Abstract
الخيطية أكتين تلعب دورا حاسما في معظم العمليات المحمولة بما في ذلك القدرة على الحركة و، في الخلايا المناعية، وتشكيل التفاعل خلية خلية الرئيسي المعروف باسم المشبك المناعي. وتكهن F-الأكتين أيضا أن تلعب دورا في تنظيم توزيع الجزيئية في غشاء الخلايا بما في ذلك ديناميات الحويصلة شبه غشائي والبروتين المجموعات. في حين تسمح تقنيات المجهر الضوئي القياسية الملاحظات المعممة ومحدودة الحيود أن يكون جعلت، العديد من الأحداث الخلوية والجزيئية بما في ذلك تجميع وتدفق الجزيئي تحدث في السكان في طول المقاييس أقل بكثير من حل السلطة من المجهر الضوئي العادي. من خلال الجمع بين مجموع مضان انعكاس داخلي مع سوبر القرار التصوير أسلوب منظم إضاءة المجهر، وسجلت تدفق الجزيئية ثنائي الأبعاد من F-الأكتين في المشبك المناعي للخلايا T. المكانية والزمانية صورة ارتباط التحليل الطيفي (عصي) تم تطبيق ذلك الحين، مما يولد بالنتيجه قابلة للقياس الكميالخبر في شكل رسوم بيانية وخرائط سرعة ناقل يمثل اتجاهها التدفق والحجم. يصف هذا البروتوكول الجمع بين التصوير وعصي تقنيات فائقة الدقة لتوليد تدفق ناقلات عند مستويات الحيود الفرعي من التفاصيل. وقد استخدمت هذه التقنية لتأكيد تدفق الأكتين التي هي إلى الوراء بشكل متناظر وجابذ في جميع أنحاء محيط الخلايا T على تشكيل المشبك.
Introduction
الهدف من التجربة هو صورة وتميز تدفق الجزيئي للfilamentous- (F-) الأكتين في الخلايا الحية T، خارج حدود الحيود من أجل إقامة اتجاه التدفق والحجم خلال المشبك المناعي (IS) تشكيل. وسيتم تنفيذ هذه التقنية خارج باستخدام مجهر إضاءة منظم (SIM) في مجموع مضان انعكاس الداخلي (TIRF) واسطة، تصوير Jurkat T-خلايا تشكيل المشبك الاصطناعي على تفعيل coverslips المغلفة مع المضادة للCD3- وأضداد CD28. الأشكال ما بين خلية T وهدفه. مستضد تقديم الخلية (APC) على مستقبلات الخلايا T (TCR) تفعيل 1،2. وبما أن هذه هي الخطوة الأولى في تحديد ما إذا كان جهاز المناعة التكيفية يولد استجابة مناعية للعدوى، فإن الآثار المترتبة على الاستجابة للمؤثرات غير صحيحة يسبب عددا من الأمراض. تم توثيقه على أهمية التفاعل T خلايا APC جيدا، ومع ذلك، فإن دور (ق) من ناضجة بعد الاشتراكية TCR الأولياستيعاب gnal لا يزال يتعين مفهومة تماما.
كما يعتقد أن الهيكل الخلوي للمساعدة بعمليتين مترابطتين إلى تفعيل TCR (حركة جزيئات في غشاء البلازما والتحكم في الجزيئات مما يشير تعتمد على الهيكل الخلوي الأكتين 3،4)، فهم كيفية إعادة ترتيب الهيكل الخلوي مكانيا وزمانيا وتوضيح الخطوات إعادة التنظيم الجزيئي خلال تشكيل المشبك. ويعتقد أن تدفق الوراء من F-الأكتين إلى زريبة مجموعات TCR نحو مركز المشبك المناعي، ويعتقد أن هذا النبات هو أمر حيوي لوقف إشارة وإعادة التدوير؛ مساعدة التوازن الدقيق من تنشيط الخلايا T 5.
في حين المجهر مضان القياسية هو أداة مرنة تواصل تقديم فكرة واسعة عن العديد من الأحداث البيولوجية بما في ذلك التفاعلات خلية خلية، ويقتصر من قبل قدرة النظام على حل بدقة fluorophores متعددة المقيمين أقرب من diffrالحد عمل (≈200 نانومتر) من بعضهما البعض. والعديد من الأحداث الجزيئية داخل الخلايا وتشمل السكان الكثيفة من الجزيئات وتبدي إعادة ترتيب الحيوي سواء في هدوء أو على التحفيز معين، المجهر الضوئي التقليدي لا تقدم الصورة كاملة.
وقد أتاح استخدام القرار التصوير سوبر الباحثين للتحايل على حد الحيود باستخدام مجموعة متنوعة من التقنيات. واحد جزيء توطين المجهري (SMLM) مثل النخيل وSTORM 6،7 لديه القدرة على حل مكان الجزيئات تصل إلى دقة من حوالي 20 نانومتر، ومع ذلك، هذه التقنيات تعتمد على الاستحواذ الأوقات الطويلة، وبناء صورة على العديد من إطارات . عموما هذا يتطلب عينات أن تكون ثابتة أو هياكل لتظهر التنقل منخفضة لا يساء تفسيرها fluorophores واحدة وذلك عدة نقاط. في حين استنزاف الانبعاث المستحث (STED) التصوير يسمح فائقة الدقة من خلال انتقائية جدا متحد البؤر الإثارة 8، والمسح المطلوبةالنهج يمكن أن تكون بطيئة على حقول خلية كاملة للعرض. يوضح STED أيضا الضيائية كبيرة لدقة أعلى وذلك بسبب الزيادة في قوة شعاع استنزاف.
منظم إضاءة المجهر (SIM 9) يوفر بديلا لهذه الأساليب، قادرة على مضاعفة حل المجهر مضان القياسية وأكثر توافقا مع تصوير الخلايا الحية من تقنيات SMLM الحالية. ويستخدم الصلاحيات ليزر أقل، على نظام واسعة المجال لحقول خلية كاملة من الرأي؛ توفير زيادة سرعات الاستحواذ، ومتوافق مع وضع العلامات fluorophore القياسية. طبيعة واسعة المجال لSIM أيضا يسمح للاستخدام من مجموع مضان انعكاس الداخلي (TIRF) عن الإثارة انتقائية للغاية، مع عمق تغلغل في البعد المحوري <100 نانومتر.
التحليل الطيفي ارتباط صورة (ICS) هو وسيلة لربط التقلبات في كثافة مضان. وتطور ICS. ايم المكانية والزمانيةعمر ارتباط التحليل الطيفي (عصي 10) يرتبط إشارات الفلورية الخلايا في الزمان والمكان. عن طريق الربط بين كثافة بكسل مع توضيح بكسل في الأطر المتخلفة عبر وظيفة الارتباط، وحصلت على معلومات بشأن سرعة تدفق واتجاهها. لضمان الأجسام الساكنة لا تتداخل مع تحليل عصي، يتم تطبيق عامل تصفية كائن متحرك، والذي يعمل عن طريق طرح المتوسط المتحرك لشدة بكسل.
ويعتقد أن تقنية المعروضة هنا لتكون أول مظاهرة من صورة الارتباط الطيفي يجري تطبيقها على البيانات المجهر فائقة الدقة لقياس تدفق الجزيئات في الخلايا الحية 11. يحسن هذا الأسلوب على التصوير محدودة حيود تدفق F-الأكتين عن طريق تحليل عصي 12، وسوف تتناسب مع الباحثين الذين يرغبون في تحديد التدفق الجزيئي ثنائي الأبعاد في الخلايا الحية، من البيانات التي حصل عليها في القرارات المكانية تتجاوز الحد حيود الضوء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: مراحل 1 و 2 وذلك قبل يوم من التصوير. ضمان جميع وسائل الإعلام والمكملات الغذائية لاستخدامها قبل أو على والمتوازنة في يوم التصوير. ويتم تحقيق موازنة من خلال ارتفاع درجة حرارة سائل الإعلام والمكملات الغذائية إلى 37 درجة مئوية في حاضنة لتعيين 5٪ CO 2. جميع الخطوات عمل خلية ثقافة وساترة الطلاء تتم في ظروف معقمة تحت غطاء تدفق الصفحي.
ترنسفكأيشن 1. خلية
- Transfect خلايا T ليمكن تصوير 24 ساعة قبل التجربة مع ترميز البلازميد الانصهار فلوري بناء لوضع العلامات GFP F-الأكتين والتصوير. ملاحظة: يجب تقسيم خلايا 24 ساعة قبل ترنسفكأيشن (48 ساعة قبل التصوير) للتأكد من الخلايا في تمام الصحة ومرحلة النمو لوغاريتمي بهم.
- وضع 5 مل من RPMI ملحق (RPMI 1640 بالإضافة إلى 10٪ FBS و 1٪ القلم بكتيريا (اختياري)) في بئر واحدة من لوحة 6 جيدا في حاضنة للتوازن.
- بيليه 2 × 10 7 خلايا T عبادةمحكم في 37 ° C +5٪ CO 2 في RPMI ملحق باستخدام أنبوب الطرد المركزي في 327 x ج لمدة 5 دقائق ويغسل في حجم مساو من وسائل الاعلام Electroporation للما قبل تحسنت. ملاحظة: Electroporation للالمتوسطة هو وسيلة المصل خفض تحتوي على مخازن والمكملات (انظر المواد الاستهلاكية).
- بعد إعادة التكوير-في 327 x ج لمدة 5 دقائق، resuspend الخلايا في 500 ميكرولتر من وسائل الاعلام Electroporation للوببطء إضافة إلى كفيت، إضافة 5 ميكروغرام من البلازميد في PCR الصف درهم 2 O لوصفها F-الأكتين.
- اضغط برفق كفيت على مساحة غطاء محرك السيارة لضمان إزالة أي فقاعات الهواء في وسائل الإعلام، والذي يمكن أن يسبب الانحناء من الكهرباء وتوزيع الخلايا بالتساوي في وسائل الاعلام.
- بدوره على جهاز Electroporation للوتعيين الجهد إلى 300 V والسعة إلى 290 Ω. عينة Electroporate باستخدام تسوس الأسي ل 20 ميللي ثانية. ملاحظة: قد تكون هناك حاجة الأمثل للخلايا المختلفة ويبني البلازميد مختلفة.
- وبمجرد أن بروتوكول ترنسفكأيشن هوكاملة، وخلايا تخزين على الجليد لمدة 1 دقيقة قبل المتابعة.
- نقل بعناية الخلايا من كفيت لوحة 6 جيدا تحتوي على 5 مل من معايرتها RPMI ملحق من الخطوة 1.1.1.
- احتضان الخلايا O / N عند 37 درجة مئوية + 5٪ CO 2.
2. Coverslips معطف والملحق التصوير قبل الدافئ
- coverslips معطف مع الأجسام المضادة للحث على تحفيز الخلايا T.
- معطف كل غرفة من ساترة 8 جيدا مع 1 ميكروغرام / مل αCD3 وαCD28 في 200 ميكرولتر PBS.
- تخزينها في 4 درجات CO / N. بدلا من ذلك، coverslips معطف 2 ساعة قبل التصوير وتبقي في حاضنة عند 37 درجة مئوية للحد من انجراف أثناء عملية التصوير عن طريق تقليل التغيرات في درجات الحرارة إلى ساترة.
- إنشاء نموذج اختبار ساترة مع 0.1 ميكرون الفرعية الحيود المجهرية الفلورسنت.
- دوامة حل سهم من الخرز لتجنب كتل.
- على، ساترة نظيفة جديدة من اله نفس نوع تلك المستخدمة في الخطوة 2.1.1، ماصة 5 ميكرولتر microsphere فلوري حل الأسهم على سطح (حسب تعليمات الشركة الصانعة).
- نشر حل microsphere على ساترة مع ماصة.
- السماح ليجف، ثم تطبيق 200 ميكرولتر تصاعد المتوسطة مثل برنامج تلفزيوني.
ملاحظة: يجب أن يطابق المتوسطة المتزايدة التي تستخدم لعينات من الخلايا التصوير.
- تتوازن HBSS (+ 20 ملي HEPES، ودعا الآخرة "ملحق HBSS ') في أنبوب الطرد المركزي عن طريق وضع في حاضنة O إلى ما قبل دافئ / N عند 37 درجة مئوية + 5٪ CO 2.
ملاحظة: إضافة HEPES هي العازلة CO 2، إذا باستخدام غرفة الحضانة مع CO 2 مدخلات تخطي هذه المكملات.
3. مجهر مجموعة المتابعة
- تشغيل الحاضنة مرحلة أعلى المجهر ومكان المياه TIRF-SIM يكفي المقطر في الخزان المجهر لتغطية كامل قاعدة عنصر التدفئة. تسمح للماء إلى البريدquilibrate إلى 37 درجة مئوية. إضافة طوق التدفئة إلى العدسة الشيئية، كما حدد إلى 37 درجة مئوية.
ملاحظة: نظرا لحساسية التركيبة، تتم هذه الخطوات في الليلة السابقة حتى المكونات البصرية هي في درجة حرارة مستقرة قبل التصوير. - وضع TIRF 488 متوافق كتلة صريف في مسار الضوء من المجهر وآمنة في المكان.
- تبديل وضع القناة وكابل الألياف إلى موقف "الواحد" على السرير الليزر والمجهر مرحلة على التوالي لإشراك مسار بصري الصحيح لوضع TIRF-SIM. ملاحظة: سوف تخطي هذه الخطوة تؤدي إلى خطأ (الشكل 1A) ضمن إطار البرنامج.
- بدوره على جميع مكونات المجهر والكمبيوتر وفتح برنامج حاسوبي لمراقبة الاستحواذ.
- فتح لوحة OC، تي الوسادة، N-SIM الوسادة وND اكتساب النوافذ (الشكل 1B). في "لوحة OC" حدد الخيار "TIRF 488" (الشكل 2B، السهم الأصفر). في إطار N-SIM الوسادة، حدد "TIRF-SIM" و "نقل" ضبط (الشكل 2C، الأسهم الصفراء). حدد زر الإعدادات (الشكل 1C، المربع الأصفر) واختر 'TIRF 488 (ل100X TIRF 488nm) "من القائمة المنسدلة، ضرب' تطبيق 'و' موافق '.
- ضبط إعدادات الكاميرا في "ضبط DU897" ل: معدل الإطار 50 ميللي ثانية، ووضع قراءات، EM كسب 3 ميغاهيرتز في 14 بت، وEM الربح المضاعف 300 مع ربح تحويل 1 (الشكل 1C، المربع الأخضر).
ملاحظة: انظر ممثل النتائج لاعتبارات معدل الإطار. - معايرة إضاءة المجهر لTIRF-SIM من خلال تحديد الهدف NA CFI امزيغ TIRF 100X 1.49، على 'N-SIM الوسادة "تحويل قوة الليزر 488 نانومتر إلى 10٪.
ملاحظة: حجم بكسل من الصور الخام هو 60 نانومتر، مع حقل 512 X 512 بكسل للعرض. - تنظيف العدسة الشيئية باستخدام الأنسجة عدسة لإزالة الغبار والنفط.
- بدء بهدف في ادنى حد ممكن ض الطائرة. وضع قطرة من زيت العدسة على الهدف وإضافة العينة microsphere فلوري من الخطوة 2.2 إلى مرحلة المجهر.
- حدد وظيفة مثالية نظام التركيز (PFS) الواقعة على جسم المجهر.
- تحرك ببطء الهدف حتى من خلال ض الطائرة حتى يتوقف على زر PFS تومض لتأكيد البؤري تم التوصل إليه.
- التبديل إلى طريقة العرض "لايف" على برنامج حاسوبي لمراقبة والصورة المجهرية للتعديلات الأخيرة التي أدلى بها باستخدام PFS عجلة الصغرى مناور.
- مراقبة الإضاءة موحدة مع أي انبعاث خارج التركيز مضان فوق موجة زائل 75 نانومتر.
ملاحظة: تأكيد هو الوفاء إضاءة منظم من خلال مراقبة نمط الإضاءة المتقلبة من العينة microsphere الفلورسنت. - قياس عينة microsphere فلوري وتحديد تحسين resolut التصويرايون من خلال مراقبة العرض الكامل في نصف الحد الأقصى (FWHM) من ملف كثافة.
- فتح تحليل البرمجيات (v4.20.01)، مع وحدة NIS-A N-SIM تحليل تركيب واختر 'تطبيقات' -> 'عرض N-SIM النافذة.
- مع تباين الإضاءة التشكيل (IMC) وعالية الدقة الضجيج (HRNS) تعيين إلى 1 لمجموعات البيانات TIRF-SIM (الشكل 2)، وإعادة بناء صورة عينة microsphere لتوليد صورة أعيد بناؤها من 1024 X 1024 بكسل مع حجم بكسل من 30 نانومتر.
- باستخدام أداة الشخصي خط بعرض 1 بكسل (3A الشكل، المربع الأصفر)، ورسم خط من خلال المركز من microsphere واحد.
- حدد زر FWHM (الشكل 3B، المربع الأصفر) وانقر على ماكسيما كثافة توزيع جاوس، تليها الحدود الدنيا شدته.
- تأكيد FWHM من microsphere هو في حدود 100 نانومتر (الشكل 3C). ملاحظة: قرار منظمة العمل ضد الجوعوتختلف العينات البيولوجية عند التصوير ieved اعتمادا على إشارة إلى نسبة الضوضاء من الكفاءة ووضع العلامات ومضان الخلفية.
4. إعداد نموذج للتصوير
- إعداد ساترة.
- استرداد ساترة αCD المغلفة من الخطوة 2.1 من الثلاجة أو الحاضنة وإزالة PBS تحتوي على αCD3 وαCD28 من كل جانب.
- إضافة 200 ميكرولتر من قبل تحسنت HBSS ملحق من الخطوة 2.3 إلى كل بئر ساترة. غسل وإزالة لضمان الحد الأدنى αCD3 وتبقى αCD28 في الحل. إضافة 200 ميكرولتر آخر من الملحق HBSS إلى الآبار ساترة.
- تنظيف الجانب السفلي من ساترة مع الأنسجة عدسة لإزالة النفط والجسيمات.
- موقف ساترة على المسرح المجهر والعثور على طائرة الوصل TIRF ساترة باستخدام PFS ض الطائرة كما هو موجود في الخطوة 3.4.
- إعداد الخلية.
- ماصة 200 ميكرولتر من يخدع وسائل الإعلامtaining الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل من الخطوة 1.1.8 في أنبوب الطرد المركزي الصغيرة.
- خلايا بيليه في جهاز للطرد المركزي الصغير في 268 x ج لمدة 20 ثانية، وإزالة وسائل الاعلام الخلية.
- Resuspend الخلايا في 200 ميكرولتر قبل تحسنت HBSS ملحق من الخطوة 2.3.
5. خلايا التصوير
- خذ التي تحتوي على خلية HBSS تكملة لالمجهر وماصة بلطف 200 ميكرولتر في واحدة من الآبار.
- في حين تبقى في المستوى البؤري TIRF في ساترة (في الوضع PFS)، استخدم العدسة المجاهر وepifluorescence الإضاءة لتعقب الخلايا الفلورسنت يقترب من ساترة.
- وبمجرد أن الخلايا تهبط على ساترة، والتحول إلى وضع "لايف" في N-SIM الوسادة لتقديم صورة حتى على رصد والتحقق من الخلايا في التركيز على شاشة الكمبيوتر.
- لتسجيل دورات الوقت، افتح نافذة ND اقتناء وحدد علامة التبويب 'الوقت'، انقر فوق 'إضافة' ومجموعة 'الفاصل' لأي تأخير، 'المدة'لمدة 10 دقيقة، "حلقات" تم تعيين إلى 1.
ملاحظة: يمكن تغيير المدة اعتمادا على عملية المصالح؛ برنامج عصي يمكن استخراج النتائج الكمية مع مداخن صورة من ≈10 الإطارات عندما اعتقل مع "لا تأخير". - مع إعدادات اكتساب مطابقة للعينة حبة، بدء تسجيل البيانات عن طريق اختيار 'تشغيل الآن' في إطار ND الاستحواذ.
6. إعادة بناء SIM الصور
- بعد اكتمال التصوير، فتح تحليل البرمجيات (v4.20.01)، مع وحدة NIS-A N-SIM تحليل تركيب واختر 'تطبيقات' -> 'عرض N-SIM النافذة.
- مع تباين الإضاءة التشكيل (IMC) وعالية الدقة الضجيج (HRNS) تعيين إلى 1 لمجموعات البيانات TIRF-SIM (الشكل 2)، وإعادة بناء واحد (أو باستخدام أداة دفعة متعددة) ملف SIM الخام لإنتاج صورة SIM التي أعيد بناؤها.
- تأكيد ملف إعادة بنائها لديها حجم بكسل من 30 نانومتر، المشار إليها فيشريط الصورة.
ملاحظة: حجم بكسل لا يؤثر تحليل عصي لكن يجب أن يكون 2X على الأقل أصغر في البعد من القرار المكانية PSF من أجل ضمان الارتباط المكاني بين بكسل. - تصدير البيانات كما .tiff الملفات، وعلى استعداد لتحليل عصي.
تحليل 7. عصي
- تحميل واستخراج STIC (C) S حزمة ماتلاب برنامج (وايزمان المختبر، كما تتوفر معلومات تكميلية). وstics_vectormapping.m السيناريو هو جوهر تحليل عصي قناة واحدة وتستخدم خطوط ال 30 الأولى من التعليمات البرمجية لتعريف معلمات الإدخال على النحو المحدد في القسم 2.1 من الدليل. فتح هذا السيناريو وتحديد معلمات الإدخال لتحليل البيانات TIRF-SIM. يقترح أيضا إضافة STIC (C) مجلد S مع المجلدات الفرعية إلى الجهاز مسار مطلب المحلي، كما هو مفصل في ملحق الدليل.
- تعريف معلمات الإدخال لتحليل البيانات عن طريق تحرير خطوط المقابلة من قانون
- لأداء آناتحلل البيانات TIRF-SIM لتوليد 1 ناقلات خريطة، تعيين المعلمات الزمنية إلى المنطقة دون الإقليمية الزمنية في خط 31 لأكبر عدد ممكن من الإطارات والتحول الزمني في خط 32 إلى 1. للحصول على سلسلة زمنية من الخرائط ناقلات تختلف هذه المعايير .
- لتصفية إزالة متحرك، تعيين المعلمة "تصفية" (خط 23) على "المتوسط المتحرك" وتعيين المعلمة 'MoveAverage' (خط 24) إلى 21.
ملاحظة: تم عرض هذا الضبط للعمل من أجل أبطأ الحركة وإشارات مضان كبيرة، لأنه يقوم على طرح أطر مسلسل من الإطار يجري تحليلها. - تغيير خطوط 33-38 لضبط اسم الناتج الملفات وعناوين الخرائط ناقلات الإخراج، فضلا عن مسار الدليل الإخراج وتحديد في ما الشكل الذي ينبغي أن يتم حفظ الخريطة الصور الموجهة.
| حجم البكسل (ميكرون) | 0.03 ميكرون | خط 19 |
| معدل الإطار (ثانية) | 1 ثانية | خط 20 |
| الحد الأقصى الوقت الضائع (لقطة) | 20 لقطة | خط 21 |
| حجم الفرعية (بكسل) | 8 بكسل | خط 29 |
| تباعد الفرعية (بكسل) | 1 بكسل | خط 30 |
- فتح run1ChannelSTICS النصي في إطار مطلب محرر. تحميل سلسلة صورة عن طريق تشغيل خطوط 1-23 من هذا السيناريو.
ملاحظة: هذا السيناريو يمكن أن تستخدم لتحميل وقبل عملية سلسلة صورة، رسم الخرائط ناقلات ورسوم بيانية السرعة وتشغيل تجهيز دفعة للعديد من الملفات. إذا لزم الأمر، اقتصاص الصورة إلى المنطقة ذات الاهتمام باستخدام سطر 24-26 من هذا السيناريو.- خطوط تشغيل 29-35 من run1ChannelSTICS لبدء تحليل عصي. عند المطالبة، حدد مضلع للإشارة إلى منطقة محددة من الفائدة (ROI)، إذا رغبت في ذلك. تأكد من أن العائد على الاستثمار لا تتداخل مع حافة الخلية، كما تحدث التحف الحدود عندما عصي يحلل هذه إعادةاملناطق.
- خطوط تشغيل 38-52 لعرض الخرائط النواقل. لرسم الرسم البياني حجم السرعة، تشغيل خطوط 53-72.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ضبط المجهر
بعد تحقيق بنجاح جميع الخطوات التي الباحث قد أنجزت إضاءة منظم (SIM) التصوير من تدفق F-الأكتين في زنزانة المشبك T (فيديو 1)، وكميا هذا التدفق الجزيئي التي كتبها المكانية والزمانية الطيفي صورة الارتباط (الشكل 4 11). قبل تسجيل الصور، وضمان عينة للإضاءة موحدة عبر تسعة الصور الخام والإضاءة منظم في شكل لوحظ في عينة هامش تموج في النسيج (الشكل 5)، وهذه هي كلا المؤشرين ساترة مسطح على المسرح وTIRF- يتم محاذاة SIM انشاء صحيح.
فمن المهم للحفاظ على قوة الليزر منخفض (≤10٪) لضمان بقاء الخلايا السليمة قدر الإمكان أثناء التجربة. إذا التعبير الفلورسنت منخفضة، حتى بعد التحسين رانه Electroporation للخطوات، وزيادة مدة التعرض من كل إطار الخام فوق 50 ميللي ثانية ذكر و / أو إعدادات التحويل ربح. كما يتطلب TIRF-SIM 9 إطارات الخام، 1 لكل من التوجهات الإضاءة 9 المطلوبة لكل صورة أعيد بناؤها، وزيادة وقت التعرض سوف يقلل من معدل الإطار. في هذه التجربة، 50 مللي ثانية التعرض يسمح ≈1 إطار أعيد بناؤها في الثانية (أيضا بما في ذلك شبكة الوقت دوران)، والحد من مخاطر القطع الأثرية الحركة ينظر عندما تتحرك الأحداث أسرع من خلال عدة ماكسيما الإضاءة في إطار الخام واحدة.
اعتمادا على سرعة تدفق الجزيئية التي تجري دراستها، مما يزيد من وقت التعرض قد يعرض القطع الأثرية الحركة؛ يجب على الباحثين حفاظ مرات التعرض إلى الحد الأدنى اللازم للإشارة جيدة. كما أحجام بكسل في الصور SIM هي أصغر من تلك الصور مضان القياسية، والسكان الجزيئي العارضة بسرعة تدفق أسرع قد تمر من خلال المنطقة دون الإقليمية قبل الاب لاحقاويكتسب AME. للبرنامج عصي لربط إشارة مضان داخل هذه المنطقة أصغر وأسرع ويطلب معدلات صورة مقارنة لقواعد البيانات مضان القياسية. على سبيل المثال حجم الفرعية من 8 × 8 بكسل البيانات SIM يمثل منطقة 240 × 240 نانومتر في حين أن 8 × 8 بكسل دون الإقليمية من مجموعة بيانات مضان القياسية تمثل مساحة 1.7 ميكرون (مع حجم بكسل يفترض من 200 نانومتر).
يمكن لدورات زمنية أطول (> 3 دقيقة) أن تؤخذ دفعة من البيانات باستخدام "الاستحواذ ND" للحد من التعرض ليزر خلال تشكيل المشبك (على سبيل المثال، والتصوير لمدة 10 ثانية في كل دقيقة لمدة 10 دقيقة سوف تعرض الخلية إلى نفس قوة الليزر التراكمية كما التصوير ل<2 دقيقة بشكل مستمر).
وأظهرت عمليات إعادة البناء دون المستوى الأمثل من التصوير SIM في الشكل (6)، حيث تم بناؤها على نفس البيانات الخام باستخدام مختلف resoluti عاليةعلى الضجيج الإعدادات (HRNS)، وتظهر أيضا التحويلات إلى الأمام فورييه (الاتحاد الفرنسي للتنس) ونصف العرض الكامل لمحات القصوى من الألياف تسليط الضوء عليها. وضع HRN هو توازن بين زيادة التحف إعادة الإعمار بسبب سوء إشارة إلى الضوضاء وزيادة القرار. A HRN التي هي منخفضة جدا (<1) يمكن أن يؤدي في صور محببة مع زيادة التحف SM سداسية، في حين مرتفعة للغاية إعداد HRNS يمكن (> 1) 'كليب' وتجاهل بيانات عالية الدقة (ينظر إليه على أنه قطرها الاتحاد الفرنسي للتنس انخفاض). ومن شأن قرار من> 100 نانومتر تشير إلى الحاجة إلى إعادة تشغيل إعادة الإعمار مع إعدادات مختلفة، وإذا القرارات لا تزال دون المستوى الأمثل reacquiring البيانات مع إعداد المجهر الأمثل قد تكون مطلوبة.
تصوير وقياس التدفق الجزيئي
لصورة تدفق الجزيئي، واتخذ بيانات السلاسل الزمنية للخلايا T الهبوط وتشكيل المشبك على coversli المحفزةص، يمكن أن ينظر F-الأكتين في التدفق بطريقة الوراء من محيط الخلية نحو مركز الخلية. كما يصبح F-الأكتين أقل كثافة نحو مركز التحليل عصي الخلية كانت تنفذ الا في محيط المشبك، هذه المنطقة هي أيضا حيث من المعروف microclusters يشير إلى تنشأ من خلال تشكيل المشبك لفترة طويلة.
عند الحصول على وتحليل البيانات باستخدام عصي من المهم أن نفهم يعتمد البرنامج على ربط تقلبات فلوري داخل مناطق فرعية مختارة لتشكيل وظيفة أعلى وأكثر سلاسة الارتباط (CF). العدد المطلق للإطارات اللازمة لتوليد الناتج عصي الناجح هو ليس بالضبط كما يعتمد البرنامج أكثر على خلق الانتاج من خلال عدد من تقلبات إشارة بناءة داخل تلك المناطق دون الإقليمية. على سبيل المثال إذا كان لديه 20 مجموعة البيانات المتنقلة، والبروتينات وصفت في كل المنطقة دون الإقليمية التي تتدفق في نفس الاتجاه عصي سوف تحتاج إلى عدد أقل من إطارات الجيناتمعدل الانتاج يمكن الاعتماد عليها، في حين أن المنطقة دون الإقليمية مع 5 نتائج البروتينات النقالة في وظيفة ارتباط أضعف وربما تتطلب المزيد من الإطارات. العدد الدقيق للإطارات وحجم الفرعية المستخدمة يعتمد على طبيعة الأحداث الجزيئية التي يجري تصويرها، وينبغي أن يكون الأمثل من قبل المستخدم.
باستخدام 'إطار المحاصيل الزمنية "أداة للعصي فمن الممكن لتحليل مجموعات فرعية من تدفق الجزيئي عبر الزمن: يسمح للباحثين لمعرفة إذا تغيرت معدلات التدفق داخل الخلية نفسها تبعا للظروف الخلوية المختلفة أو المحفزات البيئية مثل قبل وبعد العلاج بالعقاقير. تم تصميم مرشح كائن متحرك لإزالة أية مجموعة من السكان الفلورسنت متحرك قبل تحليل السكان الفلورسنت المحمول. باستخدام هذا النهج، والصور التي تحتوي على نسبة السكان ثابتة تصل إلى 90٪ منه يمكن أن يكون لا يزال بنجاح حللت 10. وضع مرشح متحرك إلى 21 إطارات بتصفية أي السكان الفلورسنت التي لا تزال قائمة ثابت لهذه الفترة من الزمن أو أكثر، والتي لن تسهم في تدفق الوراء الديناميكي أثناء تثبيت المشبك المناعي.
الشكل 1. مجهر إعدادات الاستحواذ. (A) يسلط الضوء على إعدادات N-SIM الوسادة المستخدمة في التجربة والخطأ "الألياف خاطئة" عندما لم يتم تحديد القناة والألياف وسائط واحدة. (B) جميع النوافذ اللازمة لانشاء وتسجيل وإعادة بناء صورة إضاءة المهيكلة على النظام SIM. (C) N-SIM الوسادة وإعدادات N-SIM نافذة المنبثقة (المربع الأصفر) يستخدم لتحديد برنامج الإعداد المشبك بعد وضع جسديا نانومتر 488 صريف في المجهر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 2. إعدادات لتعمير الصورة النهائية. عند اختيار زر "بارام" (المربع الأصفر)، حدد TIRF-SIM من القائمة المنسدلة، وضعت في البداية كل من "الإضاءة تعديل التباين" (IMC) و "عالية الدقة الضجيج '(HRNS) إلى 1. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
العرض الكامل في نصف الحد الأقصى (FWHM) القياس. استخدام برامج التحليل (A) ويبين الشكل 3. مؤامرة جاوس من أداة كثافة الخط المحدد (المربع الأصفر) وتعادل عن طريق SIM الصورة أعيد بناؤها من عينة حبة. (
التقط الشكل 4. ممثل البيانات إضاءة منظم وعصي الانتاج. A Jurkat T خلية معربا عن GFP المسمى F-الأكتين باستخدام TIRF-SIM على ساترة تنشيطية لتوليد المشبك المناعي. بعد خمس دقائق الاتصال، أجري بالطبع الوقت وتحليلها باستخدام برنامج التحليل عصي. صناديق صفراء تمثل المناطق التكبير في حين تظهر الخرائط ناقلات تدفق الوراء من F-الأكتين في محيط المشبك. الألوان ناقلات تشير إلى سرعة تدفق الجزيئية في تلك المنطقة دون الإقليمية، يتم رسم البيانات سرعة على الرسم البياني. نظرا لض الانتقائية من الإثارة يوفر TIRF-SIM، يمكن أن تضيع على عينة من التركيز إذا كان يفصل أو يتحرك بعيدا عن ساترة من خلال مدار الساعة من التجربة بسبب الإزعاج أو حركية. ويعتبر هذا هنا في اللوحة اليمنى العليا كتخفيض في كثافة النواقل. الحد هو نتيجة لعصي تطبيق فلتر متحرك إلى المناطق الفرعية التي لم تبد أي تقلبات الفلورية للفترة الزمنية المحددة من قبل المستخدم. هذه النتيجة تبرز أهمية اختيار المناطق فقط التي تحتوي على إشارة مضان لسلسلة الزمنية بأكملها. نحيف "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5. الصور SIM الخام. الصور الخام تسعة على اليسار تظهر 9 توجهات نمط الشبكة اللازمة لإنتاج صورة TIRF-SIM. خلية تصويرها هي الخلية Jurkat T معربا عن GFP المسمى F-الأكتين، وتظهر الخلايا أسرع واحد من تسعة الصور الخام، مما يدل على الإضاءة غير موحدة مع هامش تموج في النسيج، وخاصة حول محيط الخلية. على الرغم من أن الإضاءة منظم غير مرئية التفاعلات بين الإضاءة والعينة خلق مجالات متفاوتة القوة الإضاءة، وبعد إعادة الإعمار هذه النتائج في صورة مع تحسن القرار. كلا أشرطة مقياس هي 5 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (6) عالية الدقة الضجيج (HRNS) ضبط إعدادات الفرعية المثلى تؤدي إلى إعادة بناء صورة دون المستوى الأمثل.؛ (A) يظهر الاختلافات في البيانات التي أعيد بناؤها (الإعدادات المستخدمة يظهر في الجزء السفلي الأيسر من كل صورة)، حيث أقل HRNS يؤدي إلى زيادة الضوضاء الخلفية خارج المنطقة البتلة وHRNS أعلى يمكن أن تقلل من القرار، ويؤدي إلى فقدان التفاصيل الدقيقة. (B) يمثل فورييه إلى الأمام تحويل الصور في (A) حيث تشير المعلومات الطرفية قرار البيانات العالي؛ ملاحظة بتلات قص للتحويل عند تعيين HRNS إلى 5، مشيرا إلى انخفاض دقة الصورة. (C) يدل على نصف العرض الكامل أقصى (FWHM) من ألياف الأكتين (المربع الأصفر في) في بيئات مختلفة، والقياسات FWHM من خلال برنامج أعطت قراءةمن 90 نانومتر و 100 نانومتر و 180 نانومتر لإعدادات HRNS 0.1، 1، و 5 على التوالي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وهذه التقنية تسمح للباحثين لصورة وكميا في السابق ان التفاصيل غير القابلة للحل في الخلايا معربا عن مضان. في نتائجنا، وتبين أن F-الأكتين تدفقات بطريقة متناظرة من محيط الخلية نحو مركز الخلية في الخلية T IS. هذه النتائج تتفق مع نتائج سابقة من خط 1D البيانات الشخصية ل مخطاط التموج 13 وتمتد قدرات التحليل ل2D و بيانات فائقة الدقة.
تقنية قدم هو الانتقال من التصوير مخطاط التموج الذي يقتصر على التآمر تقلبات كثافة مضان من خلال خط واحد 1D مع مرور الوقت. مقارنة هذه التقنية الحالية تسمح الكمي لكامل الخلية التدفق الجزيئي مع كل الاتجاهية وسرعة استخراج. بينما التصوير البقع أظهرت أيضا ديناميات أكتين 14 ضمن بيئة 2D، تقنية البقع يمكن الحد من الصعوبات ذات الكثافة وضع العلامات الصحيحة ويتصور فقط جزء من السكان من الأكتين.
أهم الخطوات لتحقيق هذه النتائج لتحسين كفاءة ترنسفكأيشن من خلايا معينة يتم استخدامها من قبل الباحث ومحاذاة البصريات المجهر SIM ونمط صريف. اختيار الحجم الصحيح من دون الإقليمية يعتمد على عينة الخصائص، والمهم كإعداد صغير جدا سيعني فقدان أسرع مضان تتحرك من خلال تحليل الارتباط، ولكن اختيار كبير جدا سوف الفرعية يعني خسارة محتملة من الفروق الدقيقة في بيانات إضافية الحصول عليها باستخدام طرق فائقة الدقة.
دون الإقليمية يدل على عدد وحدات البكسل لخص لخلق بكسل سوبر لتحليل الخرائط السرعة، وزيادة هذا قد تحسين موثوقية لتتبع الأجسام تتحرك بشكل أسرع. التباعد الفرعية هي الفجوة بين البيانات داخل superpixels. عندما التباعد الفرعية أقل من حجم المنطقة دون الإقليمية، وهذه النواقل المجاورة تبادل بعض المعلومات، يمكن زيادة هذا الإعداد الحد من سلبيات الاتجاهistency من vectormap النهائي الذي تم إنشاؤه. والفارق الزمني الأقصى يتحكم في تحليل الارتباط الوقت، حيث بلغ عدد المدخلة هو العدد الأقصى من الفارق الزمني قبل انتهاء التحليل.
إعادة بناء الصورة النهائية يتطلب المقابل الإضاءة التشكيل (IMC) وعالية الدقة الضجيج (HRNS) الإعدادات التي سيتم اختيارها. قد تختلف الإعدادات المثلى من عينة لعينة. يساعد IMC تمييز نمط الإضاءة مقلم على العينة، ويقلل من القطع الأثرية إعادة الإعمار. HRNS يمكن أن تقلل من المصنوعات اليدوية من البيانات التباين المنخفض التي كتبها 'قطة' بيانات عالية الدقة من تحويل فورييه. للحفاظ على القدرات القصوى قرار والحد من القطع الأثرية إعادة الإعمار يتم تعيين هذه عادة عند 1.
تستند القيود المفروضة على هذه التقنية حول طبيعة 2D العملية، حيث أن البرمجيات عصي لا يمكن تحليل البيانات 3D هي تقنية تقتصر على TIRF-SIM أو 2D-SIM، وهذا بالتالي يتطلب العينة أن تكون تعصبشقة ively ضد ساترة. عيب فني آخر هو أن TIRF-SIM يتطلب 9 إطارات الخام التي سيتم جمعها قبل إعادة بناء فائقة دقة وضوح الصورة النهائية، على هذا النحو مع إعدادات لدينا من 50 الاستحواذ إطار ميللي ثانية، والوقت الذي تستغرقه المجهر SIM لإعادة توجيه نمط الشبكة. تم الوصول إلى معدلات الإطار ≈1 ثانية. مقارنة مع غيرها من الأوقات اكتساب تقنية فائقة الدقة ومجال واسع من الرأي هذه القيود مقبولة بالنسبة لمعظم التطبيقات.
النتائج المعروضة هنا هي قابلة للمقارنة مع قواعد البيانات من التصوير TIRF معيار تدفق F-الأكتين في تشكيل المشبك المناعي. يوضح اتفاق جيد بين طرائق التصوير عصي هو قوي ضد القطع الأثرية المحتملة إعادة الإعمار SIM وأيضا أن إعدادات الحصول على الصور التي استخدمت خلال SIM مقبولة لتحليل البيانات. باستخدام قواعد البيانات فائقة الدقة مع أصغر بكسل أحجام المزيد من البيانات يمكن استخراجها من الخلايا الفردية وديناميكية الصورةقد يتم التحقيق UB-الحيود الخلوية المجالات الدقيقة.
بعد استيعاب هذه التقنية يمكن تصوير أي تدفق الجزيئية وكميا، مع مجال لغير جراحية تحقيق العديد من الأسئلة بشأن تدفق في غشاء البلازما، أو عند أخذ العينات مع المجهر متحد البؤر، في أي مكان في الطائرة س ص الخلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables: | |||
| Jurkat E6.1 cells | APCC | ATTC TIB-152 | |
| RPMI | Life Technologies | 21875-091 | |
| FBS | Sigma | F7524-500ML | |
| Penicillin-Strepromycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-050 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630-056 | |
| #1.5 8-well Labtek coverslips | NUNC, Labtek | 155409 | |
| LifeAct GFP construct | Ibidi | 60101 | |
| OptiMem | Life Technologies | 51985-042 | |
| anti-CD3 | Cambridge Bioscience | 317315 | |
| anti-CD28 | BD Bioscience / Insight Biotechnology | 555725 | |
| PBS | Life Technologies | 20012-019 | |
| Lens oil | |||
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment: | |||
| Gene Pulsar Xcell System | BioRad | 165-2660 | |
| Cuvette (0.4cm) | BioRad | 165-2088 | |
| Centrifuge (5810R) | Eppendorf | 5805 000.327 | |
| Centrifuge (Heraeus) | Biofuge pico | 75003235 | |
| 6 well plate | Corning | 3516 | |
| Stage-top incubator | Tokai Hit | INUH-TIZSH | |
| Nikon N-SIM microscope | Nikon | Contact company | |
| Nikon Analyse software | Nikon | Contact company | |
| Incubator (190D) | LEEC | Contact company |
References
- Monks, C., Freiberg, B., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395, 82-86 (1998).
- Lanzavecchia, A. Antigen-specific interaction between T and B cells. Nature. 314, 537-539 (1985).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
- Delon, J., Bercovici, N., Liblau, R. Imaging antigen recognition by naive CD4+ T cells: compulsory cytoskeletal alterations for the triggering of an intracellular calcium response. European journal of Immunology. 28 (2), 716-729 (1998).
- Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. T Cell Receptor-Proximal Signals Are Sustained in Peripheral Microclusters and Terminated in the Central Supramolecular Activation Cluster. Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature methods. 3, 793-796 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (15), 8206-8210 (2000).
- Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells. Biophysical Journal. 88 (5), 3601-3614 (2005).
- Ashdown, G. W., Cope, A., Wiseman, P. W., Owen, D. M. Molecular Flow Quantified beyond the Diffraction Limit by Spatiotemporal Image Correlation of Structured Illumination Microscopy Data. Biophysical Journal. 107 (9), 21-23 (2014).
- Brown, C. M., et al. Probing the integrin-actin linkage using high-resolution protein velocity mapping. Journal of Cell Science. 19 (24), 5204-5214 (2006).
- Yi, J., Xufeng, S. W., Crites, T., Hammer, J. A. Actin retrograde flow and actomyosin II arc contraction drive receptor cluster dynamics at the immunological synapse in Jurkat T cells. Molecular Biology of the Cell. 23 (5), 834-852 (2012).
- Watanabe, N., Mitchison, T. J. Single-molecule speckle analysis of actin filament turnover in lamellipodia. Science. 8 (5557), 1083-1086 (2002).
