Abstract
Нитчатых актина играет решающую роль в большинстве клеточных процессов, включая моторику и, в иммунных клетках, формирование ключа взаимодействия клетка-клетка, известного как иммунологического синапса. F-актина также предположил, чтобы играть роль в регулировании распределения молекулярных на мембране клеток, включая суб-перепончатая динамики пузырька и белка кластеризации. В то время как стандартные методы световой микроскоп позволяют обобщенные и дифракционной наблюдения должны быть сделаны, многие клеточные и молекулярные события, включая кластеризации и молекулярного потока происходят в популяциях в длину масштабах намного ниже разрешающей способности стандартных световой микроскопии. Комбинируя общую флуоресценцию внутреннего отражения с разрешающей способностью супер метод структурированной подсветки микроскопии, двумерный молекулярная поток F-актина в иммунной синапса Т-клеток был записан. Пространственно-временная корреляция изображений спектроскопия (Stics), то применялась, который генерирует количественному РЕЗУЛЬТАТОВTS в виде гистограмм скорости и векторных карт, представляющих направленность потока и величины. Этот протокол описывает комбинацию изображений и Stics методов супер-разрешением, чтобы генерировать векторы движения на уровне суб-дифракционных подробно. Этот метод был использован для подтверждения, что поток актина симметрично ретроградной и центростремительных всей периферии Т-клеток при образовании синапсов.
Introduction
Цель эксперимента состоит в изображении и характеризуют молекулярный поток filamentous- (F-) актина в живых Т-клеток, за пределом дифракции для установления направления потока и величину во иммунологического синапса (IS) образование. Эта техника будет осуществляться с использованием структурированного освещения микроскопа (SIM) в полного внутреннего отражения флуоресценции (TIRF) режиме, визуализации Jurkat Т-клетки, образующие искусственную синапс на покровные активации, покрытых анти-CD3- и анти-CD28 антител. ИС формы между Т-клетке и ее цели; антигенпрезентирующей клетки (АРС) при Т-клеточный рецептор (TCR) активации 1,2. Как это первый шаг в определении, создает ли адаптивной иммунной системы иммунного ответа на инфекцию, последствия неправильного реагирования на раздражители могут вызвать ряд заболеваний. Важность взаимодействия Т-клеток-APC хорошо документирована, однако, роль (ы) зрелого после первоначального TCR сигнал интернализация еще предстоит в полной мере понять.
Как цитоскелета, как полагают, помочь два процесса, связанных с TCR активации (движения молекул на плазматической мембране и контроля сигнальных молекул, зависящие от актина цитоскелета 3,4), понимание того, как цитоскелет перестраивается во времени и пространстве будет выяснить шаги молекулярной реорганизации в процессе формирования синапсов. Ретроградное поток F-актина, как полагают, загон TCR кластеров к центру иммунологического синапса, это перемещение, как полагают, важны для прекращения и утилизации сигнала; помогая прекрасный баланс активации Т-клеток 5.
В то время как стандартная флуоресцентная микроскопия представляет собой гибкий инструмент, который продолжает оказывать представление о многих биологических событий, включая межклеточных взаимодействий, она ограничена способность системы точно решить несколько флуорофоры проживающих ближе, чем diffrПредел действие (≈200 нм) друг от друга. Как и многие молекулярные события в клетках включать плотные популяции молекул и проявляют динамическую перестройку или в неподвижности или по специфической стимуляции, обычный световой микроскопии не обеспечивает полную картину.
Использование изображений сверхвысокого разрешения позволило исследователям, чтобы обойти дифракционный предел, используя различные методы. Локализация одной молекулы микроскопии (SMLM), такие как ладонь и STORM 6,7 имеет возможность разрешить расположение молекул до точности около 20 нм, однако, эти методы опираются на долгие времена приобретения, создания образа в течение многих кадров , Как правило, это требует образцы, которые фиксированные или структуры, проявляют низкую мобильность так одиночные флуорофоры не неверно истолкованы как нескольких точек. В то время как истощение стимулировали выбросов (STED) изображения позволяет супер-разрешение через очень селективного возбуждения конфокальной 8, требуется сканированияПодход может быть медленным в течение целых клеток, полей зрения. STED также демонстрирует значительный фототоксичность для более высоких разрешениях в связи с увеличением мощности обеднения пучка.
Структурированная подсветка микроскопии (SIM-9) обеспечивает альтернативу этим методам, способных удвоения разрешение стандартного флуоресцентного микроскопа и более совместим с живой клетки визуализации, чем современные методы SMLM. Он использует нижних лазерных полномочия, в системе широкого поля для цельноклеточных полей зрения; обеспечивая повышенную скорость приобретения, и совместим со стандартным флуорофора маркировки. Широкий поля природа SIM также позволяет использование полного внутреннего отражения флуоресценции (TIRF) для высоко селективного возбуждения, с глубины проникновения в осевой размер <100 нм.
Корреляция изображения спектроскопии (ИКС) представляет собой метод корреляции флуктуации интенсивности флуоресценции. Эволюция ICS; Пространственно-временная имвозраст корреляционная спектроскопия (Stics 10) коррелирует внутриклеточные сигналы в люминесцентных времени и пространстве. Соотнося интенсивности пикселов с окружающих пикселей в отстающих кадров с помощью функции корреляции, информация о получила скоростей потока и направленности. Для обеспечения статические объекты не мешают анализу Stics, неподвижный объект фильтр реализован, который работает путем вычитания скользящей средней интенсивностей пикселей.
Методика представлена здесь, как полагают, первой демонстрацией изображения корреляционной спектроскопии применяется к данным микроскопии сверхвысокого разрешения для количественного определения молекулярного потока в живых клетках 11. Этот метод улучшает дифракционной томографии F-актина потока через Stics анализа 12 и подойдет исследователей, которые хотят, чтобы определить двумерную молекулярного потока в живых клетках, из данных, полученных в пространственным разрешением пределами дифракционного предела света.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Этапы 1 и 2 имеют место до дня томографии; убедитесь, что все средства массовой информации и добавки, которые будут использоваться до или в день визуализации уравновешивают. Уравновешивание достигается за счет потепления носителей и добавок до 37 ° С в инкубаторе установлен в 5% СО 2. Все этапы работы клеточной культуры и покровное обшивки состоится в стерильных условиях под капотом ламинарного потока.
1. трансфекции клеток
- Трансфекции Т-клеток, чтобы быть отображены 24 ч до начала эксперимента с плазмидой, кодирующей флуоресцентный слитая конструкция для F-актина маркировки GFP и визуализации. Примечание: Клетки должны быть разделены 24 ч до трансфекции (48 ч до обработки изображений), чтобы обеспечить клетки в здоровье и оптимального их логарифмической фазе роста.
- Поместите по 5 мл RPMI (RPMI дополнение 1640 плюс 10% FBS и 1% Pen-Strep (необязательно)) В одном лунку 6-луночного планшета в инкубатор для уравновешивания.
- Гранул 2 х 10 7 клеток культ Tряться при 37 ° С +5% СО 2 в RPMI дополнение использованием центрифужной пробирке на 327 мкг в течение 5 мин и мыть в равном объеме подогретого электропорации сред. Примечание: Электропорация среда является уменьшается средний сыворотка, содержащая буферы и добавки (см расходные).
- После повторного осаждения при температуре 327 х г в течение 5 мин, ресуспендирования клеток в 500 мкл электропорации сред и медленно добавить в кювету, добавляют 5 мкг плазмиды в ПЦР класса дН 2 O для маркировки F-актина.
- Аккуратно нажмите кювету на капот рабочей обеспечить удаление любых воздушных пузырьков в средствах массовой информации, которые могут вызвать искрение электричества и распределяют клетки равномерно в течение средствах массовой информации.
- Включите электропорации аппарата и установите напряжение до 300 В и емкостью до 290 Ом. Электропорации образец с использованием экспоненциального распада в течение 20 мс. Примечание: Оптимизация может потребоваться для различных клеток и различных плазмидные конструкции.
- После того, как протокол трансфекциикомплектующие, магазин клетки на льду в течение 1 мин, прежде чем продолжить.
- Тщательно передачи клетки из кюветы в 6-луночный планшет, содержащий 5 мл уравновешенной RPMI добавки с шага 1.1.1.
- Инкубируйте клетки O / N на 37 ° C ± 5% CO 2.
2. Пальто Покровные и Pre-теплый изображений Дополнение
- Coat покровные с антителами, чтобы вызвать возбуждение T клеток.
- Пальто каждая камера 8-а покровного с 1 мкг / мл αCD3 и αCD28 в 200 мкл PBS.
- Хранить при 4 ° CO / N. Кроме того, пальто покровные 2 ч до обработки изображений и держать в инкубаторе при 37 ° С, чтобы уменьшить дрейф в процессе визуализации путем минимизации изменения температуры до покровного стекла.
- Создайте тестовый образец с покровное 0,1 мкм суб-дифракционных люминесцентных микросфер.
- Вихрь раствор из бисера, чтобы избежать скопления.
- На новом, чистом покровного из йе же типа, как те, которые используются на этапе 2.1.1, пипетки 5 мкл флуоресцентного микросфер раствора на поверхность (в соответствии с инструкциями завода-изготовителя).
- Распространение микросфер раствор на покровное с кончика пипетки.
- Дайте высохнуть, а затем применить 200 мкл монтажные среды, такой как PBS.
Примечание: монтажная среда должна соответствовать используемому для образцов изображений клеток.
- Равновесие HBSS (+ 20 мМ HEPES, здесь и далее называемый "HBSS добавка ') в центрифужную пробирку путем размещения в инкубаторе предварительно теплой O / N в 37 ° C до + 5% CO 2.
Примечание: добавление HEPES является буфер СО 2, при использовании инкубационный камеру с СО 2 входа пропустить этот добавок.
3. Микроскоп Настройка
- Включите этап-топ инкубатора TIRF-SIM микроскопа и место достаточно дистиллированной воды в водохранилище микроскопом, чтобы полностью покрыть основание нагревательного элемента. Позвольте воде электроннойquilibrate до 37 ° C. Добавить нагревательный воротник объектива, установленного также до 37 ° C.
Примечание: Из-за чувствительности настройки, эти шаги делаются в ночь перед таким образом оптические компоненты находятся на стабильной температурой до визуализации. - Поместите TIRF 488 совместимый блок решетки на пути света микроскоп и закрепите на месте.
- Переключитесь в режим канала и оптического кабеля в положение "Единой" на этапе лазерного микроскопа постель и, соответственно, участвовать правильный путь для оптического режиме TIRF-SIM. Примечание: Пропуск этот шаг приведет к ошибке (рис 1А) в окне программного обеспечения.
- Включите все микроскопов и компьютерных компонентов и откройте программное обеспечение управления приобретением.
- Откройте панель OC, Ti Pad, N-SIM-Pad и Н. Д. Приобретение окна (рис 1B). В «Панели OC" выберите опцию "TIRF 488" (2В, желтая стрелка). В окне N-SIM-Pad, выберите "TIRF-SIM" и "Перемещение" настройки (Рисунок 2C, желтые стрелки). Выберите кнопку настройки (Рисунок 1С, квадрат желтого цвета) и выберите пункт "TIRF 488 (для 100x TIRF 488nm)" из выпадающего меню, нажмите «Применить» и «ОК».
- Установите параметры камеры в "настройки" в DU897: Frame Rate 50 мс, в режиме считывания, Е. М. Усиление 3 МГц в 14-битном, Е. М. Усиление множитель 300 с конверсии усиления 1 (рис 1С, зеленой корзины).
Примечание: см Представитель результаты соображений частоты кадров. - Калибровка освещение микроскопа для TIRF-SIM, выбрав 100x 1,49 Н.А. CFI Apochromat TIRF цели, на 'N-SIM Pad' повернуть мощности лазера 488 нм до 10%.
Примечание: Размер пикселя из исходных изображений 60 нм, с полем 512 х 512 пикселей зрения. - Очистите объектив с помощью объектива ткань для удаления пыли и масла.
- Начните с целью в максимально низкой г-плоскости. Поместите каплю масла на линзы объектива и добавить флуоресцентного образца микросфер с шага 2.2 в стадии микроскопа.
- Выбор функции идеального фокуса системы (PFS), расположенную на корпусе микроскопа.
- Медленно перемещайте цели через г-плоскости, пока кнопка ВБП не перестанет мигать для подтверждения фокальной плоскости была достигнута.
- Переключитесь на "Live" видом на программное обеспечение управления и изображения микросфер для окончательной корректировки, сделанные с помощью PFS-манипулятор микро колесо.
- Соблюдайте равномерное освещение, не из фокуса флуоресценции выше 75 нм исчезающего волны.
Примечание: Убедитесь, структурированный освещение выполнено с соблюдением флуктуирующую образца подсветки от флуоресцентного образца микросфер. - Измерьте флуоресцентный образец микросфер и количественно улучшенную resolut изображенийионная наблюдая полная ширина на половине максимума (FWHM) профиля интенсивности.
- Откройте Analyze программное обеспечение (v4.20.01), с помощью модуля НИС-н-SIM-анализа установлено и выберите "Приложения" -> "Показать Н-SIM окно".
- С отличие освещение модуляции (IMC) и подавления шума с высоким разрешением (HRNS) установлен в 1 для TIRF-SIM наборов данных (рисунок 2), реконструировать изображение образца микросфер для создания реконструированного изображения 1024 х 1,024 пикселей с размером пикселя 30 нм.
- Используя инструмент линии профиля шириной в 1 пиксель (рис 3А, желтый ящик), нарисуйте линию через центр одного микросферы.
- Выберите кнопку FWHM (рис 3B, квадрат желтого цвета) и нажмите на интенсивности максимумов распределения Гаусса, с последующим его интенсивности минимумов.
- Подтверждение полуширина микросферы в диапазоне от 100 нм (рис 3C). Примечание: разрешение ACHieved при визуализации биологических образцов будет варьироваться в зависимости от сигнала к шуму от эффективности мечения и фоновой флуоресценции.
4. Подготовка проб для визуализации
- Покровное подготовка.
- Получить покровное αCD покрытием с шага 2.1 из холодильника или инкубатора и удалить PBS, содержащий αCD3 и αCD28 из каждой лунки.
- Добавить 200 мкл подогретого HBSS дополнения, начиная с шага 2.3 в каждую лунку покровного стекла. Вымойте и удалить, чтобы обеспечить минимальное αCD3 и αCD28 осталось в растворе. Добавить еще 200 мкл HBSS дополнение к покровное скважин.
- Очистите нижнюю часть покровного с объективом ткани для удаления нефти и твердых частиц.
- Положение покровное на столик микроскопа и найти фокальной плоскости TIRF покровного стекла с помощью PFS плоскость г, как найден на этапе 3.4.
- Подготовка сотовый.
- Внесите 200 мкл СМИ Conсодержащие трансфекции клеток с шага 1.1.8 в микро-центрифуги трубы.
- Гранул клетки в микро-центрифуге при 268 мкг в течение 20 сек и удаления клеточных сред.
- Ресуспендируют клеток в 200 мкл подогретого HBSS дополнение с шага 2.3.
5. Клетки визуализации
- Возьмем клеток HBSS, содержащего добавку к микроскопу и осторожно пипеткой 200 мкл в одну из лунок.
- Оставаясь в фокальной плоскости TIRF на покровное (в режиме PFS), используйте окуляр микроскопов и эпифлуоресцентной освещение для отслеживания флуоресцентные клетки, приближающиеся покровное.
- После того, как клетки приземлиться на покровное, переключитесь на "Live" режиме в N-SIM Pad довести изображение на мониторе и проверить клетки находятся в фокусе на экране компьютера.
- Для записи тайм-курсы, откройте окно Н.Д. приобретения и выберите вкладку "Время", нажмите кнопку "Добавить" и установите "Интервал", чтобы без задержки, "Продолжительность"до 10 мин, 'Петли' установлен в 1.
Примечание: Длительность можно изменить в зависимости от процесса интерес; программное обеспечение Stics можно извлечь количественные результаты с изображения штабеля ≈ 10 кадров при захватили с 'без задержки ". - С одинаковыми настройками сбора к образцу борта, начать запись данных, выбрав "Выполнить сейчас" в окне Н.Д. приобретения.
6. Реконструкция SIM Изображения
- После завершения визуализации, откройте Analyze программное обеспечение (v4.20.01), с помощью модуля НИС-н-SIM-анализа установлено и выберите "Приложения" -> "Показать Н-SIM окно".
- С отличие освещение модуляции (IMC) и подавления шума с высоким разрешением (HRNS) установлен в 1 для TIRF-SIM наборов данных (рис 2), реконструировать один (или несколько с помощью Batch Tool) сырой SIM-файла, чтобы произвести реконструированное изображение SIM.
- Подтвердите реконструированный файл имеет размер пикселя 30 нм, указанный вСтрока состояния изображения.
Примечание: Размер пикселя не влияет анализ Stics но она должна быть по крайней мере, 2x меньше размера, чем ФСФ пространственным разрешением, чтобы обеспечить пространственную корреляцию между пикселями. - Экспорт данных в файлы .tiff, готовых для анализа Stics.
7. Анализ Stics
- Скачать и извлечь STIC (C) S программный пакет Matlab (Wiseman лабораторию и доступен в качестве дополнительной информации). Сценарий stics_vectormapping.m является ядром одного анализа каналов Stics и первые 30 строк кода используется для определения входных параметров, как определено в разделе 2.1 данного руководства. Откройте этот сценарий и определить входные параметры для анализа данных TIRF-SIM. Он предложил также добавить STIC (С) S папку с вложенных папок в локальной машины Matlab пути, как описано в приложении к руководству.
- Определить входные параметры для анализа данных по редактирования соответствующие строки кода
- Для выполнения анализис данных TIRF-SIM для создания 1 векторную карту, установить временные параметры на временную субрегиона в строке 31 до максимального числа кадров и временного сдвига в соответствии с 32 1. Для получения временной ряд векторных карт различаются эти параметры ,
- Для неподвижных фильтр удаления, установите параметр "фильтрации" (линия 23) на "Скользящее среднее" и установите параметр 'MoveAverage »(строка 24) до 21.
Примечание: Этот параметр, как было показано, чтобы работать на более медленном перемещении и больших сигналов флуоресценции, так как она основана на вычитании серийные кадры из кадра анализируются. - Изменить линии 33-38, чтобы установить имя выходных файлов и названий выходных векторных карт, а также путь к каталогу вывода и определить, в каком формате векторной карте изображения должны быть сохранены.
| Размер пикселя (мкм) | 0.03 мкм | Строка 19 |
| Частота кадров (сек) | 1 сек | Строка 20 |
| Максимальное время задержки (кадры) | 20 кадров | Линия 21 |
| Размер субрегиона (пикселей) | 8 пикселей | Линия 29 |
| Расстояние субрегиона (пикселей) | 1 пиксель | Строка 30 |
- Откройте сценарий run1ChannelSTICS в окне Matlab редактора. Загрузите изображения с помощью серии Запуск линии 1-23 этого сценария.
Примечание: Этот сценарий может быть использован для загрузки и предварительная обработка серии изображений, построить векторные карты и скорость гистограммы и запустить пакетную обработку для многих файлов. При необходимости, обрезать изображения в интересующей области с помощью линии 24-26 этого сценария.- Запуск линии 29-35 из run1ChannelSTICS начать анализ Stics. При появлении запроса выберите полигон, чтобы указать конкретную область процентной (ROI), если это необходимо. Убедитесь, что рентабельность не совпадать с краю ячейки, а происходят граничные артефакты, когда Stics анализирует эти ререгионов.
- Запуск линии 38-52, чтобы отобразить вектор карты. Для построения гистограммы скорость величину, запустите линии 53-72.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Настройки Микроскоп
После успешного достижения все шаги исследователь добились структурированы освещение (SIM) визуализации F-актина потока в ячейке синапса T (Видео 1), и количественно этот молекулярного потока по пространственно-временной корреляции изображений спектроскопии (рис 4 11). Перед началом записи изображения, убедитесь, что освещение образца равномерным по всей девяти необработанных изображений и структурированы освещение в виде муаровый наблюдаются на образце (рис 5), эти оба показателя покровное является плоской на сцене и TIRF- SIM-настройки правильно выровнен.
Это важно, чтобы мощность лазера низкой (≤10%), чтобы обеспечить клетки остаются здоровыми, как возможно в течение эксперимента. Если флуоресцентные выражение низкий, даже после оптимизации Tон электропорации шаги, увеличить время экспозиции каждого кадра сырья выше указанных 50 мсек и / или параметры преобразования коэффициентом усиления. Как TIRF-SIM требует 9 сырые кадры, 1 для каждого из 9 освещения ориентаций, необходимых в восстановленном изображении, увеличивая время экспозиции будет уменьшить частоту кадров. В этом эксперименте 50 мс экспозиции позволяет ≈1 реконструированного кадра в секунду (в том числе сетки времени вращения), что снижает риск артефактов движения видно, когда быстрые события перемещения по множественным освещения максимумов в одном кадре сырого.
В зависимости от скорости молекулярного потока изучается, увеличивая время экспозиции может представить артефакты движения; Исследователи должны держать время экспозиции до минимума, необходимого для хорошего сигнала. Как размеры пикселов в SIM изображений меньше, чем у стандартных флуоресцентных изображений, молекулярные населения, проявляющие высокую скорость потока может проходить через субрегионе перед последующей фрAme приобретается. Для программного обеспечения Stics соотнести сигнал флуоресценции в течение этого меньшего регионе быстрыми темпами изображения требуется по сравнению со стандартными флуоресценции данных. Например, размер субрегион 8 х 8 пикселей данных SIM представляет собой 240 х 240 нм, а площадь 8 х 8 пикселей субрегион от стандартного набора данных флуоресценции представляет собой область 1,7 мкм (с вымышленным размером пикселя 200 нм).
Для более продолжительных временных курсов (> 3 мин) партии данных может быть сделан с использованием "приобретение ND», чтобы уменьшить лазерного воздействия в процессе формирования синапсов (например, изображения в течение 10 сек каждый мин в течение 10 мин выставит ячейку же совокупном мощности лазера а для визуализации <2 мин непрерывно).
Неоптимальной реконструкции изображений из SIM продемонстрированы на фигуре 6, где тот же исходные данные был реконструирован с использованием различных высокой resolutiна шумоподавления (HRNS) настройки, форвардные преобразования Фурье (БПФ) и полная ширина полтора максимум профили выделенного волокна также показано на рисунке. Установка грн баланс между ростом артефактов реконструкции из-за плохой сигнал-шум и повышения разрешающей. HRN, что слишком низкая (<1), может привести к зернистость изображений с увеличенными шестиугольными артефактов С.М., в то время как слишком высокая настройка HRNS (> 1) может "клип" и отказаться от данных с высоким разрешением (видел как уменьшенного диаметра БПФ). Решение> 100 нм, указывают на то необходимость перезапустить реконструкцию с различными настройками, если резолюции по-прежнему неоптимальной вновь обретает данные с оптимизированной установки микроскопа могут быть необходимы.
Изображений и количественной оценки молекулярного потока
Для изображения молекулярного потока, данные временных рядов было принято Т-клеток посадки и формирования синапса на стимуляции coversliP, F-актина можно увидеть течь ретроградным способом из клеточного периферии к центру клетки. В F-актина становится менее плотным по направлению к центру анализа клеточных Stics проводилась только на периферии синапсе, эта область также, где сигнальные микрокластеры, как известно, происходит из во время формирования синапса длительного.
При сбора и анализа данных с использованием Stics важно понять, программа использует корреляцию флуктуации флуоресцентные пределах выбранного подобластей, чтобы сформировать более гладкой и корреляционную функцию (CF). Абсолютное количество кадров, необходимых для генерации успешный выход Stics не является точным, как программное обеспечение большей степени полагается на создание вывод через общего количества конструктивных колебаний сигнала в тех подобластей. Например, если набор данных имеет 20 мобильных, меченых белков в каждом субрегионе, протекающей в тех же Stics направлении будет нужно меньше кадров в генеОцените надежный выход, в то время как субрегион с 5 мобильных белков приводит к слабой корреляционной функции и может потребовать больше кадров. Точное количество кадров и размера подобласти, используемых зависит от природы молекулярных событий которая отображается, и должен быть оптимизирован пользователем.
Использование 'Временной кадр урожай »Инструмент Stics можно проанализировать подмножества молекулярного потока во времени: позволяет исследователям увидеть, если скорость потока меняется в рамках одного ячейки в зависимости от различных клеточных условиях окружающей среды или стимулы, такие как до, так и после медикаментозного лечения. Неподвижный фильтр объект предназначен для удаления неподвижный флуоресцентный населения до анализа мобильного флуоресцентный населения. Используя этот подход, изображения, содержащие статические проценты населения до 90%, может быть успешно проанализированы 10. Установка неподвижный фильтр 21 кадров отфильтровывает все люминесцентные населения, которые остаются статическая за этот период времени или больше, которые не будут способствовать динамичному ретроградного кровотока во время иммунологической стабилизации синапсов.
Рисунок 1. Микроскоп настройки приобретения. (А) Основные параметры N-SIM-Pad, используемые для эксперимента и ошибки "неправильный" Fiber когда Одноканальные и волоконной режимы не выбран. (B), Все окна, необходимые для настройки, записи и реконструировать структурированный освещения изображение на системы SIM-карты. (С) N-SIM-Pad и настройки N-SIM-поп из окна (желтый ящик) используется для выбора решетки Setup после физически размещения 488 нм решетки в микроскоп. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Настройки восстановления для конечного изображения. После выбора кнопки "Парам '(желтого цвета), выберите TIRF-SIM из выпадающего меню, и изначально устанавливается как" Освещение модуляции Контраст "(ИМК) и« Высокое разрешение Подавление шума '(HRNS) 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Полная ширина на половине высоты (FWHM) измерения. Использование программного обеспечения для анализа (A) показывает Gaussian участок от инструмента интенсивности линии выбранного (желтого цвета) и протягивается через реконструированном SIM изображения образца шва. (
Рисунок 4. Типичные структурированные данные и освещение Stics выход. Jurkat Т-клеток выразить GFP меченных F-актин визуализируют с помощью TIRF-SIM на стимуляции покровного для иммунологического синапса поколения. Через пять минут после контакта, время курс был взят и анализировали с помощью программы анализа Stics. Желтые коробки представляют увеличенной области, а векторные карты демонстрируют ретроградной поток F-актина в синапсах периферии. Вектор цвета указывают скорость молекулярного потока в этой подобласти, данные скорости, нанесенные на гистограмме. В связи с г-селективности возбуждения TIRF-SIM предоставляет образец могут быть потеряны из фокуса, если она отделяется или перемещается от покровного через время ходе эксперимента из-за, чтобы трепал или подвижность. Это видно здесь, в верхней правой панели, как снижение в векторном плотности. Снижение является результатом применения Stics неподвижный фильтр субрегионов, которые не показали люминесцентные колебания за период времени, установленный пользователем. Этот результат подчеркивает важность отбора только регионах, которые содержат сигнал флуоресценции для всего временного ряда. худой "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5. Сырье SIM изображения. Девять изображений RAW слева показать 9 ориентаций сетке, необходимого для производства TIRF-SIM изображение. Сотовый отображены является клетка Jurkat Т выражая GFP помечены F-актин, увеличено ячейка показывает один из девяти необработанных изображений, демонстрируя не-равномерное освещение с муаровый, особенно вокруг периферии клетки. Хотя структурированная подсветка не видна взаимодействия между освещения и образцом создания областей различной силы освещения, после реконструкции это приводит в изображении с улучшенным разрешением. Оба масштабные линейки 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6 подавления шума Высокое разрешение (HRNS) Настройки Суб-оптимальные настройки приведет к югу от оптимального восстановления изображения.. (А) показывает разницу в реконструированных данных (параметры, используемые показан на левой нижней части каждого изображения), где нижняя HRNS приводит к увеличению фонового шума за пределами лепесток области и высших HRNS может уменьшить разрешение и привести к потере мелкие детали. (Б) Представляет преобразование Фурье вперед изображений в (А), где периферическая информация указывает данных высокого разрешения; обратите внимание на подрезанные лепестки преобразования при HRNS установлен в 5, показывая снижение разрешение изображения. (С) демонстрирует полную ширину половину максимума (FWHM) актинового волокна (желтый ящик в) в различных условиях, измерения FWHM с помощью программного обеспечения дал чтение90 нм, 100 нм и 180 нм для HRNS настройки 0,1, 1 и 5 соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот метод позволит исследователям изображения и количественно ранее неразрешимые детали в клетках, экспрессирующих флуоресценции. В наших результатов мы показываем, что F-актин потоков в симметричной моды из клеточной периферии к центру клетки в клетки Т. Эти данные согласуются с предыдущими результатами 1D линии данных профиля кимографе 13 и расширить возможности анализа данных 2D и супер-разрешением.
Представленная методика является переход от кимографа изображений, которая ограничивается заговоре колебания интенсивности флуоресценции с помощью одного 1D линии в течение долгого времени. По сравнению текущий метод позволяет количественно оценить весь молекулярный поток клеток с обеих направленности и скорости извлечены. В то время как изображения спекл также показали, актиновые динамику 14 в среде 2D, метод спекл может быть ограничено трудности с правильными плотности маркировки и только визуализирует субпопуляции актина,
Наиболее важные шаги для достижения этих результатов для оптимизации эффективности трансфекции конкретных клеток используется исследователем и выравнивания оптики микроскопа SIM и решетки шаблон. Выбор правильного размера субрегиона зависит от характеристик выборки, и очень важно, поскольку слишком мал установка будет означать, быстрая скользящая флуоресценции теряется корреляционного анализа, но выбор слишком большой субрегион будет означать потенциальную потерю нюансов в дополнительных данных, полученных с помощью методы супер-разрешения.
Субрегион обозначает количество пикселей суммируются, чтобы создать супер-пиксель для анализа отображения скорости, увеличивая это может повысить надежность для отслеживания движущихся объектов быстрее. Расстояние субрегион является разрыв между данными в superpixels. Когда расстояние между субрегион ниже, чем размер субрегиона, эти смежные векторы поделиться некоторой информацией, повышение этого параметра может снизить направленного противistency окончательного vectormap генерируется. Максимальное время задержки управляет временной корреляционный анализ, где число вводится максимальное количество времени, прежде чем отстает концах анализа.
Реконструкция конечного изображения требует контраст освещения модуляции (IMC) и подавление шума высокого разрешения (HRNS) параметры должны быть выбраны. Оптимальные настройки могут отличаться от образца к образцу. IMC помогает отличить полосатый рисунок освещения на образце, и уменьшает артефакты реконструкции. HRNS может уменьшить артефакты от низких данных контрастных по "отсечения" данные с высоким разрешением из преобразования Фурье; сохранить максимальные возможности разрешения и свести к минимуму артефакты реконструкции обычно устанавливается на 1.
Ограничения этого метода основаны вокруг 2D характера процесса, так как программное обеспечение не может Stics проанализировать данные 3D методика ограничена TIRF-SIM или 2D-SIM, это, следовательно, требует образца быть RELATраторов квартира против покровного стекла. Еще один технический недостаток в том, что TIRF-SIM требует 9 сырые кадры должны быть собраны, прежде чем реконструировать заключительный супер-разрешение изображения, как такового с нашими настройками 50 мс приобретений кадров и время, затраченное микроскопом SIM переориентировать сетке; кадр ставки ≈ 1 сек достигается. По сравнению с другими временами приобретения техники супер-разрешением и большим полем зрения эти ограничения являются приемлемыми для большинства приложений.
Результаты, представленные здесь, являются сопоставимыми с наборами данных из стандартного TIRF визуализации F-актина потока в формировании иммунологической синапсов. Хорошее согласие между методами визуализации демонстрирует Stics устойчива к потенциальным артефактов реконструкции, а также SIM-что параметры захвата изображений, используемые в ходе SIM являются приемлемыми для анализа данных. При использовании наборов данных супер-разрешения с меньшим размерам элементов больше данных могут быть извлечены из отдельных клеток и динамики сUB-дифракционные сотовой микро-домены могут быть исследованы.
После захвата эту технику любой молекулярный поток могут быть отображены и количественно, с размаху на неинвазивным исследовать множество вопросов, касающихся поток на мембране, или при отборе проб с конфокальной микроскопии, в любой точке плоскости ху клетки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables: | |||
| Jurkat E6.1 cells | APCC | ATTC TIB-152 | |
| RPMI | Life Technologies | 21875-091 | |
| FBS | Sigma | F7524-500ML | |
| Penicillin-Strepromycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-050 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630-056 | |
| #1.5 8-well Labtek coverslips | NUNC, Labtek | 155409 | |
| LifeAct GFP construct | Ibidi | 60101 | |
| OptiMem | Life Technologies | 51985-042 | |
| anti-CD3 | Cambridge Bioscience | 317315 | |
| anti-CD28 | BD Bioscience / Insight Biotechnology | 555725 | |
| PBS | Life Technologies | 20012-019 | |
| Lens oil | |||
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment: | |||
| Gene Pulsar Xcell System | BioRad | 165-2660 | |
| Cuvette (0.4cm) | BioRad | 165-2088 | |
| Centrifuge (5810R) | Eppendorf | 5805 000.327 | |
| Centrifuge (Heraeus) | Biofuge pico | 75003235 | |
| 6 well plate | Corning | 3516 | |
| Stage-top incubator | Tokai Hit | INUH-TIZSH | |
| Nikon N-SIM microscope | Nikon | Contact company | |
| Nikon Analyse software | Nikon | Contact company | |
| Incubator (190D) | LEEC | Contact company |
References
- Monks, C., Freiberg, B., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395, 82-86 (1998).
- Lanzavecchia, A. Antigen-specific interaction between T and B cells. Nature. 314, 537-539 (1985).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
- Delon, J., Bercovici, N., Liblau, R. Imaging antigen recognition by naive CD4+ T cells: compulsory cytoskeletal alterations for the triggering of an intracellular calcium response. European journal of Immunology. 28 (2), 716-729 (1998).
- Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. T Cell Receptor-Proximal Signals Are Sustained in Peripheral Microclusters and Terminated in the Central Supramolecular Activation Cluster. Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature methods. 3, 793-796 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (15), 8206-8210 (2000).
- Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells. Biophysical Journal. 88 (5), 3601-3614 (2005).
- Ashdown, G. W., Cope, A., Wiseman, P. W., Owen, D. M. Molecular Flow Quantified beyond the Diffraction Limit by Spatiotemporal Image Correlation of Structured Illumination Microscopy Data. Biophysical Journal. 107 (9), 21-23 (2014).
- Brown, C. M., et al. Probing the integrin-actin linkage using high-resolution protein velocity mapping. Journal of Cell Science. 19 (24), 5204-5214 (2006).
- Yi, J., Xufeng, S. W., Crites, T., Hammer, J. A. Actin retrograde flow and actomyosin II arc contraction drive receptor cluster dynamics at the immunological synapse in Jurkat T cells. Molecular Biology of the Cell. 23 (5), 834-852 (2012).
- Watanabe, N., Mitchison, T. J. Single-molecule speckle analysis of actin filament turnover in lamellipodia. Science. 8 (5557), 1083-1086 (2002).
