Abstract
Filamentøs-actin spiller en afgørende rolle i et flertal af celleprocesser, herunder motilitet, og i immunceller, dannelsen af en central celle-celle interaktion kendt som den immunologiske synapse. F-actin er også spekuleret at spille en rolle i reguleringen af molekylære fordelinger på membranen af celler, herunder sub-membranøs vesikel dynamik og protein klyngedannelse. Mens standard lysmikroskop teknikker gør det muligt generaliserede og diffraktionsbegrænset observationer der skal foretages, opstår mange cellulære og molekylære begivenheder, herunder klyngedannelse og molekylær flow i populationer Omsider-skalaer langt under opløsningsevne af standard lysmikroskopi. Ved at kombinere total intern refleksion fluorescens med super opløsning billeddannelse metode struktureret belysning mikroskopi blev den todimensionale molekylær strømning af F-actin på immune synapse af T-celler registreres. Spatio-temporale billede korrelation spektroskopi (STICS) blev derefter anvendt, som genererer kvantificerbare results i form af hastighed histogrammer og vektorkort repræsenterer flow direktionalitet og størrelse. Denne protokol beskriver kombinationen af super-opløsning billeddannelse og STICS teknikker til at danne flow vektorer ved sub-diffraktion niveauer af detaljer. Denne teknik blev anvendt til at bekræfte en actin strøm, som er symmetrisk retrograd og centripetale hele periferien af T-celler ved synapsedannelse.
Introduction
Målet med forsøget er at billedet og karakterisere den molekylære strøm af filamentous- (F-) actin i levende T-celler, uden diffraktionsgrænsen med henblik på at etablere flow retning og størrelse under immunologisk synapse (IS) formation. Denne teknik vil blive gennemført ved hjælp af en struktureret belysning mikroskop (SIM) i total indre refleksion fluorescens (TIRF) tilstand, billeddannelse Jurkat T-celler, der er en kunstig synapse om aktivering dækglas overtrukket med anti-CD3- og anti-CD28 antistoffer. IS formularer mellem en T-celle og dens mål; en antigenpræsenterende celle (APC) ved T-celle receptor (TCR) aktivering 1,2. Da dette er det første skridt i at afgøre, om det adaptive immunsystem genererer en immunreaktion mod en infektion, kan konsekvenserne af ukorrekt reaktion på stimuli forårsager en række sygdomme. Betydningen af T-celle-APC interaktion er veldokumenteret, dog rolle (r) i det modne IS efter indledende TCR signal internalisering er endnu ikke fuldt forstået.
Som cytoskelettet menes at støtte to processer knyttet til TCR-aktivering (bevægelsen af molekyler på plasmamembranen og kontrollen med signalmolekyler afhængige actincytoskelettet 3,4), forstå, hvordan cytoskelettet omarrangerer rumligt og tidsligt vil belyse trinene molekylær reorganisering under synapsedannelse. Retrograd strømning af F-actin menes at corral TCR klynger mod midten af det immunologiske synapse, er denne translokation menes at være afgørende for signal ophør og genbrug; medvirken den fine balance i T-celle aktivering 5.
Mens standard fluorescens mikroskopi er et fleksibelt værktøj, der fortsætter med at give indsigt om mange biologiske begivenheder, herunder celle-celle-interaktioner, er det begrænset af systemets evne til præcist at løse flere fluoroforer bopæl tættere end diffrhandling grænse (≈200 nm) af hinanden. Da mange molekylære begivenheder inden celler involverer tætte bestande af molekyler og udviser dynamisk omlægning enten i hvile eller efter specifik stimulering, er konventionel lysmikroskopi ikke giver det fulde billede.
Anvendelsen af super opløsning billeddannelse har tilladt forskere til at omgå diffraktionsgrænsen anvendelse af en række teknikker. Enkelt molekyle lokalisering mikroskopi (SMLM), såsom Palm og STORM 6,7 har evnen til at løse placering af molekyler op til en nøjagtighed på ca. 20 nm, men disse teknikker afhængige af lange erhvervelsestider, opbygge et billede over mange rammer . Generelt kræver dette prøver, der skal faste eller til strukturer til at udvise lav mobilitet så enkelt fluoroforer ikke misforstås som flere point. Mens stimuleret emission depletion (STED) billedbehandling giver super opløsning gennem meget selektiv konfokal excitation 8, den krævede scanningtilgang kan være langsom i løbet af hele celler synsfelter. STED viser også betydelige fototoksicitet for højere opløsninger på grund af stigningen i magt nedbrydningen stråle.
Struktureret belysning mikroskopi (SIM 9) er et alternativ til disse metoder, i stand til at fordoble opløsningen af en standard fluorescens mikroskop og er mere kompatibel med levende celler end de nuværende SMLM teknikker. Det bruger lavere laser beføjelser, på en lang-felt for hel-celle synsfelter; sikrer øget erhvervelse hastigheder, og er kompatibel med standard fluorophor mærkning. Vidvinkelbilledet karakter SIM tillader også anvendelsen af total indre refleksion fluorescens (TIRF) for meget selektiv excitation, med indtrængningsdybder i den aksiale dimension <100 nm.
Billede korrelation spektroskopi (ICS) er en metode til at korrelere variationer i fluorescensintensitet. En videreudvikling af ICS; Spatio-temporale imalder korrelation spektroskopi (STICS 10) korrelerer intracellulære fluorescerende signaler i tid og rum. Ved at korrelere pixel intensiteter med omgivende pixels i tilbagestående rammer via en korrelationsfunktion, der får kendskab om flow hastigheder og retningsbestemmelse. For at sikre statiske objekter ikke forstyrrer STICS analyse, en immobil objekt-filter implementeret, som fungerer ved at trække et glidende gennemsnit af de pixel intensiteter.
Teknikken præsenteres her menes at være den første demonstration af billedet korrelation spektroskopi anvendes til super-opløsning mikroskopi data at kvantificere den molekylære flow i levende celler 11. Denne metode forbedrer diffraktionsbegrænset billeddannelse af F-actin flow via STICS analyse 12 og ville passe forskere, der ønsker at bestemme todimensional molekylær flow i levende celler, fra data indhentet ved rumlige opløsninger ud diffraktionsgrænsen af lys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: trin 1 og 2 finder sted før dagen for billeddannelse; sikre, at alle medier og kosttilskud for at blive brugt før eller på dagen for billedbehandling er i ligevægt. Ækvilibrering opnås ved opvarmning af medier og supplementer til 37 ° C i en inkubator indstillet til 5% CO2. Alle cellekultur arbejde og dækglas plating trin finder sted i sterile forhold under en laminar strømning hætte.
1. celletransfektion
- Transfektere T-celler, der skal afbildes 24 timer før forsøget med et plasmid der koder for et fluorescerende fusion konstruktion til F-actin GFP mærkning og billeddannelse. Bemærk: Celler bør opdeles i 24 timer før transfektion (48 timer før billeddannelse) for at sikre celler er på et optimalt helbred og i deres logaritmiske vækstfase.
- Placer 5 ml RPMI supplement (RPMI 1640 plus 10% FBS og 1% Pen-Strep (ekstraudstyr)) i en enkelt brønd i en 6-brønds plade i rugemaskine i ligevægt.
- Pellet 2 x 10 7 T-celler kultmåles ved 37 ° C 5% CO2 i RPMI supplement anvendelse af en centrifuge rør ved 327 xg i 5 minutter og vaskes i et lige så stort volumen forvarmet elektroporation medier. Bemærk: Elektroporation medium er en reduceret serum medium, der indeholder buffere og kosttilskud (se forbrugsstoffer).
- Efter fornyet pelletering ved 327 xg i 5 minutter, cellerne resuspenderes i 500 pi elektroporation medier og tilsæt langsomt til en kuvette, tilsættes 5 ug af plasmidet i PCR-kvalitet dH2O til mærkning F-actin.
- Bank forsigtigt på kuvetten på hætten arbejdsområdet til at sikre fjernelse af eventuelle luftbobler i medierne, som kan forårsage gnister af elektricitet og til at distribuere cellerne jævnt i medierne.
- Tænd elektroporeringsapparat og sæt spænding til 300 V og kapacitans til 290 Ω. Elektroporere prøve ved anvendelse af en eksponentiel henfald i 20 msek. Bemærk: Det kan være nødvendigt Optimization for forskellige celler og forskellige plasmidkonstruktioner.
- Når transfektionsprotokol erkomplette, lagre celler på is i 1 min før du fortsætter.
- Overføre forsigtigt cellerne fra kuvetten til 6-brønds plade indeholdende 5 ml ækvilibreret RPMI supplement fra trin 1.1.1.
- Inkubér cellerne O / N ved 37 ° C + 5% CO2.
2. Coat Dækglas og Pre-varm Imaging Supplement
- Coat dækglas med antistoffer til at inducere T-celle-stimulering.
- Coat hvert kammer i et 8-brønd dækglas med 1 pg / ml aCD3 og αCD28 i 200 pi PBS.
- Opbevares ved 4 ° CO / N. Alternativt coat dækglas 2 timer forud for billeddannelse og holde i en inkubator ved 37 ° C for at reducere afdrift under billedprocessen ved at minimere temperaturændringer til dækglasset.
- Opret et dækglas prøven med 0,1 um sub-diffraktion fluorescerende mikrokugler.
- Vortex stamopløsning af perler for at undgå klumper.
- På en ny, ren dækglas af the samme type som dem, der anvendes i trin 2.1.1, pipette 5 pi fluorescerende mikrosfære stamopløsning på overfladen (ifølge producentens anvisninger).
- Spred mikrokugle opløsning over dækglasset med pipettespidsen.
- Lad det tørre, anvendes 200 pi monteringsmedium såsom PBS derefter.
Bemærk: monteringsmediet skal matche det, der anvendes til billeddannelse celleprøver.
- Ækvilibrer HBSS (+ 20 mM HEPES, herefter kaldet "HBSS supplement«) i et centrifugeglas ved at placere i en inkubator til at pre-varm O / N ved 37 ° C + 5% CO2.
Bemærk: tilføjelse af HEPES er til buffer CO2, hvis du bruger en inkubation kammer med CO 2 input springe dette tilskud.
3. Mikroskop Opsætning
- Tænd scenen-top inkubator i TIRF-SIM mikroskop og sted nok destilleret vand i reservoiret i mikroskopet til helt at dække bunden af varmeelementet. Tillad vand til equilibrate til 37 ° C. Tilføj opvarmning kraven til objektivlinsen, også indstille til 37 ° C.
Bemærk: På grund af følsomheden af opsætning, er disse trin udføres natten før så de optiske komponenter er ved en stabil temperatur før billeddannelse. - Placer TIRF 488 kompatible rist blok i lysbanen af mikroskopet og fastgør på plads.
- Skifte kanal mode og fiber kablet til 'Single' positionen på laser seng og mikroskop scenen henholdsvis at engagere den rigtige optiske bane for TIRF-SIM-tilstand. Bemærk: Springer dette trin vil føre til en fejl (figur 1A) i softwaren vinduet.
- Tænd alle mikroskop og computer-komponenter og åbn erhvervelse kontrol software.
- Åbn OC panel, Ti Pad, N-SIM Pad og ND Acquisition vinduer (figur 1B). I 'OC Panel' vælge muligheden 'TIRF 488 «(figur 2B, gul pil). I N-SIM Pad vinduet, skal du vælge 'TIRF-SIM "og" Moving "indstillinger (figur 2C, gule pile). Vælg knappen Indstillinger (figur 1C, gul boks) og vælg 'TIRF 488 (til 100x TIRF 488 nm) «fra rullemenuen, hit' Anvend" og "OK".
- Indstil kameraets indstillinger inden for de 'DU897 indstillinger' til: Frame Rate 50 msek, indstilles til udlæsning, EM Gain 3 MHz ved 14-bit, og EM Gain Multiplier 300 med en konvertering Gain af 1 (figur 1C, grøn boks).
Bemærk: Se Repræsentative Resultater for frame rate overvejelser. - Kalibrere mikroskopets belysning til TIRF-SIM ved at vælge 100x 1,49 NA CFI Apochromat TIRF mål om »N-SIM Pad 'dreje 488 nm laser magt til 10%.
Bemærk: Pixel størrelse rå billeder er 60 nm, med en 512 x 512 pixel synsfelt. - Rengør objektivlinsen hjælp linsestof at fjerne støv og olie.
- Start med målsætningen i den lavest mulige z-planet. Placer en dråbe linse olie på objektive og tilsæt fluorescerende mikrosfæreprøven fra trin 2.2 til objektbordet.
- Vælge funktionen Perfect Focus System (PFS) placeret på kroppen af mikroskopet.
- Langsomt bevæger målet op gennem z-planet indtil knappen PFS stopper med at blinke for at bekræfte brændplanet er nået.
- Skift til 'live' syn på kontrol software og image mikrokugleme for endelige justeringer ved hjælp af PFS mikro-manipulator hjulet.
- Overhold ensartet belysning uden ude af fokus fluorescensemission over 75 nm kortvarig bølge.
Bemærk: Bekræft struktureret belysning opfyldes ved at observere en svingende belysning mønster fra det fluorescerende mikrosfære prøven. - Mål fluorescerende mikrosfæreprøven og kvantificere den forbedrede imaging resolution ved at observere den fulde bredde ved halvt maksimum (FWHM) af intensiteten profil.
- Åbn Analyze software (v4.20.01), med NIS-A N-SIM Analyse modul installeret, og vælg 'Programmer' -> 'Vis N-SIM vinduet'.
- Med belysningen modulation kontrast (IMC) og høj opløsning støjreduktion (HRNS) sat til 1 for TIRF-SIM datasæt (figur 2), rekonstruere mikrosfæreprøven billede for at generere et rekonstrueret billede af 1.024 x 1.024 pixels med en pixelstørrelse på 30 nm.
- Brug af linjen profil værktøj med en bredde på 1 pixel (figur 3A, gul boks), tegne en linje gennem midten af en enkelt mikrosfære.
- Vælg FWHM knappen (figur 3B, gul boks), og klik på intensiteten maksima af Gauss fordeling, efterfulgt af dens intensitet minima.
- Bekræft FWHM af mikrosfæren er i området fra 100 nm (figur 3C). Bemærk: opløsningen achieved når imaging biologiske prøver vil variere afhængigt af signal-støj-forholdet fra mærkningseffekt og baggrundsfluorescens.
4. Prøve Forberedelse til Imaging
- Dækglasset præparat.
- Hent aCD-belagt dækglas fra trin 2.1 fra køleskabet eller inkubator og fjern PBS indeholdende aCD3 og αCD28 fra hver brønd.
- Tilsæt 200 pi foropvarmede HBSS supplement fra trin 2.3 til hver brønd af dækglasset. Vask og fjern for at sikre minimal aCD3 og αCD28 er tilbage i opløsning. Tilføj yderligere 200 ul af HBSS supplement til dækglasset brønde.
- Rengøre undersiden af dækglasset med linsepapir for at fjerne olie og partikler.
- Position dækglas på mikroskopbordet og finde TIRF brændplan dækglasset ved hjælp af PFS z-plan som i trin 3.4.
- Cellepræparation.
- Pipettere 200 pi af medierne conTaining transficerede celler fra trin 1.1.8 i en mikro-centrifugerør.
- Pellet celler i en mikro-centrifuge ved 268 xg i 20 sekunder og fjern celle medier.
- Resuspender celler i 200 pi foropvarmede HBSS supplement fra trin 2.3.
5. Imaging Celler
- Tag celleholdige HBSS supplement til mikroskopet og forsigtigt pipette 200 pi i en af brøndene.
- Mens de resterende i TIRF fokalplan på dækglasset (i PFS-tilstand), skal du bruge mikroskoper okularet og epifluorescens belysning til at spore fluorescerende celler nærmer dækglasset.
- Når cellerne lander på dækglasset, skifte til 'live' mode i N-SIM Pad for at bringe billedet op på skærmen og kontrollere cellerne er i fokus på computerskærmen.
- Hvis du vil optage time-kurser, åbne ND Acquisition vinduet og vælg fanen 'Time', klik på 'Tilføj' og sæt 'Interval "til Ingen forsinkelse," Varighed'til 10 min, 'Loops' er sat til 1.
Bemærk: Varigheden kan ændres afhængigt af processen af interesse; den STICS software kan udtrække kvantitative resultater med billede stakke af ≈ 10 rammer, når taget med 'Ingen Forsinkelse «. - Med identiske indstillinger erhvervelse til perlen prøve, begynder at optage data ved at vælge "Kør nu" i ND Acquisition vinduet.
6. Genopbygning SIM-billeder
- Efter billeddannelse er færdig, skal du åbne Analyze software (v4.20.01), med NIS-A N-SIM Analyse modul installeret, og vælg 'Programmer' -> 'Vis N-SIM vinduet'.
- Med belysningen modulation kontrast (IMC) og høj opløsning støjreduktion (HRNS) sat til 1 for TIRF-SIM datasæt (figur 2), rekonstruere et (eller flere ved hjælp af værktøjet Batch) råt SIM-fil til at producere en rekonstrueret SIM billede.
- Bekræft rekonstruerede fil har en pixel størrelse på 30 nm, er angivet ibillede statuslinjen.
Bemærk: Pixel størrelse påvirker ikke STICS analyse, men det bør være mindst 2x mindre i dimension end PSF rumlige opløsning for at sikre rumlig sammenhæng mellem pixels. - Eksportere dataene som .tiff filer, klar til STICS analyse.
7. STICS Analyse
- Download og udtrække STIC (C) S Matlab softwarepakke (Wiseman lab, til rådighed som supplerende oplysninger). Scriptet stics_vectormapping.m er kernen i en enkelt kanal STICS analyse og de første 30 linjer kode anvendes til at definere input parametre, som defineret i punkt 2.1 i manualen. Åbn dette script og definere input parametre for TIRF-SIM dataanalyse. Det foreslås også at tilføje STIC (C) S mappe med undermapper til den lokale maskine Matlab vej, som beskrevet i tillægget af manualen.
- Definer input parametre til analyse af data ved at redigere de tilsvarende linjer i koden
- For at udføre analyse af TIRF-SIM data til at generere 1 vektor kort, skal du indstille de tidsmæssige parametre til tidsmæssig delområde på linje 31 til det maksimale antal billeder og den tidsmæssige forskydning i tråd 32 til 1. For at opnå en række vektorkort tid varierer disse parametre .
- For Immobile fjernelse filteret, skal du indstille parameteren "filtrering" (linje 23) til "Moving gennemsnit 'og sæt" MoveAverage "parameter (linie 24) til 21.
Bemærk: Denne indstilling har vist sig at arbejde for langsommere bevægende og store fluorescenssignaler, da den er baseret på at trække serielle rammer fra rammen, der analyseres. - Skift linjer 33-38 for at indstille navnet på output-filer og titlerne på de output vektorkort, samt output stien og definere i hvilket format vektoren kort billeder skal gemmes.
| Pixelstørrelse (um) | 0,03 um | Linje 19 |
| Frame rate (sek) | 1 sek | Linje 20 |
| Maksimal forsinkelse tid (rammer) | 20 frames | Linie 21 |
| Delregion størrelse (pixels) | 8 pixels | Linie 29 |
| Delregion afstand (pixel) | 1 pixel | Linie 30 |
- Åbn script run1ChannelSTICS i vinduet Matlab Editor. Indlæse billedet serien ved at køre linjer 1-23 af dette script.
Bemærk: Dette script kan bruges til at indlæse og præ-proces billedserier, plotte vektorkort og hastighed histogrammer og køre en batch-behandling for mange filer. Hvis det er nødvendigt, beskære billedet til en region af interesse ved hjælp af linjen 24-26 i dette script.- Kør linier 29-35 i run1ChannelSTICS at starte STICS analyse. Når du bliver bedt, skal du vælge en polygon for at angive en specifik region af interesse (ROI), hvis det ønskes. Sørg for, at investeringsafkastet ikke overlapper med cellens kant, som grænse artefakter opstår, når STICS analyserer disse reregioner.
- Kør linjer 38-52 for at vise vektor kort. At plotte hastigheden størrelsesorden histogram, køre linier 53-72.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikroskop indstillinger
Efter en vellykket opnå alle trin forskeren vil have gennemført struktureret belysning (SIM) billeddannelse af F-actin flow i en T-celle synapse (Video 1), og kvantificeret denne molekylære flow af spatio-temporale billede korrelation spektroskopi (Figur 4 11). Før optagelse af billeder, sikre prøven belysning er ens på tværs af de ni rå billeder, og at struktureret belysning i form af Moiré frynser er observeret ved prøven (figur 5), disse er begge indikatorer dækglasset er fladt på scenen og TIRF- SIM set-up er justeret korrekt.
Det er vigtigt at holde lasereffekten lav (≤10%) for at sikre celler forbliver så sundt som muligt under eksperimentet. Hvis fluorescerende ekspression er lav, selv efter optimering af than elektroporering trin, øge eksponeringen for hver rå ramme over de angivne 50 ms og / eller konvertering Gain indstillinger. Som TIRF-SIM kræver 9 rå rammer, 1 for hver af de 9 belysning orienteringer, der kræves pr rekonstruerede billede, stigende eksponeringstid vil reducere billedhastighed. I dette eksperiment, tillader en 50 msek eksponering ≈1 rekonstruerede billeder i sekundet (herunder også gitter rotation tid), hvilket reducerer risikoen for motion artefakter ses, når hurtigere begivenheder bevæger sig gennem flere belysning maxima i en rå ramme.
Afhængig af hastigheden af molekylær strømning blev undersøgt, øge eksponeringstiden kan indføre motion artefakter; forskere bør holde eksponeringstider til finansiering af et godt signal minimum. Som pixel størrelser i SIM billeder er mindre end standard fluorescens billeder, kan molekylære populationer udviser hurtigere flow hastigheder passere gennem det lokale, før en efterfølgende frame er erhvervet. For STICS software til at korrelere fluorescens signal inden for denne mindre region hurtigere billedfiler satser er påkrævet i forhold til standard fluorescens datasæt. For eksempel en delregion størrelse på 8 x 8 pixels SIM data repræsenterer en 240 x 240 nm område, mens en 8 x 8 pixel delregion fra en standard fluorescens datasæt repræsenterer et område på 1,7 um (med en antaget pixelstørrelse på 200 nm).
I længere tid-kurser (> 3 min) partier af data kan tages ved hjælp af "ND erhvervelse« at reducere Lasereksponeringsgrænser under synapsedannelse (f.eks billeddannelse til 10 sek hver min i 10 minutter vil udsætte cellen til samme kumulative lasereffekt som billeddannelse til <2 min kontinuerligt).
Sub-optimale rekonstruktioner fra SIM billedbehandling er demonstreret i figur 6, hvor den samme rå data er blevet rekonstrueret ved hjælp af forskellige high resolutiom støj suppression (HRNS) indstillinger, er de fremadrettede Fourier transformationer (FFT) og fuld halv bredde maksimale profiler af den fremhævede fiber også vist. Indstilling af HRN er en balance mellem stigende genopbygning artefakter på grund af dårligt signal-støj og øge opløsning. En HRN, der er for lav (<1) kan resultere i kornede billeder med øget sekskantede SM artefakter, mens for høj HRNS indstilling (> 1) kan "klip" og kassér de data, høj opløsning (set som en reduceret FFT diameter). En opløsning på> 100 nm ville indikere et behov for at køres igen genopbygningen med forskellige indstillinger, hvis beslutninger er stadig ikke optimal generhverve data med en optimeret mikroskop setup kan være påkrævet.
Billedbehandling og kvantificere molekylær flow
Til billedet molekylær flow blev tidsserie data taget af T-celler landing og danner en synapse på en stimulerende coverslip, kan F-actin ses at strømme i en retrograd måde fra cellen periferien mod midten af cellen. Som F-actin bliver mindre tæt mod midten af cellen STICS analysen kun blev udført ved periferien af synapsen, denne region er også her signaling microclusters vides at stamme fra under langvarig synapse formation.
Ved køb og analyse af data ved hjælp af STICS er det vigtigt at forstå programmet er afhængig af korrelere fluorescerende udsving inden for de udvalgte underområder til at danne en højere og mere jævn korrelationsfunktionen (CF). Det absolutte antal rammer, der er nødvendige for at generere en succesfuld STICS output er ikke eksakt, da softwaren bygger mere på at skabe et output gennem det samlede antal konstruktive signal udsving inden for disse subregioner. For eksempel hvis datasættet har 20 mobile, mærkede proteiner i hver delregion flyder i samme retning STICS får brug for færre rammer til genbedømme en pålidelig udgang, mens en underregion med 5 mobile proteiner resulterer i en svagere korrelation funktion og kan kræve flere rammer. Det nøjagtige antal af rammer og subregion størrelse anvendes, afhænger af arten af de molekylære begivenheder, der afbildes, og bør optimeres af brugeren.
Brug af STICS 'Temporal ramme afgrøde' værktøj er det muligt at analysere delmængder af molekylær flow gennem tiden: at tillade forskere at se, om strømningshastigheder ændres inden den samme celle afhængigt af forskellige cellulære betingelser eller miljømæssige stimuli såsom før og efter medicinsk behandling. Den immobile objekt filter er designet til at fjerne enhver immobile fluorescerende befolkning før analysere mobile fluorescerende befolkning. Ved hjælp af denne fremgangsmåde, billeder, der indeholder statiske population procentsatser op til 90% kan stadig være vellykket analyseret 10. Indstilling af immobile filter til 21 frames filtrerer eventuelle fluorescerende befolkninger, der forbliver statisk for denne periode eller længere, hvilket ikke vil bidrage til den dynamiske retrograd strømning i immunologisk synapse stabilisering.
Figur 1. Microscope-indstillinger erhvervelse. (A) fremhæver N-SIM Pad indstillinger, der bruges til eksperimentet, og den "forkerte Fiber 'fejl, når det indre kanal og Fiber tilstande ikke er valgt. (B) Alle vinduer er nødvendige for at sætte op, optage og rekonstruere en struktureret belysning billede på SIM-systemet. (C) N-SIM Pad og N-SIM-indstillinger pop-out vindue (gul boks) bruges til at vælge risten opsætning efter fysisk at placere 488 nm rist ind i mikroskopet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Genopbygning indstillinger for det endelige billede. Ved at vælge "Param 'knappen (gul boks), skal du vælge TIRF-SIM fra rullemenuen, og i første omgang indstille både" Illumination Modulation Contrast "(IMC) og" High Resolution Noise Suppression (HRNS) til 1. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. fulde bredde ved halvt maksimum (FWHM) måling. Brug af analysesoftware (A) viser en Gauss plot fra linjen intensitet valgte værktøj (gul boks) og trukket gennem en rekonstrueret SIM billede af en perleprøve. (
Figur 4. Repræsentative struktureret belysning data og STICS output. A Jurkat T-celle, der udtrykker GFP-mærket F-actin afbildet under anvendelse af TIRF-SIM på en stimulerende dækglas for immunologisk synapse generation. Fem minutter efter kontakt blev en tidsforløbet taget og analyseret ved hjælp af STICS analyseprogrammet. Gule kasser repræsenterer zoomet regioner, mens vektorkort demonstrere retrograd strøm af F-actin ved synapsen periferien. Vektor farver indikerer hastigheden af molekylær strømning i denne subregion, er hastigheden data afbildet på et histogram. På grund af den Z-selektivitet excitation TIRF-SIM tilbyder, kan prøven tabt fra fokus, hvis det løsner eller bevæger sig væk fra dækglasset gennem tidsforløbet for eksperimentet grund ruffling eller motilitet. Dette ses her i øverste højre panel som en reduktion i vektor tæthed. Reduktionen er et resultat af STICS anvende den immobile filter på underområder som har vist ingen fluorescerende udsving for den tidsperiode, indstillet af brugeren. Dette resultat understreger vigtigheden af kun at vælge regioner, der indeholder fluorescenssignal for serier hele tiden. lank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Rå SIM-billeder. De ni rå billeder på venstre viser de 9 orienteringer af gittermønster nødvendig for at producere en TIRF-SIM billede. Cell afbildes er en Jurkat T-celle, der udtrykker GFP-mærket F-actin, zoomet celle viser en af de ni rå billeder, der viser uensartet belysning med Moiré frynser, især omkring celleperiferien. Selv den strukturerede belysningen ikke er synlig samspillet mellem belysningen og prøven skabe områder af varierende belysning styrke, efter genopbygning dette resulterer i et billede med forbedret opløsning. Begge skala barer er 5 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 Høj opløsning støjdæmpning (HRNS) indstillinger Sub-optimale indstillinger fører til suboptimal billede genopbygning..; (A) viser forskellene i rekonstruerede data (indstillinger, der bruges vist til nederst til venstre på hvert billede), hvor lavere HRNS fører til øget baggrundsstøj udenfor kronblad region og højere HRNS kan reducere opløsningen og resultere i et tab af de finere detaljer. (B) Repræsenterer den forreste Fouriertransformation af billeder i (A), hvor perifere oplysninger tyder højere opløsning af data; Bemærk de klippede kronblade af transformationen, når HRNS er sat til 5, hvilket indikerer reduceret billedopløsning. (C) viser den maksimalt fuld halv bredde (FWHM) på actin fiber (gul boks i et) ved de forskellige indstillinger, FWHM målinger gennem softwaren gav læsning90 nm, 100 nm og 180 nm for HRNS indstillinger på 0,1, 1 og 5 henholdsvis. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne teknik vil give forskere til billedet og kvantificere tidligere uløselige detaljer i celler, der udtrykker fluorescens. I vores resultater viser vi, at F-actin flyder på en symmetrisk måde fra cellen periferien mod midten af cellen i T-cellen IS. Disse resultater er i overensstemmelse med tidligere resultater fra 1D line profil kymograph data 13 og udvide kapaciteten af analysen til 2D og data super-opløsning.
De præsenterede teknik er en progression fra kymograph billeddannelse som er begrænset til at plotte fluorescensintensitetsvariationer gennem en enkelt linje 1D over tid. Sammenlignet den nuværende teknik muliggør kvantificering af helcelle molekylær strømning med både retningsvirkning og hastighed ekstraheret. Mens speckle billedbehandling også har vist actin dynamik 14 i 2D miljø, kan speckle teknik være begrænset af problemer med korrekt mærkning tætheder og kun visualiserer en subpopulation af actin.
De vigtigste skridt til at opnå disse resultater er at optimere transfektionseffektiviteten af de særlige celler, der anvendes af forskeren og tilpasning af SIM mikroskop optik og rist mønster. At vælge den rigtige størrelse subregion afhænger af prøven egenskaber og er vigtig som for lille en indstilling vil betyde hurtigere løbende fluorescens tabes ved korrelationsanalysen, men at vælge en for stor subregion vil betyde potentielle tab af nuancer i de ekstra data indsamlet ved hjælp af super-opløsning metoder.
Subregion angiver antallet af pixels summerede at skabe en super-pixel for hastighed mapping analyse viste højere kan forbedre pålideligheden til sporing hurtigere bevægelige objekter. Den delregion afstand er kløften mellem data i superpixels. Når delregion afstand er lavere end det lokale størrelse, vil disse tilstødende vektorer dele nogle oplysninger, øge denne indstilling kan reducere retningsbestemte ulemperistency af den endelige vectormap genereret. Den maksimale forsinkelse tid styrer tid korrelationsanalyse, hvor antallet inputted er det maksimale antal af tidsforskydninger før analyse ender.
Rekonstruktion af det endelige billede kræver belysning modulation kontrast (IMC) og høj opløsning støjreduktion (HRNS) indstillinger, der skal vælges. Optimale indstillinger kan variere fra prøve til prøve. IMC hjælper skelne stribet belysning mønster på prøven, og reducerer genopbygning artefakter. HRNS kan reducere artefakter fra lave data kontrast ved 'klipning' data i høj opløsning fra Fouriertransformation; at opretholde maksimal kapacitet opløsning og minimere genopbygning artefakter disse er normalt sat til 1.
Begrænsninger af denne teknik er baseret omkring 2D karakter af processen, da STICS softwaren ikke kan analysere 3D data teknikken er begrænset til TIRF-SIM eller 2D-SIM Dette kræver derfor, at prøven vedrølukkende fladt mod dækglasset. En anden teknisk ulempe er, at TIRF-SIM kræver 9 rå rammer, der skal indsamles, før rekonstruere den endelige super-opløsning billede, som sådan med vores indstillinger på 50 msek opkøb ramme og den tid, som SIM mikroskop for at omlægge gittermønster; frame rates af ≈1 sek opnås. Sammenlignet med andre teknik erhvervelse super opløsning gange og det store synsfelt disse begrænsninger er acceptable for de fleste applikationer.
Resultaterne præsenteret her, er sammenlignelige med datasæt fra standard TIRF billeddannelse af F-actin flow i immunologisk synapsedannelse. Den gode aftale mellem billeddiagnostiske modaliteter viser STICS er robust mod potentielle SIM genopbygning artefakter, og også, at indstillingerne billedoptagelse anvendes under SIM er acceptable til dataanalyse. Ved at bruge super-opløsning datasæt med mindre pixel størrelser flere data kan udtrækkes fra individuelle celler og dynamik sUB-diffraktion cellulære mikro-domæner kan undersøges.
Efter at gribe denne teknik helst molekylære flow kan afbildes og kvantificeres, med mulighed for at ikke-invasivt undersøge en lang række spørgsmål om flow på plasmamembranen, eller når prøveudtagning med en konfokal mikroskop, hvor som helst i xy-planet af cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables: | |||
| Jurkat E6.1 cells | APCC | ATTC TIB-152 | |
| RPMI | Life Technologies | 21875-091 | |
| FBS | Sigma | F7524-500ML | |
| Penicillin-Strepromycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-050 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630-056 | |
| #1.5 8-well Labtek coverslips | NUNC, Labtek | 155409 | |
| LifeAct GFP construct | Ibidi | 60101 | |
| OptiMem | Life Technologies | 51985-042 | |
| anti-CD3 | Cambridge Bioscience | 317315 | |
| anti-CD28 | BD Bioscience / Insight Biotechnology | 555725 | |
| PBS | Life Technologies | 20012-019 | |
| Lens oil | |||
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment: | |||
| Gene Pulsar Xcell System | BioRad | 165-2660 | |
| Cuvette (0.4cm) | BioRad | 165-2088 | |
| Centrifuge (5810R) | Eppendorf | 5805 000.327 | |
| Centrifuge (Heraeus) | Biofuge pico | 75003235 | |
| 6 well plate | Corning | 3516 | |
| Stage-top incubator | Tokai Hit | INUH-TIZSH | |
| Nikon N-SIM microscope | Nikon | Contact company | |
| Nikon Analyse software | Nikon | Contact company | |
| Incubator (190D) | LEEC | Contact company |
References
- Monks, C., Freiberg, B., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395, 82-86 (1998).
- Lanzavecchia, A. Antigen-specific interaction between T and B cells. Nature. 314, 537-539 (1985).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
- Delon, J., Bercovici, N., Liblau, R. Imaging antigen recognition by naive CD4+ T cells: compulsory cytoskeletal alterations for the triggering of an intracellular calcium response. European journal of Immunology. 28 (2), 716-729 (1998).
- Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. T Cell Receptor-Proximal Signals Are Sustained in Peripheral Microclusters and Terminated in the Central Supramolecular Activation Cluster. Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature methods. 3, 793-796 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (15), 8206-8210 (2000).
- Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells. Biophysical Journal. 88 (5), 3601-3614 (2005).
- Ashdown, G. W., Cope, A., Wiseman, P. W., Owen, D. M. Molecular Flow Quantified beyond the Diffraction Limit by Spatiotemporal Image Correlation of Structured Illumination Microscopy Data. Biophysical Journal. 107 (9), 21-23 (2014).
- Brown, C. M., et al. Probing the integrin-actin linkage using high-resolution protein velocity mapping. Journal of Cell Science. 19 (24), 5204-5214 (2006).
- Yi, J., Xufeng, S. W., Crites, T., Hammer, J. A. Actin retrograde flow and actomyosin II arc contraction drive receptor cluster dynamics at the immunological synapse in Jurkat T cells. Molecular Biology of the Cell. 23 (5), 834-852 (2012).
- Watanabe, N., Mitchison, T. J. Single-molecule speckle analysis of actin filament turnover in lamellipodia. Science. 8 (5557), 1083-1086 (2002).
