Abstract
Trådformede-actin spiller en avgjørende rolle i et flertall av celleprosesser, inkludert motilitet og i immunceller, dannelse av en nøkkel celle-celle-interaksjon som kalles den immunologiske synapse. F-aktin spekuleres også å spille en rolle i å regulere molekylfordelinger ved membran av celler inkludert sub-membran vesikkel dynamikk og protein gruppering. Mens vanlige lysmikroskop teknikker tillater gener og diffraksjon-begrenset observasjoner skal gjøres, mange cellulære og molekylære hendelser inkludert clustering og molekylær flyt forekomme i populasjoner i lengden-vekter langt under oppløsningsevne standard lysmikroskopi. Ved å kombinere total indre refleksjon fluorescens med superoppløsningsavbildningsmetode strukturert belysning mikroskopi, ble det todimensjonale molekyl strøm av F-aktin ved immun synapse av T-celler registrert. Rom-tid-bilde korrelasjonsspektroskopi (pinner) ble deretter påført som genererer kvantifiserbare results i form av histogrammer og hastighetsvektorkart som representerer strømnings retningen og størrelsen. Denne protokollen beskriver kombinasjonen av super-Resolution Imaging og pinner teknikker for å generere strøm vektorer på sub-diffraksjon detaljnivå. Denne teknikken ble brukt til å bekrefte en aktin flyt som er symmetrisk retrograd og sentripetal hele periferien av T-celler ved synapse formasjonen.
Introduction
Målet med eksperimentet er å avbilde og karakterisere molekyl strømmen av filamentous- (F-) aktin i levende T-celler, utover diffraksjonsgrensen for å etablere strømnings retning og størrelse i løpet av immunologisk synapse (IS) dannelse. Denne teknikk vil bli utført ved anvendelse av en strukturert belysning mikroskop (SIM) i total indre refleksjon fluorescens (TIRF) modus, å avbilde Jurkat T-celler som danner en kunstig synapse om aktivering av dekk belagt med anti-CD3- og anti-CD28-antistoffer. IS dannes mellom en T-celle og dens mål; en antigenpresenterende celle (APC) ved T-cellereseptoren (TCR) aktivering 1,2. Siden dette er det første trinnet i å bestemme hvorvidt det adaptive immunsystemet genererer en immunrespons mot en infeksjon, kan konsekvensene av feil respons på stimuli forårsaker en rekke sykdommer. Betydningen av T-celle-APC interaksjon er godt dokumentert, er imidlertid rollen (e) i det modne, etter innledende TCR siSignal- intern er ennå ikke fullt ut forstått.
Som cytoskjelettet er antatt å hjelpe til to prosesser knyttet til TCR aktivering (bevegelsen av molekylene i plasmamembranen og styring av signalmolekyler som er avhengig av aktin cytoskjelettet 3,4), å forstå hvordan cytoskjelettet ordner romlig og tidsmessig vil belyse fremgangsmåten molekylær omorganisering under synapse formasjon. Den retrograde strømmen av F-aktin er tenkt å samle TCR klynger mot midten av den immunologiske synapse, denne translokasjonen antas å være avgjørende for signal opphør og resirkulering; hjelpe den fine balansen i T-celleaktivering 5.
Mens standard fluorescens mikroskopi er et fleksibelt verktøy som fortsetter å gi innsikt om mange biologiske hendelser, inkludert celle-celle interaksjoner, er det begrenset av systemets evne til å nøyaktig løse flere fluoroforene bosatt nærmere enn diffrhandling grense (≈200 nm) fra hverandre. Som mange molekylære hendelser i cellene innebære tette bestander av molekyler og viser dynamisk omorganisering enten i quiescence eller ved spesifikk stimulering, ikke konvensjonell lysmikroskopi gir ikke hele bildet.
Bruken av superbildeoppløsningen har tillatt forskere å omgå diffraksjonsgrensen ved hjelp av en rekke teknikker. Enkelt molekyl lokalisering mikroskopi (SMLM) som PALM og STORM 6,7 har evnen til å løse plasseringen av molekyler opp til en nøyaktighet på omkring 20 nm, men disse teknikkene er avhengige av lange innhentingstider, å bygge opp et bilde over mange rammer . Vanligvis dette krever prøver å bli løst eller for strukturer for å utvise lav mobilitet så enkelt fluorophores ikke mistolkes som flere punkter. Mens stimulert emisjon mangel (STED) avbildning gjør super-oppløsning gjennom svært selektiv konfokalt eksitasjon 8, ønsket skanningtilnærming kan være treg i løpet av hele celle synsfelt. STED demonstrerer også betydelig fototoksisitet for høyere oppløsninger på grunn av økningen i kraft av uttømming trålen.
Strukturert belysning mikroskopi (SIM 9) gir et alternativ til disse metodene, i stand til å doble oppløsningen på en standard fluorescens mikroskop og er mer kompatible med levende celle bildebehandling enn dagens SMLM teknikker. Den bruker lavere laser krefter, på et bredt felt system for hel-celle synsfelt; gir økt oppkjøps hastigheter, og er kompatibel med standard fluorophore merking. Den brede felt natur SIM tillater også bruk av total indre refleksjon fluorescens (TIRF) for svært selektiv eksitasjon, med penetreringsdybde i den aksiale dimensjon på <100 nm.
Bildekorrelasjonsspektroskopi (ICS) er en metode for å korrelere endringer i fluorescensintensitet. En evolusjon av ICS; Rom-tid imalder korrelasjonsspektroskopi (pinner 10) korrelerer intracellulære fluorescerende signaler i tid og rom. Ved å korrelere pixel intensiteter med omkringliggende piksler i lagging rammer via en korrelasjonsfunksjon, er informasjonen han fikk om strømningshastighet og retningen. For å sikre statiske gjenstander ikke interfererer med pinner analysen, er et ubevegelig objekt filter implementert, som fungerer ved å trekke et glidende gjennomsnitt av bildeelementintensitetene.
Teknikken som presenteres her antas å være den første demonstrasjonen av bildekorrelasjonsspektroskopi blir brukt til super-oppløsning mikros data for å kvantifisere den molekylære strømmen i levende celler 11. Denne metoden forbedrer på diffraksjon-begrenset avbildning av F-aktin flyt via pinner analyse 12 og vil passe forskere som ønsker å bestemme todimensjonal molekylær flyt i levende celler, fra data innsamlet ved romlig oppløsning utover diffraksjon grensen for lys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Note: Stages 1 og 2 foregår før dagen for bildebehandling; sikre alle medier og kosttilskudd som skal brukes før eller samme dag som bildebehandling er i likevekt. Likevekt er oppnådd gjennom oppvarming av media og kosttilskudd til 37 ° C i en inkubator satt til 5% CO 2. Alle cellekulturarbeid og dekkpletteringstrinnet finner sted i sterile betingelser under en laminær strømningshette.
1. Cell Transfeksjon
- Transfektere T-cellene som skal bli avbildet 24 timer før forsøket med et plasmid som koder for et fluoriserende fusjonskonstruksjon for F-aktin GFP merking og avbildning. Merk: Cellene bør være delt 24 timer før transfeksjon (48 timer forut for avbildning) for å sikre at celler som er i optimal helse og i deres logaritmiske vekstfase.
- Plassere 5 ml RPMI supplement (RPMI 1640 pluss 10% FBS og 1% Pen-Strep (valgfritt)) i en enkelt brønn i en 6-brønns plate inn i inkubatoren for å oppnå likevekt.
- Pellet 2 x 10 7 T-celler kultfigurert ved 37 ° C 5% CO2 i RPMI supplement ved hjelp av et sentrifugerør ved 327 xg i 5 minutter og vaskes i et likt volum forvarmet elektroporering media. Merk: Electroporation medium er en redusert serum medium som inneholder buffere og tilskudd (se forbruksvarer).
- Etter re-pelletere ved 327 xg i 5 min, resuspender cellene i 500 mL av electroporation media og tilsett langsomt til en kyvette, tilsett 5 ug av plasmidet i PCR grad dH 2 O for merking av F-aktin.
- Forsiktig på kyvetten på panseret arbeidsområdet for å sikre fjerning av luftbobler i media, noe som kan føre til overslag av strøm og å distribuere cellene jevnt innenfor media.
- Slå på elektroporering apparater og satt spenning på 300 V og kapasitans til 290 Ω. Electroporate prøve å bruke en eksponentiell for 20 ms. Note: Optimalisering kan kreves for forskjellige celler og forskjellige plasmidkonstruksjoner.
- Når transfeksjon protokollen erkomplette, lagercellene på is for 1 min før du fortsetter.
- Nøye overføre celler fra kyvetten til 6-brønns plate inneholdende 5 ml RPMI ekvilibrert supplement fra trinn 1.1.1.
- Cellene inkuberes O / N ved 37 ° C + 5% CO2.
2. Coat Dekk og Pre-varm Imaging Supplement
- Frakk Dekk med antistoffer for å indusere T-celle stimulering.
- Coat hvert kammer av en 8-brønnen dekkglass med 1 mg / ml aCD3 og αCD28 i 200 mL PBS.
- Oppbevar ved 4 ° CO / N. Alternativt kan belegge dekkglass i 2 timer forut for avbildning og holde i en inkubator ved 37 ° C for å redusere drift under avbildningsprosessen ved å minimere temperaturforandringer i dekkglass.
- Lag en dekk prøven med 0,1 mikrometer sub-diffraksjon fluorescerende sfærer.
- Vortex stamløsning av perler for å unngå klumper.
- På en ny, ren dekk of the samme type som de som brukes i trinn 2.1.1, pipette 5 ul fluorescerende microsphere stamløsning på overflaten (som per produsentens instruksjoner).
- Spre microsphere løsning over dekkglass med pipettespissen.
- La det tørke, deretter bruker 200 ul monterings medium som PBS.
Merk: monterings medium skal matche det som brukes for bildebehandling celleprøver.
- Ekvilibrer HBSS (+ 20 mM HEPES, heretter kalt "HBSS supplement ') i et sentrifugerør ved å plassere i en inkubator til forvarmingen O / N ved 37 ° C + 5% CO2.
Merk: tilsetting av HEPES er å bufre CO 2, hvis du bruker en inkubasjon kammer med CO 2 innspill hoppe slikt tilskudd.
3. Mikroskop Oppsett
- Slå på scenen-top inkubator av TIRF-SIM mikroskop og plass nok destillert vann i reservoaret av mikroskopet for å fullstendig dekke bunnen av varmeelementet. La vann til equilibrate til 37 ° C. Legg varme kragen til objektiv, også satt til 37 ° C.
Merk: På grunn av sensitiviteten av set-up, er disse trinnene gjort natten før så de optiske komponentene er i stabil temperatur før bildebehandling. - Plasser TIRF 488 kompatible gitterblokk i lysbanen av mikroskopet og sikkert på plass.
- Bytte kanal modus og fiberkabel til 'Single' posisjon på laser seng og mikroskop scenen henholdsvis å engasjere riktig optisk bane for TIRF-SIM-modus. Merk: Hoppe dette trinnet vil føre til en feil (figur 1A) i programvaren vinduet.
- Slå på alle mikroskop og PC-komponenter og åpne oppkjøpet kontroll programvare.
- Åpne OC panel, Ti Pad, N-SIM Pad og ND Acquisition vinduer (figur 1B). Velg i 'OC Panel "alternativet" TIRF 488' (figur 2B, gul pil). I N-SIM Pad vinduet, velg "TIRF-SIM" og "Moving" innstillinger (Figur 2C, gule piler). Velg innstillingsknappen (figur 1C, gul boks) og velg 'TIRF 488 (for 100x TIRF 488nm) "fra rullegardinmenyen, trykk" Apply "og" OK ".
- Still kamerainnstillingene innenfor 'DU897 innstillinger' til: Frame Rate 50 ms, avlesningsmodus, EM Gain 3 MHz ved 14-bit, og EM Gain Multiplier 300 med en konvertering Gain av en (figur 1C, grønn boks).
NB: Se Representative Resultater for bildefrekvens hensyn. - Kalibrere mikroskopet belysning for TIRF-SIM ved å velge 100x 1.49 NA CFI Apochromat TIRF objektiv, på 'N-SIM Pad' snu 488 nm laser makt til 10%.
Merk: Pixel størrelsen på RAW-bilder er 60 nm, med en 512 x 512 pixel synsfelt. - Rengjør objektiv du bruker linseklut for å fjerne støv og olje.
- Start med sikte på lavest mulig z-planet. Plasser en dråpe linse olje på objektiv og legge den fluorescerende microsphere prøven fra trinn 2,2 til mikroskopet scenen.
- Velg Perfect Focus System (PFS) -funksjonen plassert på legemet av mikroskopet.
- Beveg målet opp gjennom z-planet til PFS knappen slutter å blinke for å bekrefte at fokusplanet er nådd.
- Bytt til 'live' syn på kontroll programvare og bilde mikrosfærenes for endelig justeringer som er gjort ved hjelp av PFS mikro-manipulator hjulet.
- Observere jevn belysning uten out-of-fokus fluorescensemisjon over 75 nm flyktig bølge.
Merk: Bekreft strukturert belysning er oppfylt ved å observere en varierende belysningsmønster fra fluorescerende mikrosfære prøven. - Mål fluorescerende microsphere prøve og kvantifisere forbedret bildebehandling Resolution ved å observere den fulle bredde ved halv maksimum (FWHM) på intensitetsprofilen.
- Åpne Analyser programvare (v4.20.01), med NIS-A N-SIM analyse modul installert og velg "Programmer" -> "Show N-SIM-vinduet".
- Med belysning module kontrast (IMC) og høy oppløsning støydemping (HRNS) satt til 1 for TIRF-SIM datasett (figur 2), rekonstruere microsphere eksempelbilde for å generere en rekonstruert bilde av 1024 x 1024 piksler med en pikselstørrelse på 30 nm.
- Bruke linje profilen verktøyet med en bredde på en piksel (figur 3A, gul boks), tegne en linje gjennom sentrum av en enkelt mikrosfære.
- Velg FWHM knappen (figur 3B, gul boks) og klikk på intensiteten maksima av Gaussian distribusjon, etterfulgt av sin intensitet minima.
- Bekrefte FWHM av mikrokulen er i området fra 100 nm (figur 3C). Merk: oppløsningen achieved Ved avbildning av biologiske prøver, vil variere avhengig av signal-til-støy-forholdet fra merking effektivitet og bakgrunnsfluorescens.
4. Prøvepreparering for Imaging
- Dekk forberedelse.
- Hente αCD-belagt dekkglass fra trinn 2,1 fra kjøleskap eller inkubator og fjerne PBS som inneholder aCD3 og αCD28 fra hver brønn.
- Tilsett 200 ul av forvarmet HBSS supplement fra trinn 2,3 til hver brønn på dekkglass. Vask og fjern for å sikre minimal aCD3 og αCD28 er igjen i løsningen. Legge til ytterligere 200 mL av HBSS supplement til dekk brønnene.
- Rengjøre undersiden av dekkglass med linsepapir for å fjerne olje og partikler.
- Posisjon dekkglass på objektbordet og det med TIRF fokalplanet av dekkglass ved å bruke PFS z-planet som funnet i trinn 3,4.
- Cell forberedelse.
- Pipette 200 mL av media conhold transfekterte celler fra trinn 1.1.8 inn i et mikro-sentrifugerør.
- Pellet cellene i en mikrosentrifuge ved 268 xg i 20 sek og fjerne cellemateriale.
- Resuspender celler i 200 mL forvarmet HBSS supplement fra trinn 2.3.
5. Imaging Cells
- Ta celle-inneholdende HBSS supplement til mikroskopet og forsiktig 200 ul pipette inn i en av brønnene.
- Mens resterende i TIRF fokusplanet på dekkglass (i PFS-modus), kan du bruke mikroskop okularet og epifluorescence belysning for å spore fluorescerende cellene nærmer dekkglass.
- Når cellene lande på dekkglass, bytte til "live" modus i N-SIM Pad for å få bildet opp på skjermen og sjekke cellene er i fokus på dataskjermen.
- For å ta opp tids kurs, åpne ND Acquisition vinduet og velg fanen "Time", klikk "Legg til" og sette "Intervall" til Ingen forsinkelse, 'Varighet'til 10 min, 'Loops' er satt til 1.
Merk: Varighet kan endres avhengig av prosessen med interesse; den pinner programvaren kan trekke kvantitative resultater med bilde stabler av ≈ 10 rammer når fanget med 'No Delay ". - Med identiske oppkjøps innstillinger til perlen prøven, starte opptak data ved å velge "Kjør nå" i ND Acquisition vinduet.
6. Rekonstruer SIM Images
- Etter bildebehandling er fullført, åpner Analyze-programvaren (v4.20.01), med NIS-A N-SIM analyse modul installert og velg "Programmer" -> "Show N-SIM-vinduet".
- Med belysningsmodule kontrast (IMC) og høy oppløsning støyundertrykkelse (HRNS) settes til en for TIRF-SIM-datasett (figur 2), rekonstruere en (eller flere ved hjelp av verktøyet Batch) rå SIM-filen for å frembringe et rekonstruert bilde SIM.
- Bekreft rekonstruert filen har en pikselstørrelse på 30 nm, angitt iimage statuslinjen.
Merk: Pixel størrelse påvirker ikke pinner analyse, men det bør være minst 2x mindre i dimensjon enn den PSF romlig oppløsning for å sikre en romlig korrelasjon mellom piksler. - Eksportere data som TIFF-filer, klar for pinner analyse.
7. pinner Analyse
- Last ned og pakk ut STIC (C) S Matlab programvarepakke (Wiseman lab, tilgjengelig som tilleggsinformasjon). Skriptet stics_vectormapping.m er kjernen i en enkelt kanal pinner analyse og de første 30 linjer med kode brukes til å definere inngangsparametre som definert i § 2.1 i manualen. Åpne manus og definere inngangsparametre for TIRF-SIM dataanalyse. Det er foreslått å også legge til STIC (C) S mappe med undermapper til den lokale maskinen Matlab banen, som beskrevet i vedlegget til manualen.
- Definere inngangsparametere for dataanalyse ved å redigere de tilsvarende linjer i koden
- For å utføre analyse av de TIRF-SIM-data til å generere en vektorkart, sette tidsmessige parametre til tinningregion i linje 31 til maksimalt antall rammer og tidsmessig skifte i linje 32 til 1. For å få en tidsserie av vektorkart variere disse parametrene .
- For den immobile fjerning filter, satt parameteren 'filtrering' (linje 23) til "Glidende gjennomsnitt" og sette 'MoveAverage' parameter (linje 24) til 21.
Merk: Denne innstillingen har vist seg å fungere for langsommere bevegelse og store fluorescenssignaler, da det er basert på å trekke serie rammer fra rammen blir analysert. - Endre linjene 33-38 for å sette navn på utdatafiler og titlene på utgangsvektorkart, samt utgang katalogbanen og definere i hvilken format vektorkartbilder skal lagres.
| Pikselstørrelse (mikrometer) | 0,03 mikrometer | Linje 19 |
| Bildefrekvens (sek) | 1 sek | Linje 20 |
| Maksimal oppholdstid (frames) | 20 frames | Linje 21 |
| Timor størrelse (piksler) | 8 piksler | Linje 29 |
| Timor mellomrom (piksler) | 1 pixel | Linje 30 |
- Åpne script run1ChannelSTICS i vinduet Matlab Editor. Laste bildet serien ved å kjøre linjer 1-23 av dette skriptet.
Merk: Dette skriptet kan brukes til å laste og pre-prosessen bildeserie, plotte vektorkart og farts histogrammer og kjøre en gruppebehandling for mange filer. Hvis det er nødvendig, beskjære bildet til en region av interesse ved å bruke linjen 24-26 av dette skriptet.- Kjør linjer 29-35 av run1ChannelSTICS å starte pinner analyse. Når du blir bedt om å velge et polygon for å indikere et bestemt område av interesse (ROI), hvis ønskelig. Sikre at avkastningen ikke overlapper med cellekanten, som grenseverdier gjenstander oppstå når pinner analyserer disse reområder har.
- Kjør linjer 38-52 for å vise vektorkart. For å plotte hastigheten magnitude histogram, kjøre linjer 53-72.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikroskop innstillinger
Etter vellykket oppnå alle trinn forskeren vil ha oppnådd strukturert belysning (SIM) avbildning av F-aktin flyt i en T-celle synapse (Video 1), og kvantifisert dette molekylære flyt av rom-tid-image korrelasjonsspektroskopi (figur 4 11). Før du tar opp bilder, sikre prøven belysning er lik i de ni RAW-bilder og at strukturert belysning i form av moaré frynser er observert på prøven (figur 5), disse er begge indikatorene dekkglass er flat på scenen og TIRF- SIM-oppsett er riktig justert.
Det er viktig å holde lasereffekt lav (≤10%) for å sikre at cellene forblir så frisk som mulig i løpet av eksperimentet. Dersom fluoriserende uttrykk er lav, selv etter optimalisering av than elektroporering trinn, øke eksponeringstiden for hver rå ramme over de oppgitte 50 msek og / eller Conversion Gain innstillinger. Som TIRF-SIM krever 9 rå rammer, en for hver av de 9 belysning orientering kreves per rekonstruerte bildet, øke eksponeringstiden vil redusere bildefrekvensen. I dette eksperimentet, tillater en 50 msek eksponering ≈1 rekonstruerte bilder per sekund (også inkludert gitter rotasjon tid), reduserer risikoen for bevegelse gjenstander sett når raskere hendelser beveger seg gjennom flere belysnings maksima i en rå ramme.
Avhengig av hastigheten av molekylært strømning som studeres, øke eksponeringstiden kan innføre bevegelses gjenstander; forskere bør holde eksponeringstider til det minimum som kreves for et godt signal. Som pikselstørrelser i SIM-bilder er mindre enn for standard fluorescens bilder, kan molekylære populasjoner stiller raskere strømningshastighet passere gjennom region før en påfølgende frame er ervervet. For pinner programvare for å relatere fluorescens signal innenfor denne mindre regionen raskere bilde priser er nødvendig i forhold til standard fluorescens datasett. For eksempel en underregion størrelse på 8 x 8 piksler i SIM data representerer en 240 x 240 nm området mens en 8 x 8 pixel region fra en standard fluorescens datasett representerer et areal på 1,7 mikrometer (med en antatt pikselstørrelse på 200 nm).
For lengre tids-kurs (> 3 min) grupper av data kan tas ved hjelp av 'ND acquisition "for å redusere laser eksponering under synapse dannelse (f.eks bildebehandling i 10 sek hver min for 10 min vil utsette cellen til samme kumulative laser makt som bildebehandling for <2 min kontinuerlig).
Suboptimale rekonstruksjoner fra SIM bildebehandling er vist i figur 6, der den samme rå data har blitt rekonstruert ved hjelp av ulike høy resolutipå støydempings (HRNS) innstillinger, blir termin Fourier forvandler (FFT) og i full bredde halv maksimum profiler av den markerte fiber også vist. Innstilling av HRN er en balanse mellom økende rekonstruksjons gjenstander på grunn av dårlig signal-til-støy og øke oppløsningen. En HRN som er for lav (<1) kan resultere i kornete bilder med økt sekskantede SM gjenstander, mens for høy HRNS innstilling (> 1) kan "klipp" og forkaste høyoppløselige data (sett på som en redusert FFT diameter). En oppløsning på> 100 nm skulle tilsi et behov for å kjøre gjenoppbygging med ulike innstillinger, hvis oppløsningene er fortsatt sub-optimal kjøpe tilbake dataene med en optimalisert mikroskop oppsettet kan være nødvendig.
Bildebehandling og kvantifisere molekylær flyt
Til image molekylær flyt, ble tidsserie data tatt av T-celler landing og danner en synapse på en stimulerende coverslip, kan F-aktin sees å strømme i en retrograd måte fra cellen periferien mot cellens sentrum. Som F-aktin blir mindre tett mot midten av cellen pinner analysen ble kun utført ved periferien av synapsen, er denne regionen også hvor signale microclusters er kjent for å stamme fra under forlenget synapse formasjonen.
Ved å anskaffe og å analysere data ved hjelp av pinner er det viktig å forstå at programmet er avhengig av å korrelere fluorescerende svingninger i de valgte underområder for å danne en høyere og jevnere korrelasjonsfunksjonen (CF). Den absolutte antall bilder for å generere en vellykket pinner produksjonen er ikke eksakt som programvaren stoler mer på å skape en effekt gjennom det totale antallet konstruktive signalsvingninger innenfor disse underregioner. For eksempel hvis datasettet har 20 mobile, merkede proteiner i hvert delområde strømmer i samme retning pinner vil trenge færre bilder til genetrangere en pålitelig utgang, mens en underregion med 5 mobile proteiner resulterer i en svakere korrelasjon funksjon og kan kreve flere rammer. Det nøyaktige antallet rammer og delområde størrelse som brukes avhenger av arten av de molekylære hendelser som avbildes og skal være optimalisert av brukeren.
Ved hjelp av pinner "Temporal ramme avling" verktøy er det mulig å analysere undergrupper av molekylstrøm gjennom tid, noe som muliggjør forskere for å se om strømningshastigheter endres innenfor samme celle avhengig av ulike cellulære betingelser eller miljømessige stimuli slik som før og etter medikamentbehandlinger. Den immobile objektet filter er konstruert for å fjerne eventuelle immobile fluorescerende populasjonen før analysering av mobil fluorescerende befolkningen. Ved bruk av denne tilnærmingen, bilder som inneholder statiske befolkningsprosentandeler opp til 90% kan fortsatt være vellykket analysert 10. Stille immobile filter til 21 frames filtrerer ut noen fluorescerende populasjoner som gjenstår statisk for denne tidsperiode, eller lengre, noe som ikke vil bidra til den dynamiske retrograde strømmen under immunologisk synapse stabilisering.
Figur 1. Microscope oppkjøps innstillinger. (A) Høydepunkter N-SIM Pad innstillingene som brukes for forsøket og "Feil Fiber» -feil når ikke valgt enkelt kanal og Fiber moduser. (B) Alle vinduer trengs for å sette opp, ta opp og rekonstruere en strukturert belysning bilde på SIM-system. (C) N-SIM Pad og N-SIM-innstillinger pop-out window (gul boks) brukes for å velge Rist Setup etter fysisk plassere 488 nm rist i mikroskopet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Gjenoppbyggings innstillingene for det endelige bildet. Ved å velge "Param-knappen (gul boks), velger TIRF-SIM fra rullegardinmenyen, og i utgangspunktet satt både" Illumination Modulation Contrast "(IMC) og" High Resolution Noise Suppression '(HRNS) til 1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Full bredde ved halv maksimum (FWHM) måling. Ved hjelp av analyseprogramvare (A) viser en gaussisk plottet fra linjeintensiteten verktøyet valgt (gul boks) og trukket gjennom et rekonstruert bilde av et SIM vulst prøve. (
Figur 4. Representative strukturert belysning data og pinner utgang. En Jurkat T-celle uttrykker GFP-merket F-aktin avbildes med TIRF-SIM på en stimulerende dekk for immunologisk synapse generasjon. Fem minutter etter kontakt ble en tidsforløpet tatt og analysert ved hjelp av pinner analyseprogrammet. Gule boksene representerer zoomet regioner mens vektorkart demonstrere retrograde flyt av F-aktin på synapse periferien. Vektor farge indikerer hastigheten av den molekylære strømningen i den underregion, blir hastighetsdata plottet på et histogram. På grunn av den z-selektiviteten for eksitasjon TIRF-SIM gir, kan prøven bli tapt fra fokus dersom den løsner eller beveger seg bort fra dekkglasset gjennom tidsforløpet av eksperimentet på grunn av rusket eller motilitet. Dette er her vist i høyre panel som en reduksjon i tetthet vektor. Reduksjonen er et resultat av pinner påføre immobile filter for å underregioner som har vist noen fluorescerende svingninger for tiden angitt av brukeren. Dette resultat understreker betydningen av å velge bare områder som inneholder fluorescens signal for hele tidsserien. mager "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Raw SIM-bilder. De ni råbilder til venstre viser de 9 orienteringer av rutenett mønster trengs for å produsere en TIRF-SIM bilde. Cell avbildes er en Jurkat T-celle uttrykker GFP merket F-aktin, viser zoomet celle en av de ni rå bildene, som viser ikke-uniform belysning med moiré frynser, spesielt rundt cellen periferien. Selv om strukturert belysning ikke er synlig interaksjonen mellom belysning og prøven skape områder med varierende belysning styrke, etter gjenoppbygging dette resulterer i et bilde med forbedret oppløsning. Begge skala barer er fem mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 Høyoppløselig støydemping (HRNS) innstillinger Sub-optimale innstillinger føre til sub-optimal bilde gjenoppbygging..; (A) viser forskjellene i rekonstruerte data (brukes innstillingene vist nederst til venstre i hvert bilde), hvor lavere HRNS fører til økt bakgrunnsstøy utenfor bladet regionen og høyere HRNS kan redusere oppløsningen og føre til tap av de finere detaljer. (B) Representerer frem Fourier transform av bilder i (A) hvor perifer informasjon indikerer høyere oppløsning data; oppmerksom klippet petals av trans når HRNS er satt til fem, noe som indikerer redusert bildeoppløsning. (C) viser hele bredden halvparten maksimum (FWHM) av aktin fiber (gul boks i a) på de ulike innstillingene, FWHM målinger gjennom programvaren ga leser90 nm, 100 nm og 180 nm for HRNS innstillingene på henholdsvis 0,1, 1 og 5. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne teknikken vil tillate forskere til bilde og kvantifisere tidligere uløselig detaljer i celler uttrykker fluorescens. I våre resultater viser vi at F-aktin flyter på en symmetrisk måte fra cellen periferien mot cellens sentrum på T-cellen IS. Disse funnene er i tråd med tidligere resultater fra 1D linjeprofil kymograph data 13 og utvide kapasiteten på analyse til 2D og super-oppløsning data.
Den presenterte teknikken er en progresjon fra kymograph avbildning som er begrenset til å plotte fluorescensintensitet svingninger gjennom en enkelt 1D linje over tid. Til sammenligning dagens teknikken tillater kvantifisering av hele cellen molekylær flyt med både retningen og hastighet ut. Selv om flekk avbildning har også vist aktin dynamikk 14 i 2D-miljø, kan flekkteknikken være begrenset av vanskeligheter med korrekt merking tettheter og bare visualiserer en subpopulasjon av aktin.
De viktigste fremgangsmåten for å oppnå disse resultatene er å optimalisere transfeksjonseffektiviteten av de spesielle cellene som brukes av forskeren og innretting av SIM-mikroskop optikk og gittermønster. Velge riktig størrelse på underområdet avhenger av utvalgs egenskaper, og er viktig som for liten en innstilling vil bety raskere flytting fluorescens er tapt ved korrelasjonsanalyse, men velger en for stor region vil bety potensielt tap av nyansene i de ekstra data innhentet ved hjelp super oppløsning metoder.
Region betegner antall piksler summert for å lage en super-pixel for hastighetskartlegging analyse, øker dette kan forbedre påliteligheten for sporing raskere bevegelige objekter. Den underregion avstanden er gapet mellom data innenfor superpixels. Når region avstanden er lavere enn region størrelse, vil disse tilstøtende vektorer dele litt informasjon, øke denne innstillingen kan redusere retnings consistency av den endelige vectormap generert. Den maksimale lag tid styrer tiden korrelasjonsanalyse, der antall inputted er det maksimale antallet tidsetterslep før analyse ender.
Rekonstruksjon av det endelige bildet krever belysning module kontrast (IMC) og høy oppløsning støydemping (HRNS) innstillingene som skal velges. Optimale innstillingene kan variere fra prøve til prøve. IMC hjelper skille den stripete belysningsmønster på prøven, og reduserer gjenoppbygging gjenstander. HRNS kan redusere gjenstander fra data lav kontrast ved å "klippe" høyoppløsningsdata fra Fourier transform; for å opprettholde maksimal oppløsning evner og minimere gjenoppbygging gjenstander disse er normalt satt til 1.
Begrensninger av denne teknikken er basert rundt 2D innholdet i prosessen, som pinner programvaren ikke kan analysere 3D data teknikken er begrenset til TIRF-SIM eller 2D-SIM, krever derfor denne prøven til å være relatheving flatt mot dekkglass. Et annet teknisk ulempe er at TIRF-SIM krever 9 rå rammer som skal samles før rekonstruere den endelige super-oppløsning, som for eksempel med våre innstillinger av 50 ms ramme kjøp og tiden tatt av SIM-mikroskop for å reorientere gittermønster; bildefrekvens på ≈1 sek er oppnådd. Sammenlignet med andre super-oppløsning teknikk innhentingstider og stort synsfelt disse begrensningene er akseptable for de fleste bruksområder.
Resultatene som presenteres her er sammenlignbare med datasett fra standard TIRF avbildning av F-aktin strømning i immunologisk synapse formasjonen. Den gode avtalen mellom bildediagnostikk viser pinner er robust mot potensielle SIM gjenoppbygging gjenstander og også at bildet anskaffelses innstillingene som brukes under SIM er akseptable for dataanalyse. Ved å bruke super-oppløsning datasett med mindre pikselstørrelsen vi mer data kan hentes ut fra individuelle celler og dynamikk sub-diffraksjon cellulære mikrodomener kan bli etterforsket.
Etter å gripe denne teknikken alle molekylstrømning kan avbildes og kvantifiseres, med mulighet for ikke-invasiv måte å undersøke en rekke spørsmål angående strømning på plasmamembranen, eller når samplings med et konfokalt mikroskop, hvor som helst i xy-planet av cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables: | |||
| Jurkat E6.1 cells | APCC | ATTC TIB-152 | |
| RPMI | Life Technologies | 21875-091 | |
| FBS | Sigma | F7524-500ML | |
| Penicillin-Strepromycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-050 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630-056 | |
| #1.5 8-well Labtek coverslips | NUNC, Labtek | 155409 | |
| LifeAct GFP construct | Ibidi | 60101 | |
| OptiMem | Life Technologies | 51985-042 | |
| anti-CD3 | Cambridge Bioscience | 317315 | |
| anti-CD28 | BD Bioscience / Insight Biotechnology | 555725 | |
| PBS | Life Technologies | 20012-019 | |
| Lens oil | |||
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment: | |||
| Gene Pulsar Xcell System | BioRad | 165-2660 | |
| Cuvette (0.4cm) | BioRad | 165-2088 | |
| Centrifuge (5810R) | Eppendorf | 5805 000.327 | |
| Centrifuge (Heraeus) | Biofuge pico | 75003235 | |
| 6 well plate | Corning | 3516 | |
| Stage-top incubator | Tokai Hit | INUH-TIZSH | |
| Nikon N-SIM microscope | Nikon | Contact company | |
| Nikon Analyse software | Nikon | Contact company | |
| Incubator (190D) | LEEC | Contact company |
References
- Monks, C., Freiberg, B., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395, 82-86 (1998).
- Lanzavecchia, A. Antigen-specific interaction between T and B cells. Nature. 314, 537-539 (1985).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
- Delon, J., Bercovici, N., Liblau, R. Imaging antigen recognition by naive CD4+ T cells: compulsory cytoskeletal alterations for the triggering of an intracellular calcium response. European journal of Immunology. 28 (2), 716-729 (1998).
- Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. T Cell Receptor-Proximal Signals Are Sustained in Peripheral Microclusters and Terminated in the Central Supramolecular Activation Cluster. Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature methods. 3, 793-796 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (15), 8206-8210 (2000).
- Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells. Biophysical Journal. 88 (5), 3601-3614 (2005).
- Ashdown, G. W., Cope, A., Wiseman, P. W., Owen, D. M. Molecular Flow Quantified beyond the Diffraction Limit by Spatiotemporal Image Correlation of Structured Illumination Microscopy Data. Biophysical Journal. 107 (9), 21-23 (2014).
- Brown, C. M., et al. Probing the integrin-actin linkage using high-resolution protein velocity mapping. Journal of Cell Science. 19 (24), 5204-5214 (2006).
- Yi, J., Xufeng, S. W., Crites, T., Hammer, J. A. Actin retrograde flow and actomyosin II arc contraction drive receptor cluster dynamics at the immunological synapse in Jurkat T cells. Molecular Biology of the Cell. 23 (5), 834-852 (2012).
- Watanabe, N., Mitchison, T. J. Single-molecule speckle analysis of actin filament turnover in lamellipodia. Science. 8 (5557), 1083-1086 (2002).
