تحديد الظروف الحرجة لالمناعية في البازلاء المن الأجنة: زيادة نفاذية الأنسجة وتقليل خلفية تلطيخ

Abstract

وAcyrthosiphon pisum البازلاء أولا بأول، مع تسلسل الجينوم واللدونة المظهرية وفيرة، وأصبحت نموذجا الناشئة للدراسات الجينية والتنموية. مثل المن أخرى، A. pisum نشر بسرعة عن طريق الاستنساخ لود عذري، حيث تطور الأجنة داخل غرف البيض بطريقة خط التجميع في ovariole. سابقا أنشأنا منصة قوية من جبل لالجامع في الموقع التهجين السماح الكشف عن التعبير مرنا في الأجنة أولا بأول. لتحليل التعبير من البروتين، على الرغم من إنشاء بروتوكولات لالمناعية للovarioles من المن لود اللاجنسي لم تسفر عن نتائج مرضية. نحن هنا تقرير الظروف الأمثل لزيادة نفاذية الأنسجة وتقليل تلوين الخلفية، سواء التي كانت مشاكل عند تطبيق النهج المعمول بها. وتشمل التحسينات: (1) حضانة بروتين K (1 ميكروغرام / مل، 10 دقيقة)، الذي عثر عليه و الأساسيةأو اختراق الأجسام المضادة في الأجنة المتوسطة والمرحلة المتأخرة أولا بأول. (2) استبدال العادي مصل الماعز / البقري ألبومين المصل مع كاشف الحجب توفيره من قبل Digoxigenin (DIG) المستندة العازلة مجموعة و(3) تطبيق الميثانول بدلا بيروكسيد الهيدروجين (H _{2 O 2)} لتبيض البيروكسيداز الذاتية. مما ادى الى تراجع كبير في تلوين الخلفية في الأنسجة أولا بأول. وهذه الظروف الحرجة الأمثل لالمناعية السماح الكشف الفعال للمنتجات الجينات في الأجنة من A. pisum والمن أخرى.

Introduction

المن والحشرات hemipteran مع (1-10 ملم) هيئات صغيرة ناعمة. تتغذى على النباتات التي تمتص عصارة اللحاء مع فمها خارقة. بالإضافة إلى ذلك، فهي تعتمد على البكتيريا endosymbiotic تلزم، Buchnera aphidicola، لتجميع الأحماض الأمينية الأساسية التي تعاني من نقص في الغذاء عصارة اللحاء. المن لها تاريخ حياة معقد يتضمن الاستنساخ لود عذري خلال فصلي الربيع والصيف الضوئية يوم طويل والاستنساخ بياض الجنسي سببها الضوئية قصيرة اليوم تم خلاله وضع عدد محدود من البيات الشتوي البيض ^1،2. في ربيع هذه يفقس البيض لإنتاج الجيل الأول من كل الإناث المن (fundatrices)، وبعد عدة جولات من الاستنساخ عذري حتى الخريف. والتوالد العذري الدوري في المن، حيث مراحل اللاجنسي والجنسي البديل في دورة الحياة السنوية، وقد تم اعتباره ^1،2 الجدة التطوري. في المن لود عذري، مرحلة التطور الجنيني يحدث داخل غرف البيض من الأنابيب المبيض (ovarioles). على النقيض من ذلك، الأجنة بيوض الجنسية تتطور في البيض المخصب. وبصرف النظر عن ليونة الإنجابية، ويمكن المن عرض transgenerational polyphenism الجناح: استجابة لإشارات الاكتظاظ والتهديدات المفترس، يمكن للإناث اللاجنسي unwinged إنتاج viviparously ذرية المجنح للهجرة لمسافات طويلة. نشر تسلسل الجينوم من المن البازلاء Acyrthosiphon pisum -THE أول تسلسل الجينوم لالقاعدية الحشرات يسمح hemimetabolous مواصلة استكشاف اللدونة الإنجابية، polyphenism الجناح، وغيرها من الميزات بما في ذلك التفاعلات الحشرات والنبات، vectoring الفيروسي والتعايش في المن على الجزيئي أساس ^3.

بالإضافة إلى تسلسل الجينوم، الأدوات المطلوبة لتحديد خصائص التعبير الجيني وظيفة لتعزيز المن البازلاء كنموذج كائن ناضج ^4. وصفناها بروتوكولات قوية من كامل جبل 5-7 في. وقد استخدم تدخل الحمض النووي الريبي (رني) عن طريق الحقن المزدوج تقطعت بهم السبل RNA والتغذية لإسكات الجينات في حوريات المن والكبار، ولكن لم يتم الابلاغ عن ظروف مستقرة لجين ضربة قاضية في الأجنة ^10/08. المناعية، وهو النهج القائم على الأجسام المضادة التي يمكن الكشف عن البروتين التعبير في عينات قبل وبعد رني ضربة قاضية، وقد أجريت على الأجنة البازلاء أولا بأول ^11-13. ومع ذلك، زيادة نفاذية الأنسجة والقضاء على تلوين الخلفية غير مرضية حتى الآن باستخدام البروتوكولات القياسية لالمناعية في الأجنة لود اللاجنسي من المن البازلاء. على سبيل المثال، وجدنا أن انخفض اختراق الأجسام المضادة إلى الأنسجة في الأجنة gastrulating (مراحل 10/08) وأن الأجنة مع براعم الأطراف يمكن تحديدها شكليا (مراحل 13-14) كانت بالكاد يسهل اختراقها للأجسام المضادة. وبالإضافة إلى ذلك، تم تصور تلوين الخلفية في viviparo اللاجنسيلنا البازلاء الأجنة أولا بأول الملون باستخدام الأجسام المضادة ضد علامة سلالة الجرثومية فاسا وكذلك ضد البروتين Engrailed / Invected أعرب في قطاعات الجنينية ^12،13. في الواقع كان لا يزال تلوين الخلفية واضحة للعيان في الأجنة ملطخة الأجسام المضادة الثانوية وحدها.

من أجل زيادة نفاذية دون الإضرار سلامة الأنسجة أولا بأول، ونحن معاير بعناية وتركيز بروتين K وتحديد الظروف المثلى لعملية الهضم الأنسجة على الأجنة أولا بأول. من أجل تجنب تلطيخ غير محددة في المن البازلاء، ونحن بحثت عن المركبات التي يمكن أن تمنع بالفعل الأجنة والنشاط البيروكسيداز الذاتية (POD)، وهو إنزيم يعمل على تضخيم الإشارات خلال المناعية قمع. A كاشف الحجب التي يقدمها Digoxigenin (DIG) المستندة إلى مجموعة العازلة، بدلا من مصل الماعز العادي يستخدم تقليديا (خ ع) / الأبقار مصل الزلال (BSA)، انخفاضا كبيرا تلوين الخلفية. وعلاوة على ذلك، تم العثور على الميثانول ليتنهىبت النشاط POD الذاتية أكثر فعالية من بيروكسيد الهيدروجين (H _{2 O 2).} وسيتم وصف تفاصيل بشأن هذه الشروط أولا بأول محددة لالمناعية على الأجنة في الأقسام التالية.

Protocol

1. ثقافة المن

جمعت سلالة مختبر عذري لود البازلاء المن A pisum أصلا في وسط تايوان، وقد تربى على النباتات المضيفة (وبيسوم حديقة البازلاء Pisum أو الفول الفول الفول) تحت الضوئية يوم طويل لأكثر من 300 أجيال: ملاحظة. (جيل واحد: ~ 10 يوما).

1. إنبات بذور
   1. نقع بذور النباتات العائلة فى ماء الصنبور لمدة 3-5 أيام في RT. إعادة ملء مع المياه العذبة مرة واحدة يوميا.
      ملاحظة: بدلا من ذلك، وضع بذور النباتات المضيفة مباشرة الى التربة الرطبة يمكن أن تحفز إنبات كذلك.
   2. تنمو 10 البذور في الإنبات في وعاء صغير (9 سم قطر × 7 سم) مع التربة في غرفة النمو تحت الضوئية 16 ساعة ضوء / 8 ساعات الظلام في 20 ° C.
   3. بعد حوالي 10 أيام ويبدأ نمو، ونقل المن على النباتات التي هي ارتفاع أكثر من 8 سم.
2. نقل المن الحفاظ على كل وعاء للنباتات داخل كوب 1 كوب L، ونقل 8 المن الكبار على النباتات باستخدام فرشاة الرسام، ثم ختم الكأس مع غطاء جوي للاختراق مثل شبكة الشاش لمنع المن من الهرب.
3. احتضان المن في غرفة النمو تحت الضوئية 16 ساعة ضوء / 8 ساعات الظلام في 20 ° C. الماء كل وعاء النبات من النباتات مرة واحدة كل يوم.
4. للحصول على الجيل القادم من المن، نكرر الخطوات 1.1.3-1.2.2 بعد عشرة أيام من نقل المن الأساسي.

2. تشريح والتثبيت من المبايض

1. طازجة إعداد بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) في 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) باعتبارها منطقة عازلة التثبيت.
2. ملء بئر واحدة من لوحة البقعة مع PFA (حوالي 500 ميكرولتر)، وضع لوحة تحت المجهر ستيريو في التكبير المنخفض، ويغرق في المن الكبار داخل PFA للتشريح.
3. تشريح المبيض عن طريق الضغط على الرأس والبطن مع مجموعة واحدة من الملقط، وقطع مفتوحة ظهريبشرة البطن، وسحب المبايض بعيدا عن تجويف البطن.
4. إصلاح ثلاثة أزواج من المبيض في أنبوب 1.5 مل تحتوي على 1 مل من PFA في RT لمدة 20 دقيقة.
5. صب عازلة التثبيت مع ماصة نقل (إما من الزجاج أو التخلص منها) ثم يغسل المبايض مع 0.2٪ TritonX-100 في برنامج تلفزيوني 1X (PBST) 3 مرات لمدة 10 دقيقة لكل منهما. خفيفة تهتز على خلاط / المدورة (زاوية الدوران: 60 ° (F60) / سرعة دوران: 8 RPM) يوصى لكل من تثبيت والغسيل.

3. العلاج مع بروتين K (PK) لزيادة نفاذية الأنسجة الجنينية

يتم تطبيق العلاج PK إلى الأجنة من الفرقة الجرثومية تمديد فصاعدا (المرحلة 11 من التنمية): ملاحظة. لأجنة الأصغر سنا، هذه الخطوة اختيارية.

1. تمييع متسلسل محلول المخزون من PK (10 ملغ / مل) مع برنامج تلفزيوني 1X إلى تركيز العمل 1 ميكروغرام / مل.
2. احتضان المبايض مع 1 ميكروغرام / مل من PK (حوالي 500 ميكرولتر) لمدة 10 دقيقة مع اهتزاز خفيف.
3. صب PK solutiعلى وثم يغسل المبايض مع 700 ميكرولتر من جليكاين (2 ملغ / مل) 3 مرات لمدة 5 دقائق لكل منهما.
4. غسل المبايض مع 0.2٪ PBST مرتين لمدة 10 دقيقة لكل منهما.
5. إصلاح المبيض مرة أخرى مع العازلة التثبيت لمدة 15 دقيقة في RT مع اهتزاز خفيف.
6. تجاهل طاف ويغسل المبايض مع 0.2٪ PBST مرتين لمدة 10 دقيقة لكل منهما.

4. الميثانول الحضانة للقمع في البيروكسيداز الذاتية (POD) النشاط

لا يتم تطبيق الميثانول الحضانة إلى الأجنة يتعرضون لتلطيخ Phalloidin أو الأجسام المضادة الحواتم التي هي الميثانول حساسة: ملاحظة.

1. متسلسل يذوى المبايض بنسبة مختلفة من الميثانول في 0.2٪ PBST (ت / ت: 1: 3، 1: 1، 3: 1) التي يحتضنها المبيضين في كل تركيز محلول الميثانول لمدة 10 دقيقة مع الإثارة معتدل.
2. يذوى المبايض مع الميثانول بنسبة 100٪ لمدة 1 ساعة على RT مع اهتزاز خفيف.
   ملاحظة: لا يزال من الممكن الحصول على نتائج مرضية من تلطيخ من الأنسجة المن التي تم تخزينها في الميثانول بنسبة 100٪ في -20 &# 176؛ C لمدة شهر واحد.
3. متسلسل ترطيب المبايض بنسبة مختلفة من الميثانول في 0.2٪ PBST (ت / ت: 3: 1، 1: 1، 1: 3) التي يحتضنها المبيضين في كل تركيز محلول الميثانول لمدة 10 دقيقة مع الإثارة معتدل.

5. تلوين الأجسام المضادة

1. تمييع الحل 10X حجب من مجموعة العازلة على أساس DIG (DIG-B) ل1x أخرى.
   ملاحظة: الحل حجب 1X DIG-B هو أكثر فعالية للحد من الخلفية تلطيخ من عرقلة كاشف القياسية تتكون من 5٪ (V / V) مصل الماعز العادي (خ ع) و 0.5٪ (ت / ت) ألبومين المصل البقري (BSA ) في 0.2٪ PBST.
2. احتضان المبايض مع 1X DIG-B عرقلة الحل ل2،5-4 ساعة على RT أو O / N عند 4 درجات مئوية مع اهتزاز خفيف.
   ملاحظة: للحصول على ثلاثة أزواج من المبيض في أنبوب 1.5 مل، 200 ميكرولتر هو الحد الأدنى للحجم لحجب عينة وتلوين الأجسام المضادة.
3. صب طاف واستبدالها مع حل 1X DIG-B حجب الطازجة التي تحتوي على الأجسام المضادة الأولية في diluti مناسباعلى النسبة. وصمة عار على المبايض لمدة 4 ساعة عند RT أو O / N عند 4 درجات مئوية مع اهتزاز خفيف.
   ملاحظة: للتجربة وصفها هنا، استخدام التخفيفات الأمثل التالية من الأجسام المضادة الأولية: (1) ApVas1 الأجسام المضادة: 1: 500 لتلطيخ مولد اللون، 01:50 لتلوين المناعي. (2) الأجسام المضادة لمكافحة α تويولين: 1: 500؛ (3) 4D9 وحيدة النسيلة الأجسام المضادة: 01:25.
4. غسل المبايض مع 0.2٪ PBST 4 مرات لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
5. احتضان المبايض مع 1X DIG-B عرقلة الحل لمدة 1 ساعة على RT مع اهتزاز خفيف.
6. صب طاف واستبدالها مع الطازجة 1X حل DIG-B حجب تحتوي على الأجسام المضادة الثانوية في نسبة التخفيف المناسبة. وصمة عار على المبايض لمدة 4 ساعة عند RT أو O / N عند 4 درجات مئوية مع اهتزاز خفيف.
   1. استخدام نسب التخفيف التالية من الأجسام المضادة الثانوية: (1) لتلوين المناعي: 1: 500 للاليكسا فلور 633 الماعز مفتش المضادة للأرنب أو فلور اليكسا 488 الماعز المضادة للمفتش الماوس. (2) لتلطيخ مولد اللون: 1: 200 للأغنام البيروكسيديز المضادة للأرنب مفتش.
      ملاحظة: يتم تطبيق الضد الثانوية المعقدة البيروكسيديز للتفاعل مع أفيدين-البيوتين المعقدة (ABC) في (مولد اللون) كشف القائم على الركيزة، التي يتم من خلالها تضخيم كبير إشارات تلطيخ.
   2. لتلوين المناعي، تنفيذ تلطيخ في الظلام لأن الأجسام المضادة الثانوية خفيفة حساسة.
7. يغسل الأجسام المضادة الثانوية مع 0.2٪ PBST 4 مرات لمدة 10 دقيقة لكل منهما.

6. النووية وF-أكتين تلطيخ

ملاحظة: يطبق هذا فقط للتلوين المناعي.

1. وصمة عار المبايض مع 0.2٪ PBST تحتوي على دابي (2 نانوغرام / ميكرولتر) وPhalloidin-TRITC (100 نيوتن متر) لمدة 2 ساعة على RT في الظلام.
2. غسل المبايض مع 0.2٪ PBST 4 مرات لمدة 10 دقيقة لكل منهما.
3. احتضان المبايض مع تصاعد المتوسطة O / N عند 4 درجات مئوية مع اهتزاز خفيف.

7. تنمية الإشارة

ملاحظة: يطبق هذا فقط لتلطيخ مولد اللون.

1. إعداد 100 ميكرولتر منكاشف أفيدين-البيوتين مجمع (ABC) لتعزيز الإشارات بإضافة 1 ميكرولتر من كاشف A (أفيدين) في 98 ميكرولتر من 0.2٪ PBST، خلط دقيق عبر pipetting لطيف، وإضافة 1 ميكرولتر من الكاشف B (البيوتين مترافق مع الفجل البيروكسيداز )، تليها خلط فوري. احتضان الخليط لمدة 30 دقيقة في RT مع اهتزاز خفيف.
2. احتضان المبايض (بما في ذلك غرف البيض نأت) في خليط من الكواشف A و B لمدة 30 دقيقة في RT مع اهتزاز خفيف.
3. يغسل مزيج من الكواشف A و B مع 0.2٪ PBST 4 مرات لمدة 10 دقيقة لكل منهما.
4. نقل المبايض غارقة في PBST إلى بئر على لوحة البقعة مع قطارة بلاستيكية.
5. يعد حل ركيزة من 3،3'-Diaminobenzidine (DAB): حل قرص DAB واحد زائد واليوريا فوق أكسيد الهيدروجين آخر واحدة تحتوي في 1 مل من ده _{2 O} عبر vortexing لقوي لمدة 1 دقيقة.
   ملاحظة: DAB، ركيزة عجل من الغلوثانيون، هو مولد اللون الشعبي لالمناعية. وتنتج رراسب الخاصة وغير قابلة للذوبان بعد التعرض للأكسدة التي الغلوثانيون. ويمكن تعزيز الإشارات الضعيفة عن طريق إضافة كلوريد النيكل في حل الركيزة (تركيز النهائي 0،05-0،08٪).
6. إزالة حل PBST المتبقية في البئر وإعادة ملء مع 100 ميكرولتر من محلول DAB الركيزة للتنمية الإشارة.
7. مراقبة كثافة الإشارات تحت المجهر ستيريو في التكبير المنخفض.
8. وقف ردود الفعل عن طريق إزالة الحل DAB، تليها إعادة تعبئة مع 1X PBS على الفور. تكرار غسل مرتين.
9. نقل المبيضين إلى أنبوب 1.5 مل ثم يغسل مع برنامج تلفزيوني 1X PBST أو مرتين لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
10. احتضان المبايض في وسط القائمة على الجلسرين تركيب (70٪ الجلسرين) O / N عند 4 درجات مئوية مع اهتزاز خفيف.

8. تركيب والمن الأجنة

ملاحظة: سمك الأجنة أولا بأول يتراوح بين مراحل التنمية. وبالتالي تعديل استراتيجيات التركيب لتناسب في وقت مبكر (germaria ومراحل 0-10)، منتصف (مراحل11-18)، وأواخر الأجنة (مراحل 19-20)، والتي أثبتت في الشكل 2B - D. وجاء انطلاق الجنينية ميورا وآخرون ¹²

1. نقل المبيضين معا مع تصاعد المتوسطة إلى علبة الخلية مع قطارة بلاستيكية ومراقبة العينات تحت المجهر ستيريو في التكبير المنخفض.
2. قطع الكؤوس المرتبطة قناة البيض الجانبية باستخدام دبابيس الحشرات ومن ثم نقل إلى ovariole معزولة إلى زجاج فارغة بشكل جيد مع قطارة. تشكل الحجم النهائي إلى 50-100 ميكرولتر باستخدام تصاعد المتوسط.
3. نقل وovariole على الشريحة مع قطارة الزجاج ثم تشريح الدوائر البيض باستخدام دبابيس الحشرات.
   ملاحظة: للحصول على الأجنة أقدم من مرحلة 6 من التنمية، ويقترح فصل الدوائر البيض. لgermaria وأول مجلسين البيض الذين تقل أعمارهم عن المرحلة 6، والفصل هو اختياري.
4. انتقال غرفة البيض تشريح لشريحة نظيفة باستخدام قطارة الزجاج.
5. وضع ساترة (الحجم: 22 × 22مم) خلال germaria تشريح أو دوائر البيض (التي تحتوي على أجنة في مراحل 10/01 التنمية) ببطء لتجنب الفقاعات.
   1. غرف جبل البيض (التي تحتوي على أجنة في مراحل 18/11 للتنمية) على شريحة مع جانب واحد جسر ساترة ومكان آخر ساترة (الحجم: 18 × 18 ملم) على أعلى من العينة.
   2. غرف جبل البيض (التي تحتوي على أجنة مضى عليها أكثر من 19 مرحلة التنمية) على شريحة مع وجهين لجسر ساترة ومكان آخر ساترة (الحجم: 18 × 18 ملم) على أعلى من العينة.
6. ملء الفراغ تحت ساترة أعلى مع وسائل الإعلام متزايدة لتجنب تجفيف العينة.
7. لفة أقل ما يقال الجنين عن طريق تحريك ساترة للحصول على التوجه الصحيح للمراقبة.
8. ختم حول حافة coverslips (بما في ذلك لل coverslips الجسر) بطلاء الأظافر.

تحليل 9. التصوير

1. صورة النقيض تدخل الفرق (DIC) صور من جبل لالجامع الأجنة مع compouالثانية المجهر مجهزة البصريات DIC وعدسة موضوعية الجافة (10X، 20X، 40X) متصلة الكاميرا. تثبيت برنامج لنقل الصور بين الكاميرا والكمبيوتر باستخدام تعليمات الشركة الصانعة.
2. الحصول على التوقعات من الأجنة fluorescently المسمى مع ليزر مسح متحد البؤر المجهر ^14. اتبع تعليمات الشركة الصانعة للتصوير، ض التراص، و3D إسقاط مع برامج التصوير.
   1. تحويل الشريحة رأسا على عقب، والعثور على عينة مزودة 10X الهدف، ودائرة منطقة العينة مع غرامة القلم استنادا يتأهل.
      ملاحظة: وهذا يجعل تحديد العينة أسهل عند البحث عنه من خلال أهداف المجهر متحد البؤر.
   2. إضافة قطرة من الزيت على الجزء العلوي من منطقة ساترة الذي هو المسمى كما هو موضح في 9.2.1 الجانب المعاكس.
3. العثور على طائرة الوصل في 40X الهدف النفط الغمر ثم تتغير إلى هدف النفط الغمر 63X. نقل يدويا تركيز الرقابة الدقيقة والقيامسفل لالتقاط أفضل البؤري.
   ملاحظة: للحصول على ملاحظة التفاصيل الهيكلية للgermaria والأجنة في وقت مبكر، نقترح استخدام 40X الأهداف أو الذين لديهم أعلى التكبير.
4. مسح الجنين في قنوات الإثارة المختلفة والحصول على صورة ض المكدس.
   ملاحظة: للحصول على أنسجة أولا بأول البازلاء، والحد من سماكة كل قسم البصرية وصولا الى 1.5 ميكرون أو أقل.

Representative Results

في هذه الدراسة، أجرينا كله جبل المناعية على الأجنة من المن البازلاء اللاجنسي (الشكل 1A). هذه الإناث تنتج ذرية parthenogenetically وviviparously. هذه الأجنة الإناث تتطور داخل غرف البيض من الأنابيب المبيض (ovarioles) (1B الشكل والشكل 2A). قبل المجهري، وovarioles تشريح هي الأهداف تلطيخ. ومع ذلك، لا بد من الفصل بين البيض غرف للمراقبة الأجنة تحت المجهر (الشكل 2B - D).

زيادة نفاذية النسيج

بروتين K (PK) العلاج هو نهج موحد لتعزيز نفاذية الأنسجة، ولكن لأجنة بعض الكائنات الحية مثل النموذج بوصفه انواع معينة ايليجانس (النيماتودا)، ذبابة الفاكهة (ذبابة)، ودانيو rerio (الزرد)، هذا الخطوة اختيارية. في المن البازلاء، والشرط لتلقي العلاج PK هو تعتمد على المرحلة: لgermaria والأجنة قبل تكون المعيدة (المراحل 0-7)، والعلاج PK يمكن حذفها. ولكن لأجنة تحت تمديد germband (المرحلة 11) أو في مراحل لاحقة ينصح بشدة هذه الخطوة. على سبيل المثال، خلال إشارات منتصف مرحلة التطور الجنيني تم الكشف بالكاد في الأجنة من دون علاج PK (الشكل 3A - C). على النقيض من ذلك، تم تعزيز كثافة إشارة بشكل كبير في الأجنة يتعرضون لPK الهضم (الشكل 3A '- C، A "- C").

الحد من تلوين الخلفية

وحددت مستوى عال من البيروكسيداز الذاتية (POD) النشاط في الأنسجة الجنينية من المن. لقمع هذا النشاط الانزيم، وحضنت الأجنة ثابتة لامتصاص العرق في وجود HYdrogen بيروكسيد (H _{2 O 2)،} كاشف مشترك للأكسدة POD. أظهرت نتائجنا أن H _{2 O 2} العلاج لم قمع نشاط الذاتية POD بفعالية في الأجنة في مرحلة متأخرة (الشكل 4A، D). على النقيض من ذلك، تم تخفيض تلوين الخلفية بشكل كبير في الأجنة يتعرضون للميثانول الحضانة (الشكل 4B، C، E، F). قبل سدت تطبيق الأجنة الأجسام المضادة الأولية في محلول يحتوي على NGS وBSA كما هو موضح في البروتوكولات القياسية لتلوين الأجسام المضادة. ومع ذلك، تم الكشف عن تلوين الخلفية المتبقية في الأجنة المن (الشكل 3A '- C'). تم حل هذه المشكلة بعد استبدال NGS / BSA مع كاشف الحجب التي قدمتها مجموعة عازلة للتجارب DIG وضع العلامات مثل التهجين الموضعي (الشكل 3A "- C") في. وهكذا فإننا نستنتج أن بعد تثبيت مع الميثانول والحضانة مع DIG-Bحجب كاشف كلاهما ضروري للحد من تلوين الخلفية في الأجنة أولا بأول.

العلاج PK وDIG-B حجب كاشف مطلوبة ليس فقط للكشف عن إشارة فعال باستخدام الأساليب اللونية ولكن الفلورسنت أيضا. تلوين أكتين مع phalloidin أو تلطيخ لتراعي الميثانول حاتمة، ومع ذلك، لا يعمل في الأجنة تتعرض إلى ما قبل التثبيت مع الميثانول، والتي يمكن أن تدمر شكل الأصلي من الأكتين أو الأجسام المضادة. وبناء على ذلك، ينبغي تجنب هذا العلاج عند تنفيذ مضان المناعية. وبصرف النظر عن القضاء على خطوات العلاج الميثانول المناعي يسمح تجارب متعددة العلامات في الأجنة أولا بأول. باستخدام متحد البؤر المجهري، على سبيل المثال، بروتين البازلاء أولا بأول Vasa1 (ApVas1) في الخلايا الجرثومية، ألفا تويولين في الأنابيب الدقيقة، F-الأكتين في microfilaments، والحمض النووي في نواة يمكن أن تكون وضعت في وقت واحد وتصور (الشكل 5A، C). بالمقارنة مع CHROطريقة mogenic (الشكل 5B)، متحد البؤر باجتزاء عينات من fluorescently المسمى يوفر أفضل قرار إشارات محلية مثل ApVas1 في بلازما الجرثومية وcellularizing الخلايا الجرثومية في الأجنة أولا بأول في وقت مبكر (الشكل 5C، D - D "). اعتماد شروط وضع العلامات الخلايا الجرثومية المذكورة أعلاه، كانت ملطخة البروتين Engrailed / Invected في قطاعات توسيع نطاق الجرثومية أيضا مع الأجسام المضادة 4D9 (الشكل 6). وهذا يدل على بروتوكول لدينا يمكن أن أساليب تطبيقها-المناعية بما في ذلك اللونية والفلورسنت فعال للإشارة إلى الكشف في كل سلالة الجرثومية والأنساب خلية جسدية في المن.

الشكل 1. عذري المن البازلاء لود. (A) A حورية الأولى الطور الناشئة من الإناث البالغات لود اللاجنسي. (B 12. يحتوي على ovariole على germarium في الطرف (الأسهم)، 1-2 البويضات، و5-7 غرف الجنينية. عادة ما ترتبط القناة الهضمية والفرس مع المبيضين تشريح. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2. توضيحات من الاستراتيجيات لتركيب الأجنة أولا بأول في مراحل مختلفة من التنمية. (A) لمحة عامة عن التطور الجنيني في ovariole تشريح من الإناث البالغات لود عذري. ويتبع oogenesis وجيزة (المرحلة germarial والمراحل 0-2) من خلال التطور الجنيني (المراحل 3-20). الخطوط العريضة للمرحلة التطور الجنيني: F ormation الوقود النووي من المخلوي الأريمة (المراحل 3-5)؛ تكون الأريمة (المراحل 6-7)؛ تكون المعيدة (المراحل 8-10)؛ استطالة الفرقة الجرثومية (مراحل 11-14)؛ katatrepsis (مراحل 15)؛ آخر katatrepsis والجرثومية الفرقة تراجع (مراحل 16-17)؛ توالد (مراحل 18-20). مفاتيح اللون هي في الجزء السفلي من هذا الرقم. (B، B ') Germarium ومراحل 0-10 الأجنة. لا يلزم جسر ساترة. (C، C ') مراحل 11-18 الأجنة. مطلوب جسر ساترة. (D، D ') مراحل 19-20 الأجنة. مطلوبة الجسور ساترة مزدوجة. يمكن المتداول الأجنة عن طريق تحريك ساترة خلق زوايا مختلفة من المراقبة. أحجام coverslips: 22 × 22 مم (B)، 18 × 18 مم (C) و (D). سمك coverslips: 0،13-0،16 مم. وجاء انطلاق الجنينية ميورا وآخرون ¹² المختصرات: ز: germarium. أولا: المرحلة.كوم / ملفات / ftp_upload / 53883 / 53883fig2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

. الشكل 3. بروتين K العلاج والمقارنة من الكواشف مع آثار حجب مختلفة الأمامي من الدوائر البيض على يسار. جميع الآراء الجانبية إلا الأجنة هو مبين في (B "، C، C")، والتي هي الظهرية. هي ملطخة أجنة باستخدام كل ApVas1 الأجسام المضادة (التخفيف 1: 500) وتوضع إشارات ApVas1 في غضون 10-20 ثانية. السهام تشير إلى موقع الخلايا الجرثومية. (A - C) الأجنة دون علاج بروتين K (PK). وتلتقط إشارات ApVas1 في الخلايا الجرثومية بالكاد. (A '- C، A "- C") مقارنة تلوين الخلفية في كتلة الأجنةرطة مع NGS وBSA (A '- C') وكاشف الحجب التجاري في غسل DIG وكتلة مجموعة العازلة (DIG-B) (A "- C"). يتم تخفيض الخلفية بشكل كبير في الأجنة هو مبين في (A "- C"). اختصار: ب: البكتيريا. أشرطة النطاق: 100 ميكرون الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

. الشكل 4. التقليل تلوين الخلفية مع الميثانول الأمامي من الأجنة إلى اليسار. جميع الآراء الظهرية. يتم التعامل مع الأجنة PK لزيادة نفاذية من الأجسام المضادة. السهام تشير إلى موقع الخلايا الجرثومية. (A، B، D، E) مقارنة العلاجاتمع بيروكسيد الهيدروجين (H _{2 O 2)} والميثانول. هي ملطخة الأجنة فقط مع الأجسام المضادة الثانوية. H _{2 O 2} العلاج (0.3٪ ث / ت، 10 دقيقة): خلفية عالية (A، D)؛ العلاج الميثانول (100٪، 60 دقيقة): خلفية منخفضة (B، E). (C، F) الضد الابتدائي تلطيخ على الأجنة تعامل مع الميثانول. شروط العلاج الميثانول مماثلة لتلك المستخدمة في الأجنة هو مبين في (B، E). الأجسام المضادة ApVas1 تسميات تفضيلي الخلايا الجرثومية الجنينية. أشرطة النطاق: 100 ميكرون الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5. المناعي تلطيخ على الأجنة المبكرة. (A، C - D) و 1: 500 في (B). (A) إشارات تلطيخ، والتي تشمل ApVas1، α تويولين، F-الأكتين، وDNA النووي، والكشف عنها باستخدام أربع قنوات مع أطوال موجية مختلفة. وتظهر مفاتيح لون الإشارات في الجزء السفلي من هذا الرقم. (B) DIC صورة من نتيجة اللونية للمقارنة. غير المخصب ApVas1 داخل germarium في حين أن شدة تباين توطين الخلفي من ApVas1 (السهام) في الجنين المرحلة 3 ليست واضحة كما هو موضح في (C، C). (C، C ') إثراء إشارات ApVas1 في الخلفية البيض. وتتعزز إشارات مترجمة إلى المنطقة الخلفية من القاعة البيض (السهام) من خلال صورة التراص. لأن الإشارات من F-الأكتين وα تويولين تحجب جزئيا تلك ApVas1 في الخلفية (C)، وهي الصورة التي تنتجها المسح واحد توجه هو مبين في (C '). (D - D '') باجتزاء متحد البؤر من ApVas1 المحلية في المنطقة الخلفية للجنين مرحلة 4. الصور المبينة في (D) و (D ') يتم الكشف عن ApVas1 في المياه السطحية وطائرات التنسيق المركزية، على التوالي. (D ") هي الصورة المدمجة لجميع أقسام من نفس الجنين كما (D) و (D ') المختصرات: مثل: أستر، FC، خلايا بصيلات؛ POC، البويضة المحتملين؛ س: المغزل، ح، الحبال الغذائية. أشرطة النطاق: 10 ميكرون الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 6. المناعية على شرائح الجنينية. ومنterior الغرف البيض على يسار. هي ملطخة الأجنة المعالجة PK مع الأجسام المضادة وحيدة النسيلة 4D9 ضد Engrailed / Invected، والتي يتم التعبير عنها في قطاعات الجنينية. وتظهر مفاتيح لون الإشارات في الجزء السفلي من هذا الرقم. (A، A ') المناعي تلطيخ على الجنين المرحلة 13. (A)، صورة مبائر مكدسة من صور Engrailed / Invected، α تويولين، F-الأكتين، وstainings DNA النووية. (A ') صورة متحد البؤر تبين تلطيخ Engrailed / Invected فقط. دون تدخل من الاشارات من القنوات الأخرى، يتم عرض إشارات أفضل. (B، C) اللونية تلطيخ على الأجنة في المراحل 13 و 17 من التنمية، على التوالي. (B) المرحلة 13 الجنين. (C) المرحلة 17 الجنين. من مراحل 13-17، وصفت الأعداد المتزايدة من قطاعات في البطن من قبل 4D9. (D) السيطرة السلبية (-Ctrl) وصمة عارفقط مع الأجسام المضادة الثانوية مترافق مع فلور اليكسا 633. تقريبا يتم الكشف عن أي إشارات المناعية على ovariole دون الأجسام المضادة الأولية جي. ومع ذلك، يتم الكشف عن تألق ذاتي من البكتيريا (خط شرطة) ضمن المرحلة 7 و 13 من غرف البيض في نانومتر الإثارة الطول الموجي 488. الاختصارات: A: البطن. ب: البكتيريا. H: الرأس. T: الصدر. أشرطة النطاق: 100 ميكرون الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

حددنا الظروف المثلى حاسمة لنجاح المناعية في البازلاء المن A. pisum، وهو الناشئة كائن نموذج للدراسات الجينية والتنموية ^3،15. الظروف الأمثل لزيادة نفاذية الأنسجة وتقليل تلوين الخلفية عززت كثافة ونوعية الإشارات. وهي تختلف عن البروتوكولات القياسية لالمناعية في النماذج الحيوانية الأخرى في خطوات إنشاء المسام في أغشية الخلايا ومنع الأجسام المضادة غير محددة ملزمة.

لالمناعية والتهجين في الموقع، بروتين K (PK) الهضم هي واحدة من النهج المشتركة لزيادة نفاذية الأنسجة ^16-19. في تلوين الأجسام المضادة من الأنسجة أولا بأول، وأظهرت نتائجنا أن: (1) الهضم PK زيادة كبيرة إشارات المناعية في الأجنة لود عذري خلال الجرثومية الفرقة التمديد (مراحل 11-14) (الشكل 3B ''، C '')، على الرغم منلا تزال الإشارات الضعيفة واضحة في الأجنة خالية من العلاج PK (الشكل 3B، C). وكان (2) الهضم PK اجب على الأجنة من katatrepsis فصاعدا (مراحل 15-20) (الشكل 4C، F والشكل 6C). للود الأجنة اللاجنسية قبل katatrepsis، من غير المرجح أن حجم الدوائر البيض سبب مشكلة الاختراق بسبب المناعية ناجحة في وقت مبكر الأجنة بيوض الجنسية المقيمين في البيض، التي وضعت تعادل تقريبا في حجم الأكثر نضجا اللاجنسي chamber- البيض لا يتطلب PK الهضم ^20. ولذلك، فإن التطويل وقابلة للطي من الفرقة الجرثومية (مراحل 11-14) في مساحة محدودة من الدوائر البيض اللاجنسي قد تعوق مدخل من الأجسام المضادة، وأنه هو PK التي تسمح للاختراق من الأجسام المضادة من خلال خلق المسام في أغشية الخلايا بين هياكل الجنينية التشويش. على النقيض من ذلك، وتمديد خط مستقيم من الفرقة الجرثومية في البيض الجنسية قد يفسر لماذا اتسخت أنه حتى فيغياب PK. إزالة المغلف المحي / المشيمه يمكن أيضا أن الأجنة بيوض الجنسية في متناول الأجسام المضادة. للأجنة بعد katatrepsis (مراحل 16-20)، والعلاج PK أمر ضروري لكلا نقرأ اللاجنسي والجنسي لأن الأجنة سميكة cuticled ¹⁹ (الشكل 4C، F والشكل 6C).

ومع ذلك، فإن حالة المقترحة لPK الهضم (1 ميكروغرام / مل لمدة 10 دقيقة) يتطلب مزيد من التعديل إذا نزاهة البنى الجنينية أو شدة الإشارات ليست مرضية. والسبب الرئيسي لذلك النشاط PK التي قد تختلف من دفعة لدفعة واحدة. على سبيل المثال، إذا تصبح الأنسجة الجنينية تضررت بعد PK الهضم، وتركيز PK يمكن تخفيضها إلى 0.5 ميكروغرام / مل. وبالمثل، إذا كثافة إشارة ضعيفة، ومن ثم أوصى بتمديد حضانة إلى 15-20 دقيقة. الأجنة الأكثر نضجا (المرحلة 20) تعرض للحضانة PK لفترات طويلة تصل إلى 20 دقيقة عند 1.0 ميكروغرام / مل تركيز، هاوالاصدار، وعادة عرض إشارات ضعيفة، مما يشير إلى أن PK الهضم هو لم تكتمل بعد. الهضم لفترات طويلة يمكن أن تعزز إشارات تلطيخ لكن هو اختياري، وخصوصا عندما أنماط التعبير الكشف في المرحلة 18 الأجنة مماثلة لتلك التي في مرحلة 20 الأجنة. في مقارنة مع الأجنة في مرحلة 20 من التنمية، المرحلة 18 الأجنة مع التشكل مماثلة ولكن مع كمية أقل من بشرة الجسم عموما يمكن أن تسفر عن كثافة إشارة أقوى.

خلال تنمية إشارة، تلوين الخلفية يمكن أن تكون مرتفعة من نشاط الانزيمات الذاتية التي يمكن أن تعبر تتفاعل مع ركائز. في الأجنة البازلاء أولا بأول، تم الكشف عن نشاط الفوسفاتيز القلوية الذاتية (AP) والغلوثانيون (POD)، وكلاهما تقارن الأجسام المضادة مشتركة لهضم ركائز الإشارة. النشاط هيدرولاز من AP الذاتية يمكن قمعها بشكل فعال في جميع أنحاء مرحلة التطور الجنيني من قبل الليفاميزول (لا تظهر البيانات). ومع ذلك، وعلاج الأجنة مع 0،3-0،6٪ hydrogأون بيروكسيد (H _{2 O 2)} يمكن أن تقضي فقط على النشاط POD الذاتية قبل katatrepsis ولكنه لم يكن كافيا لأجنة القديمة (الشكل 4A، D). حضانة الميثانول، وهو نهج بديل لتغيير طبيعة البروتينات الذاتية، وقد أثبتت أن تكون فعالة في المن ²¹ (الشكل 4B، E). على عكس H _{2 O 2،} الامر الذي يسيء أولا بأول الأنسجة أثناء حضانة طويلة من 30 دقيقة أو أكثر، والميثانول لا الهضم أو تشوه الأجنة أثناء أي مرحلة من مراحل التنمية (الشكل 4C، F). ونتيجة لذلك، والميثانول هو أفضل بديل لقمع النشاط POD الذاتية في الأجنة أولا بأول. إذا تم الكشف عن تلوين الخلفية المتبقية، والتي عادة ما يحدث للأجنة ناضجة مع طبقة سميكة من إهاب، O / N الحضانة في الميثانول في 4 درجات مئوية وفقا لتجربتنا، يمكن زيادة خفض النشاط POD الذاتية.

تم الكشف عن تلوين الخلفية المتبقية فيالأجنة سدت مع البروتينات في الدم مثل المصل العادي حمار (NDS)، مصل الماعز العادي (خ ع)، ألبومين المصل البقري (BSA)، أو الخلائط ¹³ (الشكل 3A'-C '). اعتماد كاشف حظر توريدها تجاريا المستخدمة في التهجين في الموقع، على النقيض من ذلك، يمكن أن الخلفية المتبقية خلال المناعية يكون بشكل ملحوظ القضاء على ⁵ (الشكل 3A '' - C ''). على الرغم من أن مكونات كاشف الحجب هي الملكية، فإنه من المرجح يحتوي على البروتينات غير المصل التي يمكن أن تسد الحواتم غير محددة من البروتينات البازلاء أولا بأول. كما عملت على عرقلة كاشف أفضل بكثير من الأمصال الحيوانية في الأخضر الخوخ أولا بأول Myzus بيرسيكا. وبالمثل، في M أدى الهضم بيرسيكا PK والميثانول حضانة في اختراق الأجسام المضادة مرضية والحد من الخلفية - مماثل لتحسين النتائج التي تحققت في A. pisum (لا تظهر البيانات). نتوقع أن الظروف optimizإد لزيادة نفاذية الأنسجة وتقليل الخلفية، ما إذا كان أحد يستخدم تلطيخ مولد اللون أو مضان، سيتم تطبيقها على العديد من أنواع المن الأخرى.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% hydrogen perxidase (H2O2)	Sigma-Aldrich	18304	For bleaching endogenous peroxidase of embryos.
4’6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542	For labeling the double-strand DNA. TOXIC. Wear gloves, dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure
4D9 anti-engrailed/invected mouse monoclonal antibody	Developmental studies hybridoma bank	AB_528224	For labeling the developing segments of embryo.
ApVas1 rabbit polyclonal antibody	Our laboratory	N/A	For labeling the aphid germline specific Vas1 protein in embryos. This antibody was made by our laboratory.
Austerlitz Insect pins	ENTOMORAVIA	N/A	For seperating each egg chambers from an ovariole. Size 000, BLACK ENAMELLED.
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	9048-46-8	For blocking the non-specific binding of antibodies.
Camera connted to compound microscope	Canon	EOS 5D	For photographing of aphid embryos.
Colorimetric 8 cell tray	Kartell Labware	357	For developing the staining signal of aphid embryos. Diameter 95 x 57 mm, cell depth 2 mm.
Compound microscope with DIC optics	Leica Microsystems	DMR	For photographing of aphid embryo mounted on the slides.
DIG Wash and Block Buffer Set	Sigma-Aldrich (Roche)	11585762001	For blocking the non-specific binding of antibodies. We diluted the 10x Blocking solution into 1x as blocking reagent.
Forceps	Ideal-tek	N/A	For dissection of ovaries from aphids. Manufacturer part No 5: 5 SA.
Glass dropper	N/A	N/A	For transfering ovaries of aphids from the splot plate to tubes. 150 mm of total length and 5 3/4" of tip length.
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	For clearing of aphid embryos and mounting.
Glycine	Bioshop	N/A	For blocking the enzyme activity of proteinase K (PK).
Goat anti-mouse IgG conjugated Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11017	For detection of primary antibody from mouse.
Goat anti-rabbit IgG conjugated Alexa Fluor 633	Invitrogen	A21072	For detection of primary antibody from rabbit.
Intelli mixer	ELMI laboratory equipment	RM-2M	For improving the thorughly reaction of reagents with ovaries.
Laser-scanning confocal microscopy	Leica Microsystems	SP5	For photographing of aphid embryo mounted on the slides with florecent tag.
methanol	Burdick and Jackson	AH2304	For bleaching endogenous peroxidase of embryos.
Microscope slides	Thermo scientific	10143560	For mounting of embryos. SUPERFROST ground edges, ca./env. 76 x 26 mm.
Microscope Cover glasses	Marienfeld	0101030	For mounting embryos on the slides. Size 18 x 18 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
Microscope Cover glasses	Marienfeld	0101050	For mounting embryos on the slides. Size 22 x 22 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
mouse monoclonal anti-alphaTubulin antibody (DM1A)	Santa Cruz Biotechnology	sc-32293	For labeling the distrbution of alpha-tubulin of cells.
Nail polish	N/A	N/A	For sealing the coverslips on the slides.
Normal goat serum (NGS)	Sigma-Aldrich	G9023	For blocking the non-specific binding of antibodies.
Paraformaldehyde (PFA)	VWR	MK262159	For fixation of aphid ovaries.
Phalloidin-TRITC	Sigma-Aldrich	P1951	For labeling the distrbution of F-actin on embryos.
Phosphate-buffered saline (PBS)	N/A	N/A	As isotonic solution for aphid ovaries.
Plastic dropper	N/A	N/A	For transfering ovaries of aphids from tube to cell tray. Size 3 ml.
Proteinase K	Merck	124678	For creating pores (punching) on the cell membrane and facilitating the access of antibodies.
Pyrex spot plate	N/A	N/A	For dissection and color reactions of aphid ovaries under microscopy. Each cavity with diameter 22 mm and  depth 7 mm.
SIGMAFAST 3,3’-diaminobenzidine (DAB) tablets	Sigma-Aldrich	D4168	For developing of substrated signals. Also called DAB peroxidase substrate tablet set.
Stereo microscope	Leica Microsystems	EZ4	For dissection and observation of aphid ovaries.
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	T8787	For creating pores (punching) on the cell membrane.
VECTASHIELD Elite ABC Kit (Rabbit IgG)	Vector laboratories	PK-6101	For enhancement of the signal. Including of biotinylated goat anti-rabbit IgG secondary antibody, A and B reagents.
VECTASHIELD mounting medium	Vector laboratories	H1000	For clearing of aphid embryos and mounting.