Abstract
Filamenteus actine speelt een cruciale rol in de meeste celprocessen zoals motiliteit en in immuuncellen, de vorming van een belangrijke cel-cel interactie bekend als immunologische synaps. F-actine ook gespeculeerd een rol spelen bij het reguleren moleculaire verdelingen in de membraan van cellen inclusief sub-membraneuze blaasjes dynamiek en eiwit clustering. Terwijl de standaard lichtmicroscoop technieken maken algemene en buigingsbegrensd waarnemingen worden gedaan, vele cellulaire en moleculaire gebeurtenissen zoals clustering en moleculaire stroom optreden in populaties in lengte-schalen ver onder het oplossend vermogen van standaard lichtmicroscopie. Door het combineren van totale interne reflectie fluorescentie met superresolutie beeldvormingswerkwijze gestructureerde verlichting microscopie, de tweedimensionale moleculaire stroom F-actine bij de immune synaps van T-cellen opgenomen. Tijdruimtelijke afbeelding correlatie spectroscopie (Stokjes) werd vervolgens toegepast, waarbij meetbare resul genereertts in de vorm van snelheid histogrammen en vector kaarten die stroom richting en omvang. Dit protocol beschrijft de combinatie van super-resolutie beeldvorming en Stokjes technieken om stroom vectoren op sub-diffractie niveau van detail te genereren. Deze techniek werd gebruikt om een actine stroom die symmetrisch retrograde en centripetale gehele omtrek van T-cellen na synapsvorming bevestigen.
Introduction
Het doel van het experiment is het beeld en karakteriseren van de moleculaire stroom filamentous- (F-) actine in levende T-cellen, dan de diffractielimiet om stromingsrichting en de omvang vast tijdens immunologische synapsen (IS) formatie. Deze techniek wordt uitgevoerd met een gestructureerde belichting microscoop (SIM) in de totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) modus beeldvorming Jurkat T-cellen die een kunstmatige synaps het activeren dekglaasjes bekleed met anti-CD3 en anti-CD28-antilichamen. De IS vormen tussen een T-cel en zijn doel; een antigeen presenterende cel (APC) van T-celreceptor (TCR) activatie 1,2. Aangezien dit de eerste stap bij het bepalen of het adaptieve immuunsysteem genereert een immuunreactie op een infectie, kunnen de gevolgen van onjuiste respons op stimuli een aantal ziekten. Het belang van de T-cel-APC interactie goed gedocumenteerd, maar de rol (len) van het rijpe IS na de eerste TCR signaal internalisatie zijn nog niet volledig begrepen.
Aangezien het cytoskelet wordt gedacht dat twee processen verbonden TCR activering (beweging van de moleculen aan het plasmamembraan en de controle van signaalmoleculen afhankelijk van het actine cytoskelet 3,4), begrijpen hoe het cytoskelet herschikt ruimtelijk en temporeel steun de stappen verhelderen moleculaire reorganisatie gedurende synapsvorming. De retrograde stroom F-actine wordt gedacht dat TCR clusters kraal naar het midden van de immunologische synaps wordt deze translocatie verondersteld essentieel voor signaal beëindiging en recycling worden; helpen de fijne balans van T-celactivering 5.
Terwijl de standaard fluorescentie microscopie is een flexibel instrument dat blijft inzicht over de vele evenementen, waaronder biologische cel-cel interacties, wordt beperkt door het vermogen van het systeem om nauwkeurig te lossen meerdere fluoroforen woonachtig dichterbij dan de diffractielimiet (≈200 nm) van elkaar. Zoveel moleculaire gebeurtenissen in cellen betrekken dichte populaties van moleculen en vertonen dynamische omlegging hetzij in rust of bij specifieke stimulatie, maakt conventionele lichtmicroscopie geen volledig beeld.
Het gebruik van superresolutie beeldvorming heeft toegestaan onderzoekers om de diffractielimiet behulp van een verscheidenheid aan technieken te omzeilen. Enkel molecuul lokalisatie microscopie (SMLM) zoals PALM en STORM 6,7 heeft de mogelijkheid om de locatie van moleculen opgelost tot een nauwkeurigheid van ongeveer 20 nm, maar deze technieken afhankelijk langere opnametijden, opbouw van een beeld op vele frames . In het algemeen vereist dit monsters vast te stellen of voor structuren om lage mobiliteit vertonen dus enkele fluoroforen worden niet geïnterpreteerd als meerdere punten. Terwijl de gestimuleerde emissie uitputting (STED) beeldvorming maakt super-resolutie door zeer selectieve confocale excitatie 8, de vereiste scannenbenadering kan langzaam over heel cel gezichtsvelden zijn. STED toont ook significant fototoxiciteit hogere resoluties vanwege de vermogenstoename van de uitputting bundel.
Gestructureerde verlichting microscopie (SIM 9) biedt een alternatief voor deze methoden, die in staat van een verdubbeling van de resolutie van een standaard fluorescentie microscoop en is compatibel met live cell imaging dan de huidige SMLM technieken. Het maakt gebruik van lagere laser bevoegdheden, op een breed veld voor whole-cell gezichtsvelden; Sterkere overname snelheden, en is compatibel met standaard fluorofoor etikettering. De breedveldbeeld karakter van SIM maakt ook het gebruik van de totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) voor zeer selectieve excitatie met indringdiepten in de axiale afmeting van <100 nm.
Afbeelding correlatie spectroscopie (ICS) is een methode correleren fluctuaties in fluorescentie-intensiteit. Een evolutie van ICS; Tijdruimtelijke imleeftijd correlatie spectroscopie (Stokjes 10) correleert intracellulaire fluorescerende signalen in tijd en ruimte. Door het correleren pixelintensiteiten met de omliggende pixels in achterblijvende frames via een correlatie functie, wordt informatie verkregen over stroomsnelheden en richting. Om ervoor statische objecten niet interfereren met de Stokjes analyse wordt een onbeweeglijk object filter toegepast, die werkt door het aftrekken van een voortschrijdend gemiddelde van de pixelintensiteiten.
De hier gepresenteerde techniek wordt als de eerste demonstratie van beeldcorrelatie spectroscopie toegepast op microscopie data superresolutie de moleculaire stroming in levende cellen 11 kwantificeren. Deze methode verbetert buigingsbegrensd beeldvorming van F-actine stroom via Stokjes analyse 12 en zou onderzoekers die willen bepalen tweedimensionale moleculaire stroming in levende cellen, uit gegevens verkregen bij ruimtelijke resoluties dan de diffractie limiet van het licht aan te passen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: Stages 1 en 2 vinden plaats voor de dag van beeldvorming; ervoor zorgen dat alle media en supplementen om te worden gebruikt voor of op de dag van beeldvorming zijn evenwicht gebracht. Evenwichtstoestand is bereikt door verwarming van media en supplementen tot 37 ° C in een incubator ingesteld op 5% CO2. Alle celcultuur werk en dekglaasje plating stappen vinden plaats in steriele omstandigheden onder een laminaire stroming kap.
1. celtransfectie
- Transfecteren de T-cellen af te beelden 24 uur voor het experiment met een plasmide dat codeert voor een fluorescent fusieconstruct van F-actine labeling GFP en beeldvorming. Opmerking: De cellen worden gesplitst 24 uur voor transfectie (48 uur voorafgaand aan beeldvorming) te garanderen cellen bij een optimale gezondheid en in hun logaritmische groeifase.
- Plaats 5 ml RPMI supplement (RPMI 1640 plus 10% FBS en 1% Pen-Strep (optioneel)) in een enkel putje van een 6-wells plaat in de incubator equilibreren.
- Pellet 2 x 10 7 T-cellen cultreerd bij 37 ° C 5% CO2 in RPMI supplement met een centrifugebuis bij 327 g gedurende 5 minuten en was in een gelijk volume van voorverwarmde media elektroporatie. Opmerking: Electroporation medium is een gereduceerd serum medium met buffers en supplementen (zie consumables).
- Na opnieuw het pelleteren bij 327 xg gedurende 5 min, resuspendeer de cellen in 500 pl elektroporatie media en langzaam aan een cuvette, voeg 5 ug van het plasmide PCR graad dH 2 O labeling F-actine.
- Tik de cuvette op de kap werkruimte om verwijdering van luchtbellen in de media, die boog van de stroom kan leiden en aan de cellen gelijkmatig te verdelen binnen de media te verzekeren.
- Zet de elektroporatie apparatuur en ingesteld voltage op 300 V en capaciteit tot 290 Ω. Electroporate monster met behulp van een exponentiële verval van 20 msec. Opmerking: optimalisatie kan vereist zijn voor verschillende cellen en verschillende plasmide constructen.
- Nadat het transfectie protocolcompleet, slaan de cellen op ijs gedurende 1 minuut voordat u verder gaat.
- Breng voorzichtig de cellen van de cuvette met de 6-wells plaat met 5 ml geëquilibreerd RPMI supplement uit stap 1.1.1.
- Incubeer de cellen O / N bij 37 ° C + 5% CO2.
2. Coat Dekglaasjes en Pre-warm Imaging Supplement
- Coat dekglaasjes met antilichamen voor T-cel stimulatie induceren.
- Jas iedere kamer van een 8-well dekglaasje met 1 ug / ml aCD3 en αCD28 in 200 pi PBS.
- Bewaren bij 4 ° CO / N. Alternatief, laag dekglaasjes 2 uur voorafgaand aan beeldvorming en in een incubator bij 37 ° houden C drift te verminderen tijdens het beeldvormingsproces door het minimaliseren van temperatuurveranderingen op het dekglaasje.
- Maak een dekglaasje proefmonster met 0,1 micrometer sub-diffractie fluorescerende microbolletjes.
- Draaikolk voorraad oplossing van kralen klonten voorkomen.
- Op een nieuwe, schone dekglaasje van the hetzelfde type als gebruikt in stap 2.1.1 Pipetteer 5 ul fluorescerend microbolletje voorraadoplossing op het oppervlak (volgens de instructies van de fabrikant).
- Verspreid microsfeer oplossing over het dekglaasje met een pipet tip.
- Laten drogen, vervolgens 200 gl fixeermiddel zoals PBS toepassing.
Let op: de montage medium moet overeenkomen met die gebruikt worden voor de beeldvorming cel monsters.
- Equilibreren HBSS (+ 20 mM HEPES, hierna "HBSS supplement ') in een centrifugebuis door in een incubator voorverwarmen O / N bij 37 ° C + 5% CO2.
Let op: de toevoeging van HEPES buffer is om CO 2, bij gebruik van een incubatiekamer met CO 2-ingang sla deze suppletie.
3. Microscoop Set-up
- Zet het podium-top incubator van de TIRF-SIM microscoop en plaats voldoende water in het reservoir van de microscoop doorgronden van de voet van het verwarmingselement. Laat het water equilibrate tot 37 ° C. Voeg de verwarmingsmanchet de objectieflens, ook ingesteld op 37 ° C.
Opmerking: Vanwege de gevoeligheid van de set-up, zijn deze stappen eerder gedaan 's nachts, zodat de optische componenten zijn bij een stabiele temperatuur voorafgaand aan de beeldvorming. - Plaats de TIRF 488 compatibele raspen blok in het lichtpad van de microscoop en vast te zetten.
- Schakel de kanaal modus en de glasvezelkabel naar de 'Single' positie op de laser bed en microscoop podium respectievelijk om de juiste optische pad voor de TIRF-SIM-modus in te schakelen. Opmerking: sla deze stap leidt tot een fout (figuur 1A) binnen de softwarevenster.
- Zet alle microscoop en computer componenten en de overname besturingssoftware openen.
- Open het OC panel, Ti Pad, N-SIM-Pad en ND Acquisition vensters (Figuur 1B). In de 'OC Panel' de optie 'TIRF 488' (Figuur 2B, gele pijl). In het venster N-SIM-Pad, selecteert u de 'Moving' settings (figuur 2C, gele pijlen) TIRF-SIM 'en. Selecteer de knop Instellingen (figuur 1C, gele doos) en selecteer 'TIRF 488 (voor 100x TIRF 488nm)' uit het dropdown-menu, klik op 'Apply' en 'OK'.
- Stel de camera-instellingen binnen de 'DU897 instellingen' aan: Frame Rate 50 msec, afleestoestand, EM Gain 3 MHz 14-bit, en EM Gain Multiplier 300 met een Conversie Gain van 1 (figuur 1C, groene doos).
Opmerking: zie representatieve resultaten voor de frame rate overwegingen. - Kalibreer belicht microscoop voor TIRF-SIM door 100x 1,49 NA CFI Apochromat TIRF doelstelling selecteren, op het "N-SIM Pad" zet de 488 nm laservermogen tot 10%.
Opmerking: Pixel grootte van de ruwe beelden is 60 nm, met een 512 x 512 pixel gezichtsveld. - Reinig het objectief met behulp van de lens weefsel om stof en olie te verwijderen.
- Beginnen met het doel in de laagst mogelijke z-vlak. Breng een druppel olie op de lens objectief en voeg de fluorescerende microsfeer monster uit stap 2.2 de microscoop podium.
- Selecteer de Perfect Focus System (PFS) functie op het lichaam van de microscoop.
- Bewegen langzaam het doel omhoog door de z-vlak tot de PFS-knop stopt met knipperen om de focal plane bevestigen is bereikt.
- Overschakelen op 'Live' zicht op de besturingssoftware en het imago van de microbolletjes voor de laatste aanpassingen gemaakt met behulp van de PFS micro-manipulator wiel.
- Let op de gelijkmatige verlichting zonder out-of-focus fluorescentie-emissie boven de 75 nm uitdovende golf.
Opmerking: Bevestig gestructureerde verlichting wordt vervuld door het observeren van een wisselende belichting patroon uit de fluorescerende microsfeer monster. - Meet fluorescerende microbolletjes monster en kwantificeren van de verbeterde beeldvorming Resolution door het observeren van de breedte op halve hoogte (FWHM) van het intensiteitsprofiel.
- Open de Analyze software (v4.20.01), met de NOS-N-SIM Analysis module geïnstalleerd en selecteer 'Applications' -> 'Toon N-SIM-venster'.
- Met de verlichting modulatie contrast (IMC) en hoge resolutie ruisonderdrukking (HRNS) ingesteld op 1 voor TIRF-SIM datasets (figuur 2), te reconstrueren beeld microsferen monster om een gereconstrueerd beeld van 1024 x 1024 pixels genereren met een pixelgrootte van 30 nm.
- Met behulp van de lijn profiel tool met een breedte van 1 pixel (Figuur 3A, gele doos), trek een lijn door het midden van een enkele microsfeer.
- Selecteer de FWHM knop (figuur 3B, geel vakje) en klik op de intensiteit maxima van de Gauss distributie, gevolgd door de intensiteit minima.
- Controleer de FWHM van de microsfeer in het bereik van 100 nm (figuur 3C). Opmerking: de resolutie achieved bij beeldvorming biologische monsters is afhankelijk van de signaal-ruisverhouding van merkingsrendement en achtergrondfluorescentie.
4. Monstervoorbereiding for Imaging
- Coverslip voorbereiding.
- Ophalen αCD-gecoate dekglaasje uit stap 2.1 van de koelkast of incubator en verwijder PBS met aCD3 en αCD28 uit elk putje.
- Voeg 200 ul voorverwarmde HBSS supplement van stap 2,3 aan elk putje van het dekglaasje. Wassen en te verwijderen om ervoor te zorgen minimale aCD3 en αCD28 blijft in oplossing. Voeg nog 200 ul van HBSS aanvulling op het dekglaasje putjes.
- Reinig de onderzijde van het dekglaasje met lens tissue olie en deeltjes te verwijderen.
- Positie dekglaasje op de microscoop podium en vind de TIRF brandvlak van het dekglaasje met behulp van de PFS z-vlak als in stap 3.4.
- Celpreparaat.
- Pipet 200 ul van de media conbevattende getransfecteerde cellen uit stap 1.1.8 in een micro-centrifugebuis.
- Pellet cellen in een micro-centrifuge bij 268 xg gedurende 20 seconden en verwijder de cel media.
- Resuspendeer cellen in 200 ul voorverwarmde HBSS supplement vanaf stap 2.3.
5. Imaging Cellen
- Take-cel met HBSS aanvulling op de microscoop en voorzichtig pipetteren 200 ul in een van de wells.
- Terwijl die nog in de TIRF focal plane op het dekglaasje (in de PFS-modus), met de microscopen oculair en epifluorescentie verlichting te fluorescerende cellen naderen van de dekglaasje volgen.
- Zodra de cellen landen op de dekglaasje, over te schakelen naar 'Live' modus in de N-SIM-Pad om het beeld te brengen op de monitor en controleer of de cellen in de focus op het computerscherm.
- Om tijd-cursussen te nemen, het venster ND Verwerving en selecteer het tabblad 'Time', klikt u op 'Toevoegen' en stel 'Interval' om Geen vertraging, 'Duur'tot 10 min, 'Loops' op 1.
Opmerking: Duur kan worden gewijzigd, afhankelijk van het proces van belang; de Stokjes software kan halen kwantitatieve resultaten met afbeelding stapels van ≈10 frames wanneer gevangen met 'No Delay'. - Met identieke overname instellingen naar de kraal monster, beginnen met het opnemen van gegevens door het selecteren van 'nu Run' in het venster ND Acquisition.
6. Reconstructing SIM Afbeeldingen
- Na beeldvorming is voltooid, opent de Analyze software (v4.20.01), met de NOS-N-SIM Analysis module geïnstalleerd en selecteer 'Applications' -> 'Toon N-SIM-venster'.
- Met de belichting modulatie contrast (IMC) en hoge resolutie ruisonderdrukking (HRNS) ingesteld op 1 voor TIRF-SIM datasets (figuur 2), reconstrueren één (of meerdere met het Batch tool) ruwe SIM bestand naar een gereconstrueerd beeld SIM produceren.
- Bevestig de gereconstrueerde bestand heeft een pixelgrootte van 30 nm, die in deimage statusbalk.
Opmerking: pixelgrootte geen invloed Stokjes analyse, maar het moet ten minste 2x kleiner in omvang dan de PSF ruimtelijke resolutie in om het ruimtelijk verband tussen pixels te waarborgen. - De gegevens te exporteren als .tiff bestanden, klaar voor Stokjes analyse.
7. Stokjes Analyse
- Download en pak de STIC (C) S Matlab softwarepakket (Wiseman lab; beschikbaar als aanvullende informatie). Het script stics_vectormapping.m is de kern van een enkel kanaal Stokjes analyse en de eerste 30 regels code worden gebruikt om de input parameters te definiëren als bedoeld in artikel 2.1 van de handleiding. Open deze script en definiëren de input parameters voor TIRF-SIM data-analyse. Er wordt voorgesteld om ook de S folder STIC (C) toe met submappen aan de lokale machine Matlab pad, zoals beschreven in de bijlage van de handleiding.
- Definieer de input parameters voor de data-analyse door het bewerken van de desbetreffende regels van de code
- Om ana voerenlysis van de TIRF-SIM data genereren 1 vector kaart, stelt de tijdelijke parameters tijdelijke subregio in de lijn 31 om het maximale aantal frames en de tijdelijke verschuiving in de lijn 32 naar 1. Om een tijdreeks van vector kaarten te verkrijgen variëren van deze parameters .
- Voor de immobiele verwijderen filter, stel de parameter 'filtering' (lijn 23) naar 'Moving gemiddeld' en stel parameter 'MoveAverage' (lijn 24) naar 21.
Opmerking: Deze instelling is aangetoond werken langzamer bewegende en grote fluorescentiesignalen, aangezien het berust op het aftrekken serie frames uit het frame worden geanalyseerd. - Verander lijnen 33-38 om de naam van de output bestanden en titels van de output vector kaarten, evenals de output directory pad te stellen en te bepalen in welk formaat de vector kaart afbeeldingen moeten worden opgeslagen.
| Pixelgrootte (pm) | 0,03 micrometer | Lijn 19 |
| Frame rate (sec) | 1 seconde | Lijn 20 |
| Maximale vertragingstijd (frames) | 20 frames | Lijn 21 |
| Subregio grootte (pixels) | 8 pixels | Lijn 29 |
| Subregio afstand (pixels) | 1 pixel | Lijn 30 |
- Open het script run1ChannelSTICS in het venster Matlab editor. Laad de afbeelding serie van lopende sporen 1-23 van dit script.
Opmerking: Dit script kan worden gebruikt voor het laden en pre-proces afbeelding serie, plot van de vector kaarten en snelheid histogrammen en uitvoeren van een batch processing te veel bestanden. Indien nodig, bij te snijden op de afbeelding om een gebied van belang met behulp van de lijn 24-26 van dit script.- Run lijnen 29-35 van run1ChannelSTICS om Stokjes analyse beginnen. Wanneer u wordt gevraagd, selecteert u een polygoon tot een bepaalde regio van belang (ROI) te geven, indien gewenst. Zorg ervoor dat de ROI niet overlapt met de cel rand, zoals grens artefacten optreden wanneer Stokjes analyseert deze reregio's.
- Lopen lijnen 38-52 om de vector kaarten weer te geven. Om de snelheid magnitude histogram plot, lopen lijnen 53-72.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Microscoop instellingen
Na het succesvol realiseren van alle stappen van de onderzoeker zal hebben volbracht gestructureerd verlichting (SIM) beeldvorming van F-actine stroming in een T-cel synaps (Video 1), en gekwantificeerd deze moleculaire stroom van tijd-ruimtelijke afbeelding correlatie spectroscopie (figuur 4 11). Vóór het opnemen van beelden, zorgen voor de steekproef verlichting is uniform over de negen ruwe beelden en dat gestructureerd verlichting in de vorm van moiré franjes worden waargenomen bij het monster (Figuur 5), zijn deze beide indicatoren het dekglaasje wordt plat op het podium en de TIRF- SIM set-up goed is uitgelijnd.
Het is belangrijk om het laservermogen laag (≤10%) te garanderen cellen blijven gezond mogelijk tijdens het experiment te houden. Als fluorescerende expression laag, zelfs na optimalisatie van dHij elektroporatie stappen, verhoging van de belichtingstijd van elke ruwe kader boven de genoemde 50 msec en / of de conversie Gain instellingen. Als TIRF-SIM vereist 9 ruwe frames, 1 voor elk van de 9 verlichting oriëntaties nodig gereconstrueerd beeld per, het verhogen van de belichtingstijd zal de frame rate te verlagen. In dit experiment, een 50 msec blootstelling laat ≈1 gereconstrueerde beelden per seconde (waaronder ook rooster rotatie tijd), waardoor het risico van beweging artefacten gezien toen sneller gebeurtenissen bewegen door meerdere verlichting maxima in een ruwe frame.
Afhankelijk van de snelheid van moleculaire stroom bestudeerd, waardoor de belichtingstijd kan bewegingsartefacten te voeren; onderzoekers moeten belichtingstijden te houden tot het minimum vereiste voor een goed signaal. Zoals pixel maten in de SIM-beelden zijn kleiner dan die van standaard fluorescentie beelden, kunnen moleculaire populatie vertonen snellere stroomsnelheden passeren de subregio voordat een volgende frame wordt verworven. Voor de Stokjes software om de fluorescentie-signaal binnen deze kleinere regio correleren snellere beeldverwerking tarieven nodig zijn in vergelijking met standaard fluorescentie datasets. Bijvoorbeeld een subgebied afmeting van 8 x 8 pixels van simgegevens is een 240 x 240 nm gebied, terwijl een 8 x 8 pixel deelgebied van een standaard fluorescentie dataset representeert een gebied van 1,7 urn (met een verondersteld pixelgrootte van 200 nm).
Voor langere gangen (> 3 min) batches data kunnen worden gemaakt met "ND acquisitie om laserbelichting in synapsvorming (verminderen bijvoorbeeld beeldvorming voor 10 sec elke min gedurende 10 min wordt de cel blootgesteld aan dezelfde cumulatieve laservermogen zoals beeldvorming voor <2 min continu).
Sub-optimale reconstructies van SIM beeldvorming getoond in figuur 6, waarbij dezelfde ruwe data gereconstrueerd met verschillende high resolutiop ruisonderdrukking (HRNS) instellingen, zijn de voorwaartse Fourier-transformaties (FFT) en de volledige breedte halve hoogte profielen van de gemarkeerde vezels ook getoond. Het instellen HRN een evenwicht tussen meer reconstructie artefacten vanwege de slechte signaal-ruis en toenemende resolutie. Een HRN die te laag is (<1) kan leiden tot korrelige beelden met verhoogde hexagonale SM artefacten, terwijl een te hoge HRNS instelling (> 1) kan 'clip' en gooi de hoge resolutie data (gezien als een gereduceerde diameter FFT). Een resolutie van> 100 nm zou noodzakelijk de reconstructie met verschillende instellingen herhaald geven, wanneer resoluties nog steeds suboptimaal opnieuw toe de gegevens met een geoptimaliseerde microscoop opzet worden vereist.
Beeldvorming en kwantificeren van moleculaire stroom
Om het moleculaire stroom werd tijdreeksen data genomen van T-cellen de landing en de vorming van een synaps op een stimulerende coverslip, kan F-actine zichtbaar te stromen in een retrograde wijze uit de cel periferie naar het centrum cel. Als F-actine wordt minder dicht naar het midden van de cel Stokjes analyse alleen bij de omtrek van de synaps werd uitgevoerd regio ook wanneer signalering microclusters bekend afkomstig uit tijdens langdurige formatie synaps.
Bij het verwerven en analyseren van gegevens met Stokjes is het belangrijk te begrijpen programma voert correleren fluorescentie fluctuaties binnen de geselecteerde deelgebieden een hogere en gladder correlatiefunctie (CF) te vormen. Het absolute aantal frames nodig is om een succesvolle Stokjes vermogen te genereren is niet precies zoals de software vertrouwt meer op het creëren van een uitgang door het totale aantal constructieve signaal schommelingen binnen deze deelgebieden. Bijvoorbeeld als de dataset 20 mobiel gemerkte eiwitten in elk subgebied stroomt in dezelfde richting Stokjes ziet minder frames gen nodigtarief een betrouwbare output, terwijl een subregio met 5 mobiele eiwitten resulteert in een zwakkere correlatie functie en meer frames nodig. Het exacte aantal frames en subregio grootte hangt af van de aard van de moleculaire gebeurtenissen die afgebeeld en worden geoptimaliseerd door de gebruiker.
De Stokjes "Temporal lijst crop 'hulpmiddel is het mogelijk om subsets van moleculaire stroming doorgelicht tijd: voor onderzoekers om te zien of stroomsnelheden verandering binnen dezelfde cel, afhankelijk van verschillende cellulaire omstandigheden of omgevingsstimuli, zoals voor en na de behandeling met geneesmiddelen. De immobiele object filter is ontworpen om een immobiel fluorescerende populatie verwijder voor het analyseren van de mobiele fluorescerende populatie. Met deze aanpak, afbeeldingen met statische bevolking percentages tot 90% kan nog steeds met succes worden geanalyseerd 10. De immobiele filter instellen op 21 frames filtert elke fluorescerende populaties die blijven static deze periode of langer, hetgeen niet bijdraagt tot de dynamische retrograde stroom tijdens immunologische synaps stabiliseren.
Figuur 1. Microscoop overname instellingen. (A) wijst op de N-SIM Pad instellingen die worden gebruikt voor het experiment en de 'verkeerde Fiber' fout wanneer de interne kanaal en Fiber-modi niet worden geselecteerd. (B) Alle ramen nodig, opname-up set en het imago van een gestructureerde belichting te reconstrueren op de SIM-systeem. (C) N-SIM-Pad en N-SIM-instellingen pop-out venster (gele doos) gebruikt om het raspen Setup na fysiek plaatsen van de 488 nm rooster in de microscoop te selecteren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Reconstructie instellingen voor het uiteindelijke beeld. Bij de 'Param' knop (gele doos), selecteer TIRF-SIM te selecteren in het dropdown menu, en aanvankelijk zowel de 'Illumination Modulation Contrast' (IMC) en 'met hoge resolutie ruisonderdrukking '(HRNS) op 1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Volledige breedte op halve hoogte (FWHM) meting. Met behulp van de analyse software (A) toont een Gauss-plot van de lijn intensiteit gereedschap geselecteerd (gele doos) en getekend een gereconstrueerde SIM beeld van een kraal monster door. (
Figuur 4. Representatieve gestructureerde verlichting databank Stokjes uitgang. Een Jurkat T cel die GFP-gelabelde F-actine afgebeeld met behulp TIRF-SIM een stimulerende dekglaasje voor immunologische synaps genereren. Vijf minuten na contact, werd een time-cursus gevolgd en het gebruik van de Stokjes analyse programma geanalyseerd. Gele vakken vertegenwoordigen ingezoomd regio terwijl vector kaarten tonen de retrograde stroom van F-actine in de synaps periferie. Vector kleuren geven de snelheid van de moleculaire stroming in dat deelgebied is snelheidsgegevens uitgezet op een histogram. Door de z-selectiviteit van excitatie TIRF-SIM verschaft, kan het monster verloren scherpstelling wanneer losmaakt en zich van het dekglaasje door het tijdsverloop van het experiment vanwege plooien of motiliteit. Dit wordt gezien hier in het bovenste rechter paneel als een verlaging vector dichtheid. De reductie is een gevolg van Stokjes toepassing van de immobiele filter subgebieden die waarbij geen fluorescentie schommelingen de tijd ingesteld door de gebruiker. Dit resultaat onderstreept het belang van het selecteren van enige regio die fluorescentie signaal voor de hele tijdreeks bevatten. lank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Raw SIM-beelden. De negen ruwe beelden aan de linkerkant geven de 9 oriëntaties van de rasterpatroon nodig is om een afbeelding TIRF-SIM te produceren. Cell afgebeeld is een Jurkat T cel die GFP gelabelde F-actine, hebt cel geeft een van de negen onbewerkte afbeeldingen tonen ongelijkmatige belichting met Moiré franjes, met name rond de celperiferie. Hoewel de gestructureerde verlichting niet zichtbaar de interacties tussen de belichting en het monster creëren gebieden van variërende sterkte belichting, na de reconstructie resulteert in een beeld met een betere resolutie. Beide schaal bars zijn 5 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6 Hoge resolutie ruisonderdrukking (HRNS) instellingen Sub-optimale instellingen leiden tot suboptimale beeldreconstructie..; (A) toont de verschillen in de gereconstrueerde data (instellingen gebruikt getoond onderaan links van elke foto), waar de lagere HRNS leidt tot een verhoogde ruis buiten de bloemblaadje regio en hogere HRNS kan de resolutie verminderen en leiden tot een verlies van de fijnere details. (B) Vertegenwoordigt de voorwaartse Fouriertransformatie van beelden (A) waarbij de perifere gegevens blijkt hogere resolutie gegevens; let op de geknipte bloemblaadjes van de transformatie bij HRNS is ingesteld op 5, geeft de verminderde resolutie afbeelding. (C) toont de volledige breedte half maximum (FWHM) van de actine vezel (gele box aan a) en verschillende instellingen, FWHM metingen via de software gaf lezingvan 90 nm, 100 nm en 180 nm voor HRNS instellingen van 0,1, 1 en 5 respectievelijk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze techniek zal de onderzoekers om de afbeelding toe te staan en te kwantificeren eerder onoplosbare informatie in cellen die fluorescentie. In onze resultaten laten we zien dat F-actine stromen op symmetrische wijze uit de cel periferie naar het centrum van de cel T-cel IS. Deze bevindingen komen overeen met eerdere resultaten uit 1D lijnprofiel kymograaf data 13 en de capaciteit van de analyse uit te breiden naar 2D en super-resolutie data.
De gepresenteerde techniek is een vooruitgang van kymograaf beeldvorming die beperkt is tot het uitzetten fluorescentie-intensiteit fluctuaties via één lijn 1D tijd. In vergelijking levert de huidige techniek kwantificering van gehele cellen moleculaire stroom met zowel richting en snelheid geëxtraheerd. Terwijl spikkel beeldvorming heeft ook aangetoond actine dynamiek 14 binnen de 2D omgeving, kan de vlek techniek worden beperkt door problemen met de juiste etikettering dichtheden en alleen visualiseert een subpopulatie van actine.
De belangrijkste maatregelen om deze resultaten te bereiken voor het optimaliseren van de transfectie-efficiëntie van de bepaalde cellen die worden gebruikt door de onderzoeker en uitlijning van de SIM microscoop optica en roosterpatroon. Het kiezen van de juiste maat van de subregio, hangt af van het monster kenmerken, en is belangrijk als een te kleine instelling zal betekenen sneller bewegende fluorescentie verloren gaat door de correlatie analyse, maar het kiezen van een te grote subregio zal potentieel verlies van nuances in de extra data verkregen met behulp betekenen super-resolutie methoden.
Subregio geeft het aantal pixels opgeteld om een super-pixel velocity mapping analyse maken verhogen kan de betrouwbaarheid verbeteren bijhouden sneller bewegende objecten. De subregio afstand is de kloof tussen de gegevens binnen superpixels. Wanneer de subregio afstand kleiner is dan de subregio grootte, zullen deze vectoren naast enige informatie te delen, waardoor deze instelling kan directional nadelen beperkenistency van de uiteindelijke vectormap gegenereerd. De maximale vertraging controleert de tijd correlatie analyse, waarbij het aantal ingevoerde is het maximum aantal vertragingen voor de analyse eindigt.
Reconstructie van het uiteindelijke beeld vereist verlichting modulatie contrast (IMC) en hoge resolutie ruisonderdrukking (HRNS) instellingen worden geselecteerd. Optimale instellingen kunnen verschillen van monster tot monster. IMC helpt te onderscheiden van de gestreepte verlichting patroon op het monster, en vermindert de wederopbouw artefacten. HRNS kunnen artefacten van lage contrast gegevens te verminderen door 'knippen' gegevens met hoge resolutie van de Fourier-transformatie; om maximale resolutie capaciteiten te behouden en het minimaliseren van de wederopbouw artefacten deze worden normaal vastgesteld op 1.
Beperkingen van deze techniek is gebaseerd op het 2D aard van het proces, omdat de software niet Stokjes 3D data van de techniek is beperkt tot TIRF-SIM of 2D-SIM kan analyseren, vereist derhalve het monster te relatsluitend vlak tegen de dekglaasje. Een ander technisch nadeel is dat TIRF-SIM vereist 9 ruwe frames te verzamelen voordat het uiteindelijke superresolutie reconstrueren, als zodanig onze instelling van 50 msec acquisities kader en de tijd die de SIM microscoop om het rasterpatroon heroriënteren; frame rates van ≈1 sec worden bereikt. Vergeleken met andere super-resolutie techniek opnametijden en groot gezichtsveld deze beperkingen aanvaardbaar voor de meeste toepassingen.
De hier gepresenteerde resultaten zijn vergelijkbaar met datasets van standaard TIRF beeldvorming van F-actine stroming in immunologische synapsvorming. De goede overeenkomst tussen beeldvormende modaliteiten demonstreert Stokjes is robuust tegen mogelijke SIM reconstructie artefacten en ook dat het beeld overname instellingen gebruikt tijdens de SIM zijn aanvaardbaar voor data-analyse. Door het gebruik van super-resolutie datasets met kleinere pixelgroottes meer gegevens van individuele cellen en de dynamiek van s kan worden gewonnenub-diffractie cellulaire micro-domeinen kunnen worden onderzocht.
Na grijpen deze techniek elke moleculaire stroom kan worden gescand en gekwantificeerd met ruimte om niet-invasief onderzoeken van een veelvoud van vragen met betrekking tot stroming in de plasmamembraan, of bij bemonstering met een confocale microscoop, overal in het xy vlak van de cel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables: | |||
| Jurkat E6.1 cells | APCC | ATTC TIB-152 | |
| RPMI | Life Technologies | 21875-091 | |
| FBS | Sigma | F7524-500ML | |
| Penicillin-Strepromycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-050 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630-056 | |
| #1.5 8-well Labtek coverslips | NUNC, Labtek | 155409 | |
| LifeAct GFP construct | Ibidi | 60101 | |
| OptiMem | Life Technologies | 51985-042 | |
| anti-CD3 | Cambridge Bioscience | 317315 | |
| anti-CD28 | BD Bioscience / Insight Biotechnology | 555725 | |
| PBS | Life Technologies | 20012-019 | |
| Lens oil | |||
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment: | |||
| Gene Pulsar Xcell System | BioRad | 165-2660 | |
| Cuvette (0.4cm) | BioRad | 165-2088 | |
| Centrifuge (5810R) | Eppendorf | 5805 000.327 | |
| Centrifuge (Heraeus) | Biofuge pico | 75003235 | |
| 6 well plate | Corning | 3516 | |
| Stage-top incubator | Tokai Hit | INUH-TIZSH | |
| Nikon N-SIM microscope | Nikon | Contact company | |
| Nikon Analyse software | Nikon | Contact company | |
| Incubator (190D) | LEEC | Contact company |
References
- Monks, C., Freiberg, B., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395, 82-86 (1998).
- Lanzavecchia, A. Antigen-specific interaction between T and B cells. Nature. 314, 537-539 (1985).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
- Delon, J., Bercovici, N., Liblau, R. Imaging antigen recognition by naive CD4+ T cells: compulsory cytoskeletal alterations for the triggering of an intracellular calcium response. European journal of Immunology. 28 (2), 716-729 (1998).
- Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. T Cell Receptor-Proximal Signals Are Sustained in Peripheral Microclusters and Terminated in the Central Supramolecular Activation Cluster. Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature methods. 3, 793-796 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (15), 8206-8210 (2000).
- Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells. Biophysical Journal. 88 (5), 3601-3614 (2005).
- Ashdown, G. W., Cope, A., Wiseman, P. W., Owen, D. M. Molecular Flow Quantified beyond the Diffraction Limit by Spatiotemporal Image Correlation of Structured Illumination Microscopy Data. Biophysical Journal. 107 (9), 21-23 (2014).
- Brown, C. M., et al. Probing the integrin-actin linkage using high-resolution protein velocity mapping. Journal of Cell Science. 19 (24), 5204-5214 (2006).
- Yi, J., Xufeng, S. W., Crites, T., Hammer, J. A. Actin retrograde flow and actomyosin II arc contraction drive receptor cluster dynamics at the immunological synapse in Jurkat T cells. Molecular Biology of the Cell. 23 (5), 834-852 (2012).
- Watanabe, N., Mitchison, T. J. Single-molecule speckle analysis of actin filament turnover in lamellipodia. Science. 8 (5557), 1083-1086 (2002).
