Abstract
İpliksi-aktin motilite ve bağışıklık hücrelerinde, immünolojik sinaps olarak bilinen önemli bir hücre-hücre etkileşim oluşumu dahil hücre işlemlerinin çoğunda önemli bir rol oynar. F-aktin, aynı zamanda, alt-membranöz vezikül dinamikleri ve protein kümelenme de dahil olmak üzere hücre zarı moleküler dağılımlarının düzenlenmesinde bir rol oynadığı düşünülmektedir. Standart ışık mikroskobu teknikleri genelleştirilmiş ve kırınım sınırlı gözlemler yapılmasına izin verirken, kümeleme ve moleküler akış dahil olmak üzere birçok hücresel ve moleküler olayların çok standart ışık mikroskobu çözme gücü altında uzunluk-ölçeklerde toplumlarda görülür. Süper çözünürlük görüntüleme yöntemi yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu ile toplam iç yansıma floresan birleştirerek, T hücrelerinin bağışıklık sinaps F-aktin iki boyutlu moleküler akış kaydedildi. Ölçülebilir resul üretir uzay-zamansal görüntü korelasyon spektroskopisi (ampüller) daha sonra uygulandı,hız histogramlar ve akış yönünü ve büyüklüğünü temsil eden vektör haritaları şeklinde ts. Bu protokol detay alt kırınım seviyelerinde akış vektörleri oluşturmak için süper çözünürlüklü görüntüleme ve ampüller teknikleri kombinasyonunu açıklar. Bu teknik, sinaps formasyonu üzerine T hücrelerinin çevresi boyunca aktin simetrik retrograd akış ve merkeze doğru teyit etmek için kullanıldı.
Introduction
Bu deneyin amacı görüntü ve imünolojik sinapsın (IS) formasyonu sırasında akış yönünü ve büyüklüğünü tespit etmek için kırılma sınırının ötesine, T hücreleri canlı filamentous- (F), aktin moleküler akışını karakterize eder. Bu teknik anti-CD3 ve anti-CD28 antikorları ile kaplı lamelleri aktive yapay bir sinaps meydana Jurkat T-hücreleri görüntüleme, toplam iç yansıma flüoresans (TIRF) modunda yapısal bir aydınlatma mikroskobu (SIM) kullanılarak yürütülecektir. Bir T hücresi ve hedef arasındaki IS formları; T hücresi reseptörü (TCR) aktivasyon 1,2 üzerine, bir antijen sunan hücre (APC). Bu adaptif immün sistemi, bir enfeksiyon, bir bağışıklık cevabı üretir belirleyen ilk adım olarak, uyaranlara yanıt doğru sonuçları bir dizi hastalığın neden olabilir. T hücre-APC etkileşiminin önemini iyi belgelenmiş, ancak, Olgun rolü (ler) ilk TCR si sonra ISgnal içselleştirme henüz tam olarak anlaşılmalıdır.
Hücre iskeleti adımları aydınlatmak olacak geçici TCR aktivasyonu (plazma membranında moleküllerin hareket ve 3,4 hücre iskeletinin aktin bağımlı sinyal molekülleri kontrol), hücre iskeleti mekansal yeniden düzenler nasıl anlamak bağlantılı iki süreç yardım ve düşünülüyor gibi sinaps oluşumu sırasında moleküler yeniden yapılanma. F-aktin retrograd akım immünolojik sinaps merkezine doğru TCR kümeleri ağıl düşünülmektedir, bu translokasyon sinyal kesilmesi ve geri dönüşüm için hayati olduğuna inanılmaktadır; T hücre aktivasyonu 5 ince bir denge yardım.
Standart floresan mikroskopi hücre-hücre etkileşimleri de dahil olmak üzere birçok biyolojik olaylar hakkında fikir vermeye devam etmektedir esnek bir araç olsa da, doğru bir diffr daha yakın ikamet eden birden fazla fluorophores çözmek için sistemin yeteneği ile sınırlıdırbirbirinden işlem sınırı (≈200 nm). Hücre içinde birçok moleküler olaylar moleküllerin yoğun popülasyonları içeren ve sükunet içinde veya belirli uyarılması üzerine ya dinamik yeniden düzenlenmesi sergilemek gibi geleneksel ışık mikroskobu tam resmini sağlamaz.
Süper çözünürlüklü görüntüleme kullanımı araştırmacılar çeşitli teknikler kullanarak kırınım sınırı aşmak için izin verdi. PALM ve FIRTINA 6,7 yaklaşık 20 nm'lik bir hassasiyetle moleküllerin yerini yukarı çözmek yeteneğine sahip tek molekül yerelleştirme mikroskobu (SMLM) gibi, ancak, bu teknikler pek çok karelerin üzerine bir görüntü kadar bina, uzun satın alma süreleri güveniyor . Genellikle bu sabit örnekleri gerektirir veya yapıların düşük hareketlilik sergilemek için çok tek flüoroforlar çok noktadan olarak yanlış değildir. Uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) görüntüleme çok seçici konfokal uyarma 8, gerekli tarama yoluyla süper çözünürlük veriyor olsa dayaklaşım görünümünün tam hücre alanları üzerinde yavaş olabilir. STED nedeniyle de tükenme ışınının gücü artışı daha yüksek çözünürlükler için önemli fototoksisite göstermektedir.
Yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SİM 9) standart floresan mikroskop çözünürlüğü iki katına yeteneğine bu yöntemler, bir alternatif sağlar ve geçerli SMLM tekniklerine göre daha canlı hücre görüntüleme ile daha uyumludur. Bu bakış tüm hücre alanları için geniş alan sistemde alt lazer yetkilerini kullanır; satın alma hızları arttı ve standart fluorofor etiketleme ile uyumludur sağlamadan. SIM geniş alan doğa da <100 nm eksenel boyutunda penetrasyon derinlikleri ile, son derece seçici uyarılması için toplam iç yansıma floresan (TIRF) kullanımını izin verir.
Resim korelasyon spektroskopisi (ICS) flüoresan yoğunluğundaki değişiminin ölçülmesi için bir yöntemdir. ICS bir evrim; Uzay-zamansal imYaş korelasyon spektroskopisi (ampüller 10) zaman ve mekan hücre içi floresan sinyalleri ilişkilendirir. Korelasyon fonksiyonu ile geri kalmış çerçeveler içinde pikselleri çevreleyen piksel yoğunlukları ilişkilendirilerek, bilgi akışı hızları ve yön ile ilgili elde edilir. Statik nesneler ampüller analizi ile karışmaz sağlamak için, hareketsiz bir nesne filtre piksel yoğunluğunun bir hareketli ortalama çıkarılarak çalıştığı, uygulanmaktadır.
Burada sunulan teknik, canlı hücreler 11 moleküler akışını ölçmek için süper çözünürlük mikroskopi verileri uygulanan görüntü korelasyon spektroskopisi görüldüğü ilk örnek olduğuna inanılmaktadır. Bu yöntem, ampüller analizi 12 üzerinden F-aktin akışının kırınım sınırlı görüntüleme geliştirir ve ışık kırınım sınırının ötesinde mekansal çözünürlükte elde edilen verilerden, canlı hücrelerde iki boyutlu moleküler akışını belirlemek için isteyen araştırmacıları uygun olur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: görüntülemenin gününden önce 1 ve 2 almak yeri Aşamaları; Tüm ortam ve katkı önce veya görüntüleme gün dengelenir kullanılmak üzere olun. Dengeleme,% 5 CO2 ayarlanmış bir inkübatör içerisinde 37 ° C'ye kadar ortam ve takviyeleri ısınma ile elde edilir. Tüm hücre kültürü çalışmaları ve lamel kaplama adımlar bir laminer akış kaputu altında steril koşullarda gerçekleşecek.
1. Hücre transfeksiyonu
- Transfect T hücreleri bir plazmid floresan füzyon F-aktin GFP etiketleme ve görüntüleme için inşa kodlama ile deneyden önce 24 saat görüntülü edilecek. Not: Hücreler önce transfeksiyon (önceki görüntüleme 48 saat) hücreler optimum sağlıkta ve logaritmik büyüme aşamasında olduğundan emin olmak için 24 saat bölünmüş olmalıdır.
- Dengelenmeye inkübatör içine 6-çukurlu plaka tek bir kuyuda RPMI ekinin 5 mL (RPMI 1640 artı% 10 FBS ve% 1 Pen-Strep (isteğe bağlı)) yerleştirin.
- 2 x 10 7 T hücreleri kült pelet5 dakika boyunca 327 x g'de santrifüj tüpü kullanılarak RPMI ek, 37 ° C 5% CO2 de edili- ve önceden ısıtılmış elektroporasyon ortamının bir eşit hacmi içinde yıkayın. Not: Elektroporasyon orta tamponlar ve takviyeleri (sarf bakınız) içeren bir azalma serum ortamıdır.
- 5 dakika boyunca 327 x g'de yeniden topaklama sonrası, elektroporasyon ortamı 500 ul hücre tekrar süspansiyon ve yavaş yavaş, bir küvete ilave markalama F-aktin PCR sınıf dH 2 O plazmidin 5 ug ekleyin.
- Yavaşça elektrik kıvılcıma neden olabilir ve medya içinde eşit hücreleri dağıtmak için medyada herhangi bir hava kabarcığı, kaldırılmasını sağlamak için kaput çalışma alanında küveti dokunun.
- 290 Ω elektroporasyon aparatı ve set gerilime 300 V ve kapasitans açın. 20 ms için bir üstel çürüme kullanarak electroporate örnek. Not: Optimizasyon farklı hücreler ve farklı plazma yapıları için gerekli olabilir.
- Transfeksiyon protokolü kezdevam etmeden önce 1 dakika boyunca buz üzerinde, tam depolama hücreleri.
- Dikkatle aşama 1.1.1 dengelenmiş RPMI ekinin 5 mL içeren 6 oyuklu plakaya küvetten gelen hücreler aktarın.
- 37 ° C ile + 5% CO 2 hücreleri O / N inkübe edin.
2. Kat Lameller ve Pre-sıcak Görüntüleme Ek
- Antikorlar ile kaplayın lamelleri T hücre stimülasyonlara.
- Kat 200 ul PBS içinde 1 ug / ml αCD3 ve αCD28 ile 8 oyuklu lamel her bir bölme.
- 4 ° CO / N saklayınız. Seçenek olarak ise, 2 saat görüntü vermeden önce ve kılıf lamelleri lamel sıcaklık değişimleri en aza indirerek Görüntüleme işlemi sırasında kaymasını azaltmak için 37 ° C'da bir kuluçka makinesi içinde tutar.
- 0.1 mikron alt kırınım floresan mikroküreler ile lamel test örneği oluşturun.
- Boncuk Vortex stok çözeltisi kümeleri önlemek için.
- Th yeni, temiz bir lamel(üreticinin talimatlarına göre) yüzeye adım 2.1.1 kullanılanlar, pipet 5 ul floresan Microsphere stok solüsyonu olarak e aynı tip.
- Pipet ile lamel üzerine Mikroküre çözümü yayıldı.
- Daha sonra, kuruması gibi PBS gibi orta montaj 200 ul uygulamak için izin verin.
Not: montaj orta o görüntüleme hücre örnekleri için kullanılan aynı olmalıdır.
- HBSS dengeye 37 ° C ± 5% CO2 de önceden sıcak O / N bir kuluçka makinesi içinde yerleştirerek bir santrifüj tüpüne (bundan böyle 'HBSS ek "olarak adlandırılan + 20 mM HEPES,).
Not: HEPES eklenmesi bu takviyesi atlamak CO 2 girişli bir kuluçka odasını kullanılıyorsa, CO 2 tampon olduğunu.
3. Mikroskop Set-up
- Tam gözü tabanını kapsayacak şekilde mikroskop haznesinde TIRF-SIM mikroskop ve yer yeterli distile su sahne top inkübatör açın. Su e izin ver37 ° C'ye kadar quilibrate. Ayrıca 37 ° C olarak ayarlandı objektif lens, ısıtma yaka ekleyin.
Not: set-up duyarlılığına, bu adımlar o kadar gece önce yapılır nedeniyle optik bileşenler sabit sıcaklıkta görüntüleme öncesinde bulunmaktadır. - Mikroskop ışık yolu TIRF 488 uyumlu ızgara blok yerleştirin ve yerine sabitleyin.
- TIRF-SIM modunda doğru optik yolunu yapmaya sırasıyla lazer yatak ve mikroskop sahnede 'Tek' konumuna kanal modunu ve fiber kablo geçiş. Not: Bu adımı atlanıyor yazılım penceresi içinde bir hata (Şekil 1A) yol açacaktır.
- Tüm mikroskop ve bilgisayar bileşenleri açın ve satın alma kontrol yazılımı açın.
- OC panelini açın, Ti Pad, N-SIM Pad ve ND Acquisition pencereler (Şekil 1B). 'OC Panel' seçeneğini 'TIRF 488' (Şekil 2B, sarı ok) seçin. N-SIM Pad penceresinde, 'TIRF-SIM' ve 'Moving' Ayarları (Şekil 2C, sarı oklar) seçin. Ayarlar düğmesine (Şekil 1C, sarı kutu) seçin ve açılır menüden, hit '488 (100x TIRF 488nm için) TIRF' 'OK' 'Uygula' seçeneğini seçin.
- Frame Rate 50 msn, Okuma modu, EM Kazanç 14-bit 3 MHz, ve 1 Dönüşüm Kazancı ile EM Kazanç Çarpanı 300 (Şekil 1C, yeşil kutu): için 'DU897 ayarlarının' içinde kamera ayarlarını yapın.
Not: frame rate hususlar için Temsilcisi Sonuçlar bakın. - 'N-SIM Pad' üzerine, 100x 1.49 NA CFI Apochromat TIRF objektif seçerek TIRF-SIM için mikroskop aydınlatma kalibre% 10 488 nm lazer açın.
Not: Ham görüntülerin Piksel boyutu görünümünde bir 512 x 512 piksel alanı ile, 60 nm. - Toz ve yağı çıkarmak için mercek dokusu kullanarak objektif lens temizleyin.
- Mümkün olan en düşük z-düzleminde hedefi ile başlayın. Objektif lens petrol bir damla koyun ve mikroskop aşamasına adım 2.2 floresan Microsphere örneği ekleyin.
- Mikroskop gövdesi üzerinde bulunan Mükemmel Odak Sistemi (HTS) işlevini seçiniz.
- PFS düğmesi ulaşıldı odak düzlemi onaylamak için yanıp sönmesi durana kadar yavaşça z-düzlemi ile objektif yukarı hareket ettirin.
- Kontrol yazılımı ve görüntü PFS mikro-manipülatör tekerleği kullanılarak yapılan nihai ayarlamalar için mikroküreler üzerine 'Live' görünümüne geçin.
- 75 nm fani dalga üzerinde hiçbir out-of-focus floresan emisyonu ile homojen aydınlatma gözlemleyin.
Not: Yapılandırılmış aydınlatma floresan Microsphere örnek dalgalı bir aydınlatma deseni gözlemleyerek yerine onaylayın. - Floresan Microsphere örneği ölçün ve geliştirilmiş görüntüleme rezolüsyonlu ölçmekyoğunluk profilinin Yarım Maksimum Full Genişlik (FWHM) gözlemleyerek iyon.
- Yüklü NIS-A N-SIM Analiz modülü ile, analiz yazılımı (v4.20.01) açın ve 'Uygulamalar' seçeneğini -> 'Show N-SIM penceresi'.
- TIRF-SIM veri setleri (Şekil 2) için 1 olarak ayarlanır aydınlatma modülasyon kontrast (IMC) ve yüksek çözünürlüklü gürültü bastırma (HRNS) ile 30 piksel boyutunda 1024 x 1024 piksel yeniden görüntü oluşturmak için Microsphere örnek bir görüntüyü yeniden nm.
- 1 piksel (Şekil 3A, sarı kutu) genişliğinde çizgi profil aracını kullanarak, tek bir mikro ortasından bir çizgi çizin.
- FWHM düğmesini (Şekil 3B, sarı kutu) seçin ve yoğunluğu minimum ardından Gauss dağılım yoğunluğu maksima En tıklayın.
- Mikrosfer FWHM 100 nm'de (Şekil 3C) aralığındadır teyit edin. Not: Çözünürlük achhedeflenmektedir: görüntüleme biyolojik örnekler işaretleme verimliliğine ve arka plan floresanı sinyal-gürültü oranı bağlı olarak değişecektir.
Görüntüleme için 4. Numune Hazırlama
- Lamel hazırlanması.
- Buzdolabı veya inkübatör adım 2.1 αCD kaplı lamel Al ve her kuyudan PBS içeren αCD3 ve αCD28 kaldırın.
- Lamel, her sıra için bir adım 2.3 önceden ısıtılmış HBSS ekinin 200 ul ekle. Yıkayın ve minimal αCD3 sağlamak için kaldırmak ve αCD28 çözeltisi içinde bırakılır. Lamel kuyularına HBSS ekinin başka bir 200 ul ekleyin.
- Yağ ve partikülleri ortadan kaldırmak için mercek dokusu ile lamel alt temizleyin.
- Adım 3.4 bulunduğu gibi mikroskop sahnede Pozisyon lamel ve PFS z-düzlemi kullanarak lamel TIRF odak düzlemini bulmak.
- Hücre hazırlanması.
- Medya con 200 ul pipetBir mikro santrifüj tüpüne aşama 1.1.8 transfekte hücrelerin taining.
- 20 saniye boyunca 268 xg'de bir mikro-santrifüj Pelet hücreleri ve hücre ortamı çıkarın.
- 200 ul yeniden süspanse hücreleri adım 2.3 HBSS takviyesi ısıtılmış önceden.
5. Görüntüleme Hücreleri
- Mikroskop hücre içeren HBSS takviyesi almak ve yavaşça kuyuların birine 200 ul pipetle.
- (PFS modunda) lamel de TIRF odak düzlemi içinde kalırken, lamel yaklaşırken flüoresan hücreleri izlemek için mikroskoplar mercek ve bir epifluorışıma aydınlatma kullanıldığında.
- Hücreler lamel arazi kez monitörde Görüntüyü getirmek ve hücreler bilgisayar ekranında odak olup olmadığını kontrol etmek, N-SIM Pad 'Canlı' moduna geçin.
- Tıklatın, Kuzey Dakota Toplama penceresini açın ve 'Zaman' sekmesini seçin, zaman kurslar kaydetmek için Hiçbir gecikme, 'Süre' için 'Ekle' ve 'Aralığı' set10 dakikaya kadar, 1 olarak ayarlandığında 'Loops'.
Not: Süre ilgi sürecine bağlı olarak değiştirilebilir; 'Hayır Gecikme' ile yakalanan zaman ampüller yazılım ≈10 kare görüntü yığınları ile kantitatif sonuçlar elde edebilirsiniz. - Boncuk numune aynı satın alma ayarları ile, Kuzey Dakota Toplama penceresindeki 'şimdi çalıştır' seçilerek verileri kaydetmeye başlayın.
6. Yeniden SIM Görüntüleri
- Görüntüleme işlemi tamamlandıktan sonra, yüklü NIS-A N-SIM Analiz modülü ile, analiz yazılımı (v4.20.01) açın ve 'Uygulamalar' seçeneğini -> 'Show N-SIM penceresi'.
- TIRF-SIM veri setleri için 1 olarak ayarlanır aydınlatma modülasyon kontrast (IMC) ve yüksek çözünürlüklü gürültü bastırma (HRNS) (Şekil 2) ile bir (ya da Toplu aracını kullanarak birden) bir yeniden SIM görüntü elde etmek için ham SIM dosyası yeniden.
- Yeniden dosya teyit belirtilen 30 nm'lik bir piksel boyutuna sahiptirGörüntü durum çubuğu.
Not: Piksel boyutu ampüller analizini etkilemez ancak piksel arasındaki uzaysal ilişkiyi sağlamak için PSF mekansal çözünürlükte daha boyutunda en az 2x daha küçük olmalıdır. - Ampüller analize hazır .tiff dosyaları gibi verileri aktarın.
7. ampüller Analizi
- (; Ek bilgi olarak mevcuttur Wiseman laboratuarı) İndirme ve STIC (C) özü Matlab yazılım paketi S. Komut stics_vectormapping.m tek bir kanal ampüller analiz çekirdek ve kodunun ilk 30 satır kılavuzun bölüm 2.1'de tanımlanan giriş parametreleri tanımlamak için kullanılır. Bu komut dosyasını açın ve TIRF-SIM veri analizi için giriş parametrelerini tanımlar. Kılavuzun ekinde ayrıntılı gibi, aynı zamanda yerel makine Matlab yoluna alt klasörler ile STIC (C) S klasör eklemek için önerilmektedir.
- Kod satırlarını gelen düzenleyerek veri analizi için girdi parametreleri tanımlayın
- Ana gerçekleştirmek içinTIRF-SIM verilerinin parçalama, 1 vektör haritası oluşturmak vektör haritaları zaman serisi elde etmek için maksimum kare sayısı ve 1. hat 32 geçici bir değişikliğe hat 31 temporal bölgesinde bir yere geçici parametrelerini ayarlamak için bu parametreleri değişir .
- Hareketsiz kaldırma filtresi için 21 'MoveAverage' parametresini (satır 24) 'ortalama Hareketli' ve ayarlamak için parametre 'filtreleme' (hat 23) ayarlayın.
Not: analiz edilen çerçeveden seri kareleri çıkarılarak dayalı olarak bu ayar, yavaş hareketli ve büyük floresan sinyalleri için çalışmaya gösterilmiştir. - Değişim hatları 33-38 çıktı dosyalarını ve çıkış vektör haritaları başlıkları adını yanı sıra çıkış dizin yolunu ayarlamak ve vektör harita görüntüleri kaydedilmiş olmalıdır ne biçim içinde tanımlamak için kullanılır.
| Piksel boyutu (um) | 0.03 mikron | Satır 19 |
| Frame rate (sn) | 1 saniye | Satır 20 |
| Maksimum gecikme süresi (kare) | 20 kare | Satır 21 |
| Altbölge boyutu (piksel) | 8 piksel | Satır 29 |
| Altbölge aralığı (piksel) | 1 pixel | Satır 30 |
- Matlab Editör penceresinde komut run1ChannelSTICS açın. Çizgileri bu komut 1-23 çalıştırarak görüntü serisi yükleyin.
Not: Bu komut dosyası yüklemek ve ön süreci görüntü serisi, vektörel haritalar ve hız histogramları arsa ve çok sayıda dosya için bir toplu işlem çalıştırmak için kullanılabilir. Gerekirse, bu komut satırı 24-26 kullanılarak ilgi bölgeye Görüntüyü kırpmak.- Run çizgiler run1ChannelSTICS arasında 29-35 ampüller analizini başlatın. İstendiğinde, istenirse, faiz (ROI) belirli bir bölgesini belirtmek için bir çokgen seçin. Sınır eserler ortaya gibi ampüller bu yeniden analiz zaman ROI, hücre kenarı ile örtüşmeyen emin olungions.
- Run satırlar 38-52 vektör haritaları görüntülemek için. Hız büyüklüğü histogram çizmek için çizgileri 53-72 çalıştırın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikroskop ayarları
Başarıyla elde ettikten sonra adımları araştırmacı olacak bir T hücresi sinaps F-aktin akış başarılı yapılandırılmış aydınlatma (SİM) görüntüleme var (Video 1) ve uzay-zamansal görüntü korelasyon spektroskopisi (Şekil 4 11) tarafından bu moleküler akış miktarı. Görüntüleri kaydetmeden önce, numune aydınlatma dokuz ham görüntüleri tektip ve örnek gözlenir Moire saçaklar şeklinde olduğu yapılandırılmış aydınlatma (Şekil 5) olduğundan emin olun, bu her iki göstergeler lamel sahnede ve TIRF- düz olduğunu vardır SIM set-up düzgün hizalanmış.
Bu hücreler deney sırasında mümkün olduğunca sağlıklı kalmasını sağlamak için düşük lazer gücü (≤10%) tutmak için önemlidir. Floresan ifade bile t optimizasyon sonra, düşüksediye belirtti 50 milisaniye ve / veya Dönüşüm Kazanç ayarlarının üzerinde her ham çerçevenin pozlama süresini artırmak, adımları elektroporasyonu. TIRF-SIM kare hızını azaltacaktır pozlama süresini artırarak 9 çiğ çerçeveler, yeniden oluşturulan görüntü başına gerekli 9 aydınlatma yönelimleri her biri için 1 gerektirir gibi. Bu deneyde, 50 milisaniye pozlama veriyor ≈1 (aynı zamanda ızgara dönme süresi dahil) saniyede yeniden çerçeve, hızlı olaylar tek ham çerçeve içinde birden fazla aydınlatma maksima yoluyla taşıdığınızda görülen hareket eserler riskini azaltır.
Moleküler akış hızına bağlı olarak hareket eserler tanıtmak olabilir pozlama süresini arttırmak, çalışılan; Araştırmacılar iyi bir sinyal için gerekli olan minimum kalma süreleri tutmalı. SIM görüntülerde piksel boyutları standart floresan görüntülerin daha küçük olduğundan, daha hızlı akış hızlarına sergileyen moleküler popülasyonları sonraki fr önce alt-geçebilirame elde edilir. Ampüller yazılım daha hızlı bu küçük bölgede floresan sinyali ilişkilendirmek için görüntü oranları standart floresan veri setleri ile karşılaştırıldığında gereklidir. Standart bir floresan veri kümesinden bir 8 x 8 piksel alt bölge (200 nm'lik bir kabul piksel boyutu ile) 1,7 um'lik bir alanı temsil eder Örneğin, SIM veri 8 x 8 piksel alt bölge boyutu 240 x 240 nm alanını temsil eder.
Uzun zaman ders (> 3 dk) için veri toplu sinaps oluşumu sırasında lazer pozlama (azaltmak için 'ND edinimi' kullanılarak alınabilir, örneğin, 10 dakika boyunca her dakika aynı kümülatif lazer güç hücreyi gösterecektir 10 saniye görüntüleme Sürekli <2 dakika) için görüntüleme gibi.
SIM görüntüleme gelen alt-optimal rekonstrüksiyon aynı ham veri farklı yüksek çözünürlüğünde kullanılarak yeniden inşa edilmiştir, Şekil 6'da gösterilmektedirGürültü bastırma (HRNS) ayarlara ileri Fourier dönüşümleri (FFT) ve vurgulanan lif tam genişlikte yarı maksimum profilleri de gösterilmiştir. HRN Ayar nedeniyle zayıf sinyal-gürültü-ve artan çözünürlük artan imar eserler arasında bir dengedir. <(1) can 'klip' ve yüksek çözünürlüklü veri atın (azaltılmış FFT çapı olarak görülen) çok düşük bir HRN (çok yüksek HRNS ayarı yaparken 1), artmış altıgen SM eserler ile grenli görüntüleri neden olabilir>. Çözünürlükleri gerekebilir optimize edilmiş bir mikroskop kurulumu ile veri reacquiring hala sub-optimal iseniz> 100 nm çözünürlük, farklı ayarlarla yeniden yeniden bir ihtiyaç işaret eder.
Görüntüleme ve moleküler akış miktarının
Görüntü moleküler akışına, zaman serisi verileri uyarıcı coversli bir sinaps iniş ve şekillendirme T hücrelerinin alındıp, F-aktin hücre merkezine doğru hücre çevreden retrograd akmaya görülebilir. Hücre ampüller analiz merkezi sadece sinaps çevresinde yürütülmüştür doğru F-aktin daha az yoğun hale geldikçe sinyal microclusters uzun süreli sinaps oluşumu sırasında kaynaklandığı bilinmektedir nerede, bu bölge aynı zamanda.
Edinme ve ampüller kullanarak verileri analiz zaman programın daha yüksek ve daha yumuşak bir korelasyon fonksiyonu (CF) oluşturulması için seçilen alt bölgelere içindeki floresan dalgalanmaları ilişkilendirilmesi dayanmaktadır anlamak önemlidir. Yazılım bu alt bölgelerin içinde yapıcı sinyal dalgalanmaları toplam sayısı ile bir çıkış oluşturma konusunda daha fazla güvenir olarak başarılı bir ampüller çıktıyı üretmek için gerekli olan kare mutlak sayısı kesin değil. Örneğin, veri kümesi aynı yönde ampüller akan her alt bölgede 20 mobil etiketli proteinler varsa gene az kareleri gerekirdaha zayıf bir korelasyon fonksiyonu 5 mobil proteinler sonuçları ve bir alt bölge daha fazla kare ihtiyaç olabilir, güvenilir bir çıkış oranı. Kullanılan çerçeveleri ve alt bölge boyutunun tam sayısı görüntülü moleküler olayların doğasına bağlıdır ve kullanıcı tarafından optimize edilmelidir.
Debileri farklı hücresel koşullar ya da daha önce olduğu gibi ve ilaç tedavileri sonrasında çevresel uyaranlara bağlı olarak aynı hücre içinde değişmesi durumunda araştırmacılar görmek için izin: ampüller 'Geçici çerçeve kırpma' aracını kullanarak, zaman içinde moleküler akış alt kümelerini analiz etmek mümkündür. Hareketsiz nesne filtresi önce mobil floresan nüfusu analiz için herhangi bir taşınmaz floresan nüfusu kaldırmak için tasarlanmıştır. Bu yaklaşımı kullanarak yine başarılı olabilir% 90'a kadar statik nüfus yüzdeleri içeren görüntüler 10 analiz. 21 kareye kadar hareketsiz filtre ayarı kalan herhangi bir floresan popülasyonları filtreler immünolojik sinaps stabilizasyonu sırasında dinamik retrograd akışına katkıda bulunmamaktadırlar zaman veya daha uzun bu dönemde, statik.
Tek kanallı ve Fiber modları seçildiğinde değilken Şekil 1. Mikroskop edinme ayarları. (A) deney ve 'Yanlış fiber' hatası için kullanılan N-SIM Pad ayarlarını vurgular. (B), rekor set-up ve SIM sistemi üzerinde yapılandırılmış bir aydınlatma görüntüyü yeniden oluşturmak için gerekli olan tüm pencereleri. (C) N-SIM Pad ve N-SIM Ayarları pop-out pencere (sarı kutu) fiziksel mikroskop içine ızgara 488 nm yerleştirdikten sonra Izgara Setup seçmek için kullanılır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. Final görüntü için İmar ayarları. Açılan menüden 'Param' düğmesine (sarı kutu) seçeneğini TIRF-SIM seçtikten sonra, başlangıçta belirlenen 'Tezhip Modülasyon Kontrast' (IMC) ve 'Yüksek Çözünürlüklü Gürültü Bastırma, hem 1'e '(HRNS) Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. Yarım Maksimum (FWHM) ölçümü. Analiz yazılımı (A) kullanarak Full Genişliği bir Gauss seçilen hat yoğunluğu aracı arsa (sarı kutu) ve boncuk örneği bir yeniden SIM resmin çekilir gösterir. (
Şekil 4. Temsilcisi yapılandırılmış aydınlatma verileri ve GFP etiketli F-aktin ifade ampüller çıktı. Bir Jurkat T hücresi immünolojik sinaps üretimi için uyarıcı lamel TIRF-SIM kullanarak görüntülü. Beş dakika temastan sonra, bir zaman ders almış ve ampüller analiz programı kullanılarak analiz edildi. Vektör haritaları sinaps çevresinde F-aktin retrograd akışını göstermek iken Sarı kutular bölgeleri uzaklaştırdınız temsil eder. Vektör renkler bu subregion moleküler akış hızı, hız verileri bir histogram üzerinde çizilmiştir gösterir. O ayırır veya ruffling veya motilitesi nedeniyle deney süresi boyunca uzak lamel hareket ederse nedeniyle TIRF-SIM sağlayan uyarma z-seçicilik, numune odak kaybetmiş olabilir. Bu vektör yoğunluğunun azalması olarak sağ üst panelde burada görülüyor. Indirgeme kullanıcı tarafından belirlenen süre boyunca hiçbir floresan dalgalanmalar göstermiştir altbölgeleri hareketsiz filtre uygulayarak ampüller bir sonucudur. Bu sonuç tüm zaman serisi için floresan sinyali ihtiva sadece seçme bölgelerin önemini vurgulamaktadır. sıska "> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5. Ham SIM görüntüler. Soldaki dokuz ham görüntüleri TIRF-SIM görüntü üretmek için gerekli ızgara deseni 9 yönelimleri göstermektedir. Görüntülü Hücre GFP etiketli F-aktin ifade eden Jurkat T hücresi, uzaklaştırdınız hücre özellikle hücre çevre etrafında, Moire saçaklar ile düzgün olmayan aydınlatma gösteren, dokuz ham görüntülerden birini göstermektedir olduğunu. Yapılandırılmış aydınlatma görünür olmasa da bu gelişmiş çözünürlüğe sahip bir görüntü ile sonuçlanan yeniden sonra aydınlatma ve örnek arasındaki etkileşimler, değişen aydınlatma gücü alanları oluşturmak. Her iki ölçek çubukları 5 mikron bulunmaktadır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 6 Yüksek çözünürlüklü gürültü bastırma (HRNS) ayarlarını Alt optimum ayarlar sub-optimal görüntü rekonstrüksiyonu yol açar..; (A) yeniden verilerdeki farklılıklar göstermektedir düşük HRNS çözünürlüğü azaltmak ve ince ayrıntıları kaybına neden olabilir petal bölgenin dışında artan arka plan gürültü ve yüksek HRNS yol açar (ayarlar her resmin sol alt kısmında gösterilir kullanılan). (B) ileri Fourier periferik bilgiler daha yüksek çözünürlük verileri gösterir (A) görüntülerin dönüşümü temsil; HRNS azaltılmış görüntü çözünürlüğünü gösteren, 5'e ayarlandığında dönüşümü kırpılmış yaprakları not edin. (C) Farklı ayarları (a sarı kutu) aktin fiber tam genişlikte yarı maksimum (FWHM) gösteriyor, yazılım aracılığıyla FWHM ölçümleri okuma verdi90 nm, 100 nm ve sırasıyla 0.1, 1 ve 5 HRNS ayarları için 180 nm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu teknik görüntüye araştırmacıları izin ve floresan ifade eden hücrelerde daha önce çözümlenemeyen ayrıntıları ölçmek olacaktır. Bizim sonuçlarımıza biz F-aktin T hücresi IS hücre merkezine doğru hücre çevreden simetrik bir şekilde akar göstermektedir. Bu bulgular 1D çizgi profil kymograph verileri 13 önceki sonuçlar ile tutarlıdır ve 2D ve süper çözünürlüklü veri analizi kapasitesini artırmak.
Sunulan teknik, zamanla tek 1D hat üzerinden floresan yoğunluğu dalgalanmaları komplo sınırlıdır kymograph görüntüleme bir ilerlemedir. Buna karşılık mevcut tekniği ekstre yönlülük ve hızlı bir şekilde bütün hücre molekül akış ölçümü sağlar. Benek görüntüleme ayrıca 2D ortamında aktin dinamikleri 14 göstermiştir iken, benek tekniği doğru etiketleme yoğunlukları ile zorluklar ile sınırlıdır ve sadece aktin gösteren bir alt görüntüler olabilir.
Bu sonuçlara ulaşmak için en önemli adımlar, belirli hücrelerin transfeksiyon verimliliği SIM mikroskop optik ve ızgara desen araştırmacı ve hizalama tarafından kullanılan optimize etmek vardır. Subregion doğru boyutu seçme örnek özelliklerine bağlıdır ve çok küçük bir ayar daha hızlı hareket eden flüoresan korelasyon analizi ile kaybetti, ama çok büyük seçmektir anlamına gelir, bir alt bölge kullanılarak elde ekstra verilerdeki nüanslar potansiyel kaybı anlamına gelecektir kadar önemlidir süper çözünürlük yöntemleri.
Altbölge hızlı hareket eden nesneleri izlemek için güvenilirliğini artırmak olabilir, bu artan hız haritalama analizi için süper piksel oluşturmak için toplanır piksel sayısını gösterir. Alt bölge aralığı superpixels içinde verileri arasındaki boşluktur. Alt bölge aralığı alt bölge boyutundan daha düşük olduğunda, bu komşu vektörler bu ayarı artan yön eksilerini azaltabilir, bazı bilgileri paylaşacakNihai vectormap bir istency oluşturulur. Maksimum gecikme süresi girilen sayı zaman maksimum sayıda analizi bitmeden kalıyor ise zaman korelasyon analizi, kontrol eder.
Son görüntünün İmar aydınlatma modülasyon kontrastı (IMC) ve yüksek çözünürlüklü gürültü bastırma (HRNS) ayarları seçtikten gerektirir. Optimal ayarları numuneden farklı olabilir. IMC örnek üzerinde çizgili aydınlatma desen ayırt yardımcı olur ve yeniden yapılanma eserler azaltır. HRNS Fourier yüksek çözünürlüklü veri 'kırpma' dönüşümü ile düşük kontrastlı verilerinden eserler azaltabilir; maksimum çözünürlük yetenekleri korumak ve yeniden eserler bunlar normalde 1 ayarlanır aza indirmek için.
Bu tekniğin Sınırlamalar ampüller yazılım tekniği TIRF-SIM veya 2D-SIM ile sınırlıdır 3D verileri analiz olamaz, sürecin 2B niteliğine etrafında dayanır, bu nedenle relat olmasını gerektirir örneğilamel karşı ively düz. Başka bir teknik dezavantaj TIRF-SIM 50 msn çerçeve satın almalar ve ızgara deseni yeniden yönlendirmek için SIM mikroskopla alınan zaman bizim ayarlarıyla gibi, nihai süper çözünürlüklü görüntünün yeniden önce tahsil edilmesi 9 ham çerçeveleri gerektirir; ≈1 sn kare hızları elde edilir. Diğer süper çözünürlük tekniği edinme süreleri ve bakış geniş alanı ile karşılaştırıldığında bu sınırlamalar birçok uygulama için kabul edilebilir.
Burada sunulan sonuçlar immünolojik sinaps oluşumu F-aktin akışının standart TIRF görüntüleme gelen veri setleri ile karşılaştırılabilir. Görüntüleme yöntemleri arasında iyi bir anlaşma ampüller potansiyel SIM rekonstrüksiyon eserler karşı ve aynı zamanda SIM sırasında kullanılan görüntü elde etme ayarları veri analizi için kabul edilebilir olduğunu sağlamdır göstermektedir. Daha küçük piksel ile daha fazla veri süper çözünürlük veri setleri boyutları kullanarak bireysel hücrelerin ve s dinamikleri elde edilebilirub-kırınım hücresel mikro alanlar araştırılmalıdır olabilir.
Bu tekniği açgözlü sonra herhangi bir moleküler akış kapsam ile görüntülü ve belirlenebilir non-invaziv bir yerde hücrenin xy düzleminde, bir konfokal mikroskop ile örnekleme plazma membranında akışını ilişkin soruları, veya çok sayıda araştırmak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables: | |||
| Jurkat E6.1 cells | APCC | ATTC TIB-152 | |
| RPMI | Life Technologies | 21875-091 | |
| FBS | Sigma | F7524-500ML | |
| Penicillin-Strepromycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-050 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630-056 | |
| #1.5 8-well Labtek coverslips | NUNC, Labtek | 155409 | |
| LifeAct GFP construct | Ibidi | 60101 | |
| OptiMem | Life Technologies | 51985-042 | |
| anti-CD3 | Cambridge Bioscience | 317315 | |
| anti-CD28 | BD Bioscience / Insight Biotechnology | 555725 | |
| PBS | Life Technologies | 20012-019 | |
| Lens oil | |||
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment: | |||
| Gene Pulsar Xcell System | BioRad | 165-2660 | |
| Cuvette (0.4cm) | BioRad | 165-2088 | |
| Centrifuge (5810R) | Eppendorf | 5805 000.327 | |
| Centrifuge (Heraeus) | Biofuge pico | 75003235 | |
| 6 well plate | Corning | 3516 | |
| Stage-top incubator | Tokai Hit | INUH-TIZSH | |
| Nikon N-SIM microscope | Nikon | Contact company | |
| Nikon Analyse software | Nikon | Contact company | |
| Incubator (190D) | LEEC | Contact company |
References
- Monks, C., Freiberg, B., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395, 82-86 (1998).
- Lanzavecchia, A. Antigen-specific interaction between T and B cells. Nature. 314, 537-539 (1985).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
- Delon, J., Bercovici, N., Liblau, R. Imaging antigen recognition by naive CD4+ T cells: compulsory cytoskeletal alterations for the triggering of an intracellular calcium response. European journal of Immunology. 28 (2), 716-729 (1998).
- Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. T Cell Receptor-Proximal Signals Are Sustained in Peripheral Microclusters and Terminated in the Central Supramolecular Activation Cluster. Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature methods. 3, 793-796 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (15), 8206-8210 (2000).
- Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells. Biophysical Journal. 88 (5), 3601-3614 (2005).
- Ashdown, G. W., Cope, A., Wiseman, P. W., Owen, D. M. Molecular Flow Quantified beyond the Diffraction Limit by Spatiotemporal Image Correlation of Structured Illumination Microscopy Data. Biophysical Journal. 107 (9), 21-23 (2014).
- Brown, C. M., et al. Probing the integrin-actin linkage using high-resolution protein velocity mapping. Journal of Cell Science. 19 (24), 5204-5214 (2006).
- Yi, J., Xufeng, S. W., Crites, T., Hammer, J. A. Actin retrograde flow and actomyosin II arc contraction drive receptor cluster dynamics at the immunological synapse in Jurkat T cells. Molecular Biology of the Cell. 23 (5), 834-852 (2012).
- Watanabe, N., Mitchison, T. J. Single-molecule speckle analysis of actin filament turnover in lamellipodia. Science. 8 (5557), 1083-1086 (2002).
