Abstract
필라멘트는 액틴과 운동성, 면역 세포, 면역 시냅스로 알려진 키 세포 - 세포 상호 작용의 형성을 포함한 세포 과정의 대부분에서 중요한 역할을한다. F 액틴 또한 서브 멤브레인 소포 역학 및 단백질 클러스터링 포함한 세포의 막에 분자량 분포를 조절하는 역할을하는 것으로 추측된다. 표준 광학 현미경 기술은 일반화 된 회절 제한 관찰 할 수 있도록하지만, 클러스터링 및 분자 류를 포함한 많은 세포 및 분자 이벤트는 지금까지 표준 광학 현미경의 분해능 아래 길이 규모의 인구 집단에서 발생합니다. 초 해상도 영상 법 구조화 조명 현미경 전반사 형광을 결합하여, T 세포의 면역 시냅스에서 F 액틴의 이차원 분자 흐름을 기록 하였다. 정량화 resul을 생성 시공간 이미지 상관 분광법 (STICS)을 적용 하였다,속도 히스토그램 및 흐름의 방향성과 크기를 나타내는 벡터지도의 형태로 TS. 이 프로토콜의 세부 서브 회절 레벨에서 유동 경로를 생성하는 초 - 해상도 이미징 STICS 기법의 조합을 설명한다. 이 기술은 시냅스 형성시 T 세포의 외주에 걸쳐 액틴 대칭 역행과 구심력 흐름을 확인하는데 사용 하였다.
Introduction
실험의 목적은 이미지이며 면역 시냅스 (IS)을 형성하는 동안 흐름의 방향 및 크기를 설정하기 위해 회절 한계를 넘어, T 세포를 거주 filamentous- (F-) 액틴의 분자 유동을 특성화. 이 기술은 안티 CD3- 및 항 CD28 항체로 코팅 된 커버 활성화에 인공 시냅스 형성는 Jurkat T 세포를 이미징, 전반사 형광 (TIRF) 모드에서 구조화 된 조명 현미경 (SIM)을 사용하여 수행 될 것이다. T 세포와 표적 사이의 IS 형태; T 세포 수용체 (TCR) 활성화에 따라 1,2- 항원 제시 세포 (APC). 이 적응성 면역계는 감염에 대한 면역 반응을 생성할지 여부를 결정하는 첫 번째 단계이기 때문에, 자극에 대한 부정확 한 응답의 결과는 질환을 유발할 수있다. APC T 세포 상호 작용의 중요성은 잘 기록되어있다, 그러나, 성숙한의 역할 (들)의 초기 TCR SI 이후gnal 국제화는 아직 완전히 이해되어야한다.
골격은 단계를 해명 할 시간적 TCR 활성화 (세포막에서 분자의 운동과 3,4- 골격 액틴에 의존 신호 분자의 제어), 세포 골격이 공간적으로 재 배열 방식을 이해 연결된 두 프로세스를 원조하고 생각된다로서 시냅스 형성 동안 분자 구조 조정의. F - 굴지의 역행 흐름이 면역 시냅스의 중심을 향해 TCR 클러스터를 가축 위해 생각하고,이 전위는 신호 정지 및 재활용에 매우 중요 할 것으로 생각된다; T 세포 활성화 (5)의 미세한 균형을 은닉.
표준 형광 현미경이 세포 - 세포 상호 작용을 비롯한 다양한 생물학적 이벤트에 대한 통찰력을 제공하고 유연한 도구이지만, 그것은 정확하게 diffr보다 가까운 상주 여러 형광체를 해결하는 시스템의 능력에 의해 제한된다서로의 활동 제한 (≈200 ㎚). 세포 내에서 많은 분자 이벤트 분자의 밀도가 인구를 포함하고 정지 또는 특정 자극에 하나 동적 재 배열을 나타내는 바와 같이, 기존의 광학 현미경은 전체 그림을 제공하지 않습니다.
초 해상도 영상의 사용은 연구자들이 다양한 기술을 이용하여 회절 한계를 회피 할 수있다. 손바닥과 폭풍 6,7가 약 20 nm의 정밀도로 분자의 위치를 해결할 수있는 능력을 가지고 단일 분자 현지화 현미경 (SMLM)와 같은, 그러나, 이러한 기술은 많은 프레임을 통해 이미지를 구축, 긴 획득 시간에 의존 . 일반적으로이 고정되는 샘플을 요구 또는 구조가 낮은 이동성을 전시하기 때문에 하나의 형광체는 여러 개의 점으로 잘못 해석되지 않습니다. 유도 방출 고갈 (STED)는 촬상 매우 선택적 촛점 여진 8, 필요한 주사를 통해 초 해상도를 허용하면서접근 방식은 뷰의 전체 세포 분야에 걸쳐 속도가 느려질 수 있습니다. STED는 또한 공핍 빔의 전력의 증가로 더 높은 해상도에 대한 상당한 광독성을 보여준다.
구조화 된 조명 현미경 (SIM 9) 표준 형광 현미경의 해상도를 배가시킬 이러한 방법에 대한 대안을 제공하며, 현재의 기술보다 SMLM 생균 이미징에 더 잘 호환된다. 그것은보기의 전체 세포 분야에 대한 폭 넓은 필드 시스템에서 낮은 레이저 파워를 사용합니다; 수집 속도를 증가 및 표준 형광 라벨와 호환 제공한다. SIM의 와이드 필드 자연 또한 <100 nm 인 축 방향 치수의 침투 깊이가 매우 선택적 음원 정보 전반사 형광 (TIRF)의 이용을 허용한다.
화상 상관 분광법 (ICS)의 형광 강도의 변동을 상관하는 방법이다. ICS의 진화; 시공간 메신저나이 상관 분광법 (STICS 10)는 시간과 공간의 세포 내 형광 신호의 상관 관계. 상관 함수를 통해 후행 프레임의 화소를 주변 화소로 강도를 상관시킴으로써, 정보 흐름의 속도 및 방향성에 대하여 얻어진다. 정적 오브젝트 STICS 분석을 방해하지 않도록하기 위해, 부동 오브젝트 필터는 픽셀 세기들의 이동 평균을 뺌으로써 작동되는, 구현된다.
여기에 제시된 기술은 생균 11 분자 흐름을 계량하는 수퍼 - 해상도 현미경 데이터에 적용되는 화상 상관 분광법 제 데모 것으로 여겨진다. 이 방법은 STICS 분석 12 통해 F 액틴 흐름의 회절 제한된 촬상에 향상시키고 광의 회절 한계를 넘어 공간 해상도에서 획득 된 데이터로부터, 생균의 이차원 분자 유동을 결정하고자하는 연구자 맞게 것이다.
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Protocol
참고 : 영상의 전날 1, 2 포획 장소 스테이지; 모든 미디어 및 보충 전이나 영상의 날이 평형을에 사용할 수 있도록. 평형은 5 % CO 2로 설정 배양기에서 37 ° C 미디어와 보충 온난화을 통해 달성된다. 모든 세포 배양 작업과 커버 슬립 도금 단계 층류 후드 하에서 무균 조건에서 일어난다.
1. 세포 형질
- 형질 T 세포는 플라스미드 형광 융합 F 액틴 GFP 표지 및 이미징 구성 인코딩 실험 전 24 시간을 묘화한다. 참고 : 세포가 이전에 형질 전환 (이전 영상에 48 시간) 세포가 최적의 건강에 자신의 대수 성장 단계에 있는지 확인하기 위해 24 시간을 분할해야한다.
- 평형 인큐베이터로 6 웰 플레이트의 단일 잘 RPMI 보충의 5 ㎖ (RPMI 1640 플러스 10 % FBS와 1 % 펜 연쇄상 구균 (옵션)) 놓습니다.
- 2 × 10 7 T 세포 숭배 펠렛5 분 동안 327 XG에서 원심 분리 튜브를 사용하여 보충 RPMI에서 37 ° C 5%의 CO 2에서와 ured는 예열 일렉트로 매체의 동일 부피로 세척 하였다. 주 : 일렉트로 매체 버퍼와 보조제 (소모품 참조)를 함유하는 감소 된 혈청 배지이다.
- 5 분 동안 327 XG에서 다시 펠렛 후, 전기 미디어의 500 μL의 세포를 재현 탁 천천히, 큐벳에 추가 라벨 F - 굴지에 대한 PCR 학년 DH 2 O에서 플라스미드의 5 μg의를 추가합니다.
- 부드럽게 전기 아크가 발생할 수 있습니다 미디어 내에서 고르게 세포를 배포하는 매체의 기포의 제거를 보장하기 위해 후드 작업 공간에 큐벳을 누릅니다.
- 290 Ω에 전기 장치 및 설정 전압 300 V 및 용량의 전원을 켭니다. 20 밀리 초에 대한 지수 부패를 사용 Electroporate 샘플. 참고 : 최적화가 다른 세포와 다른 플라스미드 구조 필요할 수 있습니다.
- 형질 감염 프로토콜되면계속하기 전에 1 분 동안 얼음에 완료, 저장 세포.
- 신중 단계 1.1.1에서 평형화 RPMI 보충 5 ㎖를 함유하는 6- 웰 플레이트에 세포를 큐벳에서 전송.
- 37 ° C ~ + 5 % CO 2의 세포 O / N을 품어.
2. 코트 커버 슬립과 사전 따뜻한 영상 보충
- 항체 코팅 된 커버는 T 세포의 자극을 유도한다.
- 코트 200 μL PBS에 1 μg의 / ㎖ αCD3 및 αCD28와 8 잘 커버 슬립의 각 실.
- 4 ° CO / N 스토어. 대안 적으로, 2 시간 이미징 이전과 코팅 된 커버는 커버 슬립에 대한 온도 변화를 최소화하여 촬상 과정 드리프트를 감소시키기 위해 37 ℃ 배양기에서 유지.
- 0.1 μm의 서브 회절 형광 마이크로 스피어와 coverslip에 테스트 샘플을 만듭니다.
- 구슬의 소용돌이 원액 덩어리를 방지 할 수 있습니다.
- 일의 새로운, 깨끗한 커버 슬립에(제조업체의 지침에 따라) 표면에 단계 2.1.1에서 사용되는, 피펫 5 μL 형광 마이크로 스피어 원액으로 전자 같은 유형입니다.
- 피펫 팁과 커버 슬립을 통해 마이크로 스피어 솔루션을 확산.
- 다음, 건조 등의 PBS와 같은 매체를 장착 200 μl를 적용 할 수 있습니다.
참고 : 설치 매체는 이미징 세포 샘플에 사용되는 일치해야합니다.
- HBSS를 평형 37 ° C ~ + 5 % CO 2에서 할 사전 따뜻한 O / N 인큐베이터에 배치하여 원심 분리기 튜브 (이하 'HBSS 보충'라고 + 20 mM의 HEPES).
주 : HEPES의 첨가가이 보충 이동 CO 2 입력으로 배양 챔버를 사용하는 경우, CO 2 버퍼이다.
3. 현미경 셋업
- 완전히 가열 요소의 기초를 충당하기 위해 현미경의 저수지에서 TIRF-SIM 현미경과 장소 충분히 증류수 무대 정상 인큐베이터를 켭니다. 물이 전자 허용37 ℃로 quilibrate. 또한 37 ° C로 설정 대물 렌즈로 가열 칼라를 추가합니다.
참고 : 셋업의 감도로, 다음 단계는 그래서 전날 밤을 완료 인해 광학 부품은 안정적인 온도에서 촬영에 앞서 있습니다. - 현미경의 빛 경로에 TIRF 488 호환 격자 블록을 놓고 제자리에 고정합니다.
- TIRF-SIM 모드에 대한 올바른 광 경로를 참여하는 각각의 레이저 침대와 현미경 무대에 '싱글'위치로 채널 모드와 광섬유 케이블을 전환합니다. 참고 :이 단계를 건너 뛰는 것은 소프트웨어 창에서 오류 (그림 1A)로 이어질 것입니다.
- 모든 현미경과 컴퓨터 구성 요소의 전원을 켜고 수집 제어 소프트웨어를 엽니 다.
- OC 패널을 열고, 티 패드, N-SIM 패드와 ND 획득 창 (그림 1B). 'OC 패널'에서 '옵션 TIRF 488'(그림 2B, 노란색 화살표)을 선택합니다. N-SIM 패드 창에서 'TIRF-SIM'와 '이동'설정 (그림 2C, 노란색 화살표)을 선택합니다. 설정 버튼 (그림 1C, 노란색 상자)을 선택하고 드롭 다운 메뉴에서, 히트 '488 (100 배 TIRF 488nm의 경우) TIRF는' '확인' '적용'을 선택합니다.
- 프레임 속도 50 밀리 초, 판독 모드, EM 게인 14 비트에서 3 MHz의 1의 변환 이득과 EM 게인 승수 (300) (그림 1C, 녹색 상자)에 'DU897 설정'에서 카메라 설정을 설정합니다.
참고 : 프레임 속도 고려 사항 대표 결과를 참조하십시오. - 'N-SIM 패드'에 100 배 1.49 NA CFI 고차 색지움 TIRF 목표를 선택하여 TIRF-SIM에 대한 현미경의 조명을 보정 10 % 488 nm의 레이저 전원을 켭니다.
참고로 이미지의 픽셀 크기는 볼 (512) X 512 픽셀 필드에, 60 ㎚이다. - 먼지와 기름을 제거하기 위해 렌즈 용 티슈를 사용하여 대물 렌즈를 청소합니다.
- 가장 낮은 Z 평면의 목적으로 시작합니다. 목적에 렌즈 오일 한 방울을 놓고 현미경 단계 단계 2.2에서 형광 마이크로 스피어 샘플을 추가합니다.
- 현미경의 몸에있는 완벽한 초점 시스템 (PFS) 기능을 선택합니다.
- PFS 버튼에 도달 초점면을 확인하기 위해 깜박 멈출 때까지 천천히 Z 평면을 통해 목표를 위로 이동합니다.
- 제어 소프트웨어 및 이미지 PFS 마이크로 조작 휠을 사용하여 만든 최종 조정에 대한 미세에 '라이브'보기로 전환.
- 75 nm의 소산 파 위없는 아웃 - 오브 - 초점 형광 방출과 균일 한 조명을 준수하십시오.
참고 : 구조화 된 조명은 형광 마이크로 스피어 샘플에서 변동 조명 패턴을 관찰하여 충족 확인합니다. - 형광 마이크로 스피어 샘플을 측정하고 개선 이미징 resolut을 정량화강도 프로파일의 반가 폭 (FWHM)을 관찰함으로써 이온.
- 설치 NIS-N-SIM 분석 모듈, 분석 소프트웨어 (v4.20.01)을 열고 '응용 프로그램'을 선택 -> '쇼 N-SIM 창'.
- TIRF-SIM 데이터 셋 (도 2)에 대해 1로 설정된 조명 변조 콘트라스트 (IMC)와 높은 해상도의 잡음 억제 (HRNS)로, (30)의 화소 크기 024 X 024 픽셀의 복원 영상을 생성하는 마이크로 스피어의 샘플 이미지를 재구성 나노.
- 1 픽셀 (도 3A, 노란 박스)의 폭을 갖는 라인 프로파일 도구를 사용하여 하나의 마이크로 스피어의 중심을 통해 선을 그린다.
- FWHM 버튼 (그림 3B, 노란색 상자)을 선택하고 그 세기 최소치 다음에 가우스 분포의 강도 맥시을 클릭합니다.
- 마이크로 스피어의 FWHM이 100 nm 인 (도 3c)의 범위 인 것을 확인. 주 : 해상도가 ACH를ieved 촬상 생물학적 시료는 표지 효율 및 백그라운드 형광으로부터 신호 대 잡음비에 따라 달라질 것이다.
이미징 4. 샘플 준비
- coverslip에 준비.
- 냉장고 또는 인큐베이터에서 2.1 단계에서 αCD 코팅 커버 슬립을 검색하고 각 우물에서 PBS 포함 αCD3과 αCD28를 제거합니다.
- 커버 슬립의 각 웰에 단계 2.3에서 미리 예열 HBSS 보충 200 μl를 추가합니다. 씻고 최소한의 αCD3 보장하기 위해 제거하고 αCD28 용액에 남아 있습니다. coverslip에 우물에 HBSS 보충의 또 다른 200 μl를 추가합니다.
- 석유와 미립자를 제거하기 위해 렌즈 티슈 커버 슬립의 밑바닥을 청소합니다.
- 단계 3.4에서 볼 수있는 현미경 단계에 위치 커버 슬립과는 PFS의 Z 평면을 사용하여 커버 슬립의 TIRF 초점면을 찾을 수 있습니다.
- 셀 준비.
- 미디어 콘의 200 μl를 피펫마이크로 원심 분리기 튜브에 단계 1.1.8에서 형질 전환 된 세포를 이닝.
- 20 초 동안 268 XG에 마이크로 원심 분리기에서 펠렛의 세포와 세포 용지를 제거합니다.
- 200 μL에 재현 탁 세포 단계 2.3에서 HBSS 보충을 따뜻하게가 미리.
5. 이미징 세포
- 현미경으로 세포 함유 HBSS 보충을 가지고 부드럽게 우물 중 하나에 200 μl를 피펫.
- (PFS 모드)로 커버 슬립 TIRF 초점면에 잔류하는 동안, 커버 슬립 접근 형광 세포를 추적하기 위해 현미경 및 접안 렌즈 표면 형광 조명을 사용한다.
- 세포는 커버 슬립에 도착하면, 모니터 상에 화상을 불러 온 세포는 컴퓨터 화면에 포커스가 확인 N-SIM 패드 '라이브'모드로 전환.
- 클릭 ND 취득 창을 열고 '시간'탭을 선택, 시간 과정을 기록 없음 지연, '시간'에 '추가'와 '간격'설정10 분, 1로 설정되어있는 '루프'.
주 : 기간 관심 과정에 따라 변경 될 수있다; '지연'캡처 할 때 STICS 소프트웨어는 ≈10 프레임의 이미지 스택과 함께 정량적 인 결과를 추출 할 수 있습니다. - 비드 샘플과 동일한 인수 설정으로, ND 취득 창에서 '지금 실행'을 선택하여 데이터 기록을 시작합니다.
6. 재구성 SIM 이미지
- 이미지가 완료되면, 설치 NIS-N-SIM 분석 모듈, 분석 소프트웨어 (v4.20.01)를 열고 '응용 프로그램'을 선택 -> '쇼 N-SIM 창'.
- TIRF-SIM 데이터 세트 1로 설정된 조명 변조 콘트라스트 (IMC)와 높은 해상도의 잡음 억제 (HRNS) (도 2)와, 하나 (또는 배치 툴하여 여러) 재구성 된 SIM 이미지를 생성하기 위하여 원시 SIM 파일을 재구성.
- 재구성 된 파일을 확인하는 것은 표시된 30nm의 픽셀 크기를 갖는다이미지 상태 표시 줄.
주 : 화소 크기가 STICS 분석에 영향을 미치지 않는다하지만 화소 간의 공간적 상관 관계를 보장하기 위해 PSF 차원 공간 분해능보다 적어도 2 배 작아야한다. - STICS 분석을위한 준비 .TIFF 파일로 데이터를 내 보냅니다.
7. STICS 분석
- (; 보충 정보로 사용할 수 와이즈만 연구소) 다운로드 및 STIC (C)를 추출은 matlab에 소프트웨어 패키지를 S. 스크립트 stics_vectormapping.m는 단일 채널 STICS 분석의 핵심이며, 코드의 처음 30 라인들은 매뉴얼의 섹션 2.1에 정의 된 입력 매개 변수를 정의하기 위해 사용된다. 이 스크립트를 열고 TIRF-SIM 데이터 분석에 대한 입력 매개 변수를 정의합니다. 매뉴얼의 부록에 설명 된대로 그것은 또한 로컬 시스템의 MATLAB 경로에 하위 폴더와 STIC (C) S 폴더를 추가하는 것이 좋습니다.
- 코드의 해당 라인을 편집하여 데이터 분석을위한 입력 매개 변수를 정의
- 아나을 수행하려면TIRF-SIM 데이터의 용해는, 1 벡터 맵을 생성 벡터 맵의 시계열을 얻기 위해 프레임의 최대 수와 (1)에 라인 (32)의 시간적 변화에 라인 (31)에 시간적 부분 영역에 시간 매개 변수를 설정하기 위해 이들 파라미터를 변화 .
- 부동 제거 필터의 경우, 21 'MoveAverage'매개 변수 (라인 24) 평균 이동 '과 설정에 매개 변수'필터링 '(라인 23)을 설정합니다.
주 : 분석되고 프레임으로부터 일련의 프레임을 감산에 기초로이 설정은, 느린 이동 및 큰 형광 신호에 대해 작동하는 것으로 나타났다. - 라인 33-38 변화는 출력 파일과 출력 벡터 맵 타이틀 이름뿐만 아니라 출력 디렉터리 경로를 설정하고 벡터지도 이미지가 저장되어야 하는지를 정의하는 형식.
| 픽셀 크기 (μm의) | 0.03 μm의 | 선 (19) |
| 프레임 속도 (초) | 1 초 | 선 (20) |
| 최대 지연 시간 (프레임) | 20 프레임 | 선 (21) |
| 아구 크기 (픽셀) | 8 픽셀 | 선 (29) |
| 아구 간격 (픽셀) | 1 픽셀 | 선 (30) |
- matlab에 편집기 창에 스크립트 run1ChannelSTICS를 엽니 다. 라인이 스크립트의 1-23를 실행하여 이미지 시리즈를로드합니다.
주 :이 스크립트는로드 전처리 이미지 시리즈, 벡터지도 및 속도 히스토그램 플롯 많은 파일을 일괄 처리를 실행하는 데 사용될 수있다. 필요한 경우,이 스크립트의 라인 24 ~ 26을 사용하여 관심 영역에 이미지를 자릅니다.- 실행 라인 run1ChannelSTICS의 29 ~ 35은 STICS 분석을 시작합니다. 메시지가 표시되면, 원하는 경우, 관심 (ROI)의 특정 영역을 표시하기 위해 다각형을 선택합니다. 경계 유물이 발생할 STICS이 다시 분석하면 투자 수익 (ROI)은, 셀 가장자리와 중복되지 않는지 확인gions.
- 실행 라인 38-52은 벡터지도를 표시합니다. 속도 크기 히스토그램을 플롯하려면 라인 53-72을 실행합니다.
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Representative Results
현미경 설정
성공적으로 모두를 달성 한 후 단계를 연구하는 T 세포의 시냅스에서 F - 굴지의 흐름 달성 구조화 조명 (SIM) 영상을 (비디오 1) 시공간 이미지 상관 분광학 (그림 4 11)에 의해이 분자의 흐름을 정량화. 이미지를 촬영하기 전에 샘플 조명은 구 RAW 이미지에 걸쳐 균일 한 샘플에서 관찰되는 모아레 무늬의 형태로 그 구조화 조명 (그림 5)은 확인이 두 지표 coverslip에 무대와 TIRF-에 평평하게되어 있습니다 SIM 설정이 올바르게 정렬됩니다.
이 세포는 실험 기간 동안 가능한 한 건강을 유지 보장하기 위해 낮은 레이저 파워 (≤10 %)을 유지하는 것이 중요합니다. 형광 발현도 T의 최적화 후, 낮은 경우그는 기재 50 밀리 및 / 또는 변환 이득 셋팅 상기 각 원료 프레임 노출 시간을 증가 단계를 전기. TIRF-SIM은 프레임 레이트를 감소시킬 것이다 노출 시간을 증가시키는 생 9 프레임, 복원 영상 당 필요한 9의 조명 방향의 각각에 대한 제 1 요구로서. 이 실험에서는, 50 밀리 초 허용 노출 ≈1 (또한 그리드 회전 시간 포함) 초당 복원 된 프레임을 빨리 이벤트가 하나의 프레임에 복수의 원료 조명 맥시 이동할 때 본 모션 아티팩트의 위험을 감소시킨다.
분자 흐름의 속도에 따라, 움직임 아티팩트를 초래할 수있다 노출 시간을 증가 연구되고; 연구진은 좋은 신호에 필요한 최소 노출 시간을 유지해야합니다. SIM 이미지에서 픽셀 크기가 표준 형광 이미지의보다 작은 한, 빠른 속도의 흐름을 나타내는 분자 집단은 후속 FR 전에 하위 영역을 통과 할 수있다AME는 취득한다. STICS 소프트웨어가 빠르게이 작은 영역 내에서 형광 신호의 상관 관계에 대한 이미지 비율은 표준 형광 데이터 세트에 비해 필요합니다. 표준 형광 데이터 세트에서 8 × 8 화소 부분 영역 (200 nm 인 것으로, 화소 크기) 1.7 ㎛ 인 영역을 나타내는 예를 들어 SIM 데이터의 8 × 8 화소의 부분 영역의 사이즈는 240 × 240 nm의 영역을 나타낸다.
긴 시간 과정 (> 3 분)에 대한 데이터의 배치는 시냅스 형성시 레이저 노광 (줄이기 'ND 획득'을 사용하여 수행 될 수있다 예를 들어, 10 분마다 분 동일한 누적 레이저 파워에 세포를 노출한다 10 초 동안 이미징 계속해서 <2 분)에 대한 이미징.
SIM 영상에서 차선의 재구성은 동일한 원시 데이터는 다른 높은 resoluti을 사용하여 재구성 된도 6에서 입증되고노이즈 억제 (HRNS) 설정에, 앞으로 푸리에 변환 (FFT) 및 강조 섬유의 전체 폭의 절반 최대 프로파일도 표시됩니다. HRN 설정으로 인해 가난한 신호 대 잡음 및 증가 해상도 증가 재건 유물 사이의 균형이다. <(1) 할 수있는 '클립'과 높은 해상도의 데이터를 폐기 (감소 FFT 직경으로 간주) 너무 낮은 HRN은 (너무 높은 HRNS 설정하면서 1), 증가 육각 SM 유물과 거친 이미지가 발생할 수 있습니다>. 해상도가 요구 될 수있다 최적화 된 현미경 설정과 데이터를 재 취득 여전히 차선의 경우> 100 nm의 분해능은, 다른 설정으로 복원을 다시 실행해야 할 필요를 나타냅니다.
이미징 및 분자 흐름을 정량화
이미지 분자 흐름, 시계열 데이터는 자극 coversli에 시냅스를 방문하고 형성하는 T 세포의 찍은P는 F-액틴은 셀 중심을 향해 주변으로부터 셀 역행 방식으로 유동을 알 수있다. 셀 STICS 분석 센터 만 시냅스 외주 행했다 향해 F 액틴 덜 치밀 해짐 시그널링 microclusters 연장해 시냅스 형성시에서 발생하는 것으로 알려진 경우에,이 영역은도이다.
획득하고 STICS를 사용하여 데이터를 분석 할 때 그 프로그램이 높고 부드러운 상관 함수 (CF)를 형성하기 위해 선택된 하위 영역 내의 형광 변동에 의존하는 상관 관계를 이해하는 것이 중요하다. 소프트웨어는 그 소 영역 내에서 보강 된 신호의 변동을 통해 총 출력을 생성 추가로 의존 성공적인 STICS 출력을 생성하기 위해 필요한 프레임 수는 정확한 절대 아니다. 예를 들어, 데이터 세트가 같은 방향 STICS에 흐르는 각 하위 영역에 20 모바일, 표지 단백질이있는 경우 유전자에 적은 수의 프레임이 필요합니다약한 상관 함수에서 5 모바일 단백질 결과와 함께 하위 영역이 더 많은 프레임이 필요할 수 있지만, 안정적인 출력을 평가. 사용되는 프레임 및 서브 영역의 크기의 정확한 수는 이미지화되는 분자 사건의 특성에 따라 상기 사용자에 의해 최적화되어야한다.
유량이 다른 세포 조건 또는 이전과 및 약물 치료 후 환경 자극에 따라 동일 셀 내에서 변경하는 경우 연구자가 볼 수 있도록 : STICS '임시 프레임 자르기'도구를 사용하여이 시간을 통해 분자 흐름의 부분 집합을 분석 할 수있다. 움직이지 오브젝트 필터는 이전에 모바일 형광 인구를 분석하는 어떤 움직이지 형광 인구를 제거하도록 설계되어 있습니다. 이 방법을 사용하여 여전히 성공적 일 수 90 %까지 정적 인구 백분율을 함유하는 이미지 (10)를 분석 하였다. 21 프레임으로 움직이지 필터를 설정하면 남아있는 형광 인구를 필터링 면역 시냅스 안정화 동안 동적 역행 흐름에 기여하지 않습니다 시간 이상이 기간, 정적.
단일 채널 섬유 모드가 선택되지 않은 경우도 1. 현미경 취득 설정. (A)는 실험과 '잘못된 섬유'오류 사용 N-SIM 패드 설정을 강조한다. (B), 업 레코드를 설정하고 SIM 시스템에서 구조화 된 조명 영상을 복원하는 데 필요한 모든 Windows. (C) N-SIM 패드 및 N-SIM 설정 팝 아웃 창 (노란색 상자) 물리적으로 현미경으로 격자 488 nm의를 배치 한 후 격자 설정을 선택하는 데 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 최종 이미지에 대한 재구성 설정. 드롭 다운 메뉴에서 '파람'버튼 (노란색 상자)를 선택 TIRF-SIM을 선택하면, 및 초기 설정 '조명 변조 대비'(IMC)와 '높은 해상도 노이즈 억제 모두 1. '(HRNS) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 절반 최대 (FWHM) 측정. 분석 소프트웨어 (를) 사용의 전체 폭은 가우스 선택한 라인 강도 도구에서 플롯 (노란색 상자)와 비드 샘플의 재구성 SIM 이미지를 그려을 보여줍니다. (
도 4 주제 구조화 된 조도 데이터 및 GFP 표지 된 F 액틴 발현 STICS 출력. 주르 케트 T 세포 면역 시냅스 생성 자극 커버 슬립에 TIRF-SIM을 사용하여 이미지화. 5 분 접촉 후, 시간 코스 취하여 STICS 분석 프로그램을 이용하여 분석 하였다. 벡터지도는 시냅스 주변에서 F - 굴지의 역행 흐름을 보여 주 동안 노란색 상자 영역을 확대 나타냅니다. 벡터의 색상은 그 하위 영역에서 분자 흐름의 속도는, 속도 데이터 히스토그램 플롯 나타낸다. 이 분리 또는 파동 운동 또는 운동에 의한 실험의 시간 경과를 통해 멀리 이동하면 커버 슬립에서 기인 TIRF-SIM 제공 여진의 z 선택성, 샘플은 초점에서 손실 될 수있다. 이 벡터 밀도의 감소로 오른쪽 상단 패널에 여기에서 볼 수있다. 감소는 사용자가 설정 한 시간의 기간에 대한 형광 변동을 도시하지 않은 소 영역으로 움직 필터를 적용 STICS의 결과이다. 이 결과는 전체 시계열 형광 신호를 포함하는 영역만을 선택의 중요성을 강조한다. 여윈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5 원료 SIM 이미지. 왼쪽 아홉 원시 이미지 TIRF-SIM 이미지를 생성하는데 필요한 격자 패턴의 9 배향을 나타낸다. 묘화 셀 GFP 표지 된 F-액틴 발현 된 Jurkat T 세포는 세포 확대 특히 셀 둘레, 모아레에 불균일 한 조명을 보여주는, 아홉 원시 이미지 중 하나를 보여주고있다. 구조화 된 조명이 표시되지 않지만이 개선 된 해상도와 이미지의 결과를 재구성 한 후 조명 및 샘플 사이의 상호 작용은 다양한 조명 강도의 영역을 만들 수 있습니다. 두 스케일 바는 5 μm의 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 고해상도 잡음 제거 (HRNS) 설정 하위 최적의 설정은 하위 최적의 영상 재구성로 이어집니다..; (A)는 복원 된 데이터의 차이점을 보여줍니다 낮은 HRNS 해상도를 줄이고 정밀한 세부 사항의 손실이 발생할 수 있습니다 꽃잎 지역 외부 증가 배경 소음과 높은 HRNS 리드 (설정은 각 이미지의 좌측 하단에 사용). (B)는 전방 푸리에 주변 정보는 더 높은 해상도를 나타내는 데이터 (A)의 이미지로 변환 나타냄; HRNS는 축소 화상의 해상도를 나타내는 5로 설정되어있을 때의 변환 클립핑 꽃잎 참고. (C)는 다른 설정으로 (노란 박스) 액틴 섬유의 전체 폭의 절반 최대치 (FWHM)을 보여, 소프트웨어를 통해 FWHM 측정은 판독했다90 나노, 100 nm의 각각 0.1, 1, 5 HRNS 설정 180 nm의의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 기술은 이미지에 대한 연구를 허용하고 형광을 발현하는 세포에서 이전에 확인할 수없는 정보를 정량화한다. 본 연구 결과에서는 F-T는 액틴 세포는 IS에 셀 중심쪽으로 셀 주변에서 대칭으로 흐르는 것을 보여준다. 이러한 결과는 1D 라인 프로파일 kymograph 데이터 (13)로부터 이전의 결과와 일치하며, 2D 및 초 - 해상도 데이터의 분석 능력을 확장한다.
제시된 기술은 시간이 지남에 따라 하나의 1D 라인을 통해 형광 강도의 변동을 세우고 제한됩니다 kymograph 영상에서 진행됩니다. 이에 비해 현재의 기술은 추출 방향성과 속도 모두 전체 세포 분자 흐름의 정량화 할 수 있습니다. 스펙 클 이미징 또한 2 차원 환경에서 액틴 역학 14에 도시되었지만, 기술 스펙 클은 정확한 라벨링 밀도 어려움에 의해 제한 만 액틴의 모집단을 시각화 할 수있다.
이러한 결과를 얻기 위해 가장 중요한 단계는 특정 세포의 형질 전환 효율은 SIM 현미경 광학 격자 패턴의 연구원 및 정렬에 의해 사용되는 최적화한다. 하위 영역의 정확한 크기를 선택하면 시료의 특징에 따라, 너무 작은 설정은 빠른 이동 형광 상관 관계 분석에 의해 잃었지만, 너무 많은 선택을 의미하는 것입니다 하위 영역을 사용하여 획득 한 추가 데이터의 뉘앙스의 잠재적 인 손실을 의미하므로 중요하다 수퍼 - 해상도 방법.
하위 영역은 빠르게 움직이는 물체를 추적하기위한 신뢰성이 향상 될 수 증가 속도 맵핑 분석 슈퍼 픽셀을 생성하는 합산 된 화소의 수를 나타낸다. 아구 간격은 슈퍼 픽셀 내의 데이터 사이의 갭이다. 하위 영역의 간격이 하위 영역의 크기보다 낮은 경우,이 인접 벡터는이 설정을 증가하는 방향 단점을 줄일 수있는 몇 가지 정보를 공유 할 것입니다최종 vectormap의 istency 생성. 최대 지연 시간은 입력 번호가 시간의 최대 수는 분석이 종료하기 전에 지연 인 시간 상관 분석을 제어한다.
최종 이미지의 재구성 조명 변조 대비 (IMC)와 고해상도 잡음 제거 (HRNS) 설정을 선택하기 위해 필요합니다. 최적의 설정은 샘플링 할 샘플과 다를 수 있습니다. IMC는 샘플에 줄무늬 조명 패턴을 구별하는 데 도움이, 그리고 재건 유물을 줄일 수 있습니다. HRNS는 푸리에에서 고해상도 데이터를 '클리핑'변환에 의해 콘트라스트가 낮은 데이터로부터 유물을 감소시킬 수있다; 최대 해상도 기능을 유지하고 재건 유물이이 정상적으로 1로 설정된다 최소화합니다.
이 기술의 한계가 STICS 소프트웨어 기술 TIRF-SIM 또는 2D-SIM에 한정되는 3D 데이터를 분석 할 수 없기 때문에, 공정의 2D 특성 기반으로되어,이 때문에 relat로 샘플을 필요coverslip에 대한 ively 평면. 또 다른 기술적 인 단점은 TIRF-SIM은 50 밀리 초 프레임 인수 및 격자 패턴 방향을 재 SIM 현미경으로 찍은 시간 우리의 설정 등, 최종 초 해상도 영상을 복원하기 전에 수집해야하는 9 원 프레임을 필요로한다는 것이다; ≈1 초의 프레임 속도를 얻을 수있다. 다른 초 해상 기술 획득 시간 및 볼의 큰 필드와 비교하여 이러한 제약은 대부분의 적용에 적합하다.
여기에 제시된 결과는 면역 시냅스 형성에 F - 굴지 흐름의 표준 TIRF 영상에서 데이터 세트와 비교할 수 있습니다. 영상 방식과 잘 일치 STICS 잠재적 SIM 재구성 인공물에 대해 또한 사용 중에 SIM 화상 취득 설정 데이터 분석 용으로 허용되는 것을 보여 강하다. 작은 화소로 많은 데이터를 초해 셋 사이즈 사용하여 개별 셀 (S)의 역학으로부터 추출 될 수있다UB-회절 세포 마이크로 도메인을 조사 할 수있다.
이 기술을 파지 한 후 임의의 분자 유동을 범위로, 촬상하고 정량화 할 수있다 비 침습적 어딘가에 셀의 XY 평면 내에서, 공 초점 현미경으로 샘플링 세포막의 흐름에 대한 질문, 또는 경우에 다수의 조사.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables: | |||
| Jurkat E6.1 cells | APCC | ATTC TIB-152 | |
| RPMI | Life Technologies | 21875-091 | |
| FBS | Sigma | F7524-500ML | |
| Penicillin-Strepromycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-050 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630-056 | |
| #1.5 8-well Labtek coverslips | NUNC, Labtek | 155409 | |
| LifeAct GFP construct | Ibidi | 60101 | |
| OptiMem | Life Technologies | 51985-042 | |
| anti-CD3 | Cambridge Bioscience | 317315 | |
| anti-CD28 | BD Bioscience / Insight Biotechnology | 555725 | |
| PBS | Life Technologies | 20012-019 | |
| Lens oil | |||
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment: | |||
| Gene Pulsar Xcell System | BioRad | 165-2660 | |
| Cuvette (0.4cm) | BioRad | 165-2088 | |
| Centrifuge (5810R) | Eppendorf | 5805 000.327 | |
| Centrifuge (Heraeus) | Biofuge pico | 75003235 | |
| 6 well plate | Corning | 3516 | |
| Stage-top incubator | Tokai Hit | INUH-TIZSH | |
| Nikon N-SIM microscope | Nikon | Contact company | |
| Nikon Analyse software | Nikon | Contact company | |
| Incubator (190D) | LEEC | Contact company |
References
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