Abstract
Filamentosa-actina gioca un ruolo cruciale nella maggioranza dei processi cellulari tra cui motilità e, in cellule immunitarie, la formazione di una interazione cellula-cellula chiave noto come sinapsi immunologica. F-actina è anche ipotizzato a svolgere un ruolo nella regolazione distribuzioni molecolari alla membrana delle cellule tra cui dinamiche vescicole sub-membranoso e proteine clustering. Mentre le tecniche microscopio ottico standard, consentono osservazioni generalizzate e diffrazione limitata da apportare, molti eventi cellulari e molecolari, tra cui il clustering e il flusso molecolare si verificano in popolazioni a lunghezza scale molto al di sotto del potere risolutivo di microscopia ottica standard. Combinando riflessione interna totale fluorescenza con la super Resolution Imaging metodo strutturato illuminazione microscopia, il flusso molecolare bidimensionale di F-actina alla sinapsi immune delle cellule T è stato registrato. Spettroscopia spazio-temporale dell'immagine correlazione (STIC) è stato poi applicato, che genera Resul quantificabilits in forma di istogrammi di velocità e mappe vettoriali rappresentanti direzionalità del flusso e la grandezza. Questo protocollo descrive la combinazione di tecniche di imaging e racchette super-risoluzione per generare vettori di flusso a livello sub-diffrazione di dettaglio. Questa tecnica è stata utilizzata per confermare un flusso actina che è simmetricamente retrogrado e centripeta tutta la periferia delle cellule T sulla formazione di sinapsi.
Introduction
L'obiettivo di questo esperimento è all'immagine e caratterizzare il flusso molecolare di filamentous- (F-) actina in cellule viventi T, oltre il limite di diffrazione per stabilire la direzione del flusso e della portata durante sinapsi immunologica (IS) formazione. Questa tecnica sarà effettuata utilizzando un microscopio illuminazione strutturata (SIM) in modalità riflessione totale fluorescenza interna (TIRF), l'imaging Jurkat cellule T costituiscono sinapsi artificiale sull'attivazione vetrini rivestiti di anti-CD3- ed anticorpi anti-CD28. Le forme si trova tra una cellula T e il suo obiettivo; una cellula che presenta l'antigene (APC) sul recettore delle cellule T (TCR) di attivazione 1,2. Poiché questo è il primo passo per determinare se il sistema immunitario adattativo genera una risposta immunitaria ad una infezione, le conseguenze di risposta agli stimoli non corretto può causare una serie di malattie. L'importanza dell'interazione cellule T-APC è ben documentata, tuttavia, il ruolo (s) del maturo è dopo TCR si inizialeinternalizzazione de segnal devono ancora essere pienamente compreso.
Poiché il citoscheletro è pensato per aiutare due processi legati all'attivazione TCR (il movimento delle molecole sulla membrana plasmatica ed il controllo di molecole di segnalazione dipendenti dal citoscheletro actina 3,4), comprendere come il citoscheletro riorganizza spazialmente e temporalmente delucideranno gradini di riorganizzazione molecolare durante la formazione delle sinapsi. Il flusso retrogrado di F-actina è pensato per corral cluster TCR verso il centro della sinapsi immunologica, questa traslocazione si crede di essere di vitale importanza per la cessazione del segnale e il riciclaggio; favorendo il delicato equilibrio di attivazione delle cellule T 5.
Mentre un microscopio a fluorescenza è uno strumento flessibile che continua a fornire indicazioni su molti eventi biologici comprese le interazioni cellula-cellula, è limitata dalla capacità del sistema di risolvere con precisione più fluorofori che risiedono vicino di quanto il diffrLimite di azione (≈200 nm) l'uno dall'altro. Come molti eventi molecolari all'interno delle cellule coinvolgono popolazioni dense di molecole e mostrano riassetto dinamico sia in quiescenza o in seguito a stimolazione specifica, microscopia ottica convenzionale non fornisce il quadro completo.
L'uso di super risoluzione delle immagini ha permesso ai ricercatori di aggirare il limite di diffrazione usando una varietà di tecniche. Microscopia localizzazione molecola singola (SMLM) come Palm e STORM 6,7 ha la capacità di risolvere la posizione di molecole fino a una precisione di circa 20 nm, tuttavia, queste tecniche contare su lunghi tempi di acquisizione, costruire un'immagine di numerose cornici . In genere questo richiede campioni da fisso o per le strutture di esporre scarsa mobilità in modo singole fluorofori non sono male interpretato come più punti. Mentre esaurimento emissione stimolata (STED) di imaging consente super-risoluzione attraverso molto selettivo confocale eccitazione 8, la scansione richiestaapproccio può essere lento su campi di cellule intere di vista. STED dimostra anche fototossicità significativo per risoluzioni più elevate a causa dell'aumento della potenza del fascio esaurimento.
Structured microscopia illuminazione (SIM 9) fornisce un'alternativa a questi metodi, in grado di raddoppiare la risoluzione di un microscopio a fluorescenza standard ed è più compatibile con cellule vive rispetto alle tecniche attuali SMLM. Esso utilizza potenze laser inferiori, in un sistema a grande campo per i campi di cellule intere di vista; fornire una maggiore velocità di acquisizione, ed è compatibile con l'etichettatura fluoroforo standard. La natura a grande campo di SIM permette anche l'utilizzo di totale fluorescenza riflessione interna (TIRF) per l'eccitazione altamente selettiva, con profondità di penetrazione nella dimensione assiale di <100 nm.
Spettroscopia di correlazione immagine (ICS) è un metodo di correlare fluttuazioni di intensità di fluorescenza. Un'evoluzione di ICS; Im spazio-temporalespettroscopia di correlazione età (STIC 10) correla segnali fluorescenti intracellulari nel tempo e nello spazio. Correlando intensità dei pixel con pixel circostanti in cornici in ritardo di sviluppo tramite una funzione di correlazione, le informazioni si ottiene quanto concerne la velocità di flusso e direzionalità. Per assicurare oggetti statici non interferiscono con l'analisi STICS, un filtro oggetto immobile viene implementato, che funziona sottraendo una media mobile delle intensità dei pixel.
La tecnica qui presentata si crede di essere la prima dimostrazione della spettroscopia di correlazione immagine che viene applicata ai dati microscopia super-risoluzione per quantificare il flusso molecolare in cellule vive 11. Questo metodo migliora sull'imaging diffrazione limitata di flusso F-actina tramite STICS analisi 12 e sarebbe adatto ricercatori che desiderano per determinare il flusso molecolare bidimensionale in cellule vive, dai dati acquisiti a risoluzioni spaziali oltre il limite di diffrazione della luce.
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Protocol
Nota: Tappe 1 e 2 avvengono prima del giorno delle immagini; garantire tutti i media e gli integratori da utilizzare prima o il giorno delle immagini sono equilibrate. Equilibration è ottenuta attraverso il riscaldamento dei media e integratori a 37 ° C in un incubatore impostato a 5% di CO 2. Tutte le fasi di placcatura lavoro coltura cellulare e coprioggetto avvengono in condizioni sterili sotto una cappa a flusso laminare.
Trasfezione 1. cella
- Trasfezione le cellule T per essere ripreso 24 ore prima che l'esperimento con un plasmide codificante una fusione fluorescente costrutto per l'etichettatura GFP-F actina e di imaging. Nota: Le cellule devono essere suddivisi 24 ore prima della trasfezione (48 ore prima di imaging) per assicurare cellule sono in salute ottimale e nella loro fase di crescita logaritmica.
- Mettere 5 ml di RPMI supplemento (RPMI 1640 più il 10% FBS e 1% Pen-Strep (opzionale)) in un unico pozzo di un 6-pozzetti nell'incubatore per equilibrare.
- Pellet 2 x 10 7 cellule T cultorato a 37 ° C + 5% di CO 2 in RPMI integratore utilizzando un tubo centrifugare a 327 xg per 5 minuti e lavare in un volume uguale di supporti elettroporazione pre-riscaldato. Nota: elettroporazione media è un mezzo di siero ridotto contenente tamponi e supplementi (vedi materiali di consumo).
- Dopo ri-pellet a 327 xg per 5 minuti, risospendere le cellule in 500 ml di mezzi di elettroporazione e lentamente aggiungere ad una cuvetta, aggiungere 5 mg di plasmide in grado PCR dH 2 O per l'etichettatura di F-actina.
- Battere delicatamente la cuvetta sull'area di lavoro cofano per garantire la rimozione di eventuali bolle d'aria nei media, che possono causare la formazione di archi di energia elettrica e per distribuire le cellule in modo uniforme nei media.
- Accendere l'apparecchio elettroporazione e la tensione impostata a 300 V e la capacità a 290 Ω. Campione elettroporazione utilizzando un decadimento esponenziale per 20 msec. Nota: L'ottimizzazione può essere richiesto per le cellule diverse e diversi costrutti plasmide.
- Una volta che il protocollo è transfezionecompleti, celle negozio in ghiaccio per 1 min prima di continuare.
- Trasferire accuratamente le cellule dalla provetta al 6 pozzetti contenenti 5 ml di equilibrata supplemento RPMI dal punto 1.1.1.
- Incubare le cellule O / N a 37 ° C + 5% di CO 2.
2. Coprioggetto Coat e Supplemento Imaging pre-caldo
- Coprioggetto Coat con anticorpi per indurre stimolazione delle cellule T.
- Cappotto ciascuna camera di un vetrino da 8 pozzetti con 1 mg / ml αCD3 e αCD28 in 200 l di PBS.
- Conservare a 4 ° CO / N. In alternativa, coprioggetto cappotto 2 ore prima di imaging e mantenere in un incubatore a 37 ° C per ridurre la dispersione durante il processo di imaging riducendo al minimo le variazioni di temperatura al vetrino.
- Creare un campione di prova vetrino con microsfere fluorescenti 0,1 micron sub-diffrazione.
- Soluzione madre vortice di perline per evitare grumi.
- In una nuova, coprioggetto pulito di the stesso tipo di quelli utilizzati in fase 2.1.1, pipetta 5 ml soluzione madre microsfere fluorescenti sulla superficie (come da istruzioni del produttore).
- Distribuire soluzione microsfere sopra il vetrino con la punta della pipetta.
- Lasciare asciugare, quindi applicare 200 ul medio di montaggio come PBS.
Nota: il mezzo di montaggio deve corrispondere a quello utilizzato per i campioni di cellule di imaging.
- Equilibrare HBSS (+ HEPES 20 mM, di seguito denominato 'HBSS integratore') in una provetta da centrifuga mettendo in un incubatore a caldo pre-O / N a 37 ° C + 5% CO 2.
Nota: l'aggiunta di HEPES è di buffer di CO 2, se si utilizza una camera di incubazione con CO 2 ingressi saltare questa integrazione.
3. Microscopio Set-up
- Accendere incubatore fase-top del microscopio e posto acqua distillata sufficiente TIRF-SIM nel serbatoio del microscopio a coprire completamente la base dell'elemento riscaldante. Permettere all'acqua di all'equilibrate a 37 ° C. Aggiungere il collare di riscaldamento per la lente dell'obiettivo, anche impostato a 37 ° C.
Nota: A causa della sensibilità del set-up, questi passaggi sono fatto la notte prima quindi i componenti ottici sono ad una temperatura stabile prima di imaging. - Posizionare il TIRF 488 blocco reticolo compatibile nel percorso della luce del microscopio e fissarlo in posizione.
- Cambiare la modalità di canale e il cavo in fibra nella posizione 'Single' sul palco base del laser e microscopio, rispettivamente, di coinvolgere il percorso ottico corretto per la modalità TIRF-SIM. Nota: Saltare questo passaggio porterà ad un errore (Figura 1A) all'interno della finestra del software.
- Accendere tutti i componenti del microscopio e computer e aprire il software di controllo di acquisizione.
- Aprire il pannello OC, Ti Pad, N-SIM Pad e ND Acquisition finestre (Figura 1B). Nel 'Pannello OC' selezionare l'opzione 'TIRF 488' (Figura 2B, freccia gialla). Nella finestra N-SIM Pad, selezionare il 'TIRF-SIM' e impostazioni 'Moving' (Figura 2C, frecce gialle). Selezionare il pulsante Impostazioni (Figura 1C, scatola gialla) e selezionare 'TIRF 488 (per 100x TIRF 488 nm)' dal menu a discesa, ha colpito 'Apply' e 'OK'.
- Impostare le impostazioni della fotocamera in 'Impostazioni DU897' a: Frame Rate 50 msec, modalità di lettura, EM guadagno 3 MHz a 14 bit, e EM guadagno moltiplicatore 300 con un guadagno di conversione di 1 (figura 1C, scatola verde).
Nota: vedi Rappresentante dei risultati in base a considerazioni di frame rate. - Calibrare illuminazione del microscopio per TIRF-SIM selezionando l'obiettivo 100x 1,49 NA CFI Apochromat TIRF, sulla 'N-SIM Pad' accendere la potenza del laser 488 nm a 10%.
Nota: le dimensioni dei pixel delle immagini prime è di 60 nm, con un campo di 512 x 512 pixel di vista. - Pulire la lente dell'obiettivo con panno per lenti per rimuovere la polvere e l'olio.
- Iniziare con l'obiettivo nell'eventuale piano z più basso. Mettere una goccia di olio lente sull'obiettivo e aggiungere il campione microsfere fluorescenti dal punto 2.2 al palco microscopio.
- Selezionare la funzione perfetta Focus System (PFS) situata sul corpo del microscopio.
- Spostare lentamente l'obiettivo attraverso il piano z finché il pulsante PFS smette di lampeggiare per confermare il piano focale è stato raggiunto.
- Passare alla visualizzazione 'Live' sul software di controllo e l'immagine le microsfere di regolazioni finali effettuate utilizzando la rotella micromanipolatore PFS.
- Osservare l'illuminazione uniforme senza emissione out-of-focus fluorescenza sopra l'onda evanescente 75 nm.
Nota: Conferma illuminazione strutturato si realizza osservando un pattern di illuminazione fluttuante dal campione microsfere fluorescenti. - Misurare campione microsfere fluorescenti e quantificare il miglioramento resolut immaginiion osservando la larghezza a metà massimo (FWHM) del profilo di intensità.
- Aprire il software Analyze (v4.20.01), con il modulo di NIS-N-SIM Analisi installato e selezionare "Applicazioni" -> 'Mostra finestra N-SIM'.
- Con il contrasto di modulazione illuminazione (IMC) e la soppressione del rumore ad alta risoluzione (HRNS) impostato a 1 per dataset TIRF-SIM (Figura 2), ricostruire l'immagine del campione microsfere di generare una immagine ricostruita di 1.024 x 1.024 pixel con una dimensione dei pixel di 30 nm.
- Con lo strumento linea di profilo con una larghezza di 1 pixel (Figura 3A, scatola gialla), tracciare una linea attraverso il centro di un unico microsfere.
- Selezionare il pulsante FWHM (figura 3B, scatola gialla) e fare clic in corrispondenza del massimo di intensità della distribuzione gaussiana, seguito dalla sua intensità minimi.
- Conferma la FWHM della microsfera è nell'intervallo di 100 nm (Figura 3C). Nota: la risoluzione achquando di imaging campioni biologici ieved variano a seconda del rapporto segnale-rumore di efficienza di etichettatura e fluorescenza di fondo.
4. Preparazione del campione per l'imaging
- Preparazione Coverslip.
- Recupera coprioggetto αCD rivestite dal punto 2.1 da frigo o in un incubatore e rimuovere PBS contenente αCD3 e αCD28 da ogni pozzetto.
- Aggiungere 200 ml di pre-riscaldato supplemento HBSS dal punto 2.3 a ciascun pozzetto del vetrino. Lavare e togliere per garantire il minimo αCD3 e αCD28 viene lasciato in soluzione. Aggiungere altri 200 ml di supplemento HBSS ai pozzetti coprioggetto.
- Pulire la parte inferiore del vetrino con il tessuto dell'obiettivo per rimuovere l'olio e particolato.
- Posizione vetrino sul palco microscopio e trovare il piano focale TIRF del vetrino utilizzando il piano z PFS come si trova al punto 3.4.
- Preparazione cellulare.
- Dispensare 200 microlitri della con supporticontenenti cellule trasfettate dal punto 1.1.8 in un tubo di micro-centrifuga.
- Cellule pellet in un micro-centrifugare a 268 xg per 20 secondi e rimuovere i supporti cellulari.
- Risospendere le cellule in 200 ml preriscaldata HBSS supplemento dal punto 2.3.
5. Le cellule Imaging
- Prendere cella contenente HBSS supplemento al microscopio e delicatamente pipetta 200 microlitri in uno dei pozzi.
- Pur rimanendo nel piano focale TIRF al vetrino (in modalità PFS), utilizzare l'oculare microscopio e illuminazione epifluorescenza per monitorare le cellule fluorescenti avvicina il vetrino.
- Una volta che le cellule atterrano sul vetrino, passare alla modalità 'Live' nel N-SIM Pad per portare l'immagine sul monitor e controllare le celle sono a fuoco sullo schermo del computer.
- Per registrare il tempo-corsi, aprire la finestra ND Acquisizione e selezionare la scheda 'Time', fare clic su 'Aggiungi' e impostare 'Intervallo' a Nessun ritardo, 'Durata'a 10 minuti, 'Loop' è impostato a 1.
Nota: durata può essere cambiato a seconda del processo di interesse; il software STICS può estrarre risultati quantitativi, con pile di immagini di ≈10 fotogrammi quando catturato con 'Nessun ritardo'. - Con le impostazioni di acquisizione identici al campione tallone, avviare la registrazione dati selezionando 'Esegui ora' nella finestra di acquisizione ND.
6. Ricostruire SIM Immagini
- Dopo l'imaging, aprire il software Analyze (v4.20.01), con il modulo di NIS-N-SIM Analisi installato e selezionare "Applicazioni" -> 'Mostra finestra N-SIM'.
- Con il contrasto di modulazione illuminazione (IMC) e la soppressione del rumore ad alta risoluzione (HRNS) impostato a 1 per dataset TIRF-SIM (figura 2), ricostruire uno (o più utilizzando lo strumento di batch) File SIM prima per produrre una immagine ricostruita SIM.
- Confermare il file ricostruita ha una dimensione dei pixel di 30 nm, indicato nellaimmagine barra di stato.
Nota: Dimensione pixel non influisce analisi STICS ma dovrebbe essere almeno 2 più piccolo nella dimensione della risoluzione spaziale PSF per garantire la correlazione spaziale tra pixel. - Esportare i dati come file TIFF, pronti per l'analisi STICS.
7. STICS Analisi
- Scaricare ed estrarre il STIC (C) S pacchetto Matlab software (Wiseman laboratorio, disponibili come informazioni supplementari). Il stics_vectormapping.m script è il cuore di una singola analisi STICS canale e le prime 30 righe di codice vengono utilizzati per definire i parametri di input, come definito nella sezione 2.1 del manuale. Aprire questo script e definire i parametri di input per TIRF-SIM analisi dei dati. Si suggerisce di aggiungere anche la cartella STIC (C) S con sottocartelle alla macchina percorso Matlab locale, come descritto nell'appendice del manuale.
- Definire i parametri di input per l'analisi dei dati modificando le linee corrispondenti del codice
- Per eseguire analisi dei dati TIRF-SIM per generare 1 mappa vettoriale, impostare i parametri temporali per sottoregione temporale in linea 31 per il numero massimo di fotogrammi e lo spostamento temporale in linea 32 a 1. Per ottenere una serie temporale di mappe vettoriali variare questi parametri .
- Per il filtro di rimozione Immobile, impostare il parametro 'filtraggio' (linea 23) per 'Moving media' e impostare il parametro 'MoveAverage' (linea 24) a 21.
Nota: Questa impostazione ha dimostrato di funzionare per movimento lento e grandi segnali di fluorescenza, in quanto si basa su sottraendo trame seriali dal telaio analizzato. - Modificare le linee 33-38 per impostare il nome del file di output e titoli delle mappe vettoriali in uscita, così come il percorso della directory di output e definire in quale formato devono essere salvate le immagini di mappe vettoriali.
| Dimensione del pixel (micron) | 0.03 micron | Linea 19 |
| Frame rate (sec) | 1 secondo | Linea 20 |
| Tempo massimo di ritardo (frames) | 20 fotogrammi | Linea 21 |
| Dimensioni subregione (pixel) | 8 pixel | Linea 29 |
| Spaziatura subregione (pixel) | 1 pixel | Linea 30 |
- Aprire le run1ChannelSTICS di script nella finestra Matlab Editor. Caricare la serie di immagini eseguendo linee 1-23 di questo script.
Nota: Questo script può essere utilizzato per caricare e pre-processo serie di immagini, tracciare le mappe vettoriali e istogrammi di velocità ed eseguire una elaborazione batch per molti file. Se necessario, ritagliare l'immagine di una regione di interesse utilizzando la linea 24-26 di questo script.- Linee Run 29-35 di run1ChannelSTICS per iniziare l'analisi STICS. Quando richiesto, selezionare un poligono per indicare una specifica regione di interesse (ROI), se lo si desidera. Assicurarsi che il ROI non si sovrapponga con il bordo delle cellule, come si verificano artefatti contorno quando STICS analizza questi reregioni.
- Linee Run 38-52 per visualizzare le mappe di vettore. Per tracciare l'istogramma velocità di grandezza, le linee 53-72 eseguire.
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Representative Results
Impostazioni del microscopio
Dopo aver raggiunto con successo tutte le fasi del ricercatore avrà illuminazione strutturata compiuto (SIM) di imaging del flusso F-actina in una sinapsi delle cellule T (Video 1), e quantificato questo flusso molecolare mediante spettroscopia immagine correlazione spazio-temporale (Figura 4 11). Prima di registrare immagini, garantire l'illuminazione del campione è uniforme attraverso le nove immagini crude e che l'illuminazione strutturata sotto forma di frange moiré sono osservati a campione (Figura 5), questi sono entrambi gli indicatori vetrino è piatto sul palco e la TIRF- SIM set-up è allineato correttamente.
È importante mantenere la potenza del laser a bassa (≤10%) per assicurare cellule rimangono più sano possibile durante l'esperimento. Se l'espressione fluorescente è bassa, anche dopo l'ottimizzazione di tegli elettroporazione passaggi, aumentare il tempo di esposizione di ogni fotogramma prima al di sopra dei 50 msec dichiarati e / o le impostazioni guadagno di conversione. Come TIRF-SIM richiede 9 fotogrammi prime, 1 per ognuna delle 9 illuminazione orientamenti richiesti immagine ricostruita per, aumentando il tempo di esposizione riduce la frequenza dei fotogrammi. In questo esperimento, un'esposizione msec 50 permette ≈1 telaio ricostruito per secondo (tra cui anche tempo di rotazione della griglia), riducendo il rischio di artefatti da movimento visto quando gli eventi più veloci si muovono attraverso molteplici illuminazione massimi in un frame grezzo.
A seconda della velocità di flusso molecolare allo studio, aumentando il tempo di esposizione può introdurre artefatti da movimento; i ricercatori dovrebbero tenere i tempi di esposizione al minimo necessario per un buon segnale. Come dimensioni dei pixel nelle immagini SIM sono più piccoli di quelli di immagini di fluorescenza standard, le popolazioni molecolari espositrici velocità di scorrimento più veloce può passare attraverso la sub-regione prima di un successivo frame è acquisito. Per il software STICS correlare il segnale di fluorescenza all'interno di questa regione più piccola veloce velocità immagini sono tenuti rispetto al set di dati di fluorescenza standard. Ad esempio una dimensione subregione 8 x 8 pixel di dati SIM rappresenta un'area di 240 x 240 nm mentre un 8 x 8 pixel subregione da un set di dati a fluorescenza rappresenta un'area di 1,7 micron (con una dimensione del pixel presunto di 200 nm).
Per tempo maggiore portate (> 3 min) batch di dati possono essere effettuate utilizzando 'acquisizione ND' per ridurre l'esposizione laser durante la formazione sinapsi (ad esempio Imaging per 10 sec ogni minuto per 10 min esporrà cella alla stessa potenza laser cumulativa l'imaging per <2 min continuamente).
Ricostruzioni sub-ottimali di immagini SIM sono dimostrate in figura 6, in cui lo stesso dati grezzi è stato ricostruito utilizzando diversi alta resolutisulle impostazioni di soppressione del rumore (HRNS), sono indicate anche le trasformate di Fourier (FFT avanti) e la piena e mezzo la larghezza profili massimi della fibra evidenziato. Impostare la HRN è un equilibrio tra l'aumento artefatti di ricostruzione a causa della scarsa segnale-rumore e aumentare la risoluzione. Un HRN che è troppo bassa (<1) può risultare in immagini sgranate con maggiori reperti SM esagonali, mentre troppo alto un'impostazione HRNS (> 1) puo 'clip' e scartare i dati ad alta risoluzione (visto come un diametro FFT ridotta). Una risoluzione di> 100 nm indicherebbe la necessità di rieseguire la ricostruzione con impostazioni diverse, se le risoluzioni sono ancora sub-ottimale riacquisire i dati con una configurazione ottimizzata microscopio può essere richiesto.
Imaging e quantificare il flusso molecolare
Per il flusso molecolare immagine, i dati di serie temporali è stata presa di cellule T di atterraggio e di formare una sinapsi su un coversli stimolantep, F-actina può essere vista fluire in maniera retrograda dalla periferia verso il centro cella cellulare. Come F-actina diventa meno denso verso il centro dell'analisi STICS cellulare è stata effettuata solo alla periferia della sinapsi, questa regione è anche dove sono noti microclusters segnalazione proveniente da durante la formazione sinapsi prolungato.
Durante l'acquisizione e l'analisi dei dati utilizzando STICS, è importante capire il programma si basa sulla correlazione fluttuazioni fluorescenti all'interno delle sub-regioni selezionate in modo da formare una funzione più alta e più agevole la correlazione (CF). Il numero assoluto di frame necessari per generare un'uscita STICS successo non è esattamente come il software si basa più sulla creazione di una uscita attraverso il numero totale di fluttuazioni del segnale all'interno di tali subregioni costruttive. Per esempio, se l'insieme di dati dispone di 20 mobili, proteine marcate in ogni subregione che scorre nella stessa direzione STICS avrà bisogno meno fotogrammi al genevalutare un'uscita affidabile, mentre una subregione con 5 proteine risultati di telefonia mobile in una funzione di correlazione più debole e può richiedere più fotogrammi. Il numero esatto di marchi e dimensioni sottoregione utilizzati dipende dalla natura degli eventi molecolari essere ripreso e dovrebbe essere ottimizzato dall'utente.
Usando 'temporale raccolto cornice' lo strumento STICS è possibile analizzare sottoinsiemi di flusso molecolare attraverso il tempo: consentendo ai ricercatori di vedere se le portate cambiano all'interno della stessa cella in base alle condizioni cellulari differenti o stimoli ambientali, come prima e dopo trattamenti farmacologici. Il filtro oggetto immobile è progettato per rimuovere qualsiasi popolazione fluorescente immobile prima di analizzare la popolazione fluorescenza cellulare. Usando questo approccio, le immagini contenenti percentuali di popolazione statici fino al 90% può ancora essere analizzati con successo 10. Impostare il filtro immobile a 21 fotogrammi filtra eventuali popolazioni fluorescenti che rimangono statica per questo periodo di tempo o più, che non contribuisce al flusso retrogrado dinamica durante la stabilizzazione sinapsi immunologica.
Figura 1. Microscopio impostazioni di acquisizione. (A) mette in evidenza le impostazioni N-SIM Pad utilizzati per l'esperimento e l'errore del 'sbagliato Fiber' quando non sono selezionati i modi di canale e fibra singoli. (B) Tutte le finestre necessarie per set-up, registrare e ricostruire una immagine illuminazione strutturata sul sistema SIM. (C) N-SIM Pad e Impostazioni N-SIM finestra pop-out (scatola gialla) utilizzati per selezionare Setup Grata dopo aver piazzato fisicamente il 488 nm grata nel microscopio. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Impostazioni di ricostruzione per l'immagine finale. Dopo aver selezionato il pulsante 'Param' (scatola gialla), selezionare TIRF-SIM dal menu a discesa, e inizialmente impostare sia il 'Illuminazione Modulation Contrast' (IMC) e 'soppressione del rumore ad alta risoluzione '(HRNS) a 1. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. di grande ampiezza a metà del massimo (FWHM) di misura. Utilizzando il software di analisi (A) mostra un grafico gaussiana dallo strumento intensità linea selezionata (scatola gialla) e convogliato attraverso un immagine ricostruita SIM di un campione tallone. (
Figura 4. Rappresentante dei dati strutturati e di illuminazione STICS uscita. Un Jurkat cellule T che esprimono GFP-etichettata F-actina ripreso con TIRF-SIM su un vetrino di stimolo per la generazione di sinapsi immunologica. Cinque minuti dopo il contatto, un time-corso è stato prelevato e analizzato utilizzando il programma di analisi STICS. Scatole gialle rappresentano ingrandite regioni, mentre le mappe vettoriali dimostrano il flusso retrogrado di F-actina alla periferia sinapsi. Colori Vector indicano la velocità del flusso molecolare che sottoregione, dati di velocità viene tracciata su un istogramma. A causa della z-selettività dell'eccitazione TIRF-SIM fornisce, il campione può essere perso da fuoco se si stacca o si allontana dal vetrino attraverso l'andamento temporale dell'esperimento causa scompigliandogli o motilità. Questo è visto qui nel pannello superiore destra come una riduzione della densità vettoriale. La riduzione è il risultato di STICS applicazione del filtro immobile per subregioni che non hanno mostrato alcuna fluttuazione fluorescenti per il periodo di tempo impostato dall'utente. Questo risultato evidenzia l'importanza di scegliere unicamente regioni che contengono segnale di fluorescenza per l'intera serie storica. lank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. immagini Raw SIM. Le nove immagini grezze a sinistra mostrano i 9 orientamenti del modello di griglia necessaria per produrre un'immagine TIRF-SIM. Cellulare immaginato è una cellula T Jurkat che esprimono GFP etichettata F-actina, cellula ingrandita mostra una delle nove immagini raw, dimostrando un'illuminazione non uniforme con frange moiré, in particolare intorno al periferia cellulare. Anche se l'illuminazione strutturata non è visibile le interazioni tra l'illuminazione e il campione creano zone di varia intensità dell'illuminazione, dopo la ricostruzione questo si traduce in un'immagine con una migliore risoluzione. Entrambe le barre di scala sono 5 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6 soppressione del rumore ad alta risoluzione (HRNS) Impostazioni sub-ottimali portano alla ricostruzione sub-ottimale delle immagini..; (A) mostra le differenze di dati ricostruiti (impostazioni utilizzate visualizzate in basso a sinistra di ogni immagine), se inferiore HRNS porta ad un aumento del rumore di fondo al di fuori della regione petalo e HRNS superiori in grado di ridurre la risoluzione e causare la perdita dei dettagli più fini. (B) Rappresenta il Fourier avanti trasformata di immagini in (A) in cui le informazioni periferica indica una maggiore risoluzione dei dati; notare i petali tagliate della trasformata quando HRNS è impostato su 5, indicando risoluzione ridotta. (C) illustra (scatola gialla in a) piena a metà larghezza massima (FWHM) della fibra actina alle diverse impostazioni, misurazioni FWHM attraverso il software dato letturadi 90 nm, 100 nm e 180 nm per le impostazioni HRNS di 0,1, 1, e 5, rispettivamente. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questa tecnica permetterà ai ricercatori di immagine e quantificare precedentemente dettagli irrisolvibili in cellule che esprimono fluorescenza. Nei nostri risultati ci mostrano che F-actina scorre in modo simmetrico dalla periferia verso il centro cella di cella nella cella di T IS. Questi risultati sono in linea con le precedenti risultati di linea 1D dati del profilo chimografo 13 ed estendere la capacità di analisi dei dati super-risoluzione 2D e.
La tecnica presentata è una progressione da chimografo immagini che è limitata a tracciare fluttuazioni di intensità di fluorescenza attraverso un'unica linea 1D nel tempo. In confronto la tecnica attuale consente la quantificazione di tutto il flusso molecolare delle cellule sia con direzionalità e la velocità estratto. Mentre speckle imaging ha anche dimostrato dinamica dell'actina 14 all'interno dell'ambiente 2D, la tecnica speckle può essere limitato da difficoltà di corretta densità di etichettatura e visualizza solo una sottopopolazione di actina.
I passi principali per conseguire questi risultati sono per ottimizzare l'efficienza di transfezione delle cellule particolari utilizzato dal ricercatore e l'allineamento delle ottiche microscopio SIM e pattern reticolo. La scelta della dimensione corretta di subregione dipende dalle caratteristiche del campione, ed è importante in quanto troppo piccolo un ambiente significherà più veloce fluorescenza in movimento si perde per l'analisi di correlazione, ma la scelta troppo grande subregione significherà potenziale perdita di sfumature nei dati aggiuntivi acquisiti utilizzando Metodi di super-risoluzione.
Subregione indica il numero di pixel sommati per creare un super-pixel per l'analisi velocità di mappaggio, aumentando questo può migliorare l'affidabilità per l'inseguimento di oggetti in movimento veloce. La spaziatura subregione è il divario tra i dati all'interno superpixels. Quando la spaziatura subregione è inferiore alle dimensioni subregione, questi vettori adiacenti condividono alcune informazioni aumentando questa impostazione potrebbe ridurre cons direzionaliistency del VectorMap finale generato. Il tempo massimo di ritardo controlla il tempo di analisi di correlazione, dove il numero immesso è il numero massimo di sfasamenti temporali prima estremità di analisi.
Ricostruzione dell'immagine finale richiede contrasto modulazione illuminazione (IMC) e le impostazioni di soppressione del rumore ad alta risoluzione (HRNS) da selezionare. Impostazioni ottimali possono variare da campione a campione. IMC aiuta a distinguere il pattern di illuminazione a strisce sul campione, e riduce gli artefatti di ricostruzione. HRNS può ridurre gli artefatti dai dati a basso contrasto da 'ritaglio' dati ad alta risoluzione dal trasformata di Fourier; per mantenere la capacità massima risoluzione e ridurre al minimo gli artefatti di ricostruzione queste sono normalmente fissati a 1.
Limitazioni di questa tecnica sono basati su natura 2D del processo, come il software STICS non può analizzare dati 3D la tecnica è limitata a TIRF-SIM o 2D-SIM, questo richiede pertanto il campione di essere relatvamente piatto contro il vetrino. Un altro svantaggio è che tecnico TIRF-SIM richiede 9 fotogrammi prime per essere raccolti prima di ricostruire l'immagine finale super-risoluzione, come tale, le nostre impostazioni di 50 msec acquisizioni telaio e il tempo impiegato dal microscopio SIM per riorientare il modello di griglia; frame rate di ≈1 sec vengono raggiunti. Rispetto ad altre volte super-risoluzione di acquisizione tecnica e l'ampio campo di vista queste limitazioni sono accettabili per la maggior parte delle applicazioni.
I risultati presentati qui sono comparabili con set di dati da TIRF imaging standard di flusso F-actina in formazione di sinapsi immunologica. Il buon accordo tra modalità di imaging dimostra STICS è robusto contro potenziali artefatti ricostruzione SIM e anche che le impostazioni di acquisizione di immagini utilizzate durante SIM sono accettabili per l'analisi dei dati. Utilizzando dataset super-risoluzione con pixel più piccoli formati più dati possono essere estratti dalle cellule individuali e dinamiche di sub-diffrazione cellulari micro-domini possono essere esaminati.
Dopo cogliere questa tecnica qualsiasi flusso molecolare può essere ripreso e quantificata, con scopo di non invasivo indagare su una moltitudine di domande riguardanti il flusso a livello della membrana plasmatica o quando campionamento con un microscopio confocale, in qualsiasi parte del piano xy della cella.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables: | |||
| Jurkat E6.1 cells | APCC | ATTC TIB-152 | |
| RPMI | Life Technologies | 21875-091 | |
| FBS | Sigma | F7524-500ML | |
| Penicillin-Strepromycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-050 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630-056 | |
| #1.5 8-well Labtek coverslips | NUNC, Labtek | 155409 | |
| LifeAct GFP construct | Ibidi | 60101 | |
| OptiMem | Life Technologies | 51985-042 | |
| anti-CD3 | Cambridge Bioscience | 317315 | |
| anti-CD28 | BD Bioscience / Insight Biotechnology | 555725 | |
| PBS | Life Technologies | 20012-019 | |
| Lens oil | |||
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment: | |||
| Gene Pulsar Xcell System | BioRad | 165-2660 | |
| Cuvette (0.4cm) | BioRad | 165-2088 | |
| Centrifuge (5810R) | Eppendorf | 5805 000.327 | |
| Centrifuge (Heraeus) | Biofuge pico | 75003235 | |
| 6 well plate | Corning | 3516 | |
| Stage-top incubator | Tokai Hit | INUH-TIZSH | |
| Nikon N-SIM microscope | Nikon | Contact company | |
| Nikon Analyse software | Nikon | Contact company | |
| Incubator (190D) | LEEC | Contact company |
References
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