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Immunology and Infection

संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी डेटा की spatio- लौकिक छवि सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा मात्रा टी कोशिकाओं में cortical एक्टिन प्रवाह

Published: December 17, 2015 doi: 10.3791/53749
Automatic Translation
1, 3, 2, 4, 1
1Department of Physics and Randall Division of Cell and Molecular Biophysics, King's College London, 2Academic Department of Rheumatology, Centre for Molecular and Cellular Biology of Inflammation, Division of Immunology, Infection and Inflammatory Disease, King's College London, 3ARC Centre for Advanced Molecular Imaging, Australian Centre for NanoMedicine, University of New South Wales Australia, 4Departments of Chemistry and Physic, McGill University

Abstract

Filamentous actin के गतिशीलता और प्रतिरक्षा कोशिकाओं में, रोग प्रतिरोधक अन्तर्ग्रथन के रूप में जाना एक महत्वपूर्ण सेल सेल बातचीत के गठन सहित सेल प्रक्रियाओं के बहुमत में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। एफ actin भी उप झिल्लीदार पुटिका गतिशीलता और प्रोटीन क्लस्टरिंग सहित कोशिकाओं की झिल्ली में आणविक वितरण विनियमन में एक भूमिका निभाने के लिए अनुमान लगाया है। मानक प्रकाश माइक्रोस्कोप तकनीक सामान्यीकृत और विवर्तन सीमित टिप्पणियों किए जाने के लिए अनुमति देते हैं, वहीं क्लस्टरिंग और आणविक प्रवाह सहित कई सेलुलर और आणविक घटनाओं में अब तक मानक प्रकाश माइक्रोस्कोपी का हल शक्ति से नीचे लंबाई-तराजू पर आबादी में पाए जाते हैं। सुपर संकल्प इमेजिंग विधि संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी के साथ कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति के संयोजन से, टी कोशिकाओं की प्रतिरक्षा अन्तर्ग्रथन में एफ actin के दो आयामी आणविक प्रवाह दर्ज किया गया था। Quantifiable रेसुल उत्पन्न करता है जो spatio- लौकिक छवि के सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (Stics) तो लागू किया गया था,वेग histograms और प्रवाह दिशात्मकता और परिमाण का प्रतिनिधित्व वेक्टर नक्शे के रूप में टीएस। इस प्रोटोकॉल के विस्तार के उप-विवर्तन स्तरों पर प्रवाह वैक्टर उत्पन्न करने के लिए सुपर संकल्प इमेजिंग और Stics तकनीक के संयोजन का वर्णन है। इस तकनीक को अन्तर्ग्रथन गठन पर टी कोशिकाओं की परिधि में एक actin संतुलित रूप से पतित है कि प्रवाह और गड़बडिय़ों पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया गया था।

Introduction

प्रयोग के लक्ष्य की छवि के लिए है और रोग प्रतिरोधक अन्तर्ग्रथन (आईएस) के गठन के दौरान प्रवाह की दिशा और परिमाण स्थापित करने के क्रम में विवर्तन सीमा से परे, टी कोशिकाओं में रहने वाले filamentous- (एफ) actin के आणविक प्रवाह की विशेषताएँ। इस तकनीक विरोधी CD3- और विरोधी CD28 एंटीबॉडी के साथ लेपित coverslips को सक्रिय करने पर एक कृत्रिम अन्तर्ग्रथन गठन Jurkat टी-कोशिकाओं इमेजिंग, कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (TIRF) मोड में एक संरचित रोशनी माइक्रोस्कोप (सिम) का उपयोग कर बाहर किया जाएगा। एक टी सेल और अपने लक्ष्य के बीच है रूपों; टी सेल रिसेप्टर (TCR) सक्रियण 1,2 पर एक प्रतिजन सेल (एपीसी)। इस अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली एक संक्रमण के लिए एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया उत्पन्न करता है कि क्या निर्धारित करने में पहला कदम है, के रूप में उत्तेजनाओं को गलत जवाबदेही के परिणामों रोगों के एक नंबर हो सकता है। टी सेल एपीसी बातचीत के महत्व को अच्छी तरह से प्रलेखित है, तथापि, परिपक्व की भूमिका (ओं) प्रारंभिक TCR सी के बाद हैgnal internalization अभी तक पूरी तरह से समझ में आ सकता है।

Cytoskeleton कदम स्पष्ट होगा अस्थायी TCR सक्रियण (प्लाज्मा झिल्ली में अणुओं के आंदोलन और 3,4 cytoskeleton actin पर निर्भर संकेतन अणुओं का नियंत्रण), cytoskeleton स्थानिक rearranges कैसे समझ से जुड़े दो प्रक्रियाओं को सहायता करने के लिए सोचा है के रूप में अन्तर्ग्रथन गठन के दौरान आणविक पुनर्गठन की। एफ actin के पतित प्रवाह प्रतिरक्षात्मक अन्तर्ग्रथन के केंद्र की ओर TCR समूहों बाड़ा के लिए सोचा है, इस translocation संकेत समाप्ति और रीसाइक्लिंग के लिए महत्वपूर्ण माना जा रहा है; टी सेल सक्रियण 5 का अच्छा संतुलन सहायता।

मानक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी सेल सेल बातचीत सहित कई जैविक घटनाओं के बारे में जानकारी प्रदान करने के लिए जारी है कि एक लचीला उपकरण है, यह सही diffr की तुलना में करीब रहने वाले कई fluorophores को हल करने के लिए प्रणाली की क्षमता के द्वारा सीमित हैएक-दूसरे की कार्रवाई सीमा (≈200 एनएम)। कोशिकाओं के भीतर कई आणविक घटनाओं अणुओं के घने आबादी शामिल है और निष्क्रियता में या विशिष्ट उत्तेजना पर या तो गतिशील पुनर्व्यवस्था प्रदर्शनी के रूप में, पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोपी पूरी तस्वीर प्रदान नहीं करता है।

सुपर संकल्प इमेजिंग के उपयोग के शोधकर्ताओं ने विभिन्न तकनीकों का उपयोग करते हुए सीमा विवर्तन नाकाम करने के लिए अनुमति दी गई है। पाम और तूफान 6.7 करीब 20 एनएम के एक सटीक करने के अणुओं के स्थान तक हल करने की क्षमता है एक अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (SMLM) इस तरह के रूप में, हालांकि, इन तकनीकों कई तख्ते पर एक छवि के निर्माण, लंबी अधिग्रहण के समय पर भरोसा । आम तौर पर यह तय होने के लिए नमूने की आवश्यकता है या संरचनाओं कम गतिशीलता का प्रदर्शन करने के लिए बहुत ही fluorophores के कई बिंदुओं के रूप में गलत व्याख्या नहीं कर रहे हैं। प्रेरित उत्सर्जन कमी (STED) इमेजिंग बहुत ही चयनात्मक कोंफोकल उत्तेजना 8, आवश्यक स्कैनिंग के माध्यम से सुपर संकल्प की अनुमति देता है, जबकिदृष्टिकोण को देखने के पूरे सेल क्षेत्रों से अधिक धीमी गति से किया जा सकता है। STED की वजह से भी कमी बीम की शक्ति में वृद्धि करने के लिए उच्च संकल्प के लिए महत्वपूर्ण phototoxicity को दर्शाता है।

संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (सिम 9) एक मानक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के संकल्प को दोगुना करने में सक्षम इन तरीकों, के लिए एक विकल्प प्रदान करता है और वर्तमान SMLM तकनीक से जीना सेल इमेजिंग के साथ और अधिक संगत है। यह देखने के पूरे सेल क्षेत्रों के लिए एक व्यापक क्षेत्र सिस्टम पर कम लेजर शक्तियों का उपयोग करता है; अधिग्रहण की गति में वृद्धि हुई है, और मानक fluorophore लेबलिंग के साथ संगत है प्रदान करते हैं। सिम के व्यापक क्षेत्र प्रकृति भी <100 एनएम का अक्षीय आयाम में प्रवेश गहराई के साथ अत्यधिक चयनात्मक उत्तेजना के लिए कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (TIRF) के उपयोग को अनुमति देता है।

छवि सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (आईसीएस) प्रतिदीप्ति तीव्रता में उतार चढ़ाव correlating की एक विधि है। आईसीएस का एक विकास; Spatio- लौकिक आईएमउम्र सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (Stics 10) समय और अंतरिक्ष में intracellular फ्लोरोसेंट संकेतों संबद्ध। एक संबंध समारोह के माध्यम से ठंड फ्रेम में पिक्सल के आसपास के साथ पिक्सेल तीव्रता correlating द्वारा, सूचना प्रवाह गति और दिशात्मकता के बारे में प्राप्त की है। स्थिर वस्तुओं Stics विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप नहीं है यह सुनिश्चित करने के लिए, एक स्थिर वस्तु फिल्टर पिक्सेल तीव्रता का एक चलती औसत घटाकर द्वारा काम करता है, जो कार्यान्वित किया जाता है।

यहां प्रस्तुत तकनीक जीवित कोशिकाओं 11 में आणविक प्रवाह यों की सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी डेटा के लिए लागू की जा रही छवि के सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी का पहला प्रदर्शन माना जा रहा है। इस विधि Stics विश्लेषण 12 के माध्यम से एफ actin प्रवाह के विवर्तन सीमित इमेजिंग पर सुधार और प्रकाश के विवर्तन सीमा से परे स्थानिक प्रस्तावों पर अधिग्रहीत डेटा से, जीवित कोशिकाओं में दो आयामी आणविक प्रवाह को निर्धारित करने की इच्छा रखने वाले शोधकर्ताओं के अनुरूप होगा।

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Protocol

नोट: इमेजिंग के दिन से पहले 1 और 2 जगह ले चरणों; सभी मीडिया और पूरक आहार के पहले या इमेजिंग के दिन equilibrated कर रहे हैं पर इस्तेमाल किया जा जाता है। संतुलन 5% सीओ 2 के लिए एक मशीन सेट में 37 डिग्री सेल्सियस के लिए मीडिया और खुराक की वार्मिंग के माध्यम से हासिल की है। सभी सेल संस्कृति काम और coverslip चढ़ाना कदम एक लामिना का प्रवाह हुड के तहत बाँझ परिस्थितियों में जगह ले लो।

1. सेल अभिकर्मक

  1. Transfect टी कोशिकाओं एक प्लाज्मिड एक फ्लोरोसेंट संलयन एफ actin GFP लेबलिंग और इमेजिंग के लिए निर्माण एन्कोडिंग के साथ प्रयोग से पहले 24 घंटा imaged किया जाना है। नोट: प्रकोष्ठों से पहले अभिकर्मक (इमेजिंग के लिए पहले 48 घंटा) कोशिकाओं इष्टतम स्वास्थ्य पर और उनके लघुगणक विकास के चरण में हैं सुनिश्चित करने के लिए 24 घंटे विभाजित किया जाना चाहिए।
    1. संतुलित करने के लिए इनक्यूबेटर में 6 अच्छी तरह से थाली का एक भी कुएं में RPMI पूरक के 5 एमएल (1640 RPMI प्लस 10% FBS और 1% कलम strep (वैकल्पिक)) रखें।
    2. 2 10 x 7 टी कोशिकाओं पंथ गोली5 मिनट के लिए 327 XG पर एक अपकेंद्रित्र ट्यूब का उपयोग RPMI पूरक में 37 डिग्री सेल्सियस 5% सीओ 2 का आश्वासन दिया और पूर्व गर्म इलेक्ट्रोपोरेशन मीडिया के एक बराबर मात्रा में धो लें। नोट: electroporation मध्यम buffers और पूरक (उपभोग्य देखें) युक्त एक कम सीरम माध्यम है।
    3. 5 मिनट के लिए 327 XG पर फिर से pelleting के बाद, इलेक्ट्रोपोरेशन मीडिया के 500 μl में कोशिकाओं resuspend और धीरे-धीरे, एक क्युवेट में जोड़ने के लिए लेबलिंग एफ actin के लिए पीसीआर ग्रेड DH 2 हे में प्लाज्मिड के 5 ग्राम जोड़ें।
    4. धीरे बिजली के arcing पैदा कर सकता है और मीडिया के भीतर कोशिकाओं को समान रूप से वितरित करने के लिए है, जो मीडिया में किसी भी हवाई बुलबुले को हटाने सुनिश्चित करने के लिए हुड कार्यक्षेत्र पर क्युवेट नल।
    5. 290 Ω करने इलेक्ट्रोपोरेशन तंत्र और सेट वोल्टेज 300 वी करने के लिए और समाई चालू करें। 20 मिसे के लिए एक घातीय क्षय का उपयोग कर Electroporate नमूना। नोट: अनुकूलन अलग कक्षों और अलग प्लाज्मिड निर्माणों के लिए आवश्यक हो सकता है।
    6. अभिकर्मक प्रोटोकॉल है एक बारजारी रखने से पहले 1 मिनट के लिए बर्फ पर पूरा, स्टोर कोशिकाओं।
    7. ध्यान से कदम 1.1.1 से equilibrated RPMI पूरक के 5 एमएल युक्त 6 अच्छी तरह से थाली करने के लिए क्युवेट से कोशिकाओं को हस्तांतरण।
    8. 37 डिग्री सेल्सियस 5% सीओ 2 में कोशिकाओं हे / एन सेते हैं।

2. कोट coverslips और पूर्व गर्म इमेजिंग अनुपूरक

  1. एंटीबॉडी के साथ कोट coverslips टी सेल उत्तेजना प्रेरित करने के लिए।
    1. कोट 200 μl पीबीएस में 1 माइक्रोग्राम / एमएल αCD3 और αCD28 के साथ एक 8 अच्छी तरह से coverslip के प्रत्येक कक्ष।
    2. 4 डिग्री सीओ / एन पर स्टोर। वैकल्पिक रूप से, 2 घंटा इमेजिंग करने से पहले और कोट coverslips coverslip करने के तापमान में परिवर्तन के कम करके इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान बहाव को कम करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में रहते हैं।
  2. 0.1 माइक्रोन उप विवर्तन फ्लोरोसेंट microspheres के साथ एक coverslip परीक्षण नमूना बनाएँ।
    1. मोतियों की भंवर शेयर समाधान झुरमुटों से बचने के लिए।
    2. वें में से एक नया, स्वच्छ coverslip पर(निर्माता के निर्देशों के अनुसार) की सतह पर कदम 2.1.1 में इस्तेमाल उन लोगों, पिपेट 5 μl फ्लोरोसेंट microsphere शेयर समाधान के रूप में ई एक ही प्रकार के।
    3. विंदुक टिप के साथ coverslip पर microsphere समाधान बिखरा हुआ है।
    4. तो, सूखी ऐसे पीबीएस के रूप में बढ़ते मध्यम 200 μl लागू करने के लिए अनुमति दें।
      नोट: बढ़ते मध्यम कि इमेजिंग सेल के नमूने के लिए इस्तेमाल से मेल खाना चाहिए।
  3. HBSS संतुलित करना 37 डिग्री सेल्सियस 5% सीओ 2 में पूर्व गर्म हे / एन एक मशीन में रखकर एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में (इसके बाद 'HBSS के पूरक' नामक + 20 मिमी HEPES,)।
    नोट: HEPES के अलावा इस पूरकता को छोड़ सीओ 2 इनपुट के साथ एक ऊष्मायन कक्ष का उपयोग करते हैं, तो सीओ 2 बफर करने के लिए है।

3. माइक्रोस्कोप सेट-अप

  1. पूरी तरह से हीटिंग तत्व के आधार कवर करने के लिए माइक्रोस्कोप के जलाशय में TIRF सिम माइक्रोस्कोप और जगह पर्याप्त आसुत जल का मंच शीर्ष इनक्यूबेटर चालू करें। पानी के लिए ई करने की अनुमति दें37 डिग्री सेल्सियस तक quilibrate। यह भी 37 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट उद्देश्य लेंस, हीटिंग कॉलर जोड़ें।
    नोट: सेट-अप की संवेदनशीलता के लिए, इन चरणों से पहले रात काम कर रहे हैं के कारण ऑप्टिकल घटकों एक स्थिर तापमान पर इमेजिंग करने से पहले कर रहे हैं।
  2. माइक्रोस्कोप के प्रकाश पथ में TIRF 488 संगत झंझरी ब्लॉक प्लेस और जगह में सुरक्षित है।
    1. TIRF सिम मोड के लिए सही ऑप्टिकल पथ संलग्न करने के लिए क्रमश: लेजर बिस्तर और माइक्रोस्कोप के मंच पर 'सिंगल' की स्थिति के लिए चैनल मोड और फाइबर केबल स्विच। नोट: यह कदम लंघन सॉफ्टवेयर खिड़की के भीतर एक त्रुटि (चित्रा 1 ए) को बढ़ावा मिलेगा।
  3. सभी माइक्रोस्कोप और कंप्यूटर उपकरणों को चालू करें और अधिग्रहण नियंत्रण सॉफ्टवेयर खुला।
    1. आयोजन समिति के पैनल खोलें, तिवारी पैड, एन-सिम पैड और एन डी अधिग्रहण खिड़कियां (चित्रा 1 बी)। 'ओसी पैनल' विकल्प 'TIRF 488' (चित्रा 2 बी, पीले तीर) का चयन करें। एन-सिम पैड खिड़की में, 'TIRF-सिम' और 'चल रहा है' सेटिंग (चित्रा -2, पीला तीर) का चयन करें। सेटिंग्स बटन (चित्रा 1C, पीले बॉक्स) का चयन करें और लटकती मेनू से मारा, '488 (100x TIRF 488nm के लिए) TIRF' 'ठीक है' 'लागू करें' और का चयन करें।
    2. फ्रेम दर 50 मिसे, पढ़ा गया मोड, ईएम लाभ 14 बिट पर 3 मेगाहर्ट्ज, और 1 के एक रूपांतरण लाभ के साथ ईएम लाभ मल्टीप्लायर 300 (चित्रा 1C, हरे बॉक्स): करने के लिए 'DU897 सेटिंग' के भीतर कैमरा सेटिंग सेट करें।
      नोट: फ्रेम दर विचार के लिए प्रतिनिधि परिणाम देखते हैं।
    3. 'एन-सिम पैड' पर, 100x 1.49 एनए CFI Apochromat TIRF उद्देश्य का चयन करके TIRF सिम के लिए माइक्रोस्कोप की रोशनी जांचना 10% करने के लिए 488 एनएम लेजर बिजली की बारी है।
      नोट: कच्चे छवियों के पिक्सेल आकार देखने के एक 512 x 512 पिक्सेल क्षेत्र के साथ 60 एनएम है।
    4. धूल और तेल निकालने के लिए लेंस ऊतक का उपयोग उद्देश्य लेंस साफ करें।
    TIRF सिम फोकल हवाई जहाज़ का पता लगाएं।
    1. संभव Z विमान में उद्देश्य के साथ शुरू करो। उद्देश्य पर लेंस के तेल की एक बूंद रखें और माइक्रोस्कोप चरण के लिए 2.2 कदम से फ्लोरोसेंट microsphere नमूना जोड़ें।
    2. माइक्रोस्कोप के शरीर पर स्थित बिल्कुल सही फोकस प्रणाली (PFS) समारोह का चयन करें।
    3. PFS बटन पर पहुँच गया है फोकल हवाई जहाज़ पुष्टि करने के लिए चमकती बंद हो जाता है जब तक धीरे धीरे Z-विमान के माध्यम से उद्देश्य ऊपर ले जाएँ।
    4. नियंत्रण सॉफ्टवेयर और छवि PFS सूक्ष्म जोड़तोड़ पहिया का उपयोग करके बनाया अंतिम समायोजन के लिए microspheres पर 'लाइव' को देखने के लिए स्विच।
  4. 75 एनएम क्षणभंगुर लहर के ऊपर कोई बाहर का ध्यान केंद्रित प्रतिदीप्ति उत्सर्जन के साथ वर्दी रोशनी का निरीक्षण करें।
    नोट: संरचित रोशनी फ्लोरोसेंट microsphere नमूना से एक अस्थिर रोशनी पैटर्न देख द्वारा पूरा किया जाता है की पुष्टि करें।
  5. फ्लोरोसेंट microsphere नमूना उपाय और बेहतर इमेजिंग resolut योंतीव्रता प्रोफ़ाइल के आधा अधिकतम पर पूरी चौड़ाई (FWHM) को देख कर आयन।
    1. स्थापित एनआईएस-ए एन-सिम विश्लेषण मॉड्यूल के साथ, विश्लेषण सॉफ्टवेयर (v4.20.01) खोलें और 'एप्लीकेशन' का चयन करें -> 'शो एन ​​सिम खिड़की'।
    2. TIRF सिम डेटासेट (चित्रा 2) के लिए 1 पर सेट रोशनी मॉडुलन विपरीत (आईएमसी) और उच्च संकल्प शोर दमन (HRNS) के साथ 30 के एक पिक्सेल आकार के साथ 1024 x 1024 पिक्सल के एक खंगाला छवि उत्पन्न करने के लिए microsphere नमूना छवि को फिर से संगठित एनएम।
    3. 1 पिक्सेल (चित्रा 3 ए, पीले बॉक्स) की चौड़ाई के साथ लाइन प्रोफ़ाइल उपकरण का उपयोग, एक भी microsphere के केंद्र के माध्यम से एक रेखा खींचना।
    4. FWHM बटन (चित्रा 3 बी, पीले बॉक्स) का चयन करें और इसकी तीव्रता न्यूनतम द्वारा पीछा गाऊसी वितरण की तीव्रता Maxima, पर क्लिक करें।
    5. Microsphere की FWHM 100 एनएम (चित्रा 3 सी) की रेंज में है की पुष्टि करें। नोट: संकल्प ACHieved जब इमेजिंग जैविक नमूने लेबलिंग दक्षता और पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति से शोर अनुपात करने के लिए संकेत के आधार पर अलग अलग होंगे।

इमेजिंग के लिए 4. नमूना तैयार

  1. Coverslip तैयारी।
    1. फ्रिज या इनक्यूबेटर से 2.1 कदम से αCD लेपित coverslip निकालते हैं और एक अच्छी तरह से पीबीएस युक्त αCD3 और αCD28 हटा दें।
    2. Coverslip के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 2.3 कदम से पूर्व गर्म HBSS के पूरक के 200 μl जोड़ें। धो और न्यूनतम αCD3 सुनिश्चित करने के लिए हटाने और αCD28 समाधान में छोड़ दिया जाता है। Coverslip के कुओं के लिए HBSS के पूरक का एक और 200 μl जोड़ें।
    3. तेल और कण को ​​दूर करने के लिए लेंस ऊतक के साथ coverslip के नीचे साफ करें।
  2. 3.4 कदम के रूप में पाया खुर्दबीन मंच पर स्थिति coverslip और PFS Z-विमान का उपयोग करके coverslip के TIRF फोकल हवाई जहाज़ लगता है।
  3. सेल तैयार।
    1. मीडिया चुनाव के 200 μl पिपेटएक सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब में कदम 1.1.8 से कोशिकाओं taining।
    2. 20 सेकंड के लिए 268 XG पर एक सूक्ष्म अपकेंद्रित्र में गोली कोशिकाओं और सेल मीडिया को हटा दें।
    3. 200 μl में Resuspend कोशिकाओं 2.3 कदम से HBSS पूरक गर्म हो गया था।

5. इमेजिंग प्रकोष्ठों

  1. माइक्रोस्कोप के लिए सेल युक्त HBSS के पूरक ले लो और धीरे कुओं में से एक में 200 μl विंदुक।
  2. (PFS मोड में) coverslip पर TIRF फोकल हवाई जहाज़ में, जबकि शेष coverslip के करीब पहुंच फ्लोरोसेंट कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए माइक्रोस्कोप ऐपिस और epifluorescence रोशनी का उपयोग करें।
  3. कोशिकाओं coverslip पर भूमि एक बार, मॉनीटर पर छवि को लाने के लिए और कोशिकाओं को कंप्यूटर स्क्रीन पर ध्यान केंद्रित करने में कर रहे हैं की जाँच करने के एन-सिम पैड में 'लाइव' मोड के लिए स्विच।
  4. क्लिक करें, एन डी अधिग्रहण खिड़की खुली और 'टाइम' टैब का चयन करें, समय-पाठ्यक्रमों रिकॉर्ड करने के लिए कोई देरी, 'अवधि' के लिए 'जोड़ें' और 'अंतराल' सेट10 मिनट के लिए, 1 पर सेट है 'लूप्स'।
    नोट: अवधि के लिए ब्याज की प्रक्रिया के आधार पर बदला जा सकता है; 'कोई देरी' के साथ कब्जा कर लिया जब Stics सॉफ्टवेयर ≈10 तख्ते की छवि के ढेर के साथ मात्रात्मक परिणाम निकाल सकते हैं।
  5. मनका नमूना करने के लिए समान अधिग्रहण सेटिंग्स के साथ, एनडी अधिग्रहण खिड़की में 'अब भागो' का चयन करके डेटा रिकॉर्डिंग शुरू।

6. पुनर्निर्माण सिम छवियाँ

  1. इमेजिंग पूर्ण होने के बाद स्थापित एनआईएस-ए एन-सिम विश्लेषण मॉड्यूल के साथ, विश्लेषण सॉफ्टवेयर (v4.20.01) खोलने और 'एप्लीकेशन' का चयन करें -> 'शो एन ​​सिम खिड़की'।
  2. TIRF सिम डेटासेट के लिए 1 पर सेट रोशनी मॉडुलन विपरीत (आईएमसी) और उच्च संकल्प शोर दमन (HRNS) (चित्रा 2) के साथ, एक (या बैच उपकरण का उपयोग कर कई) एक खंगाला सिम छवि का निर्माण करने के लिए कच्चे सिम फ़ाइल का पुनर्निर्माण किया।
  3. खंगाला फ़ाइल की पुष्टि में संकेत 30 एनएम के एक पिक्सेल आकार की है,छवि की स्थिति पट्टी।
    नोट: पिक्सेल आकार Stics विश्लेषण प्रभावित नहीं करता है, लेकिन यह पिक्सल के बीच स्थानिक सहसंबंध सुनिश्चित करने के क्रम में पीएसएफ स्थानिक संकल्प से आयाम में कम से कम 2x छोटा होना चाहिए।
  4. Stics विश्लेषण के लिए तैयार झगड़ा फ़ाइलें, के रूप में डेटा निर्यात करें।

7. Stics विश्लेषण

  1. (; अनुपूरक जानकारी के रूप में उपलब्ध ऋषि प्रयोगशाला) डाउनलोड और stic (सी) निकाल मैटलैब सॉफ्टवेयर पैकेज है। स्क्रिप्ट stics_vectormapping.m एक चैनल Stics विश्लेषण का मूल है और कोड के पहले 30 लाइनों मैनुअल की धारा 2.1 के रूप में परिभाषित इनपुट पैरामीटर्स को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। इस स्क्रिप्ट को खोलें और TIRF सिम डेटा विश्लेषण के लिए इनपुट पैरामीटर्स को परिभाषित। मैनुअल के परिशिष्ट में विस्तृत रूप में यह भी स्थानीय मशीन मैटलैब पथ को सबफ़ोल्डर के साथ STIC (सी) एस फ़ोल्डर जोड़ने का सुझाव दिया है।
    1. कोड की इसी लाइनों का संपादन करके डेटा विश्लेषण के लिए इनपुट पैरामीटर्स को परिभाषित करें
    2. एना प्रदर्शन करने के लिएTIRF सिम डेटा की सेल, 1 वेक्टर नक्शा उत्पन्न वेक्टर नक्शे का एक समय श्रृंखला को प्राप्त करने के तख्ते की अधिकतम संख्या और 1 के लिए लाइन 32 में अस्थायी बदलाव के लिए लाइन 31 में अस्थायी उपप्रदेश के लिए अस्थायी मानकों को स्थापित करने के लिए इन मापदंडों भिन्न हो ।
    3. स्थिर हटाने फिल्टर के लिए, 21 को 'MoveAverage' पैरामीटर (लाइन 24) 'औसत चल रहा है' और स्थापित करने के लिए पैरामीटर 'फिल्टरिंग' (लाइन 23) की स्थापना की।
      नोट: यह विश्लेषण किया जा रहा फ्रेम से धारावाहिक फ्रेम घटाकर पर आधारित है के रूप में इस सेटिंग, धीमी चलती है और बड़े प्रतिदीप्ति संकेतों के लिए काम करने के लिए दिखाया गया है।
    4. बदलें लाइनों 33-38 आउटपुट फाइल और उत्पादन वेक्टर नक्शे के खिताब के नाम, साथ ही उत्पादन निर्देशिका पथ सेट और वेक्टर नक्शा छवियों को बचाया जाना चाहिए कि क्या प्रारूप में परिभाषित करने के लिए।
पिक्सेल आकार (माइक्रोन) 0.03 माइक्रोन रेखा 19
फ्रेम दर (सेकंड) 1 सेकंड लाइन 20
अधिकतम समय अंतराल (फ्रेम) 20 तख्ते लाइन 21
उपक्षेत्र आकार (पिक्सेल) 8 पिक्सल रेखा 29
उपक्षेत्र रिक्ति (पिक्सल) 1 पिक्सेल लाइन 30
  1. मैटलैब संपादक विंडो में स्क्रिप्ट run1ChannelSTICS खोलें। लाइनों इस स्क्रिप्ट के 1-23 चलाकर छवि श्रृंखला लोड करें।
    नोट: यह स्क्रिप्ट लोड और पूर्व प्रक्रिया छवि श्रृंखला, वेक्टर नक्शे और गति histograms साजिश और कई फाइलों के लिए एक बैच संसाधन को चलाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यदि आवश्यक हो, इस स्क्रिप्ट की लाइन 24-26 का उपयोग करके ब्याज की एक क्षेत्र के लिए छवि फसल।
    1. भागो लाइनों run1ChannelSTICS की 29-35 Stics विश्लेषण शुरू करने के लिए। जब संकेत दिया है, अगर वांछित, ब्याज (आरओआई) के एक विशिष्ट क्षेत्र इंगित करने के लिए एक बहुभुज का चयन करें। सीमा कलाकृतियों होते हैं के रूप Stics इन पुन विश्लेषण करती है जब रॉय, सेल बढ़त के साथ ओवरलैप नहीं है कि सुनिश्चितgions।
    2. भागो लाइनों 38-52 वेक्टर नक्शे प्रदर्शित करने के लिए। वेग परिमाण हिस्टोग्राम की साजिश करने के लिए, लाइनों 53-72 चलाते हैं।

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Representative Results

माइक्रोस्कोप सेटिंग्स

सफलतापूर्वक सभी प्राप्त करने के बाद कदम शोधकर्ता होगा एक टी सेल अन्तर्ग्रथन में एफ actin प्रवाह के निपुण संरचित रोशनी (सिम) इमेजिंग है (वीडियो 1), और स्थानिक-लौकिक छवि सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (चित्रा 4 11) द्वारा इस आणविक प्रवाह की मात्रा निर्धारित की। छवियों रिकॉर्डिंग से पहले, नमूना रोशनी नौ कच्चे छवियों भर में एक समान और नमूना पर मनाया जाता है मौआ किनारे के रूप में है कि संरचित रोशनी (चित्रा 5) है, यह सुनिश्चित करें कि इन दोनों संकेतक coverslip मंच और TIRF- पर फ्लैट है सिम सेट अप ठीक से गठबंधन किया है।

यह कोशिकाओं के प्रयोग के दौरान संभव के रूप में स्वस्थ रहना सुनिश्चित करने के लिए कम लेजर शक्ति (≤10%) रखने के लिए महत्वपूर्ण है। फ्लोरोसेंट अभिव्यक्ति भी टी के अनुकूलन के बाद, कम हैउन्होंने कहा 50 मिसे और / या रूपांतरण लाभ सेटिंग्स से ऊपर प्रत्येक कच्चे फ्रेम के समय जोखिम में वृद्धि, कदम electroporation। TIRF सिम फ्रेम दर कम हो जाएगा जोखिम समय में वृद्धि 9 कच्चे फ्रेम, खंगाला छवि प्रति आवश्यक 9 रोशनी झुकाव से प्रत्येक के लिए 1, की आवश्यकता है। इस प्रयोग में, एक 50 मिसे जोखिम की अनुमति देता है ≈1 (भी ग्रिड रोटेशन समय सहित) प्रति सेकंड खंगाला फ्रेम, तेज घटनाओं एक कच्चे फ्रेम में कई रोशनी Maxima के माध्यम से कदम जब देखा गति कलाकृतियों के जोखिम को कम करने।

आणविक प्रवाह की गति के आधार पर प्रस्ताव कलाकृतियां पेश हो सकता है समय जोखिम बढ़ रही है, का अध्ययन किया जा रहा है; शोधकर्ताओं ने एक अच्छा संकेत के लिए आवश्यक न्यूनतम करने के लिए कई बार प्रदर्शन कर रखना चाहिए। सिम छवियों में पिक्सेल आकार मानक प्रतिदीप्ति छवियों के उन लोगों की तुलना में छोटे होते हैं, तेजी से प्रवाह की गति का प्रदर्शन आणविक आबादी एक बाद सोमवार से पहले उपप्रदेश के माध्यम से पारित हो सकता हैAME अधिग्रहण कर लिया है। Stics सॉफ्टवेयर तेजी से इस छोटे से क्षेत्र के भीतर प्रतिदीप्ति संकेत सहसंबंधी के लिए छवि दरों मानक प्रतिदीप्ति डेटासेट की तुलना में आवश्यक हैं। एक मानक प्रतिदीप्ति डाटासेट से एक 8 x 8 पिक्सेल उपप्रदेश (200 एनएम के एक ग्रहण पिक्सेल आकार के साथ) 1.7 माइक्रोन का एक क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि उदाहरण के लिए सिम डेटा के 8 एक्स 8 पिक्सल के एक उपप्रदेश आकार एक 240 x 240 एनएम क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है।

अब समय पाठ्यक्रम (> 3 मिनट) के लिए डेटा के बैच अन्तर्ग्रथन गठन के दौरान लेजर जोखिम (कम करने के लिए 'एन डी अधिग्रहण' का उपयोग लिया जा सकता है जैसे, 10 मिनट के लिए हर मिनट एक ही संचयी लेजर सत्ता में सेल का खुलासा होगा 10 सेकंड के लिए इमेजिंग लगातार <2 मिनट) के लिए इमेजिंग के रूप में।

सिम इमेजिंग से उप इष्टतम पुनर्निर्माण ही कच्चे डेटा विभिन्न उच्च resoluti का उपयोग खंगाला गया है, जहां 6 चित्रा, में प्रदर्शन कर रहे हैंशोर दमन (HRNS) सेटिंग्स पर, आगे फूरियर रूपांतरण (FFT) और प्रकाश डाला फाइबर की पूरी चौड़ाई आधा अधिकतम प्रोफाइल भी दिखाए जाते हैं। HRN की स्थापना की वजह से गरीब संकेत-शोर से करने के लिए और बढ़ती समाधान करने के लिए बढ़ रही पुनर्निर्माण कलाकृतियों के बीच एक संतुलन है। <(1) कर सकते हैं 'क्लिप' और उच्च संकल्प डेटा त्यागने (एक कम FFT व्यास के रूप में देखा जाता है) बहुत कम है कि एक HRN (एक भी उच्च HRNS सेटिंग, जबकि 1), बढ़ हेक्सागोनल एसएम कलाकृतियों के साथ दानेदार छवियों में परिणाम कर सकते हैं>। प्रस्तावों आवश्यक हो सकता है एक अनुकूलित माइक्रोस्कोप सेटअप के साथ डेटा reacquiring अभी भी उप इष्टतम कर रहे हैं> 100 एनएम के एक संकल्प के विभिन्न सेटिंग्स के साथ पुनर्निर्माण फिर से दौड़ना करने की आवश्यकता का संकेत होता है।

इमेजिंग और आणविक प्रवाह बढ़ाता

छवि की आणविक प्रवाह करने के लिए, समय श्रृंखला डेटा एक उत्तेजक coversli पर एक अन्तर्ग्रथन लैंडिंग और बनाने टी कोशिकाओं के लिए लिया गया थापी एफ actin सेल केंद्र की ओर सेल परिधि से एक प्रतिगामी फैशन में प्रवाह करने के लिए देखा जा सकता है। सेल Stics विश्लेषण का केंद्र केवल अन्तर्ग्रथन की परिधि में बाहर किया गया था की ओर एफ actin कम घना हो जाता है संकेत microclusters लंबे समय तक अन्तर्ग्रथन गठन के दौरान से ही शुरू करने के लिए जाना जाता है, जहां इस क्षेत्र में भी है।

प्राप्त करने और Stics का उपयोग कर डेटा का विश्लेषण करते समय यह कार्यक्रम एक उच्च और चिकनी सहसंबंध समारोह (सीएफ) के रूप में चयनित उपक्षेत्र के भीतर फ्लोरोसेंट उतार चढ़ाव correlating पर निर्भर करता है समझने के लिए महत्वपूर्ण है। सॉफ्टवेयर उन उपक्षेत्र के भीतर रचनात्मक संकेत उतार चढ़ाव की कुल संख्या के माध्यम से एक उत्पादन बनाने पर अधिक निर्भर करता है के रूप में एक सफल Stics उत्पादन उत्पन्न करने की जरूरत तख्ते की कुल संख्या सही नहीं है। उदाहरण के लिए डाटासेट एक ही दिशा Stics में बह प्रत्येक उपप्रदेश में 20 मोबाइल, लेबल प्रोटीन है कि अगर जीन करने के लिए कम फ्रेम की आवश्यकता होगीएक कमजोर सहसंबंध समारोह में 5 मोबाइल प्रोटीन परिणाम और के साथ एक उपप्रदेश अधिक फ्रेम की आवश्यकता हो सकती है, जबकि एक विश्वसनीय उत्पादन दर। इस्तेमाल किया फ्रेम और उपप्रदेश आकार की सही संख्या imaged किया जा रहा आणविक घटनाओं की प्रकृति पर निर्भर करता है और उपयोगकर्ता द्वारा अनुकूलित किया जाना चाहिए।

प्रवाह की दर अलग सेलुलर शर्तों या इस तरह के रूप में पहले और नशीली दवाओं के उपचार के बाद पर्यावरण उत्तेजनाओं के आधार पर एक ही कोशिका के भीतर बदल अगर शोधकर्ताओं देखने के लिए अनुमति: Stics 'टेम्पोरल फ्रेम फसल' उपकरण का उपयोग करना है कि यह समय के माध्यम से आणविक प्रवाह के सबसेट का विश्लेषण करने के लिए संभव है। स्थिर वस्तु फिल्टर से पहले मोबाइल फ्लोरोसेंट आबादी का विश्लेषण करने के लिए किसी भी स्थिर फ्लोरोसेंट आबादी को दूर करने के लिए बनाया गया है। , इस दृष्टिकोण का उपयोग अभी भी सफलतापूर्वक किया जा सकता है 90% तक स्थिर जनसंख्या प्रतिशत युक्त छवियों 10 का विश्लेषण किया। 21 फ्रेम करने के लिए स्थिर फिल्टर की स्थापना रहते हैं कि किसी भी फ्लोरोसेंट आबादी से बाहर फिल्टर प्रतिरक्षात्मक अन्तर्ग्रथन स्थिरीकरण के दौरान गतिशील पतित प्रवाह में योगदान नहीं होगा, जो समय या उससे अधिक समय की इस अवधि के लिए स्थिर।

आकृति 1
एक चैनल और फाइबर मोड चयनित नहीं हैं जब चित्रा 1। माइक्रोस्कोप अधिग्रहण सेटिंग्स। (ए) प्रयोग और 'गलत फाइबर' त्रुटि के लिए इस्तेमाल एन सिम पैड सेटिंग्स पर प्रकाश डाला गया। (बी), रिकार्ड स्थापित किया है और सिम प्रणाली पर एक संरचित रोशनी की छवि को फिर से संगठित करने की जरूरत सभी खिड़कियां। (सी) एन-सिम पैड और एन सिम सेटिंग्स पॉप-खिड़की से बाहर (पीला बॉक्स) शारीरिक रूप से माइक्रोस्कोप में झंझरी 488 एनएम रखने के बाद झंझरी सेटअप चयन करने के लिए प्रयोग किया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

ontent "के लिए: रख-together.within-पेज =" 1 "> चित्र 2
चित्रा 2। अंतिम छवि के लिए पुनर्निर्माण सेटिंग्स। लटकती मेनू से 'परम' बटन (पीले बॉक्स), का चयन TIRF सिम का चयन करने पर, और शुरू में सेट 'रोशनी मॉड्यूलेशन कंट्रास्ट' (आईएमसी) और 'उच्च संकल्प शोर दमन दोनों 1. करने के लिए '(HRNS) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. आधा अधिकतम (FWHM) माप। विश्लेषण सॉफ्टवेयर (ए) का उपयोग पर पूरी चौड़ाई एक गाऊसी चयनित लाइन तीव्रता उपकरण से साजिश (पीले बॉक्स) और एक मनका नमूने की एक खंगाला सिम छवि के माध्यम से तैयार पता चलता है। ( (सी चुने गए हैं FWHM बटन (पीले बॉक्स) तीव्रता Maxima और minima के बिंदु का चयन करके, FWHM माप यों के लिए आवश्यक कदम से पता चलता है । प्रतिदीप्ति तीव्रता में डुबकी शोर की वजह से सिम पुनर्निर्माण की एक ज्ञात मूर्ति है, उच्च संकल्प शोर दमन समाधान करने के लिए एक कीमत पर, (चित्रा 5C) कम किया जा सकता है इस प्रभाव को तर करने के लिए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा 4
चित्रा 4. प्रतिनिधि संरचित रोशनी डेटा और GFP लेबल एफ actin व्यक्त Stics उत्पादन। ए Jurkat टी सेल प्रतिरक्षात्मक अन्तर्ग्रथन पीढ़ी के लिए एक उत्तेजक coverslip पर TIRF सिम का उपयोग imaged। पांच मिनट के संपर्क के बाद, एक समय पाठ्यक्रम ले लिया है और Stics विश्लेषण प्रोग्राम का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था। वेक्टर नक्शे अन्तर्ग्रथन परिधि में एफ actin के पतित प्रवाह का प्रदर्शन करते हुए पीले बक्से क्षेत्रों तेजी से बढ़ी प्रतिनिधित्व करते हैं। वेक्टर रंग कि उपप्रदेश में आणविक प्रवाह के वेग, वेग डेटा एक हिस्टोग्राम पर साजिश रची है का संकेत मिलता है। यह खिसकाते या ruffling या गतिशीलता के कारण प्रयोग के समय के पाठ्यक्रम के माध्यम से दूर coverslip से चलता रहता है, तो कारण TIRF सिम प्रदान उत्तेजना के Z-चयनात्मकता के लिए, नमूना ध्यान से खो दिया जा सकता है। इस वेक्टर घनत्व में कमी के रूप में शीर्ष सही पैनल में यहां देखा जाता है। कमी उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित समय की अवधि के लिए कोई फ्लोरोसेंट उतार चढ़ाव से पता चला है जो उपक्षेत्र को स्थिर फिल्टर लगाने के Stics का परिणाम है। इस परिणाम के लिए पूरे समय श्रृंखला के लिए प्रतिदीप्ति संकेत होते हैं कि केवल का चयन क्षेत्रों के महत्व पर प्रकाश डाला गया। दुबला "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. कच्चे सिम छवियों। बाईं तरफ के नौ कच्चे छवियों एक TIRF सिम छवि का निर्माण करने की जरूरत ग्रिड पैटर्न के 9 झुकाव दिखा। Imaged सेल GFP लेबल एफ actin व्यक्त Jurkat टी सेल, तेजी से बढ़ी सेल विशेष रूप से सेल परिधि के चारों ओर, मौआ किनारे के साथ गैर वर्दी रोशनी का प्रदर्शन, नौ कच्चे छवियों का पता चलता है। संरचित रोशनी दिखाई नहीं देता है, हालांकि यह सुधार के प्रस्ताव के साथ एक छवि में यह परिणाम पुनर्निर्माण के बाद रोशनी और नमूना के बीच बातचीत, अलग-अलग रोशनी ताकत के क्षेत्रों पैदा करते हैं। दोनों स्केल सलाखों 5 माइक्रोन कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

1 ">:" रख-together.within-पेज = के लिए "e_content चित्रा 6
चित्रा 6 उच्च संकल्प शोर दमन (HRNS) सेटिंग्स उप इष्टतम सेटिंग्स उप इष्टतम छवि पुनर्निर्माण के लिए सीसा।। (ए) खंगाला डेटा में अंतर से पता चलता कम HRNS संकल्प को कम करने और बेहतर जानकारी का नुकसान में परिणाम कर सकते हैं पत्ती क्षेत्र के बाहर वृद्धि की पृष्ठभूमि शोर और उच्च HRNS की ओर जाता है, जहां (सेटिंग्स प्रत्येक छवि के नीचे बाएँ में दिखाया गया है) का इस्तेमाल किया। (बी) के आगे फूरियर परिधीय जानकारी उच्च संकल्प डेटा इंगित करता है जहां (ए) में छवियों के बदलने प्रतिनिधित्व करता है; HRNS कम छवि संकल्प का संकेत है, 5 के लिए सेट है जब परिणत का काटा पंखुड़ियों ध्यान दें। (सी) अलग सेटिंग्स में (एक में पीले बॉक्स) actin फाइबर की पूरी चौड़ाई आधा अधिकतम (FWHM) को दर्शाता है, सॉफ्टवेयर के माध्यम से FWHM माप पढ़ने दिया90 एनएम, 100 एनएम और क्रमश: 0.1, 1, और 5 के HRNS सेटिंग्स के लिए 180 एनएम का। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस तकनीक की छवि के लिए शोधकर्ताओं की अनुमति है और प्रतिदीप्ति व्यक्त कोशिकाओं में पहले से unresolvable विवरण यों जाएगा। हमारे परिणामों में हम एफ actin टी सेल है में सेल केंद्र की ओर सेल परिधि से एक सममित फैशन में बहती है दिखाते हैं। इन निष्कर्षों -1 डी लाइन प्रोफ़ाइल kymograph डेटा 13 से पिछले परिणामों के साथ संगत कर रहे हैं और 2 डी और सुपर संकल्प के आंकड़ों के विश्लेषण की क्षमता का विस्तार।

प्रस्तुत तकनीक समय के साथ एक एकल -1 डी लाइन के माध्यम से प्रतिदीप्ति तीव्रता उतार चढ़ाव की साजिश रचने के लिए सीमित है जो kymograph इमेजिंग से एक प्रगति है। इसकी तुलना में मौजूदा तकनीक निकाली दिशात्मकता और गति दोनों के साथ पूरे सेल आणविक प्रवाह की मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है। बिंदु इमेजिंग भी 2 डी वातावरण के भीतर actin गतिशीलता 14 दिखाया गया है, धब्बा तकनीक सही लेबलिंग घनत्व के साथ कठिनाइयों द्वारा सीमित है और केवल actin के एक उप-जनसंख्या visualizes किया जा सकता।

इन परिणामों को प्राप्त करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम विशेष कोशिकाओं के अभिकर्मक दक्षता सिम खुर्दबीन प्रकाशिकी और झंझरी पैटर्न के शोधकर्ता और संरेखण द्वारा इस्तेमाल किया जा रहा अनुकूलन करने के लिए कर रहे हैं। उपप्रदेश का सही आकार का चयन नमूना विशेषताओं पर निर्भर करता है, और एक बहुत छोटा सेटिंग तेजी से बढ़ प्रतिदीप्ति सहसंबंध विश्लेषण से खो दिया है, लेकिन बहुत बड़ी चुनने है मतलब होगा एक छोटा प्रदेश का उपयोग कर हासिल अतिरिक्त डेटा में बारीकियों के संभावित नुकसान का मतलब होगा के रूप में महत्वपूर्ण है सुपर संकल्प तरीकों।

उपक्षेत्र तेजी से बढ़ वस्तुओं पर नज़र रखने के लिए विश्वसनीयता सुधार हो सकता है यह बढ़ रही है, वेग मानचित्रण के विश्लेषण के लिए एक सुपर पिक्सल बनाने के लिए अभिव्यक्त पिक्सेल की संख्या को दर्शाता है। उपप्रदेश रिक्ति superpixels भीतर डेटा के बीच अंतर है। उपप्रदेश रिक्ति उपप्रदेश आकार की तुलना में कम है, इन आसन्न वैक्टर इस सेटिंग में वृद्धि दिशात्मक विपक्ष को कम कर सकता है, कुछ जानकारी साझा करेंगेअंतिम vectormap की istency उत्पन्न। अधिकतम समय अंतराल inputted संख्या समय की अधिकतम संख्या विश्लेषण समाप्त होने से पहले lags है जहां समय सहसंबंध विश्लेषण, नियंत्रित करता है।

अंतिम छवि के पुनर्निर्माण रोशनी मॉडुलन विपरीत (आईएमसी) और उच्च संकल्प शोर दमन (HRNS) सेटिंग्स चयनित होने के लिए की आवश्यकता है। इष्टतम सेटिंग्स नमूने के लिए नमूना से अलग हो सकता है। आईएमसी नमूना पर धारीदार रोशनी पैटर्न भेद में मदद करता है, और पुनर्निर्माण कलाकृतियों को कम करता है। HRNS फूरियर से उच्च संकल्प डेटा 'कतरन' को बदलने से कम विपरीत डेटा से कलाकृतियां को कम कर सकते हैं; अधिकतम संकल्प क्षमताओं को बनाए रखने और पुनर्निर्माण कलाकृतियां ये आम तौर पर 1 पर सेट कर रहे कम से कम।

इस तकनीक की सीमाओं Stics सॉफ्टवेयर तकनीक TIRF-सिम या 2 डी-सिम तक सीमित है 3 डी डेटा का विश्लेषण नहीं कर सकते हैं, इस प्रक्रिया के 2 डी प्रकृति के आसपास आधारित हैं, यह इसलिए relat होने के लिए नमूने की आवश्यकता हैcoverslip के खिलाफ ively फ्लैट। एक और तकनीकी नुकसान TIRF सिम 50 मिसे फ्रेम अधिग्रहण और ग्रिड पैटर्न को नई दिशा सिम माइक्रोस्कोप से लगने वाले समय के बारे में हमारी सेटिंग्स के साथ इस तरह के रूप में, अंतिम सुपर संकल्प छवि के पुनर्निर्माण से पहले एकत्र होने के लिए 9 कच्चे फ्रेम की आवश्यकता है; ≈1 सेकंड के फ्रेम दर हासिल कर रहे हैं। अन्य सुपर संकल्प तकनीक अधिग्रहण बार और देखने के बड़े क्षेत्र के साथ तुलना में इन सीमाओं सबसे अनुप्रयोगों के लिए स्वीकार्य हैं।

यहाँ प्रस्तुत परिणाम प्रतिरक्षाविज्ञानी synapse गठन में एफ actin प्रवाह के मानक TIRF इमेजिंग से डेटासेट के साथ तुलना कर रहे हैं। इमेजिंग तौर तरीकों के बीच अच्छे समझौते Stics संभावित सिम पुनर्निर्माण कलाकृतियों के खिलाफ और भी सिम के दौरान इस्तेमाल छवि अधिग्रहण सेटिंग डेटा विश्लेषण के लिए स्वीकार्य हैं कि मजबूत है दर्शाता है। छोटे पिक्सेल के साथ और अधिक डेटा सुपर संकल्प डेटासेट आकार का उपयोग करके अलग-अलग कोशिकाओं और एस की गतिशीलता से निकाला जा सकता हैयूबी विवर्तन सेलुलर सूक्ष्म डोमेन की जांच की जा सकती है।

इस तकनीक के लोभी के बाद किसी भी आणविक प्रवाह करने के लिए गुंजाइश के साथ, imaged और मात्रा निर्धारित किया जा सकता है, गैर invasively कहीं भी सेल के xy विमान में एक confocal खुर्दबीन के साथ नमूने प्लाज्मा झिल्ली में प्रवाह के बारे में सवाल है, या जब की एक भीड़ की जांच।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Consumables:
Jurkat E6.1 cells APCC ATTC TIB-152
RPMI Life Technologies 21875-091
FBS Sigma F7524-500ML
Penicillin-Strepromycin  Life Technologies 15140-122
HBSS  Life Technologies 14025-050
HEPES Life Technologies 15630-056
#1.5 8-well Labtek coverslips NUNC, Labtek 155409
LifeAct GFP construct Ibidi 60101
OptiMem Life Technologies 51985-042
anti-CD3 Cambridge Bioscience 317315
anti-CD28 BD Bioscience / Insight Biotechnology 555725
PBS Life Technologies 20012-019
Lens oil
Name Company Catalog number Comments
Equipment:
Gene Pulsar Xcell System BioRad 165-2660
Cuvette (0.4cm) BioRad 165-2088
Centrifuge (5810R) Eppendorf  5805 000.327
Centrifuge (Heraeus) Biofuge pico 75003235
6 well plate Corning 3516
Stage-top incubator Tokai Hit INUH-TIZSH
Nikon N-SIM microscope Nikon Contact company
Nikon Analyse software Nikon Contact company
Incubator (190D) LEEC Contact company

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 106 सुपर संकल्प संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी actin लाइव सेल छवि सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी
संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी डेटा की spatio- लौकिक छवि सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा मात्रा टी कोशिकाओं में cortical एक्टिन प्रवाह
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Ashdown, G., Pandžić, E., Cope, A., Wiseman, P., Owen, D. Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data. J. Vis. Exp. (106), e53749, doi:10.3791/53749 (2015).

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