Abstract
-Actina filamentosa desempenha um papel crucial na maioria dos processos celulares, incluindo a motilidade e, em células do sistema imunológico, a formação de uma interacção célula-célula chave conhecida como a sinapse imunológica. F-actina também é especulado para desempenhar um papel na regulação da distribuição molecular na membrana de células, incluindo vesículas dinâmica sub-membranoso e agrupamento da proteína. Embora as técnicas de microscopia de luz padrão permitem observações generalizadas e limitou-difração de ser feita, muitos eventos celulares e moleculares, incluindo clustering e fluxo molecular ocorrem em populações de comprimento escalas muito abaixo do poder de resolução da microscopia de luz padrão. Através da combinação total de fluorescência de reflexão interna com o método de iluminação estruturada microscopia de super-resolução de imagem, o fluxo molecular bidimensional da actina F na sinapse imune das células T foi gravado. Espectroscopia de correlação de imagem espaço-temporal (STICS) foi então aplicada, o que gera resul quantificávelts na forma de histogramas de velocidade e mapas vetoriais que representam a direcionalidade e fluxo magnitude. Este protocolo descreve a combinação de técnicas de imagem e os paus de super-resolução para gerar vetores de fluxo em níveis sub-difração de detalhe. Esta técnica foi utilizada para confirmar uma fluxo de actina que é simetricamente retrógrada e centrípeta ao longo da periferia de células T mediante a formação de sinapses.
Introduction
O objectivo da experiência é a imagem e caracterizar o fluxo molecular de filamentous- (F-) actina em células T vivo, para além do limite de difracção, a fim de estabelecer a direcção do fluxo e durante a magnitude sinapse imunológica (IS) formação. Esta técnica irá ser realizada utilizando um microscópio de iluminação estruturada (SIM) no modo de reflexão interna total de fluorescência (TIRF), imagiologia de células T de Jurkat que formam uma sinapse artificial sobre a activação das lamelas revestidas com anti-CD3 e anti-CD28. Os formulários está entre uma célula T e seu alvo; uma célula que apresenta antigénios (APC) em cima do receptor de células T (TCR) 1,2 activação. Como esta é a primeira etapa para determinar se o sistema imunitário adaptativo gera uma resposta imunitária a uma infecção, as consequências da capacidade de resposta a estímulos incorrecta pode provocar um certo número de doenças. A importância da interacção de células T-APC está bem documentada, no entanto, o papel (s) do maduro é depois Si TCR inicialinternalização nal ainda estão para ser totalmente compreendido.
Como o citoesqueleto é pensado para auxiliar dois processos ligados à activação de TCR (o movimento de moléculas na membrana plasmática e do controlo de moléculas de sinalização dependentes do citoesqueleto de actina 3,4), compreender como o citoesqueleto reorganiza espacial e temporalmente irá elucidar os passos de reorganização molecular durante a formação de sinapses. O fluxo retrógrado de F-actina é pensado para encurralar aglomerados de TCR em direcção ao centro da sinapse imunológica, esta translocação se acredita ser fundamental para a cessação do sinal e de reciclagem; auxiliando o bom equilíbrio de activação de células T 5.
Enquanto a microscopia de fluorescência padrão é uma ferramenta flexível que continua a fornecer uma visão sobre muitos eventos biológicos, incluindo interações célula-célula, ela é limitada pela capacidade do sistema para resolver com precisão vários fluoróforos que residem mais perto do que o diffrlimite de acção (≈200 nm) de cada outro. Como muitos eventos moleculares dentro das células envolvem densas populações de moléculas e apresentam rearranjo dinâmico quer na quietude ou mediante estimulação específica, microscopia de luz convencional não fornece a imagem completa.
A utilização de super-resolução de imagem permitiu a investigadores para contornar o limite de difracção utilizando uma variedade de técnicas. Microscopia molécula única localização (SMLM), tais como PALM e STORM 6,7 tem a capacidade de resolver o local de moléculas até uma precisão de cerca de 20 nm, no entanto, estas técnicas dependem de longos tempos de aquisição, a criação de uma imagem ao longo de muitos quadros . Geralmente isso requer amostras a serem fixos ou para estruturas mostrou baixa mobilidade fluorophores tão simples não são mal interpretados como vários pontos. Enquanto esgotamento emissão estimulada (STED) imagiologia permite super-resolução através da excitação confocal muito seletivo 8, a digitalização necessáriaabordagem pode ser lento sobre os campos de células inteiras de vista. STED também demonstra fototoxicidade significativo para resoluções mais elevadas devido ao aumento do poder do feixe de esgotamento.
Microscopia de iluminação estruturada (SIM 9) proporciona uma alternativa a estes métodos, capazes de duplicar a resolução de um microscópio de fluorescência padrão e é mais compatível com a imagem de células vivas do que as técnicas correntes SMLM. Ele usa poderes de laser inferiores, em um sistema de campo amplo para campos de células inteiras de vista; proporcionando maior velocidade de aquisição, e é compatível com rotulagem fluoróforo padrão. A natureza de campo amplo de SIM também permite a utilização de fluorescência total interno de reflexão (TIRF) para excitação altamente seletivo, com profundidades de penetração na dimensão axial de <100 nm.
Espectroscopia de correlação de imagem (ICS) é um método de correlacionar as flutuações na intensidade de fluorescência. Uma evolução do ICS; Im espaço-temporalespectroscopia de correlação de idade (STICS 10) correlaciona sinais fluorescentes intracelulares no tempo e no espaço. Ao correlacionar intensidades de pixel com áreas pixels em quadros mais atrasadas através de uma função de correlação, a informação é adquirida com as velocidades de fluxo e direcionalidade. Para garantir objectos estáticos não interfiram com a análise STICS, um filtro objecto imóvel é implementado, o qual funciona através da subtracção de uma média móvel da intensidade dos pixels.
A técnica aqui apresentada acredita-se ser a primeira demonstração de espectroscopia de correlação de imagem a ser aplicada aos dados de microscopia de super-resolução para quantificar o fluxo molecular em células vivas 11. Este método melhora na imagem limitado por difração de fluxo de F-actina via análise STICS 12 e serviria para pesquisadores que desejam determinar o fluxo molecular bidimensional em células vivas, a partir de dados adquiridos em resoluções espaciais para além do limite de difração da luz.
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Protocol
Nota: Fases 1 e 2 têm lugar antes do dia de imagem; assegurar todos os meios e suplementos para ser utilizado antes ou no dia da imagiologia são equilibradas. A equilibração é conseguida através do aquecimento de meios e suplementos para 37 ° C numa incubadora a 5% de CO 2. Todas as etapas do trabalho de cultura celular e lamela chapeamento ter lugar em condições estéreis sob uma capela de fluxo laminar.
1. A transfecção celular
- Transfectar as células T a ser trabalhada 24 horas antes da experiência, com um plasmídeo que codifica uma fusão de rotulagem fluorescente construir GFP F-actina e imagiologia. Nota: As células devem ser dividida 24 h antes da transfecção (48 h antes da imagem) para garantir as células estão em óptima saúde e na sua fase de crescimento logarítmica.
- Colocar 5 ml de suplemento de meio RPMI (meio RPMI 1640 mais 10% de FBS e 1% de Pen-Strep (opcional)) em um único poço de uma placa de 6 poços na incubadora para equilibrar.
- Agregar 2 x 10 7 células T cultorado a 37 ° C, 5% de CO 2 em meio RPMI suplemento utilizando um tubo de centrifugação a 327 xg durante 5 minutos e lava-se em um volume igual de meio de electroporação pré-aquecido. Nota: médio Eletroporação é um meio de soro reduzido contendo buffers e suplementos (ver consumíveis).
- Depois de re-granulação a 327 xg durante 5 min, ressuspender as células em 500 ul de meios de electroporação e lentamente adicionar a uma cuvete, adicionam-se 5 ug do plasmídeo em PCR grau de dH2O para rotulagem de F-actina.
- Bata suavemente a tina no espaço de trabalho capa para assegurar a remoção de quaisquer bolhas de ar nos meios de comunicação, que podem provocar faíscas da eletricidade e para distribuir uniformemente as células dentro dos meios de comunicação.
- Ligue o aparelho de eletroporação e ajuste a tensão para 300 V e capacidade para 290 Ω. Electroporate amostra utilizando um decaimento exponencial de 20 mseg. Nota: Optimização podem ser necessários para diferentes células e diferentes construções de plasmídeos.
- Uma vez que o protocolo de transfecção é, células de lojas completas sobre gelo durante 1 min antes de continuar.
- Transferir cuidadosamente as células da cuvete para a placa de 6 poços contendo 5 mL de meio RPMI suplemento equilibrada a partir do passo 1.1.1.
- Incubar as células O / N a 37 ° C + 5% de CO 2.
2. Lamelas casaco e Pré-quente Suplemento de imagem
- Lamelas revestimento com anticorpos para induzir a estimulação de células T.
- Bata de cada uma das câmaras de uma lamela 8 poços com 1 ug / ml oCD3 e αCD28 em 200 ul de PBS.
- Armazenar a 4 ° CO / N. Alternativamente, lamelas de revestimento de 2 horas antes da imagem e manter-se em uma incubadora a 37 ° C para reduzir a dispersão durante o processo de imagem ao minimizar as mudanças de temperatura para a lamela.
- Criar uma amostra de teste lamela com 0,1 um sub-difração de microesferas fluorescentes.
- Solução estoque Vortex de esferas para evitar grumos.
- Em uma nova lamela, limpo de the mesmo tipo que os utilizados no passo 2.1.1, pipeta de 5 ul da solução de microesferas fluorescentes sobre a superfície (conforme as instruções do fabricante).
- Espalhe solução microesfera sobre a lamela com ponteira.
- Deixe secar, em seguida, aplicar 200 � de meio de montagem, como a PBS.
Nota: o meio de montagem deve corresponder ao utilizado para amostras de células de imagem.
- Equilibrar HBSS (+ 20 mM de HEPES, a seguir designado por "HBSS suplemento ') num tubo de centrifugação por colocação dentro de uma incubadora para pré-aquecer O / N a 37 ° C + 5% de CO 2.
Nota: a adição de HEPES é para tamponar CO 2, se estiver usando uma câmara de incubação com CO 2 de entrada pular esta suplementação.
3. Microscópio Set-up
- Ligue a fase de topo incubadora do microscópio e lugar suficiente água destilada TIRF-SIM no reservatório do microscópio para cobrir completamente a base do elemento de aquecimento. Permitir que a água para equilibrate a 37 ° C. Adicionar o colar de aquecimento para a lente da objectiva, também definido como 37 ° C.
Nota: Devido à sensibilidade do set-up, essas etapas são feitas na noite anterior para que os componentes ópticos estão a uma temperatura estável antes da imagem. - Coloque o TIRF 488 compatível bloco ralar no caminho óptico do microscópio e prenda no lugar.
- Mude o modo de canal e do cabo de fibra para a posição 'Single' no palco cama laser e microscópio, respectivamente, para envolver o caminho óptico correto para o modo TIRF-SIM. Nota: Ignorando este passo conduzirá a um erro (Figura 1A) na janela do software.
- Ligue todos os componentes do microscópio e computador e abra o software de controle de aquisição.
- Abra o painel de OC, Ti Pad, N-SIM Pad e ND Aquisição janelas (Figura 1B). No 'Painel de OC' selecione a opção 'TIRF 488' (Figura 2B, seta amarela). Na janela de N-Pad SIM, selecione a opção 'TIRF-SIM' e configurações 'em movimento "(Figura 2C, setas amarelas). Selecione o botão de configurações (Figura 1C, caixa amarela) e selecione 'TIRF 488 (para 100x TIRF 488nm)' no menu suspenso, clique em 'Aplicar' e 'OK'.
- Defina as configurações da câmera dentro das configurações DU897 'Para: Frame Rate 50 ms, modo de leitura, Gain EM 3 MHz em 14 bits, e EM Gain Multiplicador 300 com um ganho de conversão de 1 (Figura 1C, caixa verde).
Nota: Os resultados representativos para ver considerações taxa de quadros. - Calibrar a iluminação do microscópio para TIRF-SIM, seleccionando a NA CFI Apochromat TIRF objetivo 100x 1,49, no 'N-SIM Pad' virar a potência do laser de 488 nm para 10%.
Nota: O tamanho do pixel das imagens cruas é de 60 nm, com um campo de 512 x 512 pixels de vista. - Limpe a lente objetiva usando lenço de papel para remover o pó e óleo.
- Comece com o objetivo no menor z-plano possível. Coloque uma gota de óleo na lente objetiva e adicione a amostra de microesferas fluorescentes a partir do passo 2.2 para o palco microscópio.
- Seleccionar a função perfeito sistema de focagem (PFS) situado no corpo do microscópio.
- Mover-se lentamente o objectivo acima através do plano z até que o botão de PFS pára de piscar para confirmar o plano focal foi atingido.
- Mudar para a Visão 'Live' no software de controle e imagem das microesferas para ajustes finais feitas usando a roda de micro-manipuladora PFS.
- Observe a iluminação uniforme sem emissão de fluorescência fora de foco acima da onda evanescente 75 nm.
Nota: Confirme iluminação estruturada é cumprida observando um padrão de iluminação flutuante a partir da amostra de microesferas fluorescentes. - Meça fluorescente amostra microesfera e quantificar a melhoria resolut imagemion, observando toda a largura à meia altura (FWHM) do perfil de intensidade.
- Abra o software Analisar (v4.20.01), com o módulo de NIS-A N-SIM Análise instalado e selecione "Aplicativos" -> "janela mostra N-SIM '.
- Com o contraste de modulação iluminação (IMC) e supressão de ruído de alta resolução (HRNS) definido como 1 para conjuntos de dados TIRF-SIM (Figura 2), reconstruir a imagem da amostra microesfera para gerar uma imagem reconstruída de 1.024 x 1.024 pixels com um tamanho de pixel de 30 nm.
- Usando a ferramenta de perfil de linha com uma largura de 1 de pixel (Figura 3A, caixa amarela), desenhar uma linha através do centro de uma única microesfera.
- Selecione o botão FWHM (Figura 3B, caixa amarela) e clique no maxima intensidade da distribuição de Gauss, seguido por seu mínimos intensidade.
- Confirmar a FWHM da microesfera está na gama de 100 nm (Figura 3C). Nota: o ach resoluçãoquando imaging amostras biológicas quistada irá variar dependendo da relação sinal-ruído de fundo e eficiência de marcação por fluorescência.
4. Preparação de Amostras for Imaging
- Preparação lamela.
- Recuperar lamela αCD-revestido do passo 2.1 do refrigerador ou incubadora e remover PBS contendo oCD3 e αCD28 de cada poço.
- Adicionar 200 ul de pré-aquecido suplemento HBSS a partir do passo 2.3 em cada poço da lamela. Lavar e remover para assegurar o mínimo oCD3 e αCD28 é deixado em solução. Adicionar mais 200 ul de HBSS o suplemento aos poços lamela.
- Limpar o lado de baixo da lamela com o tecido da lente para retirar o óleo e partículas.
- Posição lamela na platina do microscópio e encontrar o plano focal TIRF da lamela, utilizando o plano z PFS como encontrado na etapa 3.4.
- Preparação de Células.
- Pipetar 200 mL da mídia contenção células transfectadas do passo 1.1.8 para um tubo de micro-centrífuga.
- Células de pellets em uma micro-centrífuga a 268 xg durante 20 segundos e remova a mídia celulares.
- Ressuspender as células em 200 ul de pré-aquecido suplemento HBSS a partir do passo 2.3.
5. Células de imagem
- Tome-célula suplemento contendo HBSS ao microscópio e pipeta suavemente em 200 ul de um dos poços.
- Mantendo-se no plano focal TIRF na lamela (no modo de PFS), utilize a ocular microscópios e iluminação epifluorescência para rastrear células fluorescentes que se aproximam da lamela.
- Uma vez que as células pousar na lamela, alternar para o modo 'Live' no N-SIM Pad para trazer a imagem no monitor e verifique as células estão em foco na tela do computador.
- Para gravar tempo-cursos, abra a janela ND Aquisição e selecione a guia 'Time', clique em 'Adicionar' e configure 'Intervalo' para Nenhum atraso, 'Duração'a 10 min, 'Loops' é definido como 1.
Nota: A duração pode ser alterada, dependendo do processo de interesse; o software STICS pode extrair resultados quantitativos com pilhas de imagens de = 10 quadros quando capturadas com "Sem atraso '. - Com configurações de aquisição idênticos aos da amostra talão, iniciar a gravação de dados selecionando 'Executar agora' na janela do ND Aquisição.
6. Reconstructing SIM Images
- Depois de imagem estiver concluída, abra o software Analisar (v4.20.01), com o módulo de NIS-A N-SIM Análise instalado e selecione "Aplicativos" -> "janela mostra N-SIM '.
- Com o contraste de modulação iluminação (IMC) e supressão de ruído de alta resolução (HRNS) definido como 1 para conjuntos de dados TIRF-SIM (Figura 2), reconstruir um (ou múltiplos usando a ferramenta Batch) arquivo SIM-prima para produzir uma imagem de SIM reconstruído.
- Confirme o arquivo reconstruído tem um tamanho de pixel de 30 nm, indicado nobarra de status da imagem.
Nota: o tamanho do pixel não afecta análise STICS mas deve ser de pelo menos 2x menor em dimensão do que a resolução espacial PSF, a fim de assegurar a correlação espacial entre os pixels. - Exportar os dados como .tiff arquivos, pronto para análise STICS.
7. Análise STICS
- Baixe e extraia o STIC (C) S pacote de software Matlab (Wiseman laboratório, disponível como informação suplementar). O stics_vectormapping.m roteiro é o núcleo de uma única análise STICS canal e os primeiros 30 linhas de código são usados para definir os parâmetros de entrada, tal como definido no ponto 2.1 do manual. Abra esse script e definir os parâmetros de entrada para a análise de dados TIRF-SIM. Sugere-se também adicionar a pasta S STIC (C) com subpastas para o Matlab caminho da máquina local, conforme detalhado no apêndice do manual.
- Defina os parâmetros de entrada para a análise dos dados, editando as linhas correspondentes do código
- Para executar analise dos dados TIRF-SIM para gerar um vector mapa, defina os parâmetros temporais para sub-região temporal na linha 31 para o número máximo de quadros ea mudança temporal na linha 32 para 1. Para obter uma série temporal de mapas vetoriais variar esses parâmetros .
- Para o filtro de remoção de Immobile, defina o parâmetro "filtragem" (linha 23) para 'Média móvel' e definir o parâmetro 'MoveAverage' (linha 24) a 21.
Nota: Esta definição foi mostrado para trabalhar em movimento mais lento e grandes sinais de fluorescência, como ele é baseado em subtraindo quadros de série do quadro que está sendo analisado. - Alterar linhas 33-38 para definir o nome dos arquivos de saída e títulos dos mapas saída do vetor, bem como o caminho do diretório de saída e definir em que formato as imagens vetoriais mapa deve ser salvo.
| Tamanho do pixel (um) | 0,03 mm | A linha 19 |
| Taxa de quadros (seg) | 1 segundo | Linha 20 |
| O tempo máximo de atraso (quadros) | 20 quadros | Linha 21 |
| Tamanho sub-região (pixels) | 8 pixels | Linha 29 |
| Espaçamento sub-região (pixels) | 1 pixel | Linha 30 |
- Abra as run1ChannelSTICS script na janela Editor de Matlab. Carregue a série de imagens, executando linhas 1-23 deste script.
Nota: Este script pode ser usado para carregar e pré-processo de série de imagens, traçar os mapas vetoriais e histogramas de velocidade e executar um processamento em lote para muitos arquivos. Se necessário, cortar a imagem de uma região de interesse, usando a linha 24-26 deste script.- Linhas correm 29-35 de run1ChannelSTICS para iniciar a análise STICS. Quando solicitado, selecione um polígono para indicar uma região específica de interesse (ROI), se necessário. Certifique-se de que o ROI não se sobreponha com a borda de célula, como ocorre artefatos de limite quando STICS analisa esses reregiões.
- Linhas 38-52 executados para exibir os mapas vetoriais. Para traçar o histograma velocidade magnitude, linhas 53-72 executado.
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Representative Results
Configurações de microscópio
Depois de atingir com sucesso todas as etapas o pesquisador terá iluminação estruturada realizada (SIM) imageamento de fluxo de F-actina em uma sinapse das células T (vídeo 1) e quantificou esse fluxo molecular por espectroscopia de correlação de imagem espaço-temporal (Figura 4 11). Antes de gravar imagens, assegurar a iluminação da amostra é uniforme para as nove imagens cruas e que a iluminação estruturada na forma de franjas moiré são observados na amostra (Figura 5), estes são os dois indicadores a lamela é plana sobre o palco ea TIRF- SIM set-up está bem alinhada.
É importante para manter a potência do laser de baixo (≤10%) para garantir células permanecem tão saudável quanto possível durante o experimento. Se a expressão fluorescente é baixa, mesmo após a otimização de tele electroporação passos, aumentar o tempo de exposição de cada trama em bruto acima mencionado de 50 mseg e / ou as configurações de ganho de conversão. Como TIRF-SIM exige 9 quadros crus, uma para cada um dos 9 orientações de iluminação exigidos por imagem reconstruída, aumentando o tempo de exposição irá reduzir a taxa de quadros. Neste experimento, a exposição ms 50 permite ≈1 quadro reconstruído por segundo (também incluindo o tempo de rotação da grade), reduzindo o risco de artefatos de movimento visto quando os eventos mais rápidos percorrer múltiplos iluminação maxima em um quadro-primas.
Dependendo da velocidade de fluxo molecular a ser estudada, aumentando o tempo de exposição pode introduzir artefactos de movimento; pesquisadores devem manter os tempos de exposição ao mínimo necessário para um bom sinal. Como tamanhos de pixel em imagens do SIM são menores do que aqueles de imagens de fluorescência padrão, as populações moleculares exibem velocidades de fluxo mais rápidas podem passar através da sub-região antes de uma posterior frame é adquirido. Para o software STICS para correlacionar o sinal de fluorescência dentro desta região menores taxas mais rápidas de imagem são necessários em comparação com os conjuntos de dados de fluorescência padrão. Por exemplo, um tamanho sub-região de 8 x 8 pixels de dados SIM representa uma área de 240 x 240 nm, enquanto a 8 x 8 pixels sub-região de um conjunto de dados de fluorescência padrão representa uma área de 1,7 pM (com um tamanho de pixel assumido de 200 nm).
Durante mais tempo pratos (> 3 min) lotes de dados pode ser feita usando 'aquisição ND "para reduzir a exposição a laser durante a formação de sinapses (por exemplo, imagiologia por 10 seg a cada min durante 10 min irá expor a célula para a mesma potência de laser cumulativa como a imagem latente para <2 min continuamente).
Reconstruções sub-ótimas de imagem SIM está demonstrado na Figura 6, onde os mesmos dados em bruto foi reconstruída usando diferente alta resolutiem configurações de supressão de ruído (HRNS), as transformações frente de Fourier (FFT) e largura meio perfis máximos da fibra destaque também são mostrados. Definir a HRN é um equilíbrio entre o aumento artefatos de reconstrução devido à má relação sinal-ruído e aumentar a resolução. Um HRN que é muito baixo (<1) pode resultar em imagens granuladas com maiores artefactos SM hexagonais, enquanto muito alta uma configuração HRNS (> 1) pode 'grampo' e descartar os dados de alta resolução (visto como um diâmetro FFT reduzida). Uma resolução de> 100 nm indicaria uma necessidade de executar novamente a reconstrução com diferentes configurações, se resoluções ainda estão sub-óptima readquirir os dados com uma configuração otimizada microscópio pode ser necessária.
Imagem e quantificar o fluxo molecular
Para fluxo molecular de imagem, dados de séries temporais foi feita de células T desembarque e formar uma sinapse em um coversli estimuladoraP, F-actina pode ser visto a fluir de um modo retrógrado a partir da periferia em direcção ao centro da célula a célula. Como F-actina torna-se menos densa em direcção ao centro da análise STICS células só foi realizada na periferia da sinapse, esta região é também onde microclusters sinalização são conhecidos para originar a partir durante a formação de sinapses prolongada.
Quando a aquisição e análise de dados usando STICS é importante para entender o programa baseia-se na correlação entre as flutuações fluorescentes dentro dos sub-regiões seleccionadas para formar uma função de correlação maior e mais lisa (CF). O número absoluto de quadros necessários para gerar uma saída STICS bem sucedido não é exatamente como o software se baseia mais sobre a criação de uma saída através do número total de flutuações de sinal construtivas dentro dessas sub-regiões. Por exemplo, se o conjunto de dados tem 20 móveis, proteínas marcadas em cada sub-região que flui nas mesmas STICS direção precisará de menos quadros para geneavaliar uma saída confiável, enquanto uma sub-região com 5 proteínas resulta móveis em uma função de correlação mais fraca e pode exigir mais quadros. O número exacto de tamanho sub-armações e utilizados depende da natureza dos eventos moleculares a ser trabalhada e deve ser optimizada pelo utilizador.
Usando "quadro temporal de cultura" ferramenta a STICS é possível analisar subconjuntos de fluxo molecular através do tempo: permitindo que os investigadores para ver se as taxas de fluxo mudar dentro da mesma célula, dependendo diferentes condições celulares ou estímulos ambientais, como antes e após tratamentos com drogas. O filtro de objeto imóvel é projetado para remover qualquer população fluorescente imóvel antes de analisar a população fluorescente móvel. Usando essa abordagem, imagens que contêm percentagens de população estáticos até 90% podem ainda ser analisadas com sucesso 10. Definir o filtro imóvel para 21 quadros filtra quaisquer populações fluorescentes que permanecem estática para este período de tempo mais longo ou, que não vai contribuir para o fluxo retrógrado durante a estabilização dinâmica sinapse imunológica.
Figura 1. Microscópio configurações de aquisição. (A) Destaca as configurações N-Pad SIM utilizados para a experiência e erro do 'Fiber errado "quando os modos de canal de fibra única e não são selecionados. (B) Todas as janelas necessários para set-up, registro e reconstruir uma imagem de iluminação estruturada no sistema SIM. (C) N-SIM Pad e configurações N-SIM pop-out da janela (caixa amarela) usado para selecionar o Setup Grades depois de colocar fisicamente o 488 nm ralar no microscópio. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Configurações de reconstrução para a imagem final. Ao selecionar o botão "Param" (caixa amarela), selecione TIRF-SIM no menu suspenso e, inicialmente, definir a 'Contraste Iluminação Modulation "(IMC) e' supressão de ruído alta resolução '(HRNS) para 1. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. largura total a meia altura (FWHM) de medição. Usando o software de análise (A) mostra um gráfico de Gaussian da ferramenta de intensidade da linha seleccionada (caixa amarela) e puxado através de uma imagem reconstruída SIM de uma amostra do grânulo. (
Figura 4. Representante dados de iluminação estruturada e STICS saída. A Jurkat T célula que expressa marcado com GFP F-actina fotografada usando TIRF-SIM em uma lamela estimulante para a geração de sinapse imunológica. Cinco minutos após o contato, um curso de tempo foi feita e analisados utilizando o programa de análise STICS. Caixas amarelas representam regiões ampliada enquanto mapas de vectores de demonstrar o fluxo retrógrado de actina F na periferia sinapse. Vector cores indicam a velocidade do fluxo molecular em que a sub-região, a velocidade de dados é representada como um histograma. Devido ao Z-selectividade de excitação TIRF fornece-SIM, a amostra pode ser perdido a partir de foco se destaca ou afasta-se da lamela com o curso temporal da experiência, devido a enrugamento ou motilidade. Isto é visto aqui no painel superior direito como uma redução na densidade do vetor. A redução é resultado de STICS aplicar o filtro imóvel para sub-regiões que têm mostrado há flutuações fluorescentes para o período de tempo definido pelo usuário. Este resultado destaca a importância das regiões única seleção que contêm sinal de fluorescência para toda a série temporal. lank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. imagens Raw SIM. As nove imagens brutas da esquerda mostram as 9 orientações do padrão de grade necessária para produzir uma imagem TIRF-SIM. Fotografada celular é uma célula T de Jurkat expressando GFP marcado F-actina, a célula ampliada mostra uma das nove imagens em bruto, demonstrando iluminação não uniforme com franjas onduladas, particularmente em torno da periferia da célula. Embora a iluminação estruturada não é visível as interacções entre a iluminação da amostra e criar zonas de diferentes graus de força de iluminação, após a reconstrução isto resulta numa imagem com resolução melhorada. Ambas as barras de escala são 5 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 alta resolução supressão de ruído (HRNS) Definições do Sub-óptimas levar a reconstrução da imagem sub-ótima..; (A) mostra as diferenças em dados reconstruídos (configurações usadas mostrado no canto inferior esquerdo de cada imagem), onde menor HRNS leva ao aumento do ruído de fundo fora da região pétala e HRNS mais elevadas podem reduzir a resolução e resultar em uma perda de detalhes mais finos. (B) Representa a transformada de Fourier para a frente de imagens em (A) onde a informação periférica indica dados de alta resolução; Observe as pétalas cortadas da transformada quando HRNS é definido como 5, indicando reduzida resolução da imagem. (C) demonstra a largura total metade máxima (FWHM) da fibra actina (caixa amarela em a) para as diferentes configurações, as medições FWHM através do software deu lendode 90 nm, 100 nm e 180 nm para configurações HRNS de 0,1, 1 e 5, respectivamente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Esta técnica permitirá aos investigadores a imagem e quantificar previamente detalhes insolúveis em células que expressam fluorescência. Nos nossos resultados que mostram que os fluxos de F-actina de um modo simétrico a partir da periferia em direcção ao centro da célula a célula na célula T IS. Estes resultados são consistentes com os resultados anteriores de dados de perfil quimógrafo linha 1D 13 e ampliar a capacidade de análise de dados 2D e super-resolução.
A técnica apresentada é uma progressão de imagiologia quimógrafo que é limitado a flutuações de intensidade de fluorescência traçar por meio de uma única linha 1D ao longo do tempo. Em comparação a técnica corrente permite a quantificação de fluxo molecular de células inteiras com ambos direccionalidade e extraiu-se a velocidade. Embora imagens de manchas, também tem mostrado dinâmica 14 de actina dentro do ambiente 2D, a técnica de manchas pode ser limitado pelas dificuldades com correcção densidades de rotulagem e apenas visualiza uma subpopulação de actina.
Os passos mais importantes para alcançar esses resultados são para otimizar a eficiência de transfecção das células particulares que está sendo usado pelo pesquisador e alinhamento do sistema óptico do microscópio SIM e padrão de grade. Escolher o tamanho correto da sub-região depende das características da amostra, e é importante como muito pequeno num cenário vai significar mais rápido de fluorescência em movimento é perdido pela análise de correlação, mas a escolha muito grande de uma sub-região significará perda potencial de nuances nos dados extras adquiridos usando métodos de super-resolução.
Sub-região denota o número de pixels somados para criar um super-pixel para a análise de mapeamento de velocidade, aumentando isto pode melhorar a confiabilidade para rastrear objetos em movimento rápido. O espaçamento sub-região é a diferença entre os dados dentro superpixels. Quando o espaçamento é sub-região inferior do que o tamanho sub-região, estes vectores adjacentes irão partilhar algumas informações, aumentando esta configuração poderia reduzir contras direccionaisistency do vectormap final gerado. O tempo máximo de atraso controla a análise de correlação de tempo, onde o número inserido é o número máximo de defasagens antes de fins de análise.
Reconstrução da imagem final requer contraste modulação iluminação (IMC) e supressão de ruído de alta resolução (HRNS) configurações para ser selecionado. Configurações óptimas podem variar de amostra para amostra. IMC ajuda a distinguir o padrão de iluminação listrado sobre a amostra, e reduz artefactos de reconstrução. HRNS pode reduzir artefatos a partir de dados de baixo contraste com "grampeamento" de dados de alta resolução a partir da transformada de Fourier; para manter as capacidades de resolução máxima e minimizar artefatos de reconstrução estes são normalmente fixado em 1.
Limitações desta técnica são baseados em torno da natureza do processo 2D, como o software STICS não pode analisar dados 3D a técnica é limitado a TIRF-SIM ou 2D-SIM, este exige, portanto, a amostra a ser relatvamente plana contra a lamela. Outra desvantagem técnica é que TIRF-SIM exige 9 quadros matérias a serem coletados antes de reconstruir a imagem final super-resolução, como tal, com as nossas configurações de 50 aquisições de frame ms eo tempo gasto pelo microscópio SIM para reorientar o padrão de grade; taxas de quadro de ≈1 seg sejam alcançados. Em comparação com outros tempos de aquisição técnica super-resolução e um grande campo de visão essas limitações são aceitáveis para a maioria das aplicações.
Os resultados aqui apresentados são comparáveis com os conjuntos de dados de imagem TIRF padrão de fluxo de F-actina na formação sinapse imunológica. A boa concordância entre as modalidades de imagem demonstra STICS é robusta contra potenciais artefatos de reconstrução SIM e também que as configurações de aquisição de imagem utilizados durante SIM são aceitáveis para análise de dados. Ao usar conjuntos de dados de super-resolução de pixel com tamanhos menores mais dados podem ser extraídos a partir de células individuais e dinâmicas de sub-difração de micro-domínios celulares podem ser investigadas.
Depois de agarrar esta técnica qualquer fluxo molecular podem ser visualizados e quantificados, com o escopo de forma não invasiva investigar uma série de perguntas sobre o fluxo na membrana plasmática, ou quando a amostragem com um microscópio confocal, em qualquer lugar no plano xy da célula.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables: | |||
| Jurkat E6.1 cells | APCC | ATTC TIB-152 | |
| RPMI | Life Technologies | 21875-091 | |
| FBS | Sigma | F7524-500ML | |
| Penicillin-Strepromycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-050 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630-056 | |
| #1.5 8-well Labtek coverslips | NUNC, Labtek | 155409 | |
| LifeAct GFP construct | Ibidi | 60101 | |
| OptiMem | Life Technologies | 51985-042 | |
| anti-CD3 | Cambridge Bioscience | 317315 | |
| anti-CD28 | BD Bioscience / Insight Biotechnology | 555725 | |
| PBS | Life Technologies | 20012-019 | |
| Lens oil | |||
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment: | |||
| Gene Pulsar Xcell System | BioRad | 165-2660 | |
| Cuvette (0.4cm) | BioRad | 165-2088 | |
| Centrifuge (5810R) | Eppendorf | 5805 000.327 | |
| Centrifuge (Heraeus) | Biofuge pico | 75003235 | |
| 6 well plate | Corning | 3516 | |
| Stage-top incubator | Tokai Hit | INUH-TIZSH | |
| Nikon N-SIM microscope | Nikon | Contact company | |
| Nikon Analyse software | Nikon | Contact company | |
| Incubator (190D) | LEEC | Contact company |
References
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