Abstract
-Actina filamentosa juega un papel crucial en la mayoría de los procesos celulares, incluyendo la motilidad y, en las células inmunes, la formación de una interacción célula-célula clave conocida como la sinapsis inmunológica. F-actina También se especula que desempeñan un papel en la regulación de las distribuciones moleculares en la membrana de las células incluyendo la dinámica de vesículas sub membranosa y la agrupación de proteínas. Si bien las técnicas de microscopía de luz estándar permiten observaciones generalizadas y difracción de limitarse a realizar, muchos eventos celulares y moleculares, incluyendo clustering y el flujo molecular se producen en las poblaciones en longitud escalas muy por debajo de la capacidad de resolución del microscopio óptico estándar. Mediante la combinación de fluorescencia total reflexión interna con el súper resolución de imagen método estructurado iluminación microscopía, se registró el flujo molecular bidimensional de F-actina en la sinapsis inmunitaria de las células T. Espacio-temporal espectroscopia de correlación de imágenes (STICS) y luego se aplicó, que genera resul cuantificablets en forma de histogramas de velocidad y mapas vector que representa la direccionalidad del flujo y la magnitud. Este protocolo describe la combinación de las técnicas de imagen y STICS super-resolución para generar vectores de flujo a nivel sub-difracción de detalle. Esta técnica se utilizó para confirmar un flujo de actina que es simétricamente retrógrada y centrípeta lo largo de la periferia de las células T en la formación de sinapsis.
Introduction
El objetivo del experimento es a la imagen y caracterizar el flujo molecular de filamentous- (F-) de actina en las células T de estar, más allá del límite de difracción con el fin de establecer la dirección del flujo y la magnitud durante la sinapsis inmunológica (IS) formación. Esta técnica se llevará a cabo usando un microscopio de iluminación estructurada (SIM) en el modo de fluorescencia total reflexión interna (TIRF), la formación de imágenes de células T Jurkat que forman una sinapsis artificial sobre la activación cubreobjetos recubiertos con anticuerpos anti-CD28 anti-CD3 y. Las formas se encuentra entre una célula T y su objetivo; una célula presentadora de antígeno (APC) al receptor de células T (TCR) 1,2 activación. Como este es el primer paso para determinar si el sistema inmune adaptativo genera una respuesta inmune a una infección, las consecuencias de la capacidad de respuesta a los estímulos incorrecta puede causar una serie de enfermedades. La importancia de la interacción de células T-APC está bien documentada, sin embargo, el papel (s) del madura es después si inicial TCRinternalización gnal son todavía ser plenamente comprendido.
Como se cree que el citoesqueleto para ayudar a dos procesos ligados a la activación de TCR (el movimiento de las moléculas en la membrana plasmática y el control de las moléculas de señalización dependientes de la actina del citoesqueleto 3,4), la comprensión de cómo el citoesqueleto reorganiza espacial y temporalmente se dilucidar los pasos de la reorganización molecular durante la formación de sinapsis. Se cree que el flujo retrógrado de F-actina de corral racimos de TCR hacia el centro de la sinapsis inmunológica, se cree que esta translocación a ser vital para dejar de señal y el reciclado; ayudar al delicado equilibrio de la activación de las células T 5.
Mientras que la microscopía de fluorescencia estándar es una herramienta flexible que sigue ofreciendo una visión sobre muchos eventos biológicos, incluyendo interacciones célula-célula, está limitado por la capacidad del sistema para resolver con precisión múltiples fluoróforos que residen más cerca que el diffrlímite de acción (≈200 nm) uno del otro. Como muchos eventos moleculares dentro de las células involucran poblaciones densas de moléculas y exhiben reordenamiento dinámico, ya sea en reposo o con la estimulación específica, microscopía óptica convencional no proporciona una imagen completa.
El uso de imágenes de súper resolución ha permitido a los investigadores para eludir el límite de difracción usando una variedad de técnicas. Microscopía sola molécula de localización (SMLM), tales como palma y 6,7 STORM tiene la capacidad de resolver la ubicación de las moléculas hasta una precisión de alrededor de 20 nm, sin embargo, estas técnicas se basan en largos tiempos de adquisición, la construcción de una imagen sobre muchos marcos . Generalmente esto requiere muestras sean fijos o estructuras para exhibir baja movilidad fluoróforos tan solo no están mal interpretado como múltiples puntos. Si bien el agotamiento de la emisión estimulada (STED) de imágenes permite super-resolución a través de muy selectivo de excitación confocal 8, el escaneo requeridoenfoque puede ser lento sobre los campos de células enteras de vista. STED también demuestra fototoxicidad significativa para resoluciones más altas debido al aumento de la potencia del haz de agotamiento.
Microscopía de iluminación estructurada (SIM 9) ofrece una alternativa a estos métodos, capaces de duplicar la resolución de un microscopio de fluorescencia estándar y es más compatible con imágenes de células vivas que las técnicas actuales SMLM. Utiliza los poderes de láser más bajos, en un sistema de gran campo para los campos de células enteras de vista; proporcionando una mayor velocidad de adquisición, y es compatible con el etiquetado fluoróforo estándar. La naturaleza de campo amplio de SIM también permite la utilización de fluorescencia total reflexión interna (TIRF) para la excitación altamente selectivo, con profundidades de penetración en la dimensión axial de <100 nm.
Espectroscopia de correlación de imagen (ICS) es un método de correlación de las fluctuaciones en la intensidad de fluorescencia. Una evolución del ICS; Im espacio-temporaledad correlación de espectroscopia (STICS 10) correlaciona señales fluorescentes intracelulares en tiempo y espacio. Al correlacionar las intensidades de píxeles y la zona píxeles en marcos rezagados a través de una función de correlación, se obtiene información sobre las velocidades de flujo y direccionalidad. Para asegurar objetos estáticos no interfieren con el análisis STICS, un filtro de objetos inmóviles se implementa, que funciona restando una media móvil de las intensidades de los píxeles.
La técnica que aquí se presenta se cree que es la primera demostración de la espectroscopia de correlación de imágenes que se aplica a los datos de microscopía de super-resolución para cuantificar el flujo molecular en células vivas 11. Este método mejora en las imágenes de difracción limitada del flujo de F-actina a través de análisis STICS 12 y se adaptaría a los investigadores que deseen determinar el flujo molecular bidimensional en células vivas, a partir de los datos adquiridos con resoluciones espaciales más allá del límite de difracción de la luz.
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Protocol
Nota: Etapas 1 y 2 tienen lugar antes del día de las imágenes; asegurar que todos los medios de comunicación y los suplementos a utilizar antes o el día de la proyección de imagen se equilibran. Equilibrado se consigue mediante el calentamiento de los medios de comunicación y los suplementos a 37 ° C en una incubadora con 5% de CO 2. Todas las etapas de trabajo de cultivo celular y cubreobjetos de chapado se llevan a cabo en condiciones estériles en una campana de flujo laminar.
La transfección 1. celular
- Transfectar las células T para obtener imágenes 24 hr antes del experimento con un plásmido que codifica una fusión fluorescente construir para el etiquetado GFP F-actina y formación de imágenes. Nota: Las células deben dividirse las 24 horas antes de la transfección (48 horas antes de la proyección de imagen) para asegurar las células están en óptima salud y en su fase de crecimiento logarítmico.
- Colocar 5 ml de suplemento de RPMI (RPMI 1640 más del 10% de FBS y 1% Pen-Strep (opcional)) en un solo pocillo de una placa de 6 pocillos en la incubadora se equilibre.
- Pellet 2 x 10 7 células T cultoured a 37 ° C 5% de CO 2 en el suplemento RPMI usando un tubo de centrífuga a 327 xg durante 5 min y lavar en un volumen igual de medio de electroporación pre-calentado. Nota: medio electroporación es un medio de suero reducido que contiene tampones y suplementos (ver consumibles).
- Después de volver a la granulación a 327 xg durante 5 min, resuspender las células en 500 l de medios de electroporación y se añade lentamente a una cubeta, añadir 5 g de plásmido en dH 2 O de grado PCR para el etiquetado de F-actina.
- Golpee suavemente la cubeta en el espacio de trabajo de la campana para asegurar la eliminación de las burbujas de aire en los medios de comunicación, que pueden causar la formación de arcos de la electricidad y para distribuir las células uniformemente dentro de los medios de comunicación.
- Encienda el aparato de electroporación y el voltaje ajustado a 300 V y la capacitancia a 290 Ω. Muestra electroporar utilizando un decaimiento exponencial durante 20 ms. Nota: Optimización puede ser necesaria para las diferentes células y diferentes construcciones de plásmidos.
- Una vez que el protocolo de transfección escompletos, almacenar células en hielo durante 1 min antes de continuar.
- Transferir cuidadosamente las células de la cubeta a la placa de 6 pocillos que contiene 5 ml de suplemento de RPMI equilibrada desde el paso 1.1.1.
- Se incuban las células O / N a 37 ° C + 5% de CO 2.
2. Cubreobjetos Coat y Pre-caliente Suplemento Imaging
- Cubreobjetos capa con anticuerpos para inducir la estimulación de células T.
- Escudo cada cámara de un cubreobjetos 8 pocillos con 1 mg / ml αCD3 y αCD28 en 200 l de PBS.
- Almacenar a 4 ° CO / N. Alternativamente, cubreobjetos capa 2 horas antes de la proyección de imagen y mantienen en una incubadora a 37 ° C para reducir la deriva durante el proceso de formación de imágenes, minimizando los cambios de temperatura en el cubreobjetos.
- Crear una muestra de prueba cubreobjetos con microesferas fluorescentes 0,1 micras sub-difracción.
- Vortex solución madre de los granos para evitar grumos.
- En una nueva, cubreobjetos limpio de le mismo tipo que los utilizados en el paso 2.1.1, pipeta de 5 l de microesferas fluorescentes solución madre sobre la superficie (según las instrucciones del fabricante).
- Corre solución de microesferas sobre el cubreobjetos con punta de la pipeta.
- Deje que se seque, luego aplique 200 l medio de montaje tales como PBS.
Nota: el medio de montaje debe coincidir con la utilizada para muestras de células de imágenes.
- Equilibrar HBSS (+ 20 mM HEPES, en adelante denominado "suplemento HBSS ') en un tubo de centrífuga colocando en una incubadora O comprobar la validez de frío / N a 37 ° C + 5% de CO 2.
Nota: la adición de HEPES es para amortiguar CO 2, si se utiliza una cámara de incubación con CO 2 de entrada saltarse esta suplementación.
3. Microscopio Set-up
- Encienda la incubadora de etapa superior del microscopio y lugar suficiente agua destilada TIRF-SIM en el depósito del microscopio para cubrir la totalidad de la base del elemento de calefacción. Deje que el agua Equilibrate a 37 ° C. Añadir el collar de calentamiento a la lente objetivo, también se establece en 37 ° C.
Nota: Debido a la sensibilidad de la puesta a punto, estos pasos se llevan a cabo la noche anterior para los componentes ópticos están a una temperatura estable antes de la imagen. - Coloque el TIRF 488 bloque de rejilla compatible en la trayectoria de la luz del microscopio y seguro en su lugar.
- Cambie el modo de canal y el cable de fibra a la posición 'Individual' en el escenario cama láser y microscopio, respectivamente, para acoplarse a la trayectoria óptica correcta para el modo TIRF-SIM. Nota: Saltarse este paso dará lugar a un error (Figura 1 A) dentro de la ventana del software.
- Encienda todos los componentes del microscopio y la computadora y abrir el software de control de la adquisición.
- Abra el panel de OC, Ti Pad, N-SIM Pad y ND Adquisición ventanas (Figura 1B). En el 'Panel de OC' seleccione la opción 'TIRF 488' (Figura 2B, flecha amarilla). En la ventana N-SIM Pad, seleccione el 'TIRF-SIM "y ajustes' Moving '(Figura 2C, flechas amarillas). Seleccione el botón de configuración (Figura 1C, caja amarilla) y seleccione 'TIRF 488 (de 100x TIRF 488 nm)' en el menú desplegable, de favoritos Aplicar 'y' OK '.
- Establezca los ajustes de la cámara dentro de los 'ajustes' DU897 a: Velocidad de cuadros 50 ms, modo de lectura, EM Ganancia 3 MHz a 14 bits, y EM Ganancia multiplicador 300 con una ganancia de conversión de 1 (Figura 1C, caja verde).
Nota: Véase representativos Resultados para consideraciones de velocidad de cuadro. - Calibrar la iluminación del microscopio para TIRF-SIM seleccionando el objetivo 100x 1,49 NA CFI Apocromático TIRF, en la 'N-SIM Pad' gire a la potencia del láser 488 nm a 10%.
Nota: tamaño de píxel de las imágenes en bruto es 60 nm, con un campo de 512 x 512 pixel de vista. - Limpie la lente del objetivo utilizando tejido de lentes para eliminar el polvo y el aceite.
- Comience con el objetivo de la posible plano z más bajo. Coloque una gota de aceite de la lente del objetivo y añadir la muestra de microesferas fluorescentes desde el paso 2.2 de la platina del microscopio.
- Seleccione la función Perfect Sistema de enfoque (PFS), ubicado en el cuerpo del microscopio.
- Mueva lentamente el objetivo a través del plano z hasta que el botón PFS deja de parpadear para confirmar el plano focal se ha alcanzado.
- Cambie a la vista 'en vivo' en el software de control y la imagen de las microesferas para ajustes finales realizados mediante el uso de la rueda de micro-manipulador PFS.
- Observe la iluminación uniforme sin emisión de fluorescencia fuera de foco por encima de la onda evanescente 75 nm.
Nota: Confirme iluminación estructurada se cumple mediante la observación de un patrón de iluminación fluctuante de la muestra de microesferas fluorescentes. - Mida la muestra de microesferas fluorescentes y cuantificar la resoluc de imagen mejoradaión observando la anchura a media altura (FWHM) del perfil de intensidad.
- Abra el software Analizar (v4.20.01), con el módulo de NIS-N-SIM Análisis instalada y seleccione "Aplicaciones" -> "ventana demostración N-SIM".
- Con el contraste de modulación de iluminación (IMC) y supresión de ruido de alta resolución (HRNS) se establece en 1 para conjuntos de datos TIRF-SIM (Figura 2), reconstruir la imagen de la muestra de microesferas para generar una imagen reconstruida de 1.024 x 1.024 píxeles con un tamaño de píxel de 30 Nuevo Méjico.
- Con la herramienta perfil de la línea con un ancho de 1 píxel (Figura 3A, caja amarilla), trazar una línea a través del centro de un solo microesfera.
- Seleccione el botón FWHM (Figura 3B, caja amarilla) y haga clic en los máximos de intensidad de la distribución de Gauss, seguido por su minima intensidad.
- Confirmar la FWHM de la microesfera está en el intervalo de 100 nm (Figura 3C). Nota: la resolución achCuando la imagen muestras biológicas ieved variarán dependiendo de la relación señal a ruido de la eficiencia del etiquetado y la fluorescencia de fondo.
4. Preparación de muestras para Imaging
- Preparación Coverslip.
- Recuperar cubreobjetos recubiertos de αCD desde el paso 2.1 de la nevera o incubadora y eliminar PBS que contenía αCD3 y αCD28 de cada pocillo.
- Añadir 200 l de HBSS suplemento pre-calentado desde el paso 2.3 a cada pocillo de la cubreobjetos. Lavar y quitar para asegurar una mínima αCD3 y αCD28 se deja en solución. Añadir otros 200 l de HBSS el suplemento a los pocillos de cubreobjetos.
- Limpie la parte inferior del cubreobjetos con papel para lentes para eliminar el aceite y las partículas.
- Posición cubreobjetos sobre la platina del microscopio y encontrar el plano focal TIRF del cubreobjetos usando el plano z PFS como se encuentra en el paso 3.4.
- Preparación de las células.
- Pipetear 200 l de la con los medios de comunicacióncontienen células transfectadas del paso 1.1.8 en un tubo de microcentrífuga.
- Células de pellets en un micro-centrifugar a 268 xg durante 20 segundos y retirar medios celulares.
- Resuspender las células en 200 l precalentado suplemento HBSS desde el paso 2.3.
5. Las células Imaging
- Tome suplemento de HBSS que contiene células al microscopio y la pipeta suavemente 200 l en uno de los pozos.
- Si bien se mantiene en el plano focal TIRF en el cubreobjetos (en el modo SLP), utilice el ocular microscopios de epifluorescencia y la iluminación para rastrear células fluorescentes se aproximan a la cubreobjetos.
- Una vez que las células de la tierra en el cubreobjetos, cambie al modo 'Live' en la N-SIM cojín para que la imagen en el monitor y compruebe las células están en el foco en la pantalla del ordenador.
- Para registrar los tiempos de los cursos, abra la ventana ND Adquisición y seleccione la pestaña 'Time', haga clic en "Añadir" y establecer 'Intervalo' en Sin demora, 'Duración'a 10 minutos, 'Loops' se establece en 1.
Nota: La duración puede ser cambiado dependiendo del proceso de interés; el software STICS puede extraer resultados cuantitativos con pilas de imágenes de ≈10 marcos cuando fue capturado con 'No Delay'. - Con los ajustes de adquisición idénticos a la muestra de cuentas, iniciar la grabación de datos seleccionando "Ejecutar ahora" en la ventana ND Adquisición.
6. Imágenes Reconstructora SIM
- Después de imágenes, abra el software Analizar (v4.20.01), con el módulo de NIS-N-SIM Análisis instalada y seleccione "Aplicaciones" -> "ventana demostración N-SIM".
- Con el contraste de modulación de iluminación (IMC) y la supresión de ruido de alta resolución (HRNS) establece en 1 para los conjuntos de datos TIRF-SIM (Figura 2), la reconstrucción de una (o múltiple con la función por lotes) Archivo SIM prima para producir una imagen SIM reconstruida.
- Confirmar el archivo reconstruida tiene un tamaño de píxel de 30 nm, se indica en elbarra de estado de la imagen.
Nota: Tamaño de píxel no afecta análisis STICS pero debe ser al menos 2x menor dimensión que la resolución espacial PSF con el fin de garantizar la correlación espacial entre los píxeles. - Exportar los datos como archivos .tiff, listos para el análisis STICS.
Análisis 7. STICS
- Descargue y extraiga el STIC (C) S paquete de software Matlab (laboratorio de Wiseman, disponible como información complementaria). El stics_vectormapping.m guión es el núcleo de un solo análisis STICS canal y las primeras 30 líneas de código se utilizan para definir los parámetros de entrada como se define en la sección 2.1 del manual. Abrir este script y definir los parámetros de entrada para el análisis de datos TIRF-SIM. Se sugiere añadir también la carpeta S STIC (C) con subcarpetas a la máquina ruta local Matlab, como se detalla en el apéndice del manual.
- Definir los parámetros de entrada para el análisis de datos mediante la edición de las líneas correspondientes del código
- Para llevar a cabo analisis de los datos TIRF-SIM para generar 1 de vectores mapa, establezca los parámetros temporales a subregión temporal en la línea 31 hasta el número máximo de fotogramas y el cambio temporal en la línea de 32 a 1. Para obtener una serie temporal de mapas vectoriales variar estos parámetros .
- Para el filtro de eliminación inmóvil, establezca el parámetro 'filtrado' (línea 23) a 'Promedio móvil' y establecer el parámetro 'MoveAverage' (línea 24) a 21.
Nota: Este ajuste se ha demostrado que funciona más lento señales de fluorescencia grandes en movimiento y, ya que se basa en la sustracción de marcos de serie de la estructura que se está analizando. - Cambio líneas 33-38 para establecer el nombre de los archivos de salida y los títulos de los mapas vectoriales de salida, así como la ruta del directorio de salida y definir en qué formato el mapa vectoriales imágenes se deben guardar.
| Tamaño de píxel (micras) | 0,03 micras | Línea 19 |
| Velocidad de cuadro (s) | 1 segundo | Línea 20 |
| El tiempo máximo de retardo (frames) | 20 cuadros | Línea 21 |
| Tamaño Subregión (píxeles) | 8 píxeles | Línea 29 |
| Espaciamiento Subregión (píxeles) | 1 pixel | Línea 30 |
- Abra los run1ChannelSTICS secuencia de comandos en la ventana Matlab Editor. Cargue la serie de imágenes mediante la ejecución de las líneas 1-23 de este script.
Nota: Este script se puede utilizar para cargar y pre-proceso de series de imágenes, trazar los mapas vectoriales e histogramas de velocidad y ejecutar un proceso por lotes para muchos archivos. Si es necesario, recortar la imagen de una región de interés mediante el uso de la línea 24-26 de este script.- Ejecutar líneas 29-35 de run1ChannelSTICS para iniciar el análisis STICS. Cuando se le solicite, seleccione un polígono para indicar una región específica de interés (ROI), si se desea. Asegúrese de que la ROI no se solapa con el borde de la celda, como se producen artefactos de límite cuando STICS analiza estas reregiones.
- Ejecutar líneas 38-52 para mostrar los mapas de vectores. Para trazar el histograma magnitud de la velocidad, correr las líneas 53-72.
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Representative Results
Ajustes del microscopio
Después de lograr con éxito todos los pasos del investigador tendrá iluminación estructurada logrado (SIM) de imágenes del flujo de F-actina en una sinapsis de las células T (Video 1), y se cuantifica este flujo molecular mediante espectroscopia de correlación de imágenes espacio-temporal (Figura 4 11). Antes de grabar las imágenes, asegúrese de la iluminación de la muestra es uniforme a través de las nueve imágenes en bruto y que la iluminación estructurada en forma de franjas Moiré se observan en la muestra (Figura 5), estos son los dos indicadores del cubreobjetos es plano en el escenario y la TIRF- SIM configuración está alineado correctamente.
Es importante mantener el láser de baja potencia (≤10%) para asegurar las células se mantienen lo más saludable posible durante el experimento. Si la expresión fluorescente es bajo, incluso después de la optimización de la tque electroporación medidas, aumentar el tiempo de exposición de cada fotograma prima por encima de las establecidas 50 ms y / o la configuración de conversión de ganancia. Como TIRF-SIM requiere 9 cuadros primas, 1 para cada uno de los 9 orientaciones iluminación requerida por imagen reconstruida, aumentando el tiempo de exposición se reducirá la velocidad de fotogramas. En este experimento, una exposición de 50 ms permite ≈1 trama reconstruida por segundo (también incluyendo el tiempo de rotación de la red), lo que reduce el riesgo de artefactos de movimiento visto cuando los eventos más rápidos se mueven a través de múltiples máximos de iluminación en una trama cruda.
Dependiendo de la velocidad de flujo molecular en estudio, lo que aumenta el tiempo de exposición puede introducir artefactos de movimiento; investigadores deben mantener los tiempos de exposición al mínimo necesario para una buena señal. Como tamaños de pixel en imágenes SIM son más pequeñas que las de las imágenes de fluorescencia estándar, las poblaciones moleculares que exhiben velocidades de flujo más rápidas pueden pasar a través de la subregión antes de una posterior frAME se adquiere. Para el software STICS correlacionar la señal de fluorescencia dentro de esta región más pequeño más rápido se requieren tasas de imagen en comparación con los conjuntos de datos de fluorescencia estándar. Por ejemplo, un tamaño de 8 x subregión 8 píxeles de datos de SIM representa un área de 240 x 240 nm, mientras que una subregión 8 x 8 píxeles a partir de un conjunto de datos de fluorescencia estándar representa un área de 1,7 m (con un tamaño de píxel de 200 nm asumido).
Para los tiempos de los cursos más largos (> 3 min) lotes de datos pueden ser tomadas con 'ND adquisición' para reducir la exposición al láser durante la formación de sinapsis (por ejemplo, las imágenes durante 10 segundos cada minuto durante 10 minutos expondrá el celular a la misma potencia del láser acumulada como imágenes de <2 min continuamente).
Reconstrucciones Sub-óptimas de formación de imágenes SIM se demuestran en la Figura 6, donde los mismos datos en bruto ha sido reconstruido utilizando diferentes alta resolutide supresión de ruido (HRNS) ajustes, también se muestran las transformadas de Fourier (FFT forward) y la mitad de ancho perfiles máximos de la fibra resaltado. Ajuste del HRN es un equilibrio entre el aumento de los artefactos de reconstrucción debido a la mala relación señal-ruido y aumentar la resolución. Un HRN que es demasiado bajo (<1) puede dar lugar a imágenes granuladas con un aumento de artefactos SM hexagonal, mientras que demasiado alto un entorno HRNS (> 1) puede 'pinza' y descartar los datos de alta resolución (visto como un diámetro FFT reducida). Una resolución de> 100 nm indicaría la necesidad de volver a ejecutar la reconstrucción con diferentes configuraciones, si resoluciones siguen siendo sub-óptima readquirir los datos con una configuración optimizada microscopio puede ser requerida.
Imágenes y cuantificar el flujo molecular
Para la imagen de flujo molecular, los datos de series de tiempo se tomó de las células T de aterrizaje y la formación de una sinapsis en un coversli estimulantep, F-actina se puede ver a fluir de una manera retrógrada desde la periferia de la célula hacia el centro de la célula. Como F-actina se vuelve menos denso hacia el centro del análisis STICS celda sólo se llevó a cabo en la periferia de la sinapsis, esta región es también donde se conocen microclusters de señalización que proceden de la formación de sinapsis durante prolongada.
Cuando la adquisición y análisis de datos utilizando STICS es importante para entender el programa se basa en la correlación de las fluctuaciones fluorescentes dentro de las subregiones seleccionadas para formar una función de correlación más alto y más suave (CF). El número absoluto de los marcos necesarios para generar una salida de STICS éxito no es exacta ya que el software se basa más en la creación de una salida a través del número total de las fluctuaciones de señales constructivas dentro de esas subregiones. Por ejemplo, si el conjunto de datos cuenta con 20 móviles, proteínas marcadas en cada subregión que fluye en la misma dirección STICS necesitarán menos fotogramas a genevaluar una salida fiable, mientras que una subregión con 5 proteínas resultados móviles en una función de correlación más débil y puede requerir más fotogramas. El número exacto de marcos y tamaño subregión utilizados depende de la naturaleza de los eventos moleculares se toman las radiografías y debe ser optimizado por el usuario.
Usando la herramienta 'Temporal marco de recorte' del STICS es posible analizar subconjuntos de flujo molecular a través del tiempo: lo que permite a los investigadores ver si las tasas de flujo cambian dentro de la misma celda en función de las diferentes condiciones celulares o estímulos ambientales como antes y después de los tratamientos farmacológicos. El filtro de objeto inmóvil está diseñado para eliminar cualquier población fluorescente inmóvil antes de analizar la población fluorescente móvil. Con este enfoque, las imágenes que contienen porcentajes de población estáticos hasta un 90% todavía puede ser exitosamente analizaron 10. Ajuste del filtro inmóvil a 21 fotogramas filtra ningún poblaciones fluorescentes que permanecen estática para este período de tiempo o más tiempo, que no contribuirá a la dinámica de flujo retrógrado durante la estabilización sinapsis inmunológica.
Figura 1. Microscopio ajustes de adquisición. (A) pone de relieve los valores de N-SIM Pad utilizados para el experimento y error la 'fibra incorrecto "cuando no se seleccionan los modos de canal y una sola fibra. (B) Todas las ventanas necesarias para la configuración, registrar y reconstruir una imagen iluminación estructurada en el sistema SIM. (C) N-SIM Pad y Ajustes N-SIM ventana pop-out (recuadro amarillo) utilizan para seleccionar el programa de instalación de rejilla después de colocar físicamente el 488 nm rejilla en el microscopio. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Al seleccionar el botón 'Param "(caja amarilla), seleccione TIRF-SIM en el menú desplegable inicialmente fijado tanto la' Iluminación Modulación Contraste '(IMC) y' Supresión de ruido de alta resolución figura 2. Ajustes de reconstrucción de la imagen final. Y '(HRNS) a 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. anchura total a la mitad del máximo (FWHM) de medición. Usando el software de análisis (A) muestra un gráfico gaussiano de la herramienta intensidad de la línea seleccionada (caja amarilla) y dibujado a través de una imagen reconstruida SIM de una muestra de perlas. (
Figura 4. Representante datos iluminación estructurada y STICS salida. Un Jurkat de células T que expresan GFP-etiquetados F-actina imágenes utilizando TIRF-SIM en un cubreobjetos estimulante para la generación de sinapsis inmunológica. Cinco minutos después del contacto, un tiempo de curso y se analizó mediante el programa de análisis de STICS. Cajas amarillas representan regiones zoom mientras mapas vectoriales demuestran el flujo retrógrado de F-actina en la periferia de la sinapsis. Vector colores indican la velocidad del flujo molecular en esa subregión, datos de velocidad se representa gráficamente en un histograma. Debido a la z-selectividad de excitación TIRF-SIM proporciona, la muestra se puede perder de foco si se separa o se aleja del cubreobjetos a través del curso de tiempo del experimento debido a ruffling o motilidad. Esto se ve aquí en el panel superior derecho como una reducción en la densidad del vector. La reducción es el resultado de aplicar el filtro STICS inmóviles a las subregiones que han demostrado no hay fluctuaciones fluorescentes para el período de tiempo establecido por el usuario. Este resultado pone de relieve la importancia de las regiones única selección que contienen la señal de fluorescencia para toda la serie temporal. lacio "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. imágenes Raw SIM. Los nueve imágenes en bruto de la izquierda muestran los 9 orientaciones del patrón de rejilla necesaria para producir una imagen TIRF-SIM. Celular fotografiado es una célula T Jurkat expresando GFP etiquetados actina F, célula zoom muestra una de las nueve imágenes en bruto, lo que demuestra la iluminación no uniforme con flecos muaré, especialmente alrededor de la periferia de la célula. Aunque la iluminación estructurada no es visible las interacciones entre la iluminación y la muestra crean zonas de diferente resistencia a la iluminación, después de la reconstrucción esto resulta en una imagen con una resolución mejorada. Ambas barras de escala son 5 micras. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6 de alta resolución de supresión de ruido (HRNS) ajustes de configuración Sub-óptimos conducen a la reconstrucción de imagen óptima..; (A) muestra las diferencias en los datos reconstruidos (ajustes utilizados aparecen en la parte inferior izquierda de cada imagen), donde baja HRNS conduce a un aumento del ruido de fondo fuera de la región de pétalos y HRNS altas pueden reducir la resolución y dar lugar a una pérdida de los detalles más finos. (B) Representa la Fourier transformada directa de imágenes en (A) donde la información periférica indica los datos de mayor resolución; tenga en cuenta los pétalos recortados de la transformada cuando HRNS se establece en 5, lo que indica la reducción resolución de imagen. (C) muestra la media de ancho total máximo (FWHM) de la fibra de actina (cuadro amarillo en una) en las diferentes configuraciones, las mediciones FWHM a través del software dio lecturade 90 nm, 100 nm y 180 nm para la configuración HRNS de 0,1, 1, y 5, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Esta técnica permitirá a los investigadores a imagen y cuantificar previamente detalles irresolubles en células que expresan la fluorescencia. En nuestros resultados nos muestran que la F-actina fluye en una forma simétrica de la periferia de la célula hacia el centro de la celda en la célula T es. Estos resultados son consistentes con los resultados anteriores de la línea 1D datos de perfil quimógrafo 13 y se extienden la capacidad de análisis de datos 2D y super-resolución.
La técnica presentada es una progresión de formación de imágenes quimógrafo que se limita a trazar las fluctuaciones de intensidad de fluorescencia a través de una sola línea 1D en el tiempo. En comparación, la técnica actual permite la cuantificación del flujo molecular de células enteras con tanto direccionalidad y velocidad extraído. Si bien las imágenes de moteado también ha mostrado dinámica de la actina 14 dentro del entorno 2D, la técnica speckle puede ser limitado por las dificultades con densidades etiquetado correcto y sólo visualiza una subpoblación de actina.
Los pasos más importantes para lograr estos resultados son para optimizar la eficiencia de la transfección de las células particulares siendo utilizado por el investigador y la alineación de la óptica del microscopio SIM y el patrón de rejilla. Elegir el tamaño correcto de la subregión depende de las características de la muestra, y es importante como un ajuste demasiado pequeño significará fluorescencia en movimiento más rápido se pierde por el análisis de correlación, pero la elección demasiado grande una subregión significará la pérdida potencial de los matices en los datos adicionales adquiridos utilizando métodos de super-resolución.
Subregión denota el número de píxeles sumados para crear un super-pixel para el análisis de mapeo de velocidad, aumentando esto puede mejorar la fiabilidad para el seguimiento de objetos en movimiento rápido. El espaciamiento subregión es la brecha entre los datos dentro superpíxeles. Cuando la separación subregión es menor que el tamaño de la subregión, estos vectores adyacentes comparten alguna información, aumentando esta configuración podría reducir los contras direccionalesistency del vectormap definitiva genera. El tiempo máximo de retraso controla el análisis de correlación de tiempo, donde el número introducido es el número máximo de desfases antes de fines de análisis.
Reconstrucción de la imagen final requiere contraste modulación de la iluminación (IMC) y la supresión de ruido de alta resolución (HRNS) Ajustes para ser seleccionados. Ajustes óptimos pueden variar de una muestra a otra. IMC ayuda a distinguir el patrón de iluminación rayada en la muestra, y reduce artefactos de reconstrucción. HRNS puede reducir los artefactos a partir de datos de bajo contraste de 'recorte' de datos de alta resolución de la transformada de Fourier; para mantener la capacidad máxima resolución y minimizar los artefactos de reconstrucción éstos se establecen normalmente a 1.
Limitaciones de esta técnica se basan en la naturaleza 2D del proceso, ya que el software STICS no puede analizar los datos 3D de la técnica se limita a TIRF-SIM o 2D-SIM, esto requiere, por tanto, la muestra a ser relatvamente plana contra el cubreobjetos. Otro inconveniente técnico es que TIRF-SIM requiere 9 fotogramas primas para ser recogidos antes de la reconstrucción de la imagen final de super-resolución, como tal con nuestros ajustes de 50 adquisiciones marco ms y el tiempo empleado por el microscopio SIM para reorientar el patrón de cuadrícula; se alcanzan velocidades de cuadro de ≈1 seg. En comparación con otros tiempos de adquisición técnica de super-resolución y del gran campo de visión de estas limitaciones son aceptables para la mayoría de aplicaciones.
Los resultados presentados aquí son comparables con los conjuntos de datos de imágenes TIRF nivel de flujo de F-actina en la formación de sinapsis inmunológica. El buen acuerdo entre las modalidades de imagen demuestra STICS es robusto frente a posibles artefactos de reconstrucción SIM y también que los ajustes de adquisición de imágenes utilizados durante SIM son aceptables para el análisis de datos. Mediante el uso de conjuntos de datos de super-resolución con píxeles más pequeños los tamaños más datos se puede extraer de las células individuales y la dinámica de sub-difracción celulares micro-dominios pueden ser investigados.
Después de agarrar esta técnica cualquier flujo molecular se pueden obtener imágenes y cuantificado, con margen para no invasiva investigar una multitud de preguntas relacionadas con el flujo de la membrana plasmática, o cuando se toman muestras con un microscopio confocal, en cualquier lugar en el plano xy de la célula.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables: | |||
| Jurkat E6.1 cells | APCC | ATTC TIB-152 | |
| RPMI | Life Technologies | 21875-091 | |
| FBS | Sigma | F7524-500ML | |
| Penicillin-Strepromycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-050 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630-056 | |
| #1.5 8-well Labtek coverslips | NUNC, Labtek | 155409 | |
| LifeAct GFP construct | Ibidi | 60101 | |
| OptiMem | Life Technologies | 51985-042 | |
| anti-CD3 | Cambridge Bioscience | 317315 | |
| anti-CD28 | BD Bioscience / Insight Biotechnology | 555725 | |
| PBS | Life Technologies | 20012-019 | |
| Lens oil | |||
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment: | |||
| Gene Pulsar Xcell System | BioRad | 165-2660 | |
| Cuvette (0.4cm) | BioRad | 165-2088 | |
| Centrifuge (5810R) | Eppendorf | 5805 000.327 | |
| Centrifuge (Heraeus) | Biofuge pico | 75003235 | |
| 6 well plate | Corning | 3516 | |
| Stage-top incubator | Tokai Hit | INUH-TIZSH | |
| Nikon N-SIM microscope | Nikon | Contact company | |
| Nikon Analyse software | Nikon | Contact company | |
| Incubator (190D) | LEEC | Contact company |
References
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