære Ca2 + prober er en ny mulighed for fremtidige metoder, måske endda in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Culture Medium | Gibco | 21103-049 | |
| HBSS medium | Gibco | 14170-088 | |
| Ham's F-12 medium | Gibco | 31330-038 | |
| DNase I (from bovine pancreas) | Sigma | D5025-15KU | |
| Fetal Bobine Serum | Lonza | DE14-801E | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-032 | |
| 12 mm glass coverslips | Labolan | 0111520/20012 | |
| Papain | Worthington | LS003127 | |
| 4-well multidish plaques | Nunc | 176740 | |
| Petry dishes | JD Catalan s.l. | 2120044T | |
| Sterile pipettes | Fisher Scientific | 431030 | |
| Fura2-AM | Life Technologies | F1201 | |
| Lipofectamine2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
| Coelenterazine n | Biotium | BT-10115-2250 uG | |
| Digitonin | Sigma | D5628 | |
| NMDA | Sigma | M3262 | |
| Glycine | Sigma | 50046 | |
| Zeiss Axiovert S100 TV microscope | Carl Zeiss Inc. | ||
| Xcite ilumination system | EXFO | ||
| ORCA ER fluorescence camera | Hamamatsu | ||
| VIM photon counting CCD camera | Hamamatsu | ||
| VC-8 valve controller | Warner Instruments | ||
| SH-27B heating system | Warner Instruments | ||
| Aquacosmos Software | Hamamatsu Photonics |
References
- Sattler, R., Tymianski, M. Molecular mechanisms of glutamate receptor-mediated excitotoxic neuronal cell death. Molecular Neurobiology. 24 (1-3), 107-129 (2001).
- MacDermott, A. B., Mayer, M. L., Westbrook, G. L., Smith, S. J., Barker, J. L. NMDA-receptor activation increases cytoplasmic calcium concentration in cultured spinal cord neurones. Nature. 321 (6069), 519-522 (1986).
- Choi, D. W., Maulucci-Gedde, M., Kriegstein, A. R. Glutamate neurotoxicity in cortical cell culture. The Journal of Neuroscience. 7 (2), 357-368 (1987).
- Kure, S., Tominaga, T., Yoshimoto, T., Tada, K., Narisawa, K. Glutamate triggers internucleosomal DNA cleavage in neuronal cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 179 (1), 39-45 (1991).
- Calvo, M., Sanz-Blasco, S., Caballero, E., Villalobos, C., Nunez, L. Susceptibility to excitotoxicity in aged hippocampal cultures and neuroprotection by non-steroidal anti-inflammatory drugs: role of mitochondrial calcium. Journal of Neurochemistry. 132 (4), 403-417 (2015).
- Liu, Y., et al. NMDA receptor subunits have differential roles in mediating excitotoxic neuronal death both in vitro and in vivo. The Journal of Neuroscience. 27 (11), 2846-2857 (2007).
- Zhou, M., Baudry, M. Developmental changes in NMDA neurotoxicity reflect developmental changes in subunit composition of NMDA receptors. The Journal of Neuroscience. 26 (11), 2956-2963 (2006).
- Brewer, L. D. Increased vulnerability of hippocampal neurons with age in culture: temporal association with increases in NMDA receptor current, NR2A subunit expression and recruitment of L-type calcium channels. Brain Research. 1151, 20-31 (2007).
- Berridge, M. J. Calcium signalling remodelling and disease. Biochemical Society Transactions. 40 (2), 297-309 (2012).
- Stout, A. K., Raphael, H. M., Kanterewicz, B. I., Klann, E., Reynolds, I. J. Glutamate-induced neuron death requires mitochondrial calcium uptake. Nature Neuroscience. 1 (5), 366-373 (1998).
- Pivovarova, N. B., et al. Excitotoxic calcium overload in a subpopulation of mitochondria triggers delayed death in hippocampal neurons. The Journal of Neuroscience. 24 (24), 5611-5622 (2004).
- Morris, R. G., Garrud, P., Rawlins, J. N., O'Keefe, J. Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions. Nature. 297 (5868), 681-683 (1982).
- Geinisman, Y., Detoledo-Morrell, L., Morrell, F., Heller, R. E. Hippocampal markers of age-related memory dysfunction: behavioral, electrophysiological and morphological perspectives. Progress in Neurobiology. 45 (3), 223-252 (1995).
- Sodero, A. O., Weissmann, C., Ledesma, M. D., Dotti, C. G. Cellular stress from excitatory neurotransmission contributes to cholesterol loss in hippocampal neurons aging in vitro. Neurobiology of Aging. 32 (6), 1043-1053 (2011).
- Brini, M., et al. Transfected aequorin in the measurement of cytosolic Ca2+ concentration ([Ca2+]c). A critical evaluation. The Journal of Biological Chemistry. 270 (17), 9896-9903 (1995).
- Villalobos, C., Alonso, M. T., Garcìa-Sancho, J. Bioluminescence imaging of calcium oscillations inside intracellular organelles. Methods in Molecular Biology. 574, 203-214 (2009).
- Villalobos, C., et al. Redistribution of Ca2+ among cytosol and organella during stimulation of bovine chromaffin cells. FASEB Journal. 16, 343-353 (2002).
- Rogers, K. L., et al. Visualization of local Ca2+ dynamics with genetically encoded bioluminescent reporters. The European Journal of Neuroscience. 21 (3), 597-610 (2005).
- Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM. Journal of Visualized Experiments. (23), 1067 (2009).
