Abstract
Filamentöst-aktin spelar en avgörande roll i en majoritet av cellprocesser inkluderande motilitet och, i immunceller, bildandet av en nyckel cell-cell-interaktion kallas den immunologiska synapsen. F-aktin är också spekulerats spela en roll vid reglering av molekylfördelningen vid membranet hos celler inklusive sub-membranös vesikel dynamik och protein klustring. Medan standardljusmikroskop tekniker tillåter generaliserade och diffraktionsbegränsad observationer göras, många cellulära och molekylära händelser, inklusive klustring och molekylär flöde förekommer i populationer på längdskalor långt under upplösningsförmåga standardljusmikroskop. Genom att kombinera total inre reflektion fluorescens med superupplösning avbildningsmetod strukturerad belysning mikroskopi, var två-dimensionell molekylär flöde av F-aktin vid immun synapsen av T-celler registrerats. Spatiotemporala bildkorrelationsspektroskopi (STICS) anbringades därefter, som genererar mätbara results i form av hastighets histogram och vektorkartor som representerar flödesrikt och omfattning. Detta protokoll beskriver en kombination av super-upplösning bild- och STICS teknik för att alstra flödesvektorer på sub-diffraktion detaljnivåer. Denna teknik användes för att bekräfta en aktin flöde som är symmetriskt retrograd och centripetal hela periferin av T-celler vid synapserna bildas.
Introduction
Målet med experimentet är att bilden och karakterisera den molekylära flödet av filamentous- (F-) aktin i levande T-celler, utöver diffraktionsgränsen för att fastställa flödes riktning och storlek under immunologisk synaps (IS) bildning. Denna teknik kommer att genomföras med hjälp av en strukturerad belysningsmikroskop (SIM) i total inre reflektion fluorescens (TIRF) läget, avbildning Jurkat T-celler som bildar en konstgjord synaps om hur du aktiverar täck belagda med anti-CD3- och anti-CD28-antikroppar. De IS bildas mellan en T-cell och dess mål; en antigenpresenterande cell (APC) vid T-cellreceptor (TCR) aktivering 1,2. Eftersom detta är det första steget för att avgöra om det adaptiva immunsystemet genererar ett immunsvar mot en infektion, kan konsekvenserna av felaktig respons till stimuli orsaka en rad sjukdomar. Betydelsen av T-cells APC interaktion är väl dokumenterad, dock är den roll (er) i den mogna efter inledande TCR signal interna är ännu inte helt klarlagt.
Såsom cytoskelettet tros hjälpa två processer kopplade till TCR-aktivering (förflyttning av molekyler vid plasmamembranet och kontrollen av signalmolekyler som är beroende av aktincytoskelettet 3,4), att förstå hur cytoskelettet omarrangerar spatialt och temporalt kommer belysa stegen molekyl omorganisation under synaps bildning. Bakåtsträvande flöde av F-aktin tros Corral TCR kluster mot mitten av den immunologiska synapsen, är denna translokation tros vara avgörande för signal upphörande och återvinning; medhjälp den fina balansen av T-cellsaktivering 5.
Även standard fluorescensmikroskopi är ett flexibelt verktyg som fortsätter att ge insikt om många biologiska händelser, inklusive cell-cell-interaktioner, är den begränsad av systemets förmåga att korrekt lösa flera fluoroforer bor närmare än diffraktionsgräns (≈200 nm) för varandra. Som många molekylära händelser inom celler innebär täta populationer av molekyler och uppvisar dynamisk ombildning antingen i viloläge eller vid specifik stimulering, gör konventionell ljusmikroskopi inte ger en fullständig bild.
Användningen av superupplösning avbildning har tillåtit forskare att kringgå diffraktionsgränsen med användning av en mängd olika tekniker. Enda molekyl lokalisering mikroskopi (SMLM) såsom PALM och STORM 6,7 har förmågan att lösa placeringen av molekyler upp till en precision av omkring 20 nm, men dessa tekniker är beroende av långa hämtningstider, att bygga upp en bild över många ramar . Generellt kräver detta prov för att fastställas eller strukturer för att uppvisa låg rörlighet så enkla fluoroforer inte misstolkas som flera punkter. Medan stimulerad utarmning emission (STED) imaging tillåter super-upplösning genom mycket selektiv konfokal excitation 8, skanning krävstillvägagångssätt kan vara långsam under hela cell synfält. STED visar också betydande fototoxicitet för högre upplösningar på grund av den ökade makt utarmning trålen.
Strukturerad belysning mikroskopi (SIM 9) är ett alternativ till dessa metoder, som kan fördubbla upplösningen av en standardfluorescensmikroskop och är mer förenlig med levande cell imaging än nuvarande SMLM tekniker. Den använder lägre lasereffekter, i ett system brett fält för hela celler synfält; ger ökad förvärvs hastigheter, och är kompatibel med standard fluoroforen märkning. Den brett fält natur SIM medger också användningen av total intern reflektion fluorescens (TIRF) för mycket selektiva excitering, med inträngningsdjup i den axiella dimensionen av <100 nm.
Bildkorrelationsspektroskopi (ICS) är en metod för att korrelera variationer i fluorescensintensitet. En utveckling av ICS; Spatiotemporala imålder korrelationsspektroskopi (STICS 10) korrelerar intracellulära fluorescerande signaler i tid och rum. Genom att korrelera pixelintensiteter med omgivande pixlar i eftersläpande bilder via en korrelationsfunktion, är information de fått om flödeshastigheter och rikt. För att säkerställa statiska objekt inte stör den STICS analysen en orörlig objektfilter implementerat, som fungerar genom att subtrahera ett rörligt medelvärde av intensitetpixel.
Tekniken presenteras här tros vara den första demonstrationen av bildkorrelationsspektroskopi appliceras på super upplösning mikroskopi data för att kvantifiera den molekylära flödet i levande celler 11. Denna metod förbättrar diffraktionsbegränsade avbildning av F-aktin flöde via STICS analys 12 och skulle passa forskare som vill bestämma tvådimensionell molekylär flöde i levande celler, från data som förvärvats på rumsliga upplösningar bortom diffraktionsgränsen av ljus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs! Stegen 1 och 2 sker före dagen för bildbehandling; Se till att alla medier och tillägg som ska användas före eller samma dag som avbildning ekvilibreras. Ekvilibrering uppnås genom uppvärmning av media och kompletterar till 37 ° C i en inkubator inställd på 5% CO2. Alla cellodlingsarbete och täck plätering steg äger rum i sterila förhållanden under ett laminärt flöde huva.
1. Cell Transfektion
- Transfektera T-cellerna som skall avbildas 24 h före experimentet med en plasmid som kodar ett fluorescerande fusionskonstruktion för F-aktin GFP märkning och avbildning. Obs: Celler bör delas 24 timmar före transfektion (48 timmar före avbildning) för att säkerställa celler vid optimal hälsa och deras logaritmisk tillväxtfas.
- Placera 5 ml RPMI tillägg (RPMI 1640 plus 10% FBS och 1% Pen-Strep (tillval)) i en enda brunn i en 6-brunnar i inkubatorn till jämvikt.
- Pellets 2 x 10 7 T-celler kultras till 37 ° C 5% CO2 i RPMI tillägg använder ett centrifugrör vid 327 xg under 5 minuter och tvätta i en lika stor volym av förvärmda elektroporation medier. Obs: Elektroporation medium är en minskad serummedium innehållande buffertar och kosttillskott (se förbrukningsartiklar).
- Efter förnyad pellete vid 327 xg under 5 minuter, resuspendera cellerna i 500 ^ il elektroporer medier och tillsätt långsamt till en kyvett, tillsätt 5 | ig av plasmiden i PCR-kvalitet dH 2 O för märkning F-aktin.
- Knacka försiktigt kyvetten på motorhuven arbetsytan för att säkerställa avlägsnande av eventuella luftbubblor i media, vilket kan orsaka gnistbildning av el och att distribuera cellerna jämnt inom media.
- Slå på elektroapparaten och ställ in spänningen till 300 V och kapacitans till 290 Ω. Electroporate prov med hjälp av en exponentiellt avtagande under 20 ms. Obs: Optimering kan krävas för olika celler och olika plasmidkonstruktioner.
- När transfektionsprotokoll ärkompletta, lagra cellerna på is under 1 min innan du fortsätter.
- Överför försiktigt cellerna från kyvetten till 6-brunnar innehåller 5 ml ekvilibrerad RPMI tillägg från steg 1.1.1.
- Inkubera cellerna O / N vid 37 ° C + 5% CO2.
2. Coat Täck och Pre-varm Imaging Supplement
- Coat täckglas med antikroppar för att inducera T-cellstimulering.
- Coat varje kammare av en 8-brunnars täckglas med en ^ g / ml aCD3 och αCD28 i 200 pl PBS.
- Förvaras vid 4 ° CO / N. Alternativt coat täck 2 h före avbildning och hålla i en inkubator vid 37 ° C för att minska avdrift under avbildningsprocessen genom att minimera temperaturförändringar till täckglas.
- Skapa en täck prov med 0,1 pm sub-diffraktion fluorescerande mikrosfärer.
- Virvelförrådslösning av pärlor för att undvika klumpar.
- På en ny, ren täck av the samma typ som de som användes i steg 2.1.1, pipett 5 pl fluorescerande mikrosfärstamlösning på ytan (enligt tillverkarens anvisningar).
- Sprid mikrosfärlösning över täck med pipettspetsen.
- Låt torka, sedan tillämpa 200 pl monteringsmedel såsom PBS.
Obs: monteringsmediet ska matcha det som används för avbildning cellprov.
- Jämvikt HBSS (+ 20 mM HEPES, nedan kallad "HBSS tillägg") i ett centrifugrör genom att placera i en inkubator i förväg varm O / N vid 37 ° C + 5% CO2.
Obs: tillsatsen av HEPES är att buffert CO2, om du använder en inkubationskammare med CO2 ingång hoppa över detta tillskott.
3. Mikroskop Set-up
- Slå på scenen-top inkubator av TIRF-SIM-mikroskop och rum tillräckligt destillerat vatten i reservoaren hos mikroskopet för att helt täcka basen av värmeelementet. Låt vattnet equilibrate till 37 ° C. Lägg värme kragen till objektivlinsen, också inställd på 37 ° C.
Obs: På grund av känsligheten hos set-up, är dessa steg gjort kvällen innan så de optiska komponenterna är på en stabil temperatur före avbildning. - Placera TIRF 488 kompatibla rivning block i ljusstrålen av mikroskopet och säkra på plats.
- Byter kanal läge och fiberkabeln till "Single" position på laser sängen och mikroskop scenen respektive att engagera rätt optiska banan för TIRF-SIM-läge. Obs: Hoppa över detta steg kommer att leda till ett fel (Figur 1A) inom fönstret programvara.
- Slå på alla mikroskop och datorkomponenter och öppna förvärvet styrprogram.
- Öppna OC panelen, Ti Pad, N-SIM Pad och ND Acquisition fönster (Figur 1B). I "OC Panel" välj alternativet "TIRF 488 (Figur 2B, gul pil). I N-SIM Pad fönstret väljer "TIRF-SIM" och "rörliga" inställningar (Figur 2C, gula pilar). Välj knappen Inställningar (Figur 1C, gul ruta) och välj "TIRF 488 (för 100x TIRF 488nm) i rullgardinsmenyn, tryck" Apply "och" OK ".
- Ställ in kamerainställningarna inom "DU897 Inställningar" till: bildfrekvens 50 msek, röktäthetsläge, EM Gain 3 MHz vid 14-bit, och EM Gain Multiplikator 300 med en konverterings Gain 1 (figur 1C, grön box).
OBS: Se Representativa resultat för bildhastighet överväganden. - Kalibrera mikroskopets belysning för TIRF-SIM genom att välja 100x 1,49 NA CFI Apochromat TIRF mål, om "N-SIM Pad" vrid 488 nm lasereffekten till 10%.
Obs: Pixel storlek råbilder är 60 nm, med en 512 x 512 pixel synfält. - Rengör objektivet med objektivets vävnad för att avlägsna damm och olja.
- Börja med målet i lägsta möjliga z-planet. Placera en droppe lins olja på målet och lägga till fluorescerande mikrosfärprovet från steg 2,2 till mikroskop scenen.
- Välj den perfekt fokus System (PFS) funktion belägen på kroppen av mikroskopet.
- Flytta långsamt mål upp genom z-planet tills PFS knappen slutar blinka för att bekräfta fokalplanet har nåtts.
- Växla till "Live" syn på styrmjukvaran och bildmikrosfärerna för slutliga justeringar som gjorts med hjälp av PFS mikro-manipulator hjulet.
- Observera enhetlig belysning utan fluorescensemission över 75 nm försvinnande våg out-of-fokus.
Obs: Bekräfta strukturerad belysning uppfylls genom att observera en fluktuerande belysningsmönster från fluorescerande mikrosfärprovet. - Mät fluorescerande mikrosfärprovet och kvantifiera den förbättrade avbildnings resolutjon genom att observera halvvärdesbredd (FWHM) av intensitetsprofilen.
- Öppna Analysera programvara (v4.20.01), med NIS-A N-SIM analys modul installerad och välj "Program" -> "Show N-SIM fönster".
- Med belysningsmodule kontrast (IMC) och hög upplösning brusreducering (HRNS) satt till 1 för TIRF-SIM-dataset (Figur 2), rekonstruera mikrosfärprovet bilden för att generera en rekonstruerad bild av 1024 x 1024 pixlar med en pixelstorlek på 30 nm.
- Använda linjeprofilen verktyg med en bredd av 1 pixel (Figur 3A, gul ruta), dra en linje genom centrum av en enda mikrosfär.
- Välj FWHM knappen (Figur 3B, gul ruta) och klicka på intensitetsmaxima av Gauss-fördelning, följt av dess intensitet minima.
- Bekräfta FWHM av mikrosfären är i området av 100 nm (fig 3C). Obs: upplösningen achieved vid avbildning av biologiska prover kommer att variera beroende på signalbrusförhållandet från märkning effektivitet och bakgrundsfluorescens.
4. Provberedning för Imaging
- Täckglas beredning.
- Hämta aCD belagda täck från steg 2,1 från kylskåp eller inkubatorn och ta bort PBS innehållande aCD3 och αCD28 från varje brunn.
- Tillsätt 200 pl av förvärmda HBSS tillägg från steg 2,3 till varje brunn i täck. Tvätta och ta bort för att säkerställa minimal aCD3 och αCD28 lämnas i lösning. Lägg till ytterligare 200 pl av HBSS tillägg till täck brunnarna.
- Rengöra undersidan av täckglas med linsvävnaden för att avlägsna olja och partiklar.
- Position täck på mikroskop scenen och hitta TIRF fokalplan täck med hjälp av PFS z-plan som finns i steg 3.4.
- Cellberedningen.
- Pipett 200 ul av media conlande transfekterade celler från steg 1.1.8 i en mikro-centrifugrör.
- Pellets celler i en mikro-centrifug vid 268 xg under 20 sekunder och ta bort cellmedia.
- Resuspendera cellerna i 200 ul förvärmda HBSS tillägg från steg 2.3.
5. Bild Celler
- Ta cellinnehållande HBSS tillägg till mikroskopet och försiktigt pipettera 200 ^ i en av brunnarna.
- Medan kvar i TIRF fokalplanet vid täck (i PFS-läge), använd mikroskop okularet och epifluorescence belysning för att spåra fluorescerande celler närmar sig täck.
- När cellerna landar på täck, byta till "Live" -läge i N-SIM Pad för att få bilden upp på skärmen och kontrollera cellerna är i fokus på datorskärmen.
- För att spela in tids kurser öppnar ND Acquisition fönstret och välj fliken "Tid", klicka på "Lägg till" och ange "Interval" till Ingen fördröjning, "Duration"10 min, "loopar" är satt till 1.
Obs: Duration kan ändras beroende på processen av intresse; den STICS programvara kan extrahera kvantitativa resultat med bild högar av ≈10 ramar när fångas med "Ingen fördröjning". - Med identiska förvärvs inställningar till pärlan provet börja spela in data genom att välja "Kör nu" i ND Acquisition fönstret.
6. rekonstruera SIM Images
- Efter bildbehandling är klar öppnar Analyze programvara (v4.20.01), med NIS-A N-SIM analys modul installerad och välj "Program" -> "Show N-SIM fönster".
- Med belysningsmodule kontrast (IMC) och hög upplösning brusreducering (HRNS) satt till 1 för TIRF-SIM-dataset (Figur 2), rekonstruera ett (eller flera med hjälp av Batch verktyget) rå SIM-fil för att producera en rekonstruerad SIM bild.
- Bekräfta rekonstruerade filen har en pixelstorlek på 30 nm, som anges istatusfältet image.
Obs: Pixel storlek påverkar inte STICS analys, men det bör vara minst 2x mindre dimension än PSF rumsliga upplösningen för att säkerställa spatial korrelation mellan pixlar. - Exportera data som TIFF filer, redo för STICS analys.
7. STICS Analys
- Ladda ner och extrahera STIC (C) S Matlab programvarupaket (Wiseman lab, tillgängliga som kompletterande information). Skriptet stics_vectormapping.m är kärnan i en enda kanal STICS analys och de första 30 rader kod används för att definiera inparametrarna enligt definitionen i avsnitt 2.1 i manualen. Öppna detta script och definiera ingångsparametrar för TIRF-SIM dataanalys. Det föreslås att också lägga till STIC (C) S mapp med undermappar till den lokala maskinen Matlab väg, som beskrivs i tillägget till handboken.
- Definiera inparametrarna för dataanalys genom att redigera motsvarande rader koden
- För att utföra analys av TIRF-SIM-data för att generera en vektor karta, ställ in tids parametrar till tids delregion i linje 31 till det maximala antalet ramar och tidsskifte i linje 32 till 1. För att få en tidsserie av vektorkartor varierar dessa parametrar .
- För Immobile bort filtret, ställ in parametern "filtrering" (linje 23) till "Moving genomsnittliga" och ställ in "MoveAverage" parameter (line 24) till 21.
Obs: Denna inställning har visat sig fungera för långsammare och stora fluorescenssignaler, eftersom den bygger på att subtrahera serie ramar från ramen som analyseras. - Byt linjer 33-38 för att ange namnet på de utgående filer och titlarna på utgångsvektorkartor, liksom vägen albumkatalogen och definiera i vilket format vektorkartbilder ska sparas.
| Pixelstorlek (^ m) | 0,03 | im | Linje 19 |
| Bildfrekvens (s) | 1 sek | Linje 20 |
| Maximal fördröjning (frames) | 20 ramar | Linje 21 |
| Delregion storlek (bildpunkter) | 8 pixlar | Linje 29 |
| Delregionen avstånd (pixlar) | En bildpunkt | Linje 30 |
- Öppna skript run1ChannelSTICS i Matlab redigeringsfönstret. Ladda bildserie genom att köra linjerna 1-23 av det här skriptet.
Obs: Detta skript kan användas för att ladda och pre-process bildserie, rita vektorkartor och hastighets histogram och kör en batch-bearbetning för många filer. Om det behövs, beskära bilden till ett område av intresse genom att använda linjen 24-26 i det här skriptet.- Kör linjerna 29-35 av run1ChannelSTICS att starta STICS analys. När du uppmanas att välja en polygon för att ange en specifik region av intresse (ROI), om så önskas. Se till att ROI inte överlappar med cellkanten, som gräns artefakter uppstå när STICS analyserar dessa reregioner.
- Kör linjer 38-52 för att visa vektorkartor. För att rita hastigheten storleks histogrammet, kör linjerna 53-72.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikroskop inställningar
Efter att framgångsrikt nå alla steg forskaren kommer ha åstadkommit strukturerad belysning (SIM) avbildning av F-aktin flöde i en T-cell synaps (Video 1), och kvantifieras denna molekylflödet genom spatiotemporala bildkorrelationsspektroskopi (Figur 4 11). Innan inspelning av bilder, se till att prov belysningen är likformig över nio råbilder och strukturerad belysning i form av Moiréfransar observeras på provet (Figur 5), dessa är båda indikatorerna täck är platt på scenen och TIRF- SIM set-up är korrekt inställd.
Det är viktigt att hålla lasereffekten låg (≤10%) för att säkerställa celler förblir så frisk som möjligt under försöket. Om fluorescerande uttryck är låg, även efter optimering av than Elektroporation steg, öka exponeringstiden för varje rå ram ovanför de angivna 50 ms och / eller konvertering Gain inställningarna. Som TIRF-SIM kräver 9 rå ramar, en för var och en av de 9 belysnings riktlinjer krävs per rekonstruerade bilden, vilket ökar exponeringstiden kommer att minska bildfrekvensen. I detta experiment, gör en ms exponering 50 ≈1 rekonstruerade bilder per sekund (även inklusive galler rotation tid), vilket minskar risken för rörelse artefakter ses när snabbare händelser rör sig genom flera belysning maxima i en rå ram.
Beroende på hastigheten av molekylär flöde som studeras, vilket ökar exponeringstiden kan införa rörelseartefakter; forskare bör hålla exponeringstider till det minimum som krävs för en bra signal. Som pixelstorlekar i SIM-bilder är mindre än standardfluorescensbilder, kan molekylära populationer som uppvisar snabbare flödeshastigheter passerar genom regionen innan en efterföljande frame förvärvas. För STICS programvara för att korrelera fluorescenssignalen i denna mindre region snabbare bildhastigheter krävs jämfört med standardfluorescens dataset. Till exempel kan en delregion storlek av 8 x 8 bildpunkter SIM data representerar en 240 x 240 nm området medan en 8 x 8 pixel region från en standardfluorescens dataset representerar en yta på 1,7 m (med en antagen pixelstorlek på 200 nm).
För längre tids kurser (> 3 min) satser av data kan tas med hjälp av "ND förvärv" för att minska laserexponering under synaps bildning (t.ex. avbildning i 10 sekunder varje minut under 10 minuter kommer att exponera cellen till samma kumulativa lasereffekt som bildhantering för <2 min kontinuerligt).
Suboptimala rekonstruktioner från SIM avbildning demonstreras i figur 6, där samma rådata har rekonstruerats med hjälp av olika hög resolutiom bullerdämpande (HRNS) inställningar, är de främre Fouriertransformer (FFT) och full bredd halv maximala profiler av den markerade fibern också visas. Ställa in HRN är en balans mellan ökande återuppbyggnads artefakter på grund av dålig signal-brus och öka upplösningen. En HRN som är för låg (<1) kan leda till korniga bilder med ökade hexagonala SM artefakter, medan alltför hög HRNS inställning (> 1) kan "klipp" och kasta data högupplösta (ses som en reducerad FFT diameter). En upplösning på> 100 nm skulle indikera ett behov av att köra rekonstruktionen med olika inställningar, om resolutionerna fortfarande suboptimal återackvirering data med en optimerad mikroskop inställning kan krävas.
Imaging och kvantifiera molekylära flöde
Till bilden molekylflöde, var tidsseriedata tas av T-celler landar och bildar en synaps på en stimulerande coverslip, kan F-aktin ses att strömma i en retrograd sätt från cellperiferin mot cellens centrum. Som F-aktin blir mindre tätt mot mitten av cell STICS analysen endast utförs vid periferin av synapsen, är denna region också där signalerings microclusters är kända för att härstamma från under långvarig synaps bildning.
Vid förvärv och analys av data med hjälp av STICS är det viktigt att förstå programmet bygger på att korrelera fluorescerande svängningar inom de utvalda underregioner för att bilda en högre och jämnare korrelationsfunktionen (CF). Det absoluta antalet ramar som behövs för att generera en framgångsrik STICS utgången är inte exakt eftersom programvaran förlitar sig mer på att skapa en utsignal genom det totala antalet konstruktiva signalfluktuationer inom dessa delområden. Till exempel om datamängden har 20 mobila, märkta proteiner i varje delregion flyter i samma riktning STICS behöver färre ramar till gengradera en pålitlig utgång, medan en delregion med 5 mobil proteiner resulterar i en svagare korrelationsfunktion och kan kräva fler bildrutor. Det exakta antalet ramar och delregion storlek som används beror på vilken typ av molekylära händelser som avbildas och bör optimeras av användaren.
Använda STICS "Temporal ram gröda" verktyg är det möjligt att analysera delmängder av molekylflöde genom tiden: att låta forskare för att se om flödeshastigheter förändras inom samma cell beroende på olika cellulära villkor eller miljömässiga stimuli såsom före och efter läkemedelsbehandlingar. Den orörliga objekt Filtret är konstruerat för att avlägsna eventuella orörliga fluorescerande populationen innan analysera den mobila fluorescerande befolkningen. Med hjälp av denna metod, bilder som innehåller statisk befolknings procentsatser upp till 90% kan fortfarande vara framgångsrikt analyserat 10. Ställa in orörliga filtret till 21 bildrutor filtrerar bort eventuella fluorescerande populationer som finns kvar statisk för denna tid eller längre, vilket inte kommer att bidra till den dynamiska bakåtsträvande flöde under immunologisk synaps stabilisering.
Figur 1. Mikroskop förvärvs inställningar. (A) Höjdpunkter N-SIM Pad inställningar som används för experimentet och "Fel Fiber 'fel när de enda kanal och Fiber lägena inte är valda. (B) Alla fönster som behövs för att ställa upp, spela in och rekonstruera en strukturerad belysnings bild på SIM-systemet. (C) N-SIM Pad och N-SIM-inställningar pop-ut fönstret (gul ruta) används för att välja Galler Setup efter fysiskt placera 488 nm galler i mikroskopet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Rekonstruktion inställningar för den slutliga bilden. Vid val av "Param" -knappen (gul ruta) väljer TIRF-SIM från rullgardinsmenyn, och initialt ställa in både "Belysning Modulation Contrast" (IMC) och "högupplöst brusreducering (HRNS) till 1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. halvvärdesbredd (FWHM) mätning. Med hjälp av analysprogrammet (A) visar en Gauss kurva från linjeintensitetsverktyg markerat (gul ruta) och dras genom ett rekonstruerat SIM bild av en pärla prov. (
Figur 4. Representativa strukturerad belysningsuppgifter och STICS utgång. En Jurkat T-cell som uttrycker GFP-märkt F-aktin avbildas med TIRF-SIM på en stimulerande täck för immunologisk synaps generation. Fem minuter efter kontakt, var ett tidsförlopp tas och analyseras med hjälp av STICS analysprogrammet. Gula rutor representerar zoomat regioner medan vektorkartor visar bakåtsträvande flödet av F-aktin i synapsen periferi. Vektor färg indikerar hastigheten av molekylflödet i denna delregion är hastighetsdata plottas på ett histogram. På grund av z-selektivitet excitation TIRF-SIM föreskrivs kan provet förloras från fokus om det lossnar eller rör sig bort från täck genom tidsförloppet av experimentet på grund av ruffling eller rörlighet. Detta ses här i det övre högra panelen som en minskning i vektor densitet. Minskningen är ett resultat av STICS tillämpa orörliga filtret till regioner som inte har visat några fluorescerande svängningar för den tid som fastställts av användaren. Detta resultat understryker vikten av att bara välja regioner som innehåller fluorescenssignal för hela tidsserien. stripigt "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Raw SIM bilder. De nio råbilder till vänster visar 9 orienteringarna av rutnätsmönstret som krävs för att producera en TIRF-SIM bild. Cell avbildas är en Jurkat T-cell som uttrycker GFP märkt F-aktin, visar zoomas cell en av de nio råbilder, visar icke-enhetlig belysning med Moiréfransar, särskilt runt cellen periferin. Även den strukturerade belysningen inte syns samspelet mellan belysning och provet skapa områden med varierande belysningsstyrka, efter rekonstruktion detta resulterar i en bild med förbättrad upplösning. Båda skal barer är 5 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 Högupplöst brusreducering (HRNS) inställningar Under optimala inställningar leda till suboptimal bildrekonstruktion.. (A) visar skillnaderna i rekonstruerad data (inställningar som används visas längst ner till vänster på varje bild), där lägre HRNS leder till ökad bakgrundsbruset utanför bladet regionen och högre HRNS kan minska upplösningen och resultera i en förlust av de finare detaljerna. (B) Representerar framåt Fouriertransformen av bilder i (A) där perifer information tyder på högre upplösning data; notera klippta kronblad av trans när HRNS är satt till 5, vilket tyder på minskad bildupplösning. (C) visar hela bredden halvt maximum (FWHM) av aktin fiber (gul ruta i a) vid de olika inställningarna, FWHM mätningar genom programmet gav läsning90 nm, 100 nm och 180 nm för HRNS inställningar 0,1, 1, och 5 respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna teknik gör det möjligt för forskare att bilden och kvantifiera tidigare olösliga detaljer i celler som uttrycker fluorescens. I våra resultat visar vi att F-aktin flöden på ett symmetriskt sätt från cellperiferin mot cellens centrum i T-cellen IS. Dessa resultat överensstämmer med tidigare resultat från 1D linjeprofil kymograph uppgifter 13 och utöka kapaciteten för analys till 2D och super-upplösning uppgifter.
Den presenterade tekniken är en progression från kymograph avbildning som är begränsad till att rita fluorescensintensitetsfluktuationer genom en enda 1D linje över tiden. I jämförelse den nuvarande teknik medger kvantifiering av helcells molekyl flöde med både riktning och hastighet extraherades. Medan speckle avbildning har också visat aktin dynamik 14 inom 2D miljö kan fläcktekniken begränsas av svårigheter med korrekt märkning densiteter och endast visualiserar en subpopulation av aktin.
De viktigaste stegen för att uppnå dessa resultat är att optimera transfektionseffektiviteten av speciella celler som används av forskare och anpassningen av SIM-mikroskop optik och gitter mönster. Att välja rätt storlek på delregion beror på prov egenskaper och är viktigt eftersom en för liten inställning kommer att innebära snabbare rörliga fluorescens förloras av korrelationsanalys, men att välja en alltför stor delregion kommer att innebära potentiell förlust av nyanser i de extra data som samlats in med hjälp av super-upplösning metoder.
Delregion anger antalet pixlar summerade för att skapa en super-pixel för hastighetskartläggningsanalys, ökar detta kan förbättra tillförlitligheten för att spåra snabbare rörliga objekt. Underregionen avståndet är gapet mellan data inom superpixels. När regionen avståndet är lägre än regionen storlek, kommer dessa intilliggande vektorer dela viss information, ökar den här inställningen kan minska riktnings consistency av slut vectormap genereras. Den maximala fördröjningstiden styr tidskorrelationsanalys, där antalet inmatade är det maximala antalet tidsfördröjningar innan analys slutar.
Rekonstruktion av den slutliga bilden kräver belysning module kontrast (IMC) och hög upplösning brusreducering (HRNS) inställningar som ska väljas. Optimala inställningar kan skilja sig från prov till prov. IMC hjälper skilja randiga ljusmönstret på provet, och minskar återuppbyggnads artefakter. HRNS kan minska artefakter från låga uppgifter kontrast med "klippning" hög data upplösning från Fouriertransformen; att upprätthålla maximal kapacitet upplösning och minimera återuppbyggnads artefakter dessa normalt inställd på 1.
Begränsningar av denna teknik är uppbyggd kring 2D karaktären i processen, eftersom STICS programvaran inte kan analysera 3D-data tekniken är begränsad till TIRF-SIM eller 2D-SIM kräver detta därför att provet vara fråtivt platt mot täckglas. En annan teknisk nackdel är att TIRF-SIM kräver 9 rå ramar som ska samlas in innan rekonstruera den slutliga super-upplösning, som sådan med våra inställningar för 50 msek ram förvärv och den tid som SIM-mikroskop för att omorientera gallermönster; frame rates i ≈1 sekund uppnås. Jämfört med andra förvärvs super-upplösning teknik tider och den stora synfält dessa begränsningar är acceptabla för de flesta tillämpningar.
Resultaten som presenteras här är jämförbara med datauppsättningar från standard TIRF avbildning av F-aktin flöde i immunologisk synaps bildning. Den god överensstämmelse mellan avbildningsmodaliteter visar STICS är robust mot eventuella SIM återuppbyggnads artefakter och även att bildupptagnings inställningar som används under SIM är acceptabla för dataanalys. Genom att använda super-upplösning dataset med mindre pixelstorlekar mer data kan extraheras från enskilda celler och dynamik sub-diffraktion cellulära mikrodomäner kan undersökas.
Efter greppa denna teknik varje molekylära flöde kan avbildas och kvantifieras, med utrymme för att icke-invasivt undersöka en mängd frågor om flödet vid plasmamembranet, eller när provtagning med en konfokalmikroskop, var som helst i xy-planet i cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables: | |||
| Jurkat E6.1 cells | APCC | ATTC TIB-152 | |
| RPMI | Life Technologies | 21875-091 | |
| FBS | Sigma | F7524-500ML | |
| Penicillin-Strepromycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-050 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630-056 | |
| #1.5 8-well Labtek coverslips | NUNC, Labtek | 155409 | |
| LifeAct GFP construct | Ibidi | 60101 | |
| OptiMem | Life Technologies | 51985-042 | |
| anti-CD3 | Cambridge Bioscience | 317315 | |
| anti-CD28 | BD Bioscience / Insight Biotechnology | 555725 | |
| PBS | Life Technologies | 20012-019 | |
| Lens oil | |||
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment: | |||
| Gene Pulsar Xcell System | BioRad | 165-2660 | |
| Cuvette (0.4cm) | BioRad | 165-2088 | |
| Centrifuge (5810R) | Eppendorf | 5805 000.327 | |
| Centrifuge (Heraeus) | Biofuge pico | 75003235 | |
| 6 well plate | Corning | 3516 | |
| Stage-top incubator | Tokai Hit | INUH-TIZSH | |
| Nikon N-SIM microscope | Nikon | Contact company | |
| Nikon Analyse software | Nikon | Contact company | |
| Incubator (190D) | LEEC | Contact company |
References
- Monks, C., Freiberg, B., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395, 82-86 (1998).
- Lanzavecchia, A. Antigen-specific interaction between T and B cells. Nature. 314, 537-539 (1985).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
- Delon, J., Bercovici, N., Liblau, R. Imaging antigen recognition by naive CD4+ T cells: compulsory cytoskeletal alterations for the triggering of an intracellular calcium response. European journal of Immunology. 28 (2), 716-729 (1998).
- Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. T Cell Receptor-Proximal Signals Are Sustained in Peripheral Microclusters and Terminated in the Central Supramolecular Activation Cluster. Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature methods. 3, 793-796 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (15), 8206-8210 (2000).
- Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells. Biophysical Journal. 88 (5), 3601-3614 (2005).
- Ashdown, G. W., Cope, A., Wiseman, P. W., Owen, D. M. Molecular Flow Quantified beyond the Diffraction Limit by Spatiotemporal Image Correlation of Structured Illumination Microscopy Data. Biophysical Journal. 107 (9), 21-23 (2014).
- Brown, C. M., et al. Probing the integrin-actin linkage using high-resolution protein velocity mapping. Journal of Cell Science. 19 (24), 5204-5214 (2006).
- Yi, J., Xufeng, S. W., Crites, T., Hammer, J. A. Actin retrograde flow and actomyosin II arc contraction drive receptor cluster dynamics at the immunological synapse in Jurkat T cells. Molecular Biology of the Cell. 23 (5), 834-852 (2012).
- Watanabe, N., Mitchison, T. J. Single-molecule speckle analysis of actin filament turnover in lamellipodia. Science. 8 (5557), 1083-1086 (2002).
