Abstract
Filamentösen -Actin spielt eine entscheidende Rolle bei der Mehrheit der Zellprozesse einschließlich Motilität und in Immunzellen, die Bildung eines Schlüssels Zell-Zell-Interaktion als der immunologischen Synapse bekannt. F-Actin ist auch spekuliert, eine Rolle bei der Regulierung des Molekular Verteilungen auf der Membran von Zellen einschließlich der Unter membranöse Vesikel Dynamik und Protein Clustering spielen. Während Standard-Lichtmikroskop-Techniken ermöglichen verallgemeinert und beugungsbegrenzte Beobachtungen gemacht werden, treten viele zellulären und molekularen Ereignisse, einschließlich Clusterbildung und molekulare Strömung in der Bevölkerung auf Längenskalen weit unter dem Auflösungsvermögen des Standard-Lichtmikroskopie. Durch die Kombination interner Totalreflexion Fluoreszenz mit dem Superauflösungsabbildungsverfahren strukturierten Beleuchtung Mikroskopie wurde die zweidimensionale molekulare Strömung von F-Aktin an der Immun Synapse von T-Zellen aufgezeichnet. Räumlich-zeitliche Bildkorrelationsspektroskopie (stics), wurde dann angewendet, die quantifizierbar Resul erzeugtts in Form von Geschwindigkeits Histogramme und Vektorkarten, die Strömungsrichtungs und Größenordnung. Dieses Protokoll beschreibt die Kombination von superauflösenden Abbildung und STICs Techniken zur Strömungsvektoren an Unterbeugungsdetailniveaus zu erzeugen. Diese Technik wurde verwendet, um ein Aktin-Strömung, die symmetrisch ist und retrograde zentripetalen der gesamten Peripherie der T-Zellen bei der Synapsenbildung zu bestätigen.
Introduction
Das Ziel des Experiments ist es, Bild und Charakterisierung der molekularen Strömung von filamentous- (F-) Aktin in lebenden T-Zellen, jenseits der Beugungsgrenze, um die Strömungsrichtung und die Größe bei immunologischen Synapse (IS) Bildung zu etablieren. Diese Technik wird unter Verwendung einer strukturierten Beleuchtung Mikroskop (SIM) in Totalreflexion Fluoreszenz (TIRF)-Modus durchgeführt werden, die Abbildung Jurkat T-Zellen bilden eine künstliche Synapse zur Aktivierung Deckgläser mit Anti-CD3- und anti-CD28-Antikörper beschichtet. Der IS Formen zwischen einer T-Zelle und dessen Ziel; eine Antigen-präsentierende Zelle (APC) bei der T-Zell-Rezeptor (TCR) Aktivierungs 1,2. Da dies der erste Schritt bei der Bestimmung, ob das adaptive Immunsystem eine Immunantwort auf eine Infektion, können die Folgen von Fehl auf Stimuli an einer Reihe von Krankheiten verursachen. Die Bedeutung der T-Zell-APC-Wechselwirkung ist gut dokumentiert, jedoch die Rolle (n) des reifen nach dem erstmaligen TCR signal Internalisierung sind noch nicht vollständig verstanden werden.
Wie das Zytoskelett wird angenommen, dass zwei Prozesse zur TCR-Aktivierung (die Bewegung von Molekülen in der Plasmamembran und die Steuerung der Signalmoleküle abhängig Aktinzytoskeletts 3,4), zu verstehen, wie das Zytoskelett umlagert räumlich und zeitlich verknüpft unterstützen wird die Schritte erläutern molekularer Reorganisation während der Synapsenbildung. Die retrograde Strom von F-Aktin ist gedacht, um TCR-Cluster in Richtung der Mitte der immunologischen Synapse Koppel, wird diese Translokation angenommen Vitalsignal Aufhören und Recycling zu sein; Hilfe für die feine Balance der T-Zellaktivierung 5.
Während Standard-Fluoreszenzmikroskopie ist ein flexibles Werkzeug, um einen Einblick zu vielen biologischen Ereignisse, einschließlich Zell-Zell-Interaktionen bieten weiterhin, wird es durch die Fähigkeit des Systems, mehrere Fluorophore genau aufzulösen Wohnsitz näher als die diffr begrenztAktionsgrenze (≈200 nm) voneinander. Wie viele molekularen Ereignisse innerhalb von Zellen beinhalten dichten Populationen von Molekülen und weisen dynamische Umlagerung entweder in Ruhe oder auf ausdrückliche Anregung, keine konventionellen Lichtmikroskopie nicht die vollständige Bild.
Die Verwendung von Super Resolution Imaging konnten Forscher die Beugungsgrenze unter Verwendung einer Vielzahl von Techniken zu umgehen. Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie (SMLM) wie PALM und STORM 6,7 hat die Fähigkeit, die Position von Molekülen bis zu einer Genauigkeit von etwa 20 nm zu beheben, aber diese Techniken beruhen auf langen Erfassungszeiten, den Aufbau eines Bildes über viele Frames . Im Allgemeinen erfordert diese Proben fest oder für die Strukturen, die geringe Mobilität aufweisen, so einzelne Fluorophore nicht als mehrere Punkte fehlinterpretiert. Während Stimulated Emission Depletion (STED) Bildgebung ermöglicht Super-Resolution durch sehr selektiv konfokale Anregungs 8, die erforderliche ScanAnsatz kann über die ganze Zellfelder langsam sein. STED zeigt auch signifikante Photo hohen Auflösung aufgrund der Erhöhung der Leistung des Verarmungsstrahls.
Strukturierte Beleuchtung Mikroskopie (SIM 9) stellt eine Alternative zu diesen Verfahren in der Lage, die Verdoppelung der Auflösung eines Standard-Fluoreszenzmikroskop und ist mit Live Cell Imaging ist als aktuelle SMLM Techniken kompatibel. Es nutzt niedrigere Laserleistungen, auf einem Weitfeldsystem für Ganzzellfelder; Versehen erhöhten Akquisitionsgeschwindigkeiten und ist mit Standard-Fluorophor Kennzeichnung kompatibel. Die Weitfeld Natur der SIM gestattet auch die Verwendung von interner Totalreflexion Fluoreszenz (TIRF) für hochselektive Anregung mit Eindringtiefen in axialer Durchmesser von <100 nm.
Bildkorrelationsspektroskopie (ICS) ist ein Verfahren zum Korrelieren von Fluktuationen der Fluoreszenzintensität. Eine Weiterentwicklung des ICS; Raum-Zeit-imAlter Korrelationsspektroskopie (STICs 10) korreliert intrazellulären Fluoreszenzsignale in Zeit und Raum. Durch die Korrelation Pixelintensitäten mit umgebenden Pixeln in rückständigen Rahmen über eine Korrelationsfunktion wird Informationen über Strömungsgeschwindigkeiten und Direktionalität gewonnen. Um sicherzustellen, statische Objekte nicht mit dem STICs Analyse stören, ist ein unbewegliches Objekt-Filter implementiert, das durch Subtrahieren des gleitenden Durchschnitts der Pixelintensitäten funktioniert.
Die hier vorgestellte Technik wird angenommen, dass die erste Demonstration von Bildkorrelationsspektroskopie an superauflösende Mikroskopie Daten angewendet, um die molekulare Strömung in lebenden Zellen 11 quantifizieren. Dieses Verfahren verbessert beugungsbegrenzte Abbildung von F-Actin Fluss über STICs Analyse 12 und würde Forschern, die zweidimensionale molekulare Strömung in lebenden Zellen zu bestimmen, von der bei räumlichen Auflösungen jenseits der Beugungsgrenze von Licht erfaßten Daten Wunsch zu entsprechen.
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Protocol
Hinweis: Stufen 1 und 2 erfolgen vor dem Tag der Bildgebung; sicherzustellen, dass alle Medien und Ergänzungen vor oder am Tag der Bildgebung ins Gleichgewicht gebracht werden, verwendet werden. Gleichgewichtseinstellung wird durch Erwärmung von Medien und Ergänzungen zu 37 ° C in einem Inkubator, um 5% CO 2 gelöst. Alle Zellkulturarbeit und Deckbeschichtungsschritte erfolgen unter sterilen Bedingungen unter einer Sterilbank.
1. Zelltransfektion
- Transfektion die T-Zellen, um 24 Stunden abgebildet werden vor dem Versuch mit einem Plasmid kodiert eine fluoreszierende Fusionskonstrukt für F-Actin GFP Kennzeichnung und Bildgebung. Hinweis: Die Zellen sollten 24 Stunden vor der Transfektion (48 Stunden vor der Abbildung), um sicherzustellen, Zellen sind an eine optimale Gesundheit und in ihrer logarithmischen Wachstumsphase aufgeteilt werden.
- Zeigen 5 ml RPMI Ergänzung (RPMI 1640 plus 10% FBS und 1% Pen-Strep (optional)) in einer einzelnen Vertiefung einer 6-Well-Platte in den Inkubator ins Gleichgewicht.
- Pellet 2 × 10 7 T-Zellen-Kultermittelt und mit 37 ° C + 5% CO 2 in RPMI Ergänzung unter Verwendung eines Zentrifugenröhrchen bei 327 x g für 5 min und waschen in einem gleichen Volumen von vorgewärmtem Elektroporation Medien. Hinweis: Die Elektroporation Medium eine verringerte Serum-Medium, das Puffern und Nahrungsergänzungsmittel (siehe Verbrauchsmaterialien).
- Nach der Wieder Pelletierung bei 327 xg für 5 min, resuspendieren Zellen in 500 ul Elektroporation Medien und langsam zu einer Küvette, fügen 5 ug des Plasmids in PCR Grade dH 2 O für die Kennzeichnung F-Actin.
- Klopfen Sie leicht die Küvette auf der Motorhaube Arbeitsbereich um die Entfernung von Luftblasen in den Medien, die Lichtbogenbildung der Elektrizität verursachen können, und um die Zellen gleichmäßig innerhalb der Medienformaten zu gewährleisten.
- Schalten Sie den Elektroporationseinrichtung und setzen Spannung bis 300 V und die Kapazität bis 290 Ω. Elektroporieren Probe unter Verwendung eines exponentiellen Abfall für 20 ms. Anmerkung: Die Optimierung für unterschiedliche Zellen und verschiedene Plasmidkonstrukte erforderlich.
- Sobald das Transfektionsprotokoll istkomplette, speichern Zellen auf Eis für 1 Minute, bevor Sie fortfahren.
- Die Zellen vorsichtig zu übertragen aus der Küvette zu der 6-Well-Platte mit 5 ml RPMI äquilibriert Ergänzung von Schritt 1.1.1.
- Die Zellen O / N bei 37 ° C + 5% CO 2.
2. Mantel Deckgläser und Pre-warmen Imaging Supplement
- Mantel Deckgläser mit Antikörpern gegen T-Zell-Stimulierung hervorzurufen.
- Coat jede Kammer eines 8-Well-Deckglas mit 1 ug / ml & agr; CD3 und & agr; CD28 in 200 ul PBS.
- Lagerung bei 4 ° CO / N. Alternativ fällt Deck 2 h vor der Bilderzeugung und in einem Inkubator Halten bei 37 ºC, um eine Drift während des Abbildungsprozesses zu reduzieren durch Temperaturänderungen um das Deckglas zu minimieren.
- Erstellen Sie ein Deckglas Testprobe mit 0,1 um Unterbeugungs fluoreszierende Mikrosphären.
- Vortex-Stammlösung von Perlen, um Klumpen zu vermeiden.
- Auf einem neuen, sauberen Deckglas von the gleichen Typ wie die in Schritt 2.1.1 verwendet, Pipette 5 ul fluoreszierende Mikrosphären-Stammlösung auf die Oberfläche (nach Herstellerangaben).
- Verbreiten Mikrokugel-Lösung über das Deckglas mit Pipettenspitze.
- Trocknen lassen, dann gelten 200 ul Eindeckmedium wie PBS.
Hinweis: Das Eindeckmedium sollten übereinstimmen, dass für die Bildgebung Zellproben verwendet.
- Äquilibrieren HBSS (+ 20 mM HEPES, nachstehend "HBSS Ergänzung ') in einem Zentrifugenröhrchen, indem Sie in einem Inkubator vor, eine warme O / N bei 37 ° C + 5% CO 2.
Hinweis: die Zugabe von HEPES ist in den Puffer CO 2, wenn mit Hilfe eines Inkubationskammer mit CO 2 Eingangs überspringen Sie diese Ergänzung.
3. Mikroskop Set-up
- Biegen Sie auf der Bühne-Top-Inkubator des TIRF-SIM-Mikroskop und Platz genug destilliertes Wasser in das Reservoir des Mikroskops, um die Basis des Heizelements vollständig abdecken. Damit das Wasser eine Equilibrate bis 37 ° C. Hinzufügen der Heizmanschette zu der Objektivlinse, die auch auf 37 ° C eingestellt.
Hinweis: Wegen der Empfindlichkeit der Einrichtung, diese Schritte werden in der Nacht zuvor getan die optischen Komponenten bei einer stabilen Temperatur vor der Bildgebung. - Legen Sie die TIRF-488 kompatibel Gitterblock in den Strahlengang des Mikroskops und sicher am Platz.
- Schalten Sie den Kanal-Modus und das Glasfaserkabel an die 'Single' Position auf dem Laser-Bett und Mikroskoptisch jeweils um die richtige optische Weg für die TIRF-SIM-Modus zu aktivieren. Hinweis: Überspringen Sie diesen Schritt wird zu einem Fehler (Abbildung 1A) im Software-Fenster führen.
- Schalten Sie alle Mikroskop und Computer-Komponenten und öffnen Sie die Aufnahmesteuerung Software.
- Öffnen Sie das Bedienfeld OC, Ti Pad, N-SIM-Pad und ND Acquisition Fenster (Abbildung 1B). In der 'OC Panel' die Option 'TIRF 488' (2B, gelber Pfeil). In der N-SIM-Pad-Fenster, wählen Sie die 'TIRF-SIM "und" Verschieben "Einstellungen (2C, gelbe Pfeile). Wählen Sie die Schaltfläche Einstellungen (1C, gelber Kasten) und wählen Sie "TIRF 488 (für 100x TIRF 488 nm)" aus dem Dropdown-Menü, klicken Sie auf 'Übernehmen "und" OK ".
- Stellen Sie die Kamera-Einstellungen innerhalb der "DU897-Einstellungen" auf: Frame Rate 50 ms, Auslesemodus EM Gewinn 3 MHz bei 14 Bit, und EM-Gewinn-Multiplikator 300 mit einer Umwandlungsverstärkung 1 (1C, grüner Kasten).
Hinweis: Siehe Repräsentative Ergebnisse für Bildrate Überlegungen. - Kalibrieren des Mikroskops Beleuchtung für TIRF-SIM, indem Sie die 100x 1,49 NA CFI Apochromat TIRF Ziel, auf der "N-SIM-Pad 'schalten Sie den 488 nm Laserleistung bis 10%.
Hinweis: Pixelgröße der Rohbilder ist 60 nm, mit einem 512 x 512 Pixel-Sichtfeld. - Reinigen Sie die Objektivlinse mit Linsenpapier, um Staub und Öl zu entfernen.
- Beginnen Sie mit dem Ziel, in der niedrigsten möglichen z-Ebene. Geben Sie einen Tropfen Öl auf Linse des Objektivs und fügen Sie die fluoreszierenden Mikrokügelchen Probe aus Schritt 2.2 auf den Mikroskoptisch.
- Wählen Sie die perfekte Focus System (PFS) Funktion auf dem Körper des Mikroskops befindet.
- Bewegen sich langsam das Ziel, nach oben durch die z-Ebene, bis der PFS-Taste hört auf zu blinken, um die Brennebene bestätigen, wurde erreicht.
- Wechseln Sie in den "Live" Blick auf die Steuerungssoftware und Bild die Mikrosphären für die endgültige Anpassungen mit Hilfe des PFS Mikromanipulator Rad gemacht.
- Die eine gleichmäßige Ausleuchtung zu beobachten ohne out-of-focus Fluoreszenzemission über der 75 nm abklingende Welle.
Hinweis: Bestätigen strukturierten Beleuchtung wird durch die Beobachtung einer schwankenden Beleuchtungsmuster von der fluoreszierenden Mikrosphärenprobe erfüllt. - Messen Sie fluoreszierende Mikrokügelchen Probe und zu quantifizieren, die verbesserte Bildgebung resolutIonen durch die Beobachtung der Halbwertsbreite (FWHM) des Intensitätsprofils.
- Öffnen Sie die Analyze-Software (v4.20.01), mit der NIS-A N-SIM-Analyse-Modul installiert und wählen Sie 'Anwendungen' -> 'Show N-SIM-Fenster'.
- Mit der Beleuchtungsmodulationskontrast (IMC) und hochauflösende Rauschunterdrückung (HRNS) bis 1 für die TIRF-SIM-Datensätzen (Abbildung 2) gesetzt, rekonstruieren die Mikrosphärenprobe Bild, um ein rekonstruiertes Bild von 1.024 x 1.024 Pixeln bei einer Pixelgröße von 30 zu erzeugen, nm.
- Verwenden der Linienprofilwerkzeug mit einer Breite von 1 Pixel (3A, gelber Kasten), ziehen Sie eine Linie durch die Mitte eines einzelnen Mikrokügelchen.
- Wählen Sie das FWHM Taste (3B, gelber Kasten), und klicken Sie auf der Intensitätsmaxima der Gaußschen Verteilung, gefolgt von seiner Intensität Minima.
- Bestätigen die FWHM der Mikrosphäre in einem Bereich von 100 nm (Figur 3C). Hinweis: die Auflösung achieved bei der Abbildung von biologischen Proben wird in Abhängigkeit von dem Signal-Rausch-Verhältnis von Markierungseffizienz und die Hintergrundfluoreszenz zu variieren.
4. Probenvorbereitung für die Imaging
- Deckglas Vorbereitung.
- Abrufen & agr; CD-beschichtete Deckglas aus Schritt 2.1 vom Kühlschrank oder Inkubator und entfernen PBS, das & agr; CD3 und & agr; CD28 aus jeder Vertiefung.
- Fügen Sie 200 ul vorgewärmtes HBSS Ergänzung von Schritt 2.3 in jede Vertiefung des Deckglases. Waschen und zu entfernen, um eine minimale & agr; CD3 gewährleisten und & agr; CD28 wird in der Lösung belassen. Fügen Sie eine weitere 200 ul des HBSS Ergänzung zu den Deck Brunnen.
- Reinigen Sie die Unterseite des Deckglases mit Linsenpapier, um Öl und Partikel zu entfernen.
- Decklage auf dem Mikroskoptisch und um die TIRF Brennebene des Deckglases unter Verwendung des PFS z-Ebene, wie in Schritt 3.4 festgestellt.
- Zellpräparation.
- Je 200 & mgr; l der Medien conTaining transfizierten Zellen aus Schritt 1.1.8 in einem Mikrozentrifugenröhrchen.
- Pellet-Zellen in einer Mikrozentrifuge bei 268 · g für 20 sec und entfernen Zellmedien.
- Die Zellen in 200 ul vorgewärmtes HBSS Ergänzung von Schritt 2.3.
5. Imaging Cells
- Nehmen zellhaltigen HBSS Ergänzung des Mikroskops und sanft Je 200 ul in einer der Vertiefungen.
- Während in der TIRF Brennebene verbleibenden am Deckglas (im PFS-Modus), verwenden Sie den Mikroskopen Okular und Epifluoreszenz-Beleuchtung, um fluoreszierende Zellen Annäherung an das Deckglas zu verfolgen.
- Sobald die Zellen landen auf dem Deckglas, um "Live" Modus in der N-SIM-Pad-Schalter, um das Bild auf dem Monitor zu bringen und überprüfen Sie die Zellen im Fokus auf dem Computerbildschirm.
- Um Zeit-Kurse aufzunehmen, öffnen Sie das ND-Aufnahmefenster und wählen Sie die Registerkarte 'Time', klicken Sie auf "Hinzufügen", und setzen Sie "Interval", um keine Verzögerung, 'Dauer'bis 10 min, "Loops" auf 1 gesetzt ist.
Anmerkung: Die Dauer kann je nach Verfahren von Interesse verändert werden; die stics Software kann quantitative Ergebnisse mit Bild Stapel von ≈10 Frames zu extrahieren, wenn sie mit "keine Verzögerung" festgehalten. - Mit identischen Übernahme-Einstellungen an dem Wulst Probe, starten Sie die Aufnahme-Daten, indem Sie "Jetzt ausführen" in der ND-Aufnahmefenster.
6. Rekonstruktion SIM Bilder
- Nach der vollständigen Bildgebung ist, öffnen Sie die Analyze-Software (v4.20.01), mit der NIS-A N-SIM-Analyse-Modul installiert und wählen Sie 'Anwendungen' -> 'Show N-SIM-Fenster'.
- Mit der Beleuchtungsmodulationskontrast (IMC) und hochauflösende Rauschunterdrückung (HRNS) bis 1 für die TIRF-SIM-Datensätzen festgelegt (Abbildung 2), zu rekonstruieren, eine (oder mehrere mit der Batch-Tool) raw SIM-Datei um ein rekonstruiertes Bild SIM zu produzieren.
- Bestätigen Sie die rekonstruierten Datei eine Pixelgröße von 30 nm, in der angegebenBildstatusleiste.
Hinweis: Pixelgröße hat keinen Einfluss auf stics Analyse, aber es sollte mindestens 2x kleinere Abmessung als der PSF räumliche Auflösung, um räumliche Korrelation zwischen den Pixeln zu gewährleisten. - Exportieren Sie die Daten als TIFF-Dateien, bereit für stics Analyse.
7. stics Analysis
- Download und Dekomprimierung der STIC (C) S Matlab-Software-Paket (Wiseman Labor; als Zusatzinformation zur Verfügung). Das Skript stics_vectormapping.m ist der Kern eines einzelnen Kanals stics Analyse und die ersten 30 Zeilen Code werden verwendet, um die Eingangsparameter zu definieren, wie in Abschnitt 2.1 des Handbuchs definiert. Öffnen Sie dieses Skript und definieren Sie die Eingangsparameter für TIRF-SIM-Datenanalyse. Es wird vorgeschlagen, auch die STIC (C) S-Ordner mit Unterordnern hinzuzufügen, auf die lokale Maschine Matlab-Pfad, wie im Anhang dieses Handbuchs beschrieben.
- Definieren die Eingangsparameter für die Datenanalyse durch Bearbeiten der entsprechenden Linien des Code
- Um ana führenLyse der TIRF-SIM-Daten auf 1-Vektor-Karte zu generieren, legen Sie die zeitliche Parameter, um die zeitliche Teilbereich in der Leitung 31 auf die maximale Anzahl der Bilder und der zeitlichen Verschiebung der Linie 32 bis 1. Um eine Zeitreihe von Vektorkarten zu erhalten, variieren diese Parameter .
- Für die Immobile Entfernungsfilter, setzen Sie den Parameter "Filterung" (Linie 23) zu "Gleitender Durchschnitt" und stellen Sie die 'MoveAverage' Parameter (Linie 24) bis 21.
Hinweis: Diese Einstellung hat gezeigt, dass der vorausfahrende und großen Fluoreszenzsignale zu arbeiten, wie es auf Subtrahieren Serienrahmen aus dem Rahmen, die analysiert basiert. - Ändern Linien 33-38 den Namen der Ausgabedateien und Titel der Ausgangsvektorkarten, sowie die Ausgangsverzeichnispfad zu setzen und zu definieren, in welchem Format die Vektorkarte Bilder gespeichert werden sollen.
| Pixelgröße (um) | 0,03 um | Linie 19 |
| Bildrate (sec) | 1 Sek | Line 20 |
| Maximale Verzögerungszeit (Frames) | 20 Rahmen | Zeile 21 |
| Subregion Größe (Pixel) | 8 Pixel | Zeile 29 |
| Subregion Abstand (Pixel) | 1 Pixel | Zeile 30 |
- Öffnen Sie die Skript run1ChannelSTICS in der Matlab-Editor-Fenster. Laden Sie das Bild-Serie von Laufleitungen 1-23 von diesem Skript.
Hinweis: Dieses Skript kann verwendet werden, um zu laden und Pre-Prozessabbild-Serie, zeichnen Sie die Vektorkarten und Geschwindigkeit Histogramme und führen Sie eine Stapelverarbeitung für viele Dateien werden. Falls erforderlich, das Bild zuschneiden, um einen interessierenden Bereich unter Verwendung der Linie 24-26 dieses Skripts.- Führen Linien 29-35 von run1ChannelSTICS zu stics Analyse zu starten. Wählen Sie bei Aufforderung ein Polygon, eine bestimmte Region of Interest (ROI) anzugeben, falls gewünscht. Stellen Sie sicher, dass der ROI nicht mit dem Zellenrand überlappen, als Randartefakte auftreten, wenn stics analysiert diese WiederRegionen.
- Führen Linien 38-52, um die Vektorkarten anzuzeigen. Um die Größenordnung der Geschwindigkeit Histogramm darstellen, führen Linien 53-72.
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Representative Results
Mikroskopeinstellungen
Nach der erfolgreichen Verwirklichung aller Schritte der Forscher muss erreicht strukturierten Beleuchtung (SIM) Abbildung von F-Actin Fluss in einer T-Zelle Synapse (Video 1), und quantifiziert diese Molekularströmung durch raum-zeitliche Bildkorrelationsspektroskopie (4 11). Vor der Aufnahme von Bildern, sicherzustellen, dass die Probenbeleuchtung ist einheitlich über die neun Rohbilder und strukturierte Beleuchtung in Form von Moiré-Streifen sind an der Probe beobachtet (Abbildung 5), das sind beide Indikatoren das Deckglas wird flach auf der Bühne und der TIRF- SIM-Set-up richtig ausgerichtet ist.
Es ist wichtig, die Laserleistung gering ist (≤10%) sicherzustellen Zellen bleiben während des Versuchs gesund wie möglich zu halten. Wenn Fluoreszenz Ausdruck ist gering, auch nach der Optimierung von Ter Elektroporation Schritte, erhöhen Sie die Belichtungszeit jedes rohen Rahmen über den genannten 50 ms und / oder die Umwandlungsverstärkung Einstellungen. Wie TIRF-SIM erfordert 9 rohen Rahmen, 1 für jede der 9 pro rekonstruierten Bildes erforderliche Beleuchtung Orientierungen, die Erhöhung der Belichtungszeit wird die Framerate zu reduzieren. In diesem Experiment kann ein 50 ms Belichtungs ≈1 rekonstruierten Bild pro Sekunde (auch einschließlich Grid-Umlaufzeit), wodurch das Risiko von Bewegungsartefakten zu sehen, wenn schneller Ereignisse bewegen sich durch mehrere Beleuchtungsmaxima in einem rohen Rahmen.
Abhängig von der Geschwindigkeit der Molekularströmung untersucht, wodurch die Belichtungszeit können Bewegungsartefakte einzuführen; Forscher sollten Belichtungszeiten an die für eine gute Signal erforderlichen Minimum zu halten. Wie Pixelgrößen in SIM Bilder sind kleiner als die von Standard-Fluoreszenzbilder können Molekular Populationen zeigen schnellere Fließgeschwindigkeiten durch den Teilbereich vor einer nachfolgenden fr gebename erfasst. Für die stics Software, um das Fluoreszenzsignal innerhalb dieser kleineren Bereich schneller zu korrelieren Vergleich zu Standard-Fluoreszenz-Datensätzen Bildraten erforderlich sind. Beispielsweise ein Teilbereich eine Größe von 8 x 8 Pixeln von SIM-Daten für eine 240 x 240 nm-Bereich, während ein 8 x 8-Pixel-Teilbereich von einer Standardfluoreszenz Datensatz stellt einen Bereich von 1,7 um (mit einem angenommenen Pixelgröße von 200 nm).
Bei längeren Zeitkurse (> 3 min) Chargen von Daten können mit "ND Nahme", um Laserbelichtung während der Synapsenbildung (Reduzierung ergriffen werden zB Bildgebung für 10 Sekunden jedes min für 10 min wird die Zelle auf die gleiche kumulative Laserleistung aussetzen wie Bildgebung für <2 min kontinuierlich).
Suboptimale Rekonstruktionen aus SIM-Bildgebung sind in Abbildung 6 dargestellt, wobei die gleichen Rohdaten rekonstruiert unter Verwendung verschiedener Hoch resoluti gezeigtauf Rauschunterdrückung (HRNS) Einstellungen sind die Vorwärts Fourier-Transformationen (FFT) und Halbwertsbreite Profile der markierten Faser auch gezeigt. Einstellen der HRN ist eine Balance zwischen zunehmender Rekonstruktionsartefakten aufgrund der schlechten Signal-Rausch-und zunehmende Auflösung. Ein HRN, die zu niedrig ist (<1) kann in körnigen Bildern mit erhöhter hexagonalen SM Artefakten führen, während ein zu hoher HRNS Einstellung (> 1) kann 'Clip' und entsorgen Sie die hochauflösenden Daten (als reduzierter FFT Durchmesser zu sehen). Eine Auflösung von> 100 nm würde eine Notwendigkeit, den Wiederaufbau mit anderen Einstellungen erneut ausführen, wenn Auflösungen sind immer noch suboptimal Wiederbeschaffung der Daten mit einer optimierten Mikroskopaufbau kann erforderlich sein.
Imaging und Quantifizierung molekularer Strömung
Um Bildmolekularströmung wurde Zeitreihendaten von T-Zellen entnommen Landung und Bilden einer Synapse auf einem stimulatorischen coverslip kann F-Aktin abzuwarten, retrograd von der Zellperipherie in Richtung der Zellenmitte fließen. Als F-Aktin wird weniger dicht in Richtung der Mitte der Zelle STICs Analyse wurde nur an der Peripherie der Synapse durchgeführt wird, ist dieser Bereich auch dann, wenn Signalisierungsmikrocluster sich bekanntlich von während längerer Synapsenbildung stammen.
Beim Erwerb und Analyse von Daten unter Verwendung stics ist es wichtig zu verstehen, das Programm stützt sich auf die Korrelation Fluoreszenzschwankungen innerhalb der ausgewählten Teilbereichen, um eine höhere und glatter Korrelationsfunktion (CF) zu bilden. Die absolute Anzahl der Frames benötigt wird, um eine erfolgreiche stics Ausgabe zu erzeugen ist nicht exakt, da die Software stützt sich mehr auf die Schaffung einer Ausgabe durch die Gesamtzahl der konstruktiven Signalschwankungen innerhalb dieser Teilbereiche. Zum Beispiel, wenn die Datenmenge verfügt über 20 mobilen, markierten Proteine in jedem Teilbereich in die gleiche Richtung stics fließt, weniger Frames, um Gen brauchenbewerten eine zuverlässige Leistung, während ein Teilbereich mit 5 Mobil Proteine führt zu einem schwächeren Korrelationsfunktion und kann mehr Bilder benötigen. Die genaue Anzahl der Frames und Teilgröße hängt von der Art der molekularen Ereignisse, die abgebildet und sollte vom Benutzer optimiert werden.
Verwenden von 'Temporal Rahmen crop "Werkzeug des stics ist es möglich, Teilmengen der Molekularströmung durch die Zeit zu analysieren: so dass die Forscher zu sehen, ob Durchflussraten verändern innerhalb der gleichen Zelle in Abhängigkeit von unterschiedlichen zellulären Bedingungen oder Umweltreize wie vor und nach der Behandlung mit Medikamenten. Der unbewegliche Objekt-Filter wurde entwickelt, um jede immobile Fluoreszenz Bevölkerung vor der Analyse der mobilen Fluoreszenz Bevölkerung zu entfernen. Mit diesem Ansatz, Bilder mit statischen Bevölkerung Prozentsätze bis zu 90% immer noch erfolgreich sein, analysiert 10. Einstellen des immobilen Filter bis 21 Frames filtert alle Fluoreszenzpopulationen, die bleiben statische für diesen Zeitraum oder länger, was bei der immunologischen Synapse Stabilisierung nicht auf die dynamische Rückfluss beitragen wird.
Abbildung 1. Mikroskop Nahme-Einstellungen. (A) Highlights die für das Experiment und der "falschen Fiber 'error verwendet N-SIM-Pad-Einstellungen, wenn die Ein-Kanal und Fiber-Modi werden nicht ausgewählt. (B) Alle Fenster benötigt, rekord aufgebaut und zu rekonstruieren ein strukturiertes Bild Beleuchtung auf der SIM-System. (C) N-SIM-Pad und N-SIM-Einstellungen Pop-Out-Fenster (gelber Kasten) verwendet werden, um das Gitter-Setup nach dem körperlich Platzierung der 488 nm-Gitter in das Mikroskop zu wählen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
2. Die Rekonstruktion Einstellungen für das endgültige Bild. Nachdem Sie die 'Param' Taste (gelber Kasten), wählen Sie TIRF-SIM aus dem Dropdown-Menü, und anfangs eingestellten sowohl die "Illumination Modulation Contrast" (IMC) und "High Resolution Rauschunterdrückung '(HRNS) auf 1 Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Halbwertsbreite (FWHM) Messung. Mit der Analyse-Software (A) zeigt eine Gaußsche Grundstück von der Linienintensität Werkzeug ausgewählt (gelber Kasten) und durch einen rekonstruierten SIM-Bild einer Raupe Probe gezogen. (
Abbildung 4. Repräsentative strukturierten Beleuchtung Daten und stics ausgegeben. Ein Jurkat T-Zellen-GFP-markierten F-Actin ausdrücken abgebildet mit TIRF-SIM auf einem stimulierenden Deckglas für die immunologischen Synapse Generation. Fünf Minuten nach dem Kontakt wurde eine Zeitverlauf genommen und mit Hilfe der stics Analyseprogramm analysiert. Gelbe Kästen stellen gezoomt Regionen, während Vektorkarten zeigen die retrograden Fluss von F-Aktin an der Synapse Peripherie. Vektor Farben zeigen die Geschwindigkeit der Molekularströmung in diesem Teilbereich ist Geschwindigkeitsdaten in einem Histogramm aufgetragen. Aufgrund der Z-Selektivität von Anregungs TIRF-SIM bietet, kann die Probe aus Fokus verloren werden, wenn sie löst oder entfernt sich von dem Deckglas durch den Zeitverlauf des Experiments durch Kräuseln oder Motilität. Dies wird hier in der oberen rechten Platte, wie eine Verringerung der Vektordichte gesehen. Die Verringerung ist eine Folge der stics Auftragen des unbeweglichen Filters auf Teilbereiche, die keine fluoreszierenden Schwankungen für den Zeitraum vom Benutzer eingestellt gezeigt haben. Dieses Ergebnis unterstreicht die Bedeutung der Auswahl nur Regionen, die Fluoreszenzsignal für die gesamte Zeitreihe enthalten. Lank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Raw SIM Bilder. Die neun Rohbilder auf der linken Seite zeigen die 9 Orientierungen der Gittermuster benötigt, um eine TIRF-SIM-Bild zu erzeugen. Zelle abgebildet ist eine Jurkat T-Zellen-GFP-markierten F-Actin exprimieren, gezoomt Zelle zeigt eine der neun Rohbilder, zeigen nicht-gleichmäßige Beleuchtung mit Moiré-Streifen, vor allem rund um die Zellperipherie. Obwohl die strukturierte Beleuchtung nicht sichtbar ist die Interaktion zwischen der Beleuchtung und der Probe erzeugen Bereiche unterschiedlicher Beleuchtungsstärke, nach der Rekonstruktion ergibt sich ein Bild mit verbesserter Auflösung. Beide Skala Bars sind 5 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
6 Hohe Auflösung Rauschunterdrückung (HRNS) Einstellungen Unter optimalen Einstellungen führen zu einer nicht optimalen Bildrekonstruktion..; (A) zeigt die Unterschiede in den rekonstruierten Daten, in dem unteren HRNS führt zu erhöhten Hintergrundgeräusche außerhalb der Blütenregion und höhere HRNS können die Auflösung zu reduzieren und zu einem Verlust der feineren Details (Einstellungen verwendet unten links von jedem Bild dargestellt). (B) stellt den Vorwärts Fourier-Transformation der Bilder in (A) in dem Randinformation zeigt höhere Auflösung von Daten; beachten Sie die abgeschnitten Blütenblätter der zu transformieren, wenn HRNS auf 5 gesetzt ist, was anzeigt, reduzierte Bildauflösung. (C) zeigt die Halbwertsbreite (FWHM) des Aktin-Fasern (gelber Kasten in a) bei den verschiedenen Einstellungen, FWHM-Messungen durch die Software gab Lesenvon 90 nm, 100 nm und 180 nm für HRNS Einstellungen von 0,1, 1 und 5 sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Diese Technik wird Forschern, die dem Bild zu ermöglichen und zu quantifizieren, bisher nicht auflösbaren Details in Zellen Fluoreszenz exprimieren. In unseren Ergebnissen zeigen wir, dass F-Actin fließt in einer symmetrischen Art und Weise aus der Zellperipherie in Richtung der Zellzentrum in der T-Zelle. Diese Ergebnisse stimmen mit früheren Ergebnissen von 1D Linienprofil kymograph Daten 13 und erstrecken sich die Kapazität der Analyse, um 2D- und Super-Resolution-Daten.
Die vorgestellte Technik ist eine Weiterentwicklung von kymograph Bildgebung, die begrenzt auf Plotten Fluoreszenzintensitätsfluktuationen durch eine einzelne 1D Linie über die Zeit ist. Im Vergleich der Strom-Technik ermöglicht die Quantifizierung der ganzen Zelle Molekularströmung sowohl mit Richtwirkung und Geschwindigkeit extrahiert. Während Speckle-Interferometrie wurde auch Aktindynamik 14 innerhalb des 2D-Umgebung dargestellt, kann die Speckle-Technik, die von Schwierigkeiten mit der korrekten Etikettierung Dichten begrenzt bleiben und nur visualisiert eine Subpopulation von Aktin.
Die wichtigsten Schritte, um diese Ergebnisse zu erreichen, sind zur Optimierung der Transfektionseffizienz der bestimmten Zellen durch den Forscher und Ausrichtung der SIM Mikroskopoptik und Gittermuster verwendet. Die Wahl der richtigen Größe der Teilbereich ist abhängig von den Probeneigenschaften, und ist wichtig, da eine zu kleine Einstellung bedeutet schneller bewegenden Fluoreszenz wird durch die Korrelationsanalyse verloren, aber die Auswahl zu groß ist ein Teilbereich wird potenziellen Verlust von Nuancen in den mit erworbenen zusätzliche Daten bedeuten, Superauflösungsverfahren.
Subregion bezeichnet die Anzahl von Pixeln addiert, um ein Superpixel zur Geschwindigkeitskartierungsanalyse zu schaffen, wodurch dies kann die Zuverlässigkeit für die Verfolgung schneller bewegenden Objekten zu verbessern. Der Teilbereich Abstand ist der Abstand zwischen Daten in Superpixel. Wenn der Teilbereich Abstand geringer ist als die Teilgröße ist, werden diese benachbarten Vektoren einige Informationen zu teilen, die Erhöhung dieser Einstellung könnte Richtungs Nachteile zu reduzierenistency der endgültigen Vektorkarte generiert. Die maximale Verzögerungszeit steuert die Zeit der Korrelationsanalyse, wo die Zahl eingegeben wird, die maximale Anzahl von Zeit vor der Analyse Enden nacheilt.
Wiederaufbau des endgültigen Bildes erfordert Beleuchtungsmodulationskontrast (IMC) und hochauflösende Rauschunterdrückung (HRNS) Einstellungen ausgewählt werden. Optimalen Einstellungen können von Probe zu Probe unterscheiden. IMC hilft bei der Unterscheidung der Streifenbeleuchtungsmuster auf der Probe und verringert Rekonstruktion Artefakte. HRNS können Artefakte aus niedrigen Kontrast Daten durch 'Clipping' hochauflösende Daten von der Fourier-Transformation zu reduzieren; um eine maximale Auflösungsvermögen zu erhalten und zu minimieren Rekonstruktionsartefakten werden diese in der Regel auf 1 gesetzt.
Beschränkungen dieses Verfahrens liegen über den 2D-Natur des Prozesses basiert, wie der STICs Software nicht 3D-Daten der Technik wird TIRF-SIM oder 2D-SIM beschränkt analysieren, erfordert daher die Probe relat seinively flach auf dem Deckglas. Ein weiterer technischer Nachteil ist, dass TIRF-SIM erfordert 9 rohe Frames an, bevor der Rekonstruktion des endgültigen Bildes Superauflösung mit unseren Einstellungen von 50 ms Rahmenübernahmen und die Zeit, die der SIM-Mikroskop aufgenommen, um die Gittermuster neu zu orientieren gesammelt werden, die als solche; Bildraten von ≈1 sec erreicht. Verglichen mit anderen Superauflösungstechnik Erfassungszeiten und der großen Sehfeld Diese Einschränkungen sind für die meisten Anwendungen nicht akzeptabel.
Die hier präsentierten Ergebnisse sind vergleichbar mit Datensätzen aus Standard TIRF Bildgebung von F-Actin Fluss in immunologischen Synapse Bildung. Die gute Übereinstimmung zwischen bildgebenden Verfahren zeigt stics ist robust gegen mögliche SIM Rekonstruktionsartefakten und auch, dass die Bildaufnahme-Einstellungen während der SIM verwendet werden, sind für die Datenanalyse akzeptabel. Durch die Verwendung von Super-Resolution-Datensätze mit kleineren Pixelgrößen mehr Daten können aus einzelnen Zellen und Dynamik von s extrahiert werdenub beugungs zellulären Mikrodomänen können untersucht werden.
Nach dem Ergreifen dieser Technik jede molekulare Strömung kann abgebildet und quantifiziert werden, mit Rahmen, um nicht-invasiv zu untersuchen eine Vielzahl von Fragen in Bezug auf Durchfluss an der Plasmamembran, oder bei der Probenahme mit einem konfokalen Mikroskop, überall in der xy-Ebene der Zelle.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables: | |||
| Jurkat E6.1 cells | APCC | ATTC TIB-152 | |
| RPMI | Life Technologies | 21875-091 | |
| FBS | Sigma | F7524-500ML | |
| Penicillin-Strepromycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-050 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630-056 | |
| #1.5 8-well Labtek coverslips | NUNC, Labtek | 155409 | |
| LifeAct GFP construct | Ibidi | 60101 | |
| OptiMem | Life Technologies | 51985-042 | |
| anti-CD3 | Cambridge Bioscience | 317315 | |
| anti-CD28 | BD Bioscience / Insight Biotechnology | 555725 | |
| PBS | Life Technologies | 20012-019 | |
| Lens oil | |||
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment: | |||
| Gene Pulsar Xcell System | BioRad | 165-2660 | |
| Cuvette (0.4cm) | BioRad | 165-2088 | |
| Centrifuge (5810R) | Eppendorf | 5805 000.327 | |
| Centrifuge (Heraeus) | Biofuge pico | 75003235 | |
| 6 well plate | Corning | 3516 | |
| Stage-top incubator | Tokai Hit | INUH-TIZSH | |
| Nikon N-SIM microscope | Nikon | Contact company | |
| Nikon Analyse software | Nikon | Contact company | |
| Incubator (190D) | LEEC | Contact company |
References
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