Abstract
פילמנטיות אקטין ממלא תפקיד מכריע ברוב התהליכים בתא כוללים תנועתיות ו, בתאי מערכת חיסון, ההיווצרות של אינטראקציה תאי תאי מפתח הידועה כסינפסה החיסונית. F- אקטין גם העריך לשחק תפקיד בויסות החלוקה מולקולרית בקרום של תאים כוללים דינמיקת שלפוחית תת-קרומי ואשכולות חלבון. בעוד טכניקות מיקרוסקופ האור סטנדרטית מאפשרות תצפיות כלליות ועקיפות מוגבלים להתבצע, אירועים תאיים ומולקולריים רבים, כולל אשכולות וזרימה מולקולרית מתרחשים באוכלוסיות באורך-מאזניים הרבה מתחת לכח בפתרון של מיקרוסקופ אור הרגילה. על ידי שילוב כוללת הקרינה השתקפות הפנימית עם מיקרוסקופיה תאורת סופר ההדמיה ברזולוציה השיטה מובנה, הזרימה המולקולרית דו-ממדית של F- אקטין בסינפסה החיסונית של תאי T נרשמה. ספקטרוסקופיה מרחב ובזמן קורלציה תמונה (מאפיינים אילו) ולאחר מכן יושם, אשר מייצרת resul כימותTS בצורה של היסטוגרמות מהירות ומפות וקטור המייצגות זרימת יווניות וגודל. פרוטוקול זה מתאר את השילוב של טכניקות הדמיה ומאפיינים אילו ברזולוציה הסופר לייצר תזרים וקטורים ברמות תת-עקיפה של פרט. טכניקה זו שימשה כדי לאשר זרימה אקטין שהיא סימטרי מדרדר והצנטריפטלי ברחבי הפריפריה של תאי T על היווצרות סינפסה.
Introduction
מטרת הניסוי היא תמונה ומאפיין את הזרימה המולקולרית של filamentous- אקטין (F-) בתאים חיים T, שחורגת ממגבלת העקיפה כדי להקים זרימת כיוון ועצמה במהלך סינפסה החיסונית (IS) היווצרות. טכניקה זו תבוצע באמצעות מיקרוסקופ מובנה תאורה (SIM) במצב הקרינה השתקפות פנימית (TIRF) כולל, הדמיה Jurkat תאי T יוצרים סינפסה מלאכותית על הפעלת coverslips מצופה אנטי-CD3- ונוגדנים נגד CD28. הצורות היא בין תא T והיעד שלה; תא הצגת אנטיגן (APC) על קולטן תא T 1,2 הפעלה (TCR). כמו זה הוא הצעד הראשון בקביעה האם המערכת החיסונית אדפטיבית יוצרת תגובה חיסונית לזיהום, את ההשלכות של היענות לגירויים נכונה יכולות לגרום למספר המחלות. החשיבות של האינטראקציה התא T-APC מתועדת היטב, לעומת זאת, התפקיד (ים) של הבוגר הוא לאחר סי TCR הראשוניתהפנמת gnal הם עדיין לא הבינו באופן מלא.
כחשב שלד התא כדי לסייע שני תהליכים הקשורים להפעלת TCR (התנועה של מולקולות בקרום הפלזמה והשליטה של מולקולות איתות תלויות ביקטין שלד תא 3,4), הבנה כיצד שלד התא מארגן מחדש מרחב ובזמן יבהיר את הצעדים של ארגון מחדש מולקולרי במהלך היווצרות סינפסה. הוא חשב זרימת מדרדר של F- אקטין לכלוא אשכולות TCR לכיוון מרכז סינפסה החיסונית, הוא האמין טרנסלוקציה זה להיות חיוני להפסקת אות ומחזור; סיוע לאיזון העדין של הפעלת תא T 5.
בעוד מיקרוסקופ פלואורסצנטי הסטנדרטי הוא כלי גמיש שממשיך לספק תובנה על אירועים ביולוגיים רבים, כולל אינטראקציות תא-תא, הוא מוגבל על ידי היכולת של המערכת כדי לפתור במדויק fluorophores מרובה המתגורר קרוב יותר מdiffrמגבלת פעולה (≈200 ננומטר) של אחד את השני. אירועים מולקולריים רבים בתוך תאים כרוכים אוכלוסיות צפופות של מולקולות ולהציג סידור דינמי או בקפאון או על גירוי מסוים, מיקרוסקופ אור הרגילה אינה מספקת את התמונה המלאה.
השימוש בהדמיה ברזולוציה סופר אפשר לחוקרים לעקוף את מגבלת העקיפה תוך שימוש במגוון של טכניקות. מיקרוסקופיה לוקליזציה מולקולה בודדת (SMLM) כגון PALM ו6,7 STORM יש את היכולת לפתור את המיקום של מולקולות עד דיוק של כ -20 ננומטר, לעומת זאת, טכניקות אלה מסתמכים על פי רכישה ארוכה, בניית תמונה על מסגרות רבות . בדרך כלל זה דורש דגימות להיות קבועים או למבנים להציג ניידות נמוכה fluorophores כך בודדת לא כהלכה כמספר רב של נקודות. בעוד דלדול פליטה מאולץ (STED) הדמיה מאפשרת רזולוציה סופר דרך עירור confocal מאוד סלקטיבית 8, הסריקה הנדרשתגישה יכולה להיות איטית מעל שדות תא כל מבט. STED גם מדגים phototoxicity המשמעותי לרזולוציות גבוהות יותר כתוצאה מהעלייה בכוחה של קרן הדלדול.
מיקרוסקופיה תאורה המובנה (SIM 9) מספקת אלטרנטיבה לשיטות אלה, מסוגלים להכפיל את הרזולוציה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי והוא תואם יותר עם הדמיה תא חי מטכניקות SMLM הנוכחיות. היא משתמשת בסמכויות לייזר נמוכות, במערכת רחבה בתחום לשדות כל תא מבט; מיועד לספק מוגבר במהירויות רכישה, והוא תואם עם תיוג fluorophore סטנדרטי. הטבע רחב בתחום של SIM גם מאפשר הניצול של הקרינה הכוללת הפנימית השתקפות (TIRF) לעירור סלקטיבית, עם עומק חדירה בממד הצירי של <100 ננומטר.
ספקטרוסקופיה מתאם תמונה (ICS) היא שיטה של correlating תנודות בעוצמת הקרינה. אבולוציה של ICS; im מרחב ובזמןספקטרוסקופיה מתאם גיל (מאפיינים אילו 10) קורלציה אותות ניאון תאיים בזמן ובמרחב. באמצעות התאמת עוצמות פיקסל עם סובבי פיקסלים במסגרות מפגרת באמצעות פונקציית מתאם, מידע צבר לגבי זרימת מהירויות ויווניות. כדי להבטיח אובייקטים סטטיים לא להפריע לניתוח המאפיינים אילו, מסנן אובייקט נייח מיושם, אשר עובד על ידי הפחתת ממוצע נע של עוצמות פיקסל.
הוא האמין הטכניקה המוצגת כאן להיות ההפגנה הראשונה של ספקטרוסקופיה מתאם תמונה מיושמת לנתונים במיקרוסקופ ברזולוציה הסופר לכמת את הזרימה המולקולרית בתאים חיים 11. שיטה זו משפרת בהדמיה עקיפה המוגבל של זרימת F- אקטין באמצעות ניתוח המאפיינים אילו 12 ותתאים חוקרים שרוצים לקבוע זרימה מולקולרית דו-ממדית בתאים חיים, מנתונים שנרכשו ברזולוציות מרחבי שמעבר לגבול השתברות אור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: שלבים יתקיימו 1 ו -2 לפני יום ההדמיה; להבטיח את כל התקשורת והתוספים לשימוש לפני או ביום של ההדמיה equilibrated. איזון המושג באמצעות ההתחממות של תקשורת ותוספים ל -37 מעלות צלזיוס בחממה מוגדרת 5% CO 2. כל שלבי עבודת תרבית התאים וcoverslip הציפוי יתקיימו בתנאים סטריליים תחת הזרימה למינרית.
Transfection 1. תא
- Transfect תאי T להיות צילמו 24 שעות לפני הניסוי עם קידוד פלסמיד היתוך ניאון לבנות לתיוג GFP F- אקטין והדמיה. הערה: תאים יש לפצל 24 שעות לפני transfection (48 שעות לפני ההדמיה) על מנת להבטיח תאים נמצאים בבריאות אופטימלית ובשלב צמיחת הלוגריתמים שלהם.
- מקום 5 מ"ל של תוסף RPMI (FBS 1,640 תוספת 10% RPMI ו -1% פן-דלקת (אופציונלית)) ובאחד של צלחת 6-היטב לתוך החממה לאזן.
- גלולה כת 2 x 10 7 תאי Tured על 37 מעלות צלזיוס CO 2 +5% בתוספת RPMI באמצעות צינור צנטריפוגות ב 327 XG במשך 5 דקות ולשטוף בנפח שווה של תקשורת electroporation המחוממת מראש. הערה: בינוני Electroporation הוא מדיום סרום המכיל מאגרים מופחתים ותוספים (ראה מתכלה).
- לאחר מחדש pelleting ב327 XG במשך 5 דקות, resuspend התאים 500 μl של תקשורת electroporation ולהוסיף לאט לקובט, להוסיף 5 מיקרוגרם של פלסמיד ב DH הכיתה PCR 2 O לתיוג F- אקטין.
- לטפוח בעדינות את קובט על סביבת העבודה מכסה המנוע כדי להבטיח הסרת כל בועות אוויר בתקשורת, אשר יכול לגרום לקשתית של החשמל ולהפיץ את התאים באופן שווה בתקשורת.
- הפעל את מכשיר electroporation ומתח מוגדר 300 V וקיבול 290 Ω. מדגם Electroporate באמצעות דעיכה מעריכית במשך 20 אלפיות שניים. הערה: אופטימיזציה עשויה להידרש לתאים שונים ובונה פלסמיד שונה.
- ברגע שפרוטוקול transfection הואתאים מלאים, חנות על קרח 1 דקות לפני שתמשיך.
- להעביר בזהירות את התאים מקובט לצלחת 6 היטב המכילה 5 מ"ל של תוסף RPMI equilibrated מצעד 1.1.1.
- דגירה התאים O / N ב 37 ° C + 5% CO 2.
2. Coverslips מעיל ומוסף הדמיה טרום חם
- coverslips מעיל עם נוגדנים כדי לגרום לגירוי של תאי T.
- מעיל תא אחד של coverslip 8 היטב עם 1 מיקרוגרם / מיליליטר αCD3 וαCD28 ב200 μl PBS.
- חנות ב 4 ° CO / N. לחלופין, coverslips מעיל 2 שעות לפני ההדמיה ולשמור בחממה ב 37 מעלות צלזיוס כדי להפחית להיסחף בתהליך ההדמיה על ידי מזעור שינויי טמפרטורה לcoverslip.
- צור מדגם בדיקת coverslip עם microspheres ניאון 0.1 מיקרומטר תת-העקיפה.
- פתרון מניות מערבולת של חרוזים, כדי למנוע גושים.
- על coverslip חדש, נקי של הדוארו סוג כמו אלה המשמשים בשלב 2.1.1, פתרון מניות פיפטה 5 μl microsphere ניאון על פני השטח (לפי הוראות יצרן).
- מורחים פתרון microsphere על coverslip עם קצה פיפטה.
- לאפשר לו להתייבש, ולאחר מכן להחיל 200 μl הרכבה בינונית כגון PBS.
הערה: ההרכבה בינונית צריכים להתאים שמשמש לדגימות תאי הדמיה.
- לאזן HBSS (+ 20 מ"מ HEPES, להלן נקרא "תוספת HBSS ') בצינור צנטריפוגות על ידי הצבת בחממה O מראש חם / N ב 37 ° C + 5% CO 2.
הערה: התוספת של HEPES היא חיץ CO 2, אם באמצעות תא דגירה עם CO 2 קלט לדלג תוספים זה.
3. מיקרוסקופים הוגדר למעלה
- הפעל את החממה בשלב העליונה של המים מיקרוסקופ ומקום TIRF-SIM מספיק מזוקקים במאגר של מיקרוסקופ כדי לכסות את הבסיס של גוף החימום באופן מלא. לאפשר למים לדוארquilibrate עד 37 מעלות צלזיוס. הוסף את צווארון החימום לעדשה האובייקטיבית, גם להגדיר עד 37 מעלות צלזיוס.
הערה: בשל הרגישות של הסט-אפ, צעדים אלה נעשים בלילה שלפני כל כך הרכיבים האופטיים הם בטמפרטורה יציבה לפני ההדמיה. - הנח את בלוק 488 הצורם התואם TIRF בנתיב האור של המיקרוסקופ ולהבטיח במקום.
- לעבור את מצב הערוץ וכבל הסיב למצב "בודד" על הבמה מיטת הלייזר ומיקרוסקופ בהתאמה לעסוק הנתיב האופטי הנכון למצב TIRF-SIM. הערה: הדילוג על שלב זה יוביל לשגיאה (איור 1 א) בתוך חלון התוכנה.
- הפעל את כל רכיבי מיקרוסקופ ומחשב ולפתוח את תוכנת שליטת רכישה.
- פתח את לוח OC, Ti Pad, N-SIM Pad וND רכישת חלונות (איור 1). ב'לוח OC "בחר באפשרות" TIRF 488 '(איור 2, חץ צהוב). בחלון N-SIM Pad, בחר 'TIRF-SIM' והגדרות 'העברה' (איור 2 ג, חיצים צהובים). בחר בלחצן ההגדרות (איור 1 ג, תיבה צהובה) ובחר 'TIRF 488 (ל100x TIRF 488nm)' מהתפריט הנפתח, פגע "החל" ועל 'אישור'.
- הגדר את הגדרות המצלמה בתוך "הגדרות DU897 'ל: מסגרת תכנית 50 אלפיות השניים, מצב Readout, EM רווח 3 MHz 14-bit, וEM רווח מכפיל 300 עם רווח המרת 1 (איור 1 ג, קופסא ירוקה).
הערה: ראה נציגי תוצאות לשיקולים במסגרת שיעור. - לכייל התאורה של מיקרוסקופ לTIRF-SIM על ידי בחירה אובייקטיבי NA CFI Apochromat TIRF 100x 1.49, על 'N-SIM Pad' להפוך את כוח לייזר 488 ננומטר ל -10%.
הערה: גודל פיקסל של התמונות גולמיות הוא 60 ננומטר, עם שדה 512 x 512 פיקסלים מבט. - נקה את העדשה האובייקטיבית באמצעות רקמת עדשה כדי להסיר אבק ושמן.
- התחל עם המטרה בZ-המטוס הנמוך ביותר האפשרי. מניחים ירידה של שמן עדשה במטרה ולהוסיף מדגם microsphere ניאון מצעד 2.2 לבמה מיקרוסקופ.
- בחר את פונקציית מערכת פוקוס המושלמת (PFS) הממוקמת על הגוף של המיקרוסקופ.
- לאט לאט להזיז את המטרה דרך Z-המטוס עד כפתור PFS מפסיק להבהב כדי לאשר את מישור המוקד כבר הגיע.
- לעבור לתצוגה 'חי' בתוכנת שליטה והתמונה microspheres להתאמות סופיות שנעשו על ידי השימוש במייקרו-גלגל מניפולטור PFS.
- שים לב לתאורה אחידה ללא פליטת הקרינה מחוץ לפוקוס מעל הגל החולף 75 ננומטר.
הערה: ודא תאורה מובנה מתקיימת על ידי התבוננות דפוס תאורה משתנה ממדגם microsphere ניאון. - למדוד מדגם microsphere ניאון ולכמת את resolut ההדמיה המשופרתיון על ידי התבוננות רוחב המלא במחצית המרבית (FWHM) של פרופיל העצמה.
- פתח את התוכנה לנתח (v4.20.01), עם מודול ש"ח-N-SIM ניתוח מותקן ובחר 'יישומים' -> 'חלון הצג N-SIM ".
- עם ניגוד אפנון תאורה (IMC) והפחתת רעשים ברזולוציה גבוהה (HRNS) מוגדר 1 למערכי נתוני TIRF-SIM (איור 2), לשחזר את תמונת מדגם microsphere ליצור תמונה משוחזרת של 1,024 x 1,024 פיקסלים עם גודל פיקסל של 30 ננומטר.
- שימוש בכלי פרופיל הקו עם רוחב של 1 פיקסל (איור 3 א, תיבה צהובה), למתוח קו דרך מרכז microsphere יחיד.
- בחר בלחצן FWHM (איור 3, תיבה צהובה) ולחץ במקסימום העצמה של הפצת גאוס, ואחריו מינימום עוצמתו.
- לאשר את FWHM של microsphere הוא בטווח של 100 ננומטר (איור 3 ג). הערה: אח הרזולוציהדגימות ביולוגיות כאשר ההדמיה ieved ישתנו בהתאם ליחס האות לרעש מיעילות תיוג וקרינת רקע.
לדוגמא הכנה 4. הדמיה
- הכנת coverslip.
- אחזר coverslip מצופה αCD מצעד 2.1 מהמקרר או חממה ולהסיר PBS αCD3 מכיל וαCD28 מכל טוב.
- הוסף 200 μl של תוספת HBSS מראש חימם מצעד 2.3 היטב בכל coverslip. לשטוף ולהסיר כדי להבטיח αCD3 המינימלי וαCD28 נשאר בפתרון. להוסיף עוד 200 μl של תוספת HBSS לבארות coverslip.
- נקה את החלק התחתון של coverslip עם רקמת עדשה כדי להסיר שמן וחלקיקים.
- coverslip עמדה על הבמה מיקרוסקופ ולמצוא את מישור מוקד TIRF של coverslip באמצעות Z-מטוס PFS כפי שנמצא בשלב 3.4.
- תא הכנה.
- פיפטה 200 μl של קון התקשורתtaining תאי transfected מצעד 1.1.8 לתוך צינור מיקרו צנטריפוגות.
- תאים גלולה במייקרו-צנטריפוגות ב 268 XG במשך 20 שניות ולהסיר תקשורת סלולארי.
- תאי Resuspend ב -200 μl מחוממים מראש תוספת HBSS מצעד 2.3.
5. תאי הדמיה
- קח תוספת HBSS המכיל תאים למיקרוסקופ ועדינות פיפטה 200 μl לאחת מהבארות.
- בעוד שנותר במישור מוקד TIRF בcoverslip (במצב PFS), להשתמש בעינית המיקרוסקופים ותאורת epifluorescence כדי לעקוב אחר תאי ניאון מתקרבים coverslip.
- ברגע שהתאים לנחות על coverslip, לעבור למצב "חי" בN-SIM Pad להביא את התמונה על הצג ולבדוק את התאים הם בפוקוס על מסך המחשב.
- כדי להקליט בזמן קורסים, לפתוח את חלון ND הרכישה ובחר בכרטיסייה 'הזמן', לחץ על 'הוסף' ולהגדיר 'מרווח' ללא עיכוב, 'משך'10 דק ',' לולאות 'הוא 1.
הערה: משך ניתן לשנות בהתאם לתהליך של עניין; התוכנה יכולה לחלץ המאפיינים אילו תוצאות כמותיות עם ערימות תמונה של ≈10 מסגרות כאשר נתפסו עם "אין עיכוב". - עם הגדרות רכישה זהות למדגם חרוז, להתחיל להקליט נתונים על ידי בחירה באפשרות "הפעל כעת" בחלון ND הרכישה.
6. תמונות המעשיר SIM
- לאחר ההדמיה תושלם, לפתוח את התוכנה לנתח (v4.20.01), עם מודול ש"ח-N-SIM ניתוח מותקן ובחר 'יישומים' -> 'חלון הצג N-SIM ".
- עם ניגוד אפנון תאורה (IMC) והפחתת רעשים ברזולוציה גבוהה (HRNS) מוגדר 1 למערכי נתוני TIRF-SIM (איור 2), לשחזר אחד (או מרובה באמצעות הכלי אצווה) קובץ ה- SIM גלם כדי לייצר תמונת SIM משוחזרת.
- לאשר את הקובץ המשוחזר יש גודל פיקסל של 30 ננומטר, שצוין בשורת מצב תמונה.
הערה: גודל פיקסל לא משפיע ניתוח מאפיינים אילו אבל זה צריך להיות לפחות 2x קטן יותר בממד מאשר ברזולוציה מרחבית כוחות הביטחון הפלסטיניים כדי להבטיח מתאם מרחבי בין פיקסלים. - לייצא את הנתונים כ.tiff קבצים, מוכנים לניתוח מאפיינים אילו.
ניתוח מאפיינים אילו 7.
- הורד ולחלץ את STIC (C) S חבילת Matlab תוכנה (המעבדה וייסמן; זמינה מידע משלים). Stics_vectormapping.m התסריט הוא הליבה של ניתוח מאפיינים אילו ערוץ אחד ואת 30 השורות הראשונות של קוד משמשות כדי להגדיר את הפרמטרים הקלט כהגדרתו בסעיף 2.1 למדריך. פתח התסריט הזה ולהגדיר את הפרמטרים של הקלט לניתוח נתונים TIRF-SIM. הוא הציע גם להוסיף תיקיית S STIC (C) עם תיקיות משנה לדרך Matlab מחשב המקומית, כמפורט בנספח של המדריך.
- הגדר את הפרמטרים של הקלט לניתוח נתונים על ידי עריכת הקווים המקביל הקוד
- כדי לבצע אנהתמוגה של נתונים TIRF-SIM כדי ליצור מפת וקטור 1, להגדיר את הפרמטרים זמניים לsubregion הזמני בקו 31 למספר המרבי של מסגרות והשינוי הזמני בקו 32 ל1. כדי להשיג סדרת זמן של מפות וקטור להשתנות פרמטרים אלה .
- עבור מסנן הסרת הניע, להגדיר את הפרמטר "סינון" (קו 23) ל'ממוצע נע 'ולהגדיר הפרמטר' MoveAverage '(קו 24) ל -21.
הערה: הגדרה זו הוכחה לעבוד עבור מרגשת ואותות הקרינה גדולים איטיים יותר, כפי שהוא מבוסס על הפחתת מסגרות סידורי מהמסגרת שנתחה. - קווי שינוי 33-38 כדי להגדיר את השם של קבצי הפלט והכותרות של מפות וקטור פלט, כמו גם את נתיב ספריית הפלט ולהגדיר באיזה פורמט צריכה להישמר תמונות מפת הווקטור.
| גודל פיקסל (מיקרומטר) | 0.03 מיקרומטר | קו 19 |
| קצב פריימים (שניות) | 1 שניות | קו 20 |
| זמן השהיה מרבי (מסגרות) | 20 מסגרות | קו 21 |
| גודל subregion (פיקסלים) | 8 פיקסלים | קו 29 |
| מרווח subregion (פיקסלים) | 1 פיקסל | קו 30 |
- פתח את run1ChannelSTICS התסריט בחלון Matlab העורך. טען את סדרת תמונה על ידי הפעלת קווי 1-23 של תסריט זה.
הערה: תסריט זה יכול לשמש לטעינה וסדרת תמונה מראש תהליך, עלילה מפות הווקטור והיסטוגרמות מהירות ולהפעיל עיבוד אצווה של קבצים רבים. במידת הצורך, לחתוך את התמונה לאזור של עניין באמצעות השורה 24-26 של תסריט זה.- קווים לרוץ 29-35 של run1ChannelSTICS להתחיל ניתוח מאפיינים אילו. כאשר תתבקש, בחר מצולע כדי לציין אזור ספציפי של העניין (ROI), אם תרצה בכך. ודא שההחזר על ההשקעה אינה חופפת עם קצה התא, כחפצי גבול להתרחש כאשר מאפיינים אילו ניתוחים מחדש אלהgions.
- קווים לרוץ 38-52 כדי להציג את מפות הווקטור. העלילה היסטוגרמה גודל מהירות, להפעיל קווי 53-72.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הגדרות מיקרוסקופ
לאחר הצלחת השגת כל צעדים החוקר יש לי הדמיה מושלמת תאורה מובנה (SIM) של זרימת F- אקטין בסינפסה תא T (וידאו 1), ולכמת את הזרימה מולקולרית זה על ידי ספקטרוסקופיה מרחב ובזמן קורלציה תמונה (איור 4 11). לפני הקלטת תמונות, להבטיח תאורת המדגם אחידה על פני תשע תמונות גולמיות ושתאורה מובנה בצורה של השוליים moire הם נצפו במדגם (איור 5), אלה הם שני המדדים coverslip שטוח על הבמה וTIRF- הגדרת ה- SIM מיושרת כהלכה.
חשוב לשמור על כוח הלייזר הנמוך (≤10%) על מנת להבטיח תאים להישאר בריאים ככל האפשר במהלך הניסוי. אם ביטוי ניאון הוא נמוך, גם לאחר אופטימיזציה של tהוא electroporation צעדים, להגדיל את זמן החשיפה של כל מסגרת גלם מעל 50 האלפיות השניים האמורים ו / או הגדרות המרת רווח. כTIRF-SIM דורש 9 מסגרות גלם, 1 לכל אחד מכיווני התאורה 9 נדרשו לתמונה משוחזרת, להגדיל את זמן החשיפה יפחית את קצב הפריימים. בניסוי זה, חשיפת msec 50 מאפשרת ≈1 מסגרת משוחזרת לשנייה (גם כוללים זמן סיבוב רשת), כדי לצמצם את הסיכון של חפצי תנועה ראו כאשר אירועים מהירים יותר לעבור מקסימום תאורה מרובה במסגרת אחת גלם.
תלוי במהירות של זרימה מולקולרית הנלמד, להגדיל את זמן החשיפה עשוי להציג את חפצי תנועה; חוקרים צריכים לשמור על זמני חשיפה למינימום הנדרש לאות טוב. כגודל פיקסל בתמונות SIM קטן יותר מאלה של תמונות הקרינה סטנדרטית, אוכלוסיות מולקולריות מציגות תזרים מהירויות גבוהות יכולות לעבור את subregion לפני fr הבאAME נרכש. לתוכנת המאפיינים אילו לתאם אות הקרינה בתוך אזור הקטן יותר זה יותר מהר שיעורי תמונה נדרשים בהשוואה למערכי נתוני הקרינה סטנדרטית. לדוגמא גודל subregion של 8 x 8 פיקסלים של נתוני ה- SIM מייצג אזור 240 x 240 ננומטר בעוד subregion פיקסל 8 x 8 מבסיס נתוני הקרינה סטנדרטי מייצג שטח של 1.7 מיקרומטר (עם גודל פיקסל הנחה של 200 ננומטר).
לקורסי זמן רבים יותר (> 3 דקות) ניתן לקחת קבוצות של נתונים באמצעות "רכישת ND 'כדי להפחית את חשיפת לייזר במהלך היווצרות סינפסה (למשל, הדמיה במשך 10 שניות בכל דקה במשך 10 דקות תחשוף את התא לאותו כוח הלייזר מצטבר כהדמיה ל< 2 דקות ברציפות).
שחזורים תת-אופטימליים מהדמית SIM הם הפגינו באיור 6, שבו אותו המידע גולמי שוחזר באמצעות גבוה resoluti שונהעל דיכוי רעש הגדרות (HRNS), התמרות קדימה פורייה (FFT) ופרופילים מרביים מחצית רוחב מלאה של הסיבים המודגשים מוצגים גם. הגדרת hrn היא איזון בין חפצי שחזור הגדלת בשל אות לרעש עני ורזולוציה הגדלת. Hrn שהוא נמוך מדי (<1) יכול לגרום לתמונות מגורענות עם חפצי SM משושה מוגברים, ואילו גבוהה מדי הגדרת HRNS (> 1) 'קליפ' יכול ולהשליך נתונים ברזולוציה הגבוהים (ראתה כקוטר FFT מופחת). רזולוציה של> 100 ננומטר הייתה להצביע על צורך להפעיל מחדש את השחזור עם הגדרות שונות, אם החלטות הן עדיין תת-אופטימליות reacquiring נתונים עם התקנת מיקרוסקופ מותאמת עשויים להידרש.
הדמיה וכימות זרימה מולקולרית
לזרימה מולקולרית תמונה, נתונים בזמן סדרה נלקחו מתאי T נחיתה ויצירת סינפסה על coversli גירויעמ ', F- אקטין ניתן לראות לזרום באופן מדרדר מהפריפריה התא לכיוון מרכז התא. כF- אקטין הופך פחות צפוף לכיוון מרכז ניתוח המאפיינים אילו תא בוצע רק בפריפריה של סינפסה, אזור זה הוא גם המקום שבי microclusters איתות ידוע מקורן במהלך היווצרות סינפסה ממושכת.
בעת רכישה וניתוח נתונים באמצעות מאפיינים אילו זה חשוב להבין את התכנית מסתמכת על correlating תנודות ניאון בתוך אזורי המשנה שנבחר כדי ליצור פונקצית קורלציה גבוהה יותר וחלקה יותר (CF). המספר המוחלט של מסגרות הדרושות כדי ליצור פלט מאפיינים אילו מוצלח הוא לא מדויק כמו התוכנה מסתמכת יותר על יצירת פלט באמצעות המספר הכולל של תנודות אות קונסטרוקטיביות בתוך אזורי משנה אלה. לדוגמא, אם יש לו את בסיס הנתונים 20 חלבונים ניידים, שכותרתו בכל subregion זורם באותו כיוון מאפיינים אילו יצטרך פחות מסגרות לגןלדרג פלט אמין, תוך subregion עם 5 תוצאות חלבונים ניידים בפונקציה מתאם חלשה יותר ועשוי לדרוש יותר מסגרות. מספר המסגרות וגודל subregion משמשים המדויק תלוי באופי של האירועים המולקולריים שצלם וצריך להיות מותאם על ידי המשתמש.
שימוש בכלי המאפיינים אילו 'זמני מסגרת חיתוך "שניתן לנתח תת קבוצות של זרימה מולקולרית בזמן: מאפשרים לחוקרים לראות אם ספיקות לשנות בתוך אותו התא בהתאם לתנאים סלולריים שונים או גירויים סביבתיים כמו לפני ואחרי טיפולים תרופתיים. מסנן האובייקט הנייח נועד להסיר כל אוכלוסיית ניאון נייחת לפני ניתוח אוכלוסיית הניאון הניידת. שימוש בגישה זו, תמונות המכילות אחוזי אוכלוסיית סטטי עד 90% עדיין יכול להיות בהצלחה ניתחו 10. הגדרת המסנן הנייח עד 21 מסגרות מסננת את כל אוכלוסיות ניאון שנותרו סטטי לתקופה זו של זמן או יותר, שלא תתרום לזרימת מדרדר הדינמית במהלך ייצוב סינפסה חיסוני.
איור 1. מיקרוסקופים הגדרות רכישה. () מדגיש את הגדרות N-SIM Pad משמשות לניסוי והטעייה 'הסיבים שגויים "כאשר מצבי ערוץ וסיב בודדים לא נבחרו. (ב) כל החלונות צריכים הגדרה, להקליט ולשחזר תמונת תאורה מובנה במערכת ה- SIM. (ג) N-SIM Pad והגדרות N-SIM חלון פופ-out (תיבה צהובה) משמשים לבחירת התקנת פומפיה לאחר הצבת ננומטר 488 צורם למיקרוסקופ פיזי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. הגדרות שחזור לתמונה הסופית. עם בחירת הכפתור "פרמטר" (תיבה צהובה), TIRF-SIM בחר מהתפריט הנפתח, ושני 'להפחתת רעשים בתחילה להגדיר את' ניגודיות אפנון תאורה '(IMC) ורזולוציה גבוהה '(HRNS) ל1. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. רוחב מלא במחצית המרבית (FWHM) מדידה. שימוש בתוכנת הניתוח () מראה עלילת גאוס מכלי עצמת קו שנבחרה (תיבה צהובה) ונמשך דרך תמונת SIM משוחזרת של מדגם חרוז. (
נתונים תאורה מובנה איור 4. נציגים ומאפיינים אילו תפוקה. Jurkat T תא להביע כותרת GFP F- אקטין הדמיה באמצעות TIRF-SIM על coverslip גירוי לדור סינפסה חיסוני. חמש דקות לאחר המגע, בזמן כמובן נלקח ונותח באמצעות תוכנת ניתוח המאפיינים אילו. צהובות תיבות מייצגות תקריב אזורים בעוד מפות וקטור להדגים את זרימת מדרדר של F- אקטין בפריפריה סינפסה. צבעי וקטור לציין את המהירות של הזרימה המולקולרית בsubregion ש, נתוני מהירות היא זממו על היסטוגרמה. בשל Z-הסלקטיביות של עירור TIRF-SIM מספק, המדגם יכול ללכת לאיבוד ממיקוד אם זה מתנתק או מתרחק מcoverslip באמצעות במהלך הניסוי הזמן בשל פורע או תנועתיות. זה נראה כאן בפנל הימני העליון כירידה בצפיפות וקטור. הירידה היא תוצאה של מאפיינים אילו החלת המסנן הנייח לאזורי משנה שלא הראו תנודות ניאון לתקופת הזמן שנקבע על ידי המשתמש. תוצאה זו מדגישה את החשיבות של אזורי בחירה רק המכילים אותות הקרינה לכל סדרת הזמן. כחוש "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
5. תמונות הגלם SIM איור. תשע תמונות גולמיות משמאל מראות את 9 אוריינטציות של דפוס הרשת הדרוש כדי לייצר תמונת TIRF-SIM. תא הדמיה הוא תא T Jurkat להביע F- אקטין GFP שכותרתו, תא תקריב ניתן לראות אחת מתשע תמונות גולמיות, הוכחת תאורה לא אחידה עם שוליים moire, במיוחד סביב הפריפריה התא. למרות התאורה המובנה אינה גלויה האינטראקציות בין התאורה והמדגם ליצור אזורי חוזק תאורה משתנה, לאחר שחזור זה תוצאות בתמונה עם רזולוציה משופרת. שני הברים בקנה מידה הם 5 מיקרומטר. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6 דיכוי רעש ברזולוציה גבוהה (HRNS) הגדרות הגדרות תת-אופטימליות להוביל לשחזור תמונה אופטימלית..; (א) מראה את ההבדלים בנתונים משוחזרים (הגדרות המשמשות מוצגות בפינה השמאלית תחתונה של כל תמונה), שבו נמוך יותר HRNS מובילה לרעש מוגבר רקע מחוץ לאזור עלה כותרת וHRNS גבוה יותר יכול להקטין את הרזולוציה ולגרום לאובדן של הפרטים העדינים. (ב) מייצג פורייה קדימה להפוך תמונות ב() שבו מידע היקפי מציין נתונים ברזולוציה גבוהים יותר; לבי הכותרת המקוטע של להפוך כאשר HRNS מוגדר 5, המצביע על רזולוציית תמונה מופחתת. (ג) מדגים את מחצית רוחב מלאה המקסימום (FWHM) של הסיבים אקטין (תיבה צהובה ב) בהגדרות השונות, מדידות FWHM באמצעות התוכנה נתנו קריאהשל 90 ננומטר, 100 ננומטר ו -180 ננומטר להגדרות HRNS של 0.1, 1, ו -5 בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
טכניקה זו מאפשרת לחוקרי תמונה ולכמת בעבר פרטים פתירים בתאים לבטא הקרינה. בתוצאות שלנו מראים כי F- אקטין זורם בצורה סימטרית מהפריפריה התא לכיוון מרכז התא בתא T הוא. הממצאים אלה עולים בקנה אחד עם תוצאות קודמות מנתוני רשם גלים פרופיל קו 1D 13 ולהאריך את היכולת של ניתוח ל2D ונתונים ברזולוציה סופר.
הטכניקה המוצגת הינה התקדמות מהדמיה רשם גלים שהוא מוגבל לקשירת קשר לתנודות עוצמת הקרינה באמצעות קו 1D אחת לאורך זמן. בהשוואה הטכניקה הנוכחית מאפשרת כימות של זרימה מולקולרית תא שלם עם שני יווניות ומהירות שחולצו. בעוד הדמיה רבב הראתה גם דינמיקה אקטין 14 בסביבה 2D, טכניקת רבב יכולה להיות מוגבלת על ידי קשיים עם צפיפות תיוג נכונה ורק מדמיין תת-אוכלוסייה של אקטין.
צעדים החשובים ביותר כדי להשיג תוצאות אלה כדי לייעל את יעילות transfection של תאים מסוימים בשימוש על ידי החוקר והיישור של אופטיקה מיקרוסקופ SIM ודפוס צורם. בחירת הגודל הנכון של subregion תלוי במאפייני המדגם, וחשובה לא פחות קטנה מדי הגדרה תהיה משמעות מהר יותר הקרינה מרגשת הולכת לאיבוד על ידי ניתוח המתאם, אבל בחירה גדולה מדי subregion יהיה משמעות אובדן פוטנציאלי של ניואנסים בנתונים נוספים שנרכשו באמצעות שיטות ברזולוציה סופר.
Subregion מציין את מספר הפיקסלים סיכמו ליצור סופר-פיקסל לניתוח מיפוי מהירות, הגדלת זה עשוי לשפר את האמינות למעקב אחר אובייקטים נעים מהר יותר. מרווח subregion הוא הפער בין הנתונים בתוך superpixels. כאשר מרווח subregion נמוך מגודל subregion, וקטורים הסמוכים אלה מוכנים לחלוק קצת מידע, הגדלת הגדרה זו יכולה להפחית חסרונות כיווניתistency של vectormap הסופי שנוצר. זמן ההשהיה המרבי שולט ניתוח מתאם הזמן, שבו המספר שהוזן הוא המספר המרבי של זמן מפגר לפני ניתוח קצוות.
שחזור של התמונה הסופית דורש ניגוד אפנון תאורה (IMC) והגדרות דיכוי רעש ברזולוציה גבוהה (HRNS) להיבחר. הגדרות אופטימליות יכולות להיות שונות ממדגם לטעום. IMC מסייע להבחין דפוס תאורת פסים על המדגם, ומפחית את חפצי שיקום. HRNS יכול להפחית חפצים מנתוני ניגודיות נמוכים על ידי "גזירה" נתונים ברזולוציה גבוהים מההתמרה פורייה; כדי לשמור על יכולות רזולוציה מקסימלית ולמזער חפצי שחזור אלה נקבעים בדרך כלל ב1.
מגבלות של שיטה זו מבוססות סביב טבע 2D של התהליך, כמו תוכנת המאפיינים אילו לא יכולה לנתח נתונים 3D הטכניקה מוגבלת לTIRF-SIM או 2D-SIM, זה כן דורש המדגם להיות relatively שטוח נגד coverslip. חסרון טכני נוסף הוא שTIRF-SIM דורש 9 מסגרות גלם שנאסף לפני שחזור התמונה ברזולוציה הסופר הסופית, ככזה עם ההגדרות של 50 רכישות מסגרת msec והזמן שלקח למיקרוסקופ SIM לארגון מחדש של דפוס הרשת שלנו; שיעורי מסגרת של ≈1 שניות מושגות. לעומת פעמים רכישת טכניקה ברזולוציה סופר אחרות והשדה הגדול של השקפת מגבלות אלה מקובלות עבור מרבית היישומים.
התוצאות שהוצגו כאן הן השוואה עם מערכי נתונים מTIRF הדמיה סטנדרטית של זרימת F- אקטין בהיווצרות סינפסה חיסונית. ההסכם הטוב בין שיטות הדמיה מדגים מאפיינים אילו הוא חזקים נגד חפצי שחזור SIM פוטנציאל וגם שהגדרות רכישת תמונה בשימוש במהלך SIM מקובלות לניתוח נתונים. על ידי שימוש במערכי נתונים ברזולוציה סופר עם פיקסל קטן יותר גדלים יותר נתונים ניתן להפיק תאים ודינמיקה של פרטמיקרו-תחומים סלולריים UB-עקיפה עשויים להיחקר.
לאחר האחיזה בטכניקה זו כל זרימה מולקולרית ניתן הדמיה וכימות, עם היקף להלא פולשני לחקור מספר רב של שאלות בנוגע לזרימה בקרום הפלזמה, או כאשר דגימה עם מיקרוסקופ confocal, בכל מקום במישור xy של התא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables: | |||
| Jurkat E6.1 cells | APCC | ATTC TIB-152 | |
| RPMI | Life Technologies | 21875-091 | |
| FBS | Sigma | F7524-500ML | |
| Penicillin-Strepromycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-050 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630-056 | |
| #1.5 8-well Labtek coverslips | NUNC, Labtek | 155409 | |
| LifeAct GFP construct | Ibidi | 60101 | |
| OptiMem | Life Technologies | 51985-042 | |
| anti-CD3 | Cambridge Bioscience | 317315 | |
| anti-CD28 | BD Bioscience / Insight Biotechnology | 555725 | |
| PBS | Life Technologies | 20012-019 | |
| Lens oil | |||
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment: | |||
| Gene Pulsar Xcell System | BioRad | 165-2660 | |
| Cuvette (0.4cm) | BioRad | 165-2088 | |
| Centrifuge (5810R) | Eppendorf | 5805 000.327 | |
| Centrifuge (Heraeus) | Biofuge pico | 75003235 | |
| 6 well plate | Corning | 3516 | |
| Stage-top incubator | Tokai Hit | INUH-TIZSH | |
| Nikon N-SIM microscope | Nikon | Contact company | |
| Nikon Analyse software | Nikon | Contact company | |
| Incubator (190D) | LEEC | Contact company |
References
- Monks, C., Freiberg, B., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395, 82-86 (1998).
- Lanzavecchia, A. Antigen-specific interaction between T and B cells. Nature. 314, 537-539 (1985).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
- Delon, J., Bercovici, N., Liblau, R. Imaging antigen recognition by naive CD4+ T cells: compulsory cytoskeletal alterations for the triggering of an intracellular calcium response. European journal of Immunology. 28 (2), 716-729 (1998).
- Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. T Cell Receptor-Proximal Signals Are Sustained in Peripheral Microclusters and Terminated in the Central Supramolecular Activation Cluster. Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature methods. 3, 793-796 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (15), 8206-8210 (2000).
- Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells. Biophysical Journal. 88 (5), 3601-3614 (2005).
- Ashdown, G. W., Cope, A., Wiseman, P. W., Owen, D. M. Molecular Flow Quantified beyond the Diffraction Limit by Spatiotemporal Image Correlation of Structured Illumination Microscopy Data. Biophysical Journal. 107 (9), 21-23 (2014).
- Brown, C. M., et al. Probing the integrin-actin linkage using high-resolution protein velocity mapping. Journal of Cell Science. 19 (24), 5204-5214 (2006).
- Yi, J., Xufeng, S. W., Crites, T., Hammer, J. A. Actin retrograde flow and actomyosin II arc contraction drive receptor cluster dynamics at the immunological synapse in Jurkat T cells. Molecular Biology of the Cell. 23 (5), 834-852 (2012).
- Watanabe, N., Mitchison, T. J. Single-molecule speckle analysis of actin filament turnover in lamellipodia. Science. 8 (5557), 1083-1086 (2002).
