Identifiering av kritiska förhållanden för immunfärgning i Pea Aphid embryon: Öka Tissue Permeabilitet och Minska bakgrundsfärgning

Abstract

Ärter bladlössens Acyrthosiphon pisum, med en sekvense genomet och riklig fenotypisk plasticitet, har blivit ett växande modell för iska och utvecklingsstudier. Liksom andra bladlöss, A. Pisum propagera snabbt via partenogenetiska viviparous reproduktion, där embryona utvecklas inom ägg kamrar i en församling-line mode i ovariole. Tidigare har vi etablerat en stark plattform av hela montera in situ hybridisering möjliggör detektion av mRNA uttryck i bladlöss embryon. För att analysera uttrycket av protein, men etablerade protokoll för immunfärgning av ovarioles av asexuella viviparous bladlöss inte tillfredsställande resultat. Här rapporterar vi villkor optimerade för att öka vävnads permeabilitet och minska bakgrundsfärgning, som båda var problem vid tillämpningen etablerade metoder. Optimeringar inkluderar: (1) inkubation av proteinas K (1 pg / ml, 10 min), som konstaterades väsentliga feller penetration antikropp i mitten och sena skede bladlöss embryon; (2) utbyte av normalt getserum / bovinserumalbumin med en blockeringsreagens som tillhandahålls av en Digoxigenin (DIG) -baserade buffert in och (3) Tillämpningen av metanol istället väteperoxid (H ₂ O ₂₎ för blekning av endogen peroxidas; vilket avsevärt minskade bakgrundsfärgning i bladlöss vävnader. Dessa kritiska förhållanden är optimerade för immunfärgning kommer möjliggöra en effektiv detektion av genprodukter i embryon från A. Pisum och andra bladlöss.

Introduction

Bladlöss är hemipteran insekter med små (1-10 mm) mjuka kroppar. De livnär sig på växter genom att suga phloem saven med piercing mundelar. Dessutom förlitar de sig på en obligat endosymbiotisk bakterie, Buchnera aphidicola att syntetisera essentiella aminosyror som har brist på floemet sav kost. Bladlöss har en komplex livshistoria som inkluderar partenogenetiska viviparous reproduktion under våren och sommaren lång dag fotoperioder och sexuella oviparous reproduktion utlöses av kort dagars fotoperioder under vilka de lägger ett begränsat antal övervintrande ägg ^1,2. Under våren dessa ägg kläcks att producera den första generationen av all-kvinnliga bladlöss (fundatrices), efter många rundor av partenogenetiska reproduktion fram till hösten. Den cykliska partenogenes i bladlöss, där asexuella och sexuella faser alternerar i den årliga livscykeln, har ansetts som en evolutionär nyhet ^1,2. I partenogenetiska viviparous bladlössSker embryo rum inom ägg kamrar äggstocks tubuli (ovarioles). Däremot sexuella oviparous embryon utvecklas i de befruktade äggen. Bortsett från reproduktiv plasticitet, kan bladlöss visa transgenerational vinge polyphenism: som svar på överbeläggning signaler och rovdjur hot, kan unwinged asexuella honor viviparously producerar bevingade avkomma till långväga migration. Offentliggörande av genomsekvens av ärt aphid Acyrthosiphon pisum -Den första genomsekvensen för en basal hemimetabolous insekts möjliggör ytterligare utforskning av reproduktiv plasticitet, vinge polyphenism och andra funktioner, inklusive insektsväxtinteraktioner, viral vectoring och symbios i bladlöss på molekylär grundval ^3.

Förutom det sekvense genomet, är verktyg för att karakterisera genuttryck och funktion som krävs för att främja ärta aphid som en mogen modellorganismen ^4. Vi har beskrivit robusta protokoll av hel-mount 5-7. RNA-interferens (RNAi) via dubbelsträngat RNA injektion och utfodring har använts för geners uttryck i bladlöss nymfer och vuxna, men stabila villkor för gen knockdown i embryona har ännu inte redovisats ^8-10. Immunofärgning, en antikroppsbaserad metod som kan detektera proteinuttryck i prover före och efter RNAi knockdown, har utförts på ärt bladlöss embryon ^11-13. Men ökningen av vävnad permeabilitet och eliminering av bakgrundsfärgning är ännu otillfredsställande användning av standardprotokoll för immunofärgning i asexuella tång embryon av ärter aphid. Till exempel, fann vi att penetration av antikroppar till vävnaderna minskade gastrulating embryon (stegen 8-10) och att embryon med morfologiskt identifierbara lem knoppar (stegen 13-14) var knappt genomtränglig för antikropp. Dessutom har bakgrundsfärgning visualiseras i asexuell viviparous ärt bladlöss embryon färgas med användning av antikropp mot germline markör Vasa liksom den mot engrailed / Invected protein uttryckt i de embryonala segmenten ^12,13. Egentligen bakgrundsfärgning var fortfarande tydligt i embryon färgade med den sekundära antikroppen ensam.

För att öka permeabilitet utan att skada integriteten i bladlöss vävnader, titreras försiktigt vi koncentrationen av proteinas K och bestäms optimala betingelser för vävnads uppslutning på bladlöss embryon. För att undvika icke-specifik färgning i ärt bladlöss, vi sökte för föreningar som effektivt kan blockera embryon och undertrycker aktiviteten av endogen peroxidas (POD), ett enzym som används för att förstärka signaler under immunfärgning. En blockerande reagens tillhandahålls av en digoxigenin (DIG) -baserad buffertsatsen, snarare den traditionellt använda normalt getserum (NGS) / bovint serumalbumin (BSA), reducerad bakgrundsfärgning väsentligt. Dessutom tillsattes metanol befunnits inhibet den endogena POD-aktivitet mer effektivt än väteperoxid (H ₂ O _2). Närmare uppgifter om dessa bladlöss specifika villkor för immunfärgning på embryon kommer att beskrivas i de följande avsnitten.

Protocol

1. Odling av bladlöss

OBS:. Laboratoriet stam av partenogenetiska tång ärt bladlöss A pisum ursprungligen samlades in i den centrala Taiwan och har fötts upp på värdväxter (trädgården ärter Pisum sativum eller bondbönor Vicia faba) under lång dag fotoperiod för mer än 300 generationer (en generation: ~ 10 dagar).

1. Groning av frön
   1. Blöt frön av värdväxter i kranvatten i 3-5 dagar vid RT. Fyll på med färskt vatten en gång per dag.
      OBS: Alternativt kan sätta frön av värdväxter rakt in fuktig jord framkalla groning också.
   2. Grow 10 groende frön i en liten kruka (9 cm diameter x 7 cm) med jord i tillväxtkammare under fotoperiod 16 timmar ljus / 8 h mörker vid 20 ° C.
   3. Cirka 10 dagar efter tillväxt börjar överföra bladlöss på växter vars höjd är mer än 8 cm.
2. Överföring av bladlöss Håll varje pott av växter inom en 1 L glasbägare, överföra 8 vuxna bladlöss på anläggningar som använder en pensel, och sedan försegla bägaren med ett luftgenomträngligt omslag såsom gasbinda nät för att förhindra bladlöss från att fly.
3. Inkubera bladlöss i en tillväxtkammare under fotoperiod 16 timmar ljus / 8 h mörker vid 20 ° C. Vatten potten varje planta av växter en gång varje dag.
4. För erhållande av nästa generation av bladlöss, upprepar steg 1.1.3-1.2.2 tio dagar efter den primära aphid överföring.

2. Dissekering och Fixering av ovarier

1. Färskt förbereda 4% paraformaldehyd (PFA) i 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) som fixeringsbuffert.
2. Fyll en brunn i en provplatta med PFA (ca 500 l), placera plattan under ett stereomikroskop vid låg förstoring, och dränka en vuxen aphid inom PFA för dissekering.
3. Dissekera äggstockar genom att hålla huvudet och buken med en uppsättning av tång, klippa upp ryggnagelband av buken, och dra äggstockarna bort från bukhålan.
4. Fix tre par äggstockar i en 1,5 ml rör innehållande 1 ml av PFA vid RT under 20 minuter.
5. Dekantera fixeringsbuffert med en överföringspipett (antingen glas eller engångs) och sedan tvätta äggstockar med 0,2% TritonX-100 i 1 x PBS (PBST) 3 gånger i 10 min vardera. Mild skakning på en mixer / rotator (vridningsvinkel: 60 ° (F60) / rotationshastighet: 8 RPM) rekommenderas för både fixering och tvättning.

3. Behandling med Proteinas K (PK) för att öka permeabiliteten av embryonala vävnader

OBS: PK behandling tillämpas på embryon från groddar band förlängning framåt (steg 11 utvecklings). För yngre embryon, är detta steg som tillval.

1. Seriellt utspädd stamlösningen av PK (10 mg / ml) med 1 x PBS till arbetskoncentration 1 pg / ml.
2. Inkubera äggstockar med en ^ g / ml av PK (ca 500 | j, l) under 10 minuter med mild skakning.
3. Dekantera PK solutipå och sedan tvätta äggstockarna med 700 | il glycin (2 mg / ml) 3 gånger under 5 minuter vardera.
4. Tvätta äggstockar med 0,2% PBST två gånger under 10 min vardera.
5. Fix äggstockar igen med fixeringsbuffert under 15 min vid RT med mild skakning.
6. Kassera supernatanten och tvätta äggstockar med 0,2% PBST två gånger under 10 min vardera.

4. Metanol Inkubation för att undertrycka den endogena peroxidas (POD) aktivitet

OBS: Metanol inkubation tillämpas inte på embryon som utsatts för Phalloidin färgning eller antikropps epitoper som är metanol känsliga.

1. Serie dehydratisera äggstockar med annan procentsats av metanol i 0,2% PBST (volym / volym: 1: 3, 1: 1, 3: 1) genom att inkubera äggstockar vid varje koncentration av metanollösning under 10 min med försiktig omröring.
2. Torka äggstockar med 100% metanol under 1 h vid RT med mild skakning.
   OBS: Tillfredsställande resultat av färgning kan fortfarande erhållas från bladlöss vävnader som lagrats på 100% metanol vid -20 &# 176; C under en månad.
3. Serie rehydrera äggstockar med annan procentsats av metanol i 0,2% PBST (volym / volym: 3: 1, 1: 1, 1: 3) genom att inkubera äggstockar vid varje koncentration av metanollösning under 10 min med försiktig omröring.

5. Antikropp färgning

1. Späd 10x blockeringslösningen från DIG-baserade buffert set (DIG-B) till 1x.
   OBS: 1x DIG-B-blockerande lösningen är mer effektiv för att reducera färgning bakgrunden än standard blockeringsreagens bestående av 5% (volym / volym) normalt getserum (NGS) och 0,5% (volym / volym) bovint serumalbumin (BSA ) i 0,2% PBST.
2. Inkubera äggstockarna med 1x DIG-B-blockerande lösningen för 2,5 till 4 timmar vid rumstemperatur eller O / N vid 4 ° C med mild skakning.
   OBS: För tre par äggstockar i ett 1,5 ml rör, 200 ^ är den minimivolym för prov blockering och antikroppsfärgning.
3. Dekantera supernatanten och ersätta med färsk 1x DIG-B blockerande lösning innehållande primär antikropp vid lämplig dilutipå förhållandet. Fläck äggstockarna för fyra h vid RT eller O / N vid 4 ° C med mild skakning.
   OBS: För experimentet som beskrivs här, använda följande optimala utspädningar av primära antikroppar: (1) ApVas1 antikropp: 1: 500 för kromogena färgning, 1:50 för immunofluorescensinfärgning; (2) anti-α-tubulin antikropp: 1: 500; (3) 4D9 monoklonal antikropp: 01:25.
4. Tvätta äggstockar med 0,2% PBST 4 gånger under 15 minuter vardera.
5. Inkubera äggstockar med 1x DIG-B-blockerande lösningen under 1 h vid RT med mild skakning.
6. Dekantera supernatanten och ersätta med färsk 1x DIG-B blockerande lösning innehållande sekundär antikropp vid lämplig utspädningsfaktor. Fläck äggstockarna för fyra h vid RT eller O / N vid 4 ° C med mild skakning.
   1. Använd följande utspädningsförhållanden av sekundära antikroppar: (1) För immunofluorescensinfärgning: 1: 500 för Alexa Fluor 633 get anti-kanin IgG eller Alexa Fluor 488 get-anti-mus-IgG; (2) För kromogent färgning: 1: 200 för biotinylerat get anti-kanin IgG.
      OBS: Den biotinylerade sekundära antikroppen appliceras för att interagera med avidin-biotin-komplex (ABC) i substratet baserade (kromogen) detektion, genom vilket färgningssignalerna avsevärt förstärks.
   2. För immunofluorescensinfärgning utföra färgning i mörker eftersom den sekundära antikroppen är ljuskänsligt.
7. Tvätta sekundär antikropp med 0,2% PBST 4 gånger under 10 min vardera.

6. Kärn- och F-aktin färgning

OBS: Detta är endast ansökt om immunofluorescensinfärgning.

1. Stain äggstockar med 0,2% PBST innehållande DAPI (2 ng / ul) och Phalloidin-TRITC (100 nM) under 2 timmar vid rumstemperatur i mörker.
2. Tvätta äggstockar med 0,2% PBST 4 gånger under 10 min vardera.
3. Inkubera äggstockar med monteringsmedel O / N vid 4 ° C med mild skakning.

7. Signal utveckling

OBS: Detta är endast ansökt om kromogena färgning.

1. Bered 100 plreagens avidin-biotin-komplex (ABC) för att öka signalerna genom att tillsätta 1 il Reagens A (avidin) i 98 pl av 0,2% PBST, blanda omsorgsfullt genom försiktig pipettering, och tillsätta 1 pl reagens B (biotin konjugerat med pepparrotsperoxidas ), följt av omedelbar blandning. Inkubera blandningen i 30 min vid RT med mild skakning.
2. Inkubera äggstockar (inklusive disassocierade ägg kammare) i blandningen av reagens A och B för 30 min vid RT med mild skakning.
3. Tvätta blandningen av reagens A och B med 0,2% PBST 4 gånger under 10 min vardera.
4. Överför äggstockar nedsänkta i PBST till en brunn på plats plattan med en plast pipett.
5. Bered substratlösning av 3,3'-Diaminobenzidine (DAB): lös en DAB-tablett plus ytterligare en innehållande ureaväteperoxid i en ml DDH ₂ O via kraftig vortexning under 1 minut.
   OBS: DAB, en utfällande substrat av peroxidas, är en populär kromogen för immunfärgning. Det ger en bregen och olöslig fällning efter att oxideras av peroxidas. Svaga signaler kan förstärkas genom tillsats av nickelklorid till substratlösningen (slutlig koncentration 0,05-0,08%).
6. Ta bort PBST lösningen kvar i brunnen och fyll på med 100 pl av DAB substratlösningen för signalutveckling.
7. Övervaka intensitet signaler under ett stereomikroskop med låg förstoring.
8. Stoppa reaktioner genom avlägsnande av DAB-lösning, följt av påfyllning med 1 x PBS omedelbart. Upprepa tvätta två gånger.
9. Överför äggstockar tillbaka till 1,5 ml rör och tvätta sedan med 1x PBS eller PBST två gånger under 15 minuter vardera.
10. Inkubera äggstockar i en glycerolbaserat monteringsmedium (70% glycerol) O / N vid 4 ° C med mild skakning.

8. Montera Aphid Embryon

OBS: Tjockleken på bladlöss embryon varierar mellan utvecklingsstadier. Monterings strategier därför ändras för att passa tidigt (germaria och iscensätter 0-10), mitten (steg11-18), och sen embryon (stadier 19-20), som visas i figur 2B - D. Embryonala staging följde Miura et al. ¹²

1. Överför äggstockar tillsammans med monteringsmedium till cellfacket med en plastdroppanordning och observera prov under ett stereomikroskop med låg förstoring.
2. Skär calyces i samband med den laterala äggledaren med hjälp av insekter stift och sedan överföra en isolerad ovariole till ett tomt glas väl med en pipett. Späd den slutliga volymen till 50-100 pl använder monteringsmedel.
3. Överför en ovariole på bilden med ett glas pipett och sedan dissekera ägg kammare med hjälp av insekter stift.
   OBS: För embryon äldre än etapp 6 av utveckling, separation av ägg kamrar föreslås; för germaria och de första två ägg kamrar yngre än etapp 6, är separation tillval.
4. Flytta en dissekerade ägg kammaren till ett rent objektglas med hjälp av en glas pipett.
5. Placera en täck (storlek: 22 x 22mm) över dissekerade germaria eller ägg kamrar (innehållande embryon vid steg 1-10 utveckling) långsamt för att undvika bubblor.
   1. Mount ägg kamrar (innehållande embryon vid steg 11-18 av utveckling) på en bild med ensidig täck bron och placera en annan täck (storlek: 18 x 18 mm) ovanpå provet.
   2. Mount ägg kamrar (innehållande embryon äldre än etapp 19 utvecklings) på en bild med dubbelsidig täck bron och placera en annan täck (storlek: 18 x 18 mm) ovanpå provet.
6. Fylla utrymmet under topptäckglas med monteringsmaterial för att undvika torkning av provet.
7. Svagt rulla embryot genom att skjuta täck att få rätt orientering för observation.
8. Täta runt kanten på täckglas (inklusive bryggtäckglas) med nagellack.

9. bildanalys

1. Fotografera differential interferens kontrast (DIC) bilder av hela montera embryon med en compound mikroskop utrustat med DIC optik och en torr objektivlins (10X, 20X, 40X) som är ansluten till en kamera. Installera programvaran för bildöverföring mellan kameran och datorn med hjälp av tillverkarens instruktioner.
2. Förvärva projektionerna av de fluorescerande embryon med en laserskanning konfokalmikroskop ^14. Följ tillverkarens anvisningar för fotografering, z-stapling och 3D skjuter med bildbehandlingsprogram.
   1. Vänd bilden upp och ned, hitta den monterade provet med 10X objektiv och cirkel provet med en fin oljad baserad penna.
      OBS: Detta gör att identifiera provet lättare när du söker efter det genom mål av konfokalmikroskop.
   2. Tillsätt en droppe olja på toppen av täckområde vars motsatt sida är märkt enligt beskrivningen i 9.2.1.
3. Hitta fokalplanet vid 40X oljeimmersionsobjektiv ändras sedan till en 63x oljeimmersionsobjektiv. Flytta manuellt fina fokusstyrning upp och görawn att fånga de bästa fokalplanet.
   OBS: För att observera strukturella detaljer om germaria och tidiga embryon, föreslår vi att du använder 40X mål eller de med högre förstoring.
4. Skanna embryot i olika exciterings kanaler och få en z-stack bilden.
   OBS: För ärt bladlöss vävnader, minska tjockleken hos varje optisk sektion ner till 1,5 pm eller mindre.

Representative Results

I denna studie genomförde vi hela-mount immunfärgning på embryon av asexuella ärt bladlöss (Figur 1A). Dessa honor producera avkomma parthenogenetically och viviparously. Dessa kvinnliga embryon utvecklas inom ägg kamrar äggstocks tubuli (ovarioles) (Figur 1B och figur 2A). Före mikroskopi, dissekerade ovarioles är färgnings mål; dock krävs separation av ägg kammare för observation av embryon under ett mikroskop (Figur 2B - D).

Ökning av vävnad permeabilitet

Proteinase K (PK) behandling är en standardiserad metod för att förbättra vävnads permeabilitet, men för embryon från vissa modellorganismer-såsom Caenorhabditis elegans (nematod), Drosophila melanogaster (fluga), och Danio rerio (steg zebrafisk) -Detta är valfritt. I ärt bladlöss, är kravet på PK behandlingssteg beroende: för germaria och embryon före gastrulation (stadier 0-7), kan PK behandling utelämnas; men för embryon enligt germband förlängning (steg 11) eller i senare skeden detta steg rekommenderas starkt. Till exempel, under mitten av embryosignaler var knappt detekteras i embryon utan PK behandling (fig 3A - C). Däremot var signalintensiteten avsevärt förbättrad med embryon som utsatts för PK rötning (Figur 3A "- C, A" - C ").

Reduktion av bakgrundsfärgning

En hög nivå av endogen peroxidasaktivitet (POD) aktivitet identifierades i de embryonala vävnaderna hos bladlöss. För att undertrycka denna enzymaktivitet, var paraformaldehyden fixerade embryon inkuberades i närvaro av hyDrogen peroxid _{(H2O 2),} ett vanligt reagens för oxidationen av POD. Våra resultat visade att H _{2 O 2} behandling inte undertrycka aktiviteten av endogen POD effektivt i slutskedet embryon (Figur 4A, D). Däremot har bakgrundsfärgning i hög grad reduceras med embryon utsätts för metanol inkubation (Figur 4B, C, E, F). Före tillämpning av de primära embryona antikropps blockerades i lösning innehållande NGS och BSA, såsom beskrivits i standardprotokoll för antikroppsfärgning. Emellertid kvarvarande bakgrundsfärgning i bladlöss embryon upptäcktes (Figur 3A '- C). Problemet löstes efter byte NGS / BSA med blockeringsreagens som tillhandahålls av en buffert set för DIG-märkningsexperiment såsom in situ hybridisering (figur 3A "- C"). Vi drar slutsatsen således att efter fixering med metanol och inkubation med DIG-Bblockeringsreagens är både avgörande för att minska bakgrundsfärgning i bladlöss embryon.

PK behandling och DIG-B blockeringsreagens krävs inte bara för effektiv signal upptäckt med hjälp av de kromogena men också fluorescerande metoder. Aktin färgning med phalloidin eller färgning för metanol känsliga epitop, dock inte fungerar i embryon som utsatts för pre-fixering med metanol, som kan förstöra den nativa formen av aktin eller antikroppar. Följaktligen bör denna behandling undvikas när du utför fluorescensimmunfärgning. Bortsett från att eliminera metanol behandlingsstegen immunofluorescens tillåter multi-märkningsexperiment i bladlöss embryon. Med användning av konfokalmikroskopi, till exempel, kan ärt bladlus Vasa1 protein (ApVas1) i könsceller, α-tubulin i mikrotubuli, F-aktin i mikrofilament, och DNA i kärnor vara samtidigt märkta och visualiseras (figur 5A, C). I jämförelse med chromogenic metod (figur 5B), konfokal sektionering av fluorescerande prover ger bättre upplösning av lokala signaler som ApVas1 i arvsmassa och cellularizing könsceller i början av bladlöss embryon (figur 5C, D - D "). om antagande av villkoren för märkning könsceller som beskrivits ovan engrailed / Invected protein i delar av den utsträckta grodden bandet var även färgas med antikroppen 4D9 (Figur 6). Detta visar att våra protokoll för immunfärgning-inklusive kromogena och fluorescerande metoder, kan tillämpas effektivt för att signalera upptäckt i både nedärvda och somatiska cellinjer i bladlöss.

Figur 1. partenogenetiska viviparous ärt bladlöss. (A) En första stadiet nymf som kommer från en asexuell viviparous kvinnlig vuxen. (B 12. En ovariole innehåller en germarium i spetsen (pilar), 1-2 ägg, och 5-7 embryonala kammare. Tarmen och cauda är vanligtvis förknippas med dissekerade äggstockar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2. Illustration av strategier för montering bladlöss embryon vid olika utvecklingsstadier. (A) Sammanfattning av embryonal utveckling i ovariole dissekerade från en partenogenetiska viviparous kvinnlig vuxen. Kort oogenes (germarial scenen och steg 0-2) följs av embryogenes (steg 3-20). Disposition av embryogenes: f ormation av syncytial BLASTODERM (stadier 3-5); blastulation (steg 6-7); gastrulation (steg 8-10); töjning av groddar band (stegen 11-14); katatrepsis (steg 15); post katatrepsis och groddar band indragnings (stegen 16-17); organogenesen (iscensätter 18-20). Färg nycklar är i botten av figuren. (B, B ') Germarium och stadier 0-10 embryon. Ingen täck bro behövs. (C, C ') Stages 11-18 embryon. Ett täckglas bro krävs. (D, D ') Stages 19-20 embryon. Dubbla täck broar krävs. Rullande embryon genom att skjuta täck kan skapa olika vinklar observation. Storlekar av täck: 22 x 22 mm i (B), 18 x 18 mm i (C) och (D). Tjockleken på täck: 0,13 till 0,16 mm. Embryonala staging följde Miura et al ¹² Förkortningar: g:. Germarium; st: skede..com / filer / ftp_upload / 53883 / 53883fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

. Figur 3. Proteinas K-behandling och jämförelser av reagens med olika blockerande effekter Anterior av ägg kamrar är till vänster; alla vyer är lateralt förutom embryon som visas i (B ", C ', C"), som är dorsalt. Embryon alla färgas med ApVas1 antikropp (spädning 1: 500) och signaler från ApVas1 utvecklas inom 10-20 sekunder. Pilspetsar indikerar placeringen av könsceller. (A - C) Embryon utan behandling av proteinas K (PK). ApVas1 signaler i könsceller knappt upptäcks. (A "- C, A" - C ") Jämförelse av bakgrundsfärgning i embryon blockked med NGS och BSA (A '- C') och av den kommersiella blockerande reagens i DIG Wash och Block Buffer Set (DIG-B) (A "- C"). Bakgrund minskar avsevärt med embryon som visas i (A "- C"). Förkortning: b: bakterier. Skala barer:. 100 pm klicka Vänligen här för att se en större version av denna siffra.

. Figur 4. Minimera bakgrundsfärgning med metanol Anterior av embryon är till vänster; alla åsikter är rygg. Embryon behandlas med PK för ökning permeabilitet av antikropp. Pilspetsar indikerar placeringen av könsceller. (A, B, D, E) Jämförelse av behandlingarmed väteperoxid (H ₂ O ₂₎ och metanol. Embryon endast färgas med sekundär antikropp. _{H2O 2} behandling (0,3% vikt / vol, 10 min): hög bakgrund (A, D); metanol behandling (100%, 60 min): låg bakgrund (B, E). (C, F) Primär antikropp färgning på embryon som behandlats med metanol. Villkor metanol behandling är identiska med de som används för embryon som visas i (B, E). Den ApVas1 Antikroppen märker företrädesvis embryonala könsceller. Skala barer:. 100 pm klicka Vänligen här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5. Immunofluorescens färgning på tidiga embryon. i (A, C - D) och en: 500 i (B). (A) Färgning signaler, som omfattar ApVas1, α-tubulin, F-aktin och nukleärt DNA, detekteras med hjälp av fyra kanaler med olika våglängder. Färg nycklar signaler visas längst ner i figuren. (B) DIC bild av ett kromogent resultat för jämförelse. ApVas1 anrikas i germarium medan kontrastintensitet bakre lokalisering av ApVas1 (pilspetsar) i scenen-3 embryo är inte lika tydlig som den som visas i (C, C). (C, C) Anrikning av ApVas1 signaler i ägget posterior. Signaler lokaliserade till den bakre regionen av ägget kammaren (pilhuvuden) förbättras genom bild stapling. Eftersom signaler av F-aktin och α-tubulin mask delvis de av ApVas1 i den bakre (C), en bild som alstras av enkelkanalavsöknings visas i (C). (D - D '') Confocal sektionering av ApVas1 lokaliserad i den bakre regionen av scenen-4 embryo. Bilder visas i (D) och (D) är ApVas1 detekteras i ytan och centrala fokalplan, respektive. (D ") är den sammanslagna bilden av alla sektioner från samma embryo som (D) och (D) Förkortningar: som: aster, fc, follikelceller, poc, blivande äggcellen, sp. Spindel, tc, trofiska sladdar. Skala barer:. 10 pm klicka Vänligen här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6. Immunofärgning på embryonala segment. Eninteriöra av ägg kamrar är till vänster. PK-behandlade embryon färgas med den monoklonala antikroppen 4D9 mot engrailed / Invected, som uttrycks i embryonala segment. Färg nycklar signaler visas längst ner i figuren. (A, A ') Immunofluorescens-färgning på en scen-13 embryo. (A), ett konfokalt bild staplade från bilder av engrailed / Invected, α-tubulin, F-aktin, och nukleära DNA färgningar. (A ') ett konfokalt bild som visar färgningen av engrailed / endast Invected. Utan inblandning av signaler från andra kanaler, är signalerna bättre visas. (B, C) ​​Kromogent färgning på embryon vid steg 13 och 17 i utveckling, respektive. (B) Steg-13 embryo. (C) Steg-17 embryo. Från stegen 13-17, är det växande antalet segment i buken märkt av 4D9. (D) Negativ kontroll (-Ctrl) fläcking endast med sekundär antikropp konjugerad med Alexa Fluor 633. Nästan inga immunfärgning signaler upptäcks på ovariole utan primär antikropp. Emellertid är autofluorescens av bakterier (streckad linje) inom stadium 7 och 13 över egg kammare detekteras vid excitationsvåglängden 488 nm. Förkortningar: A: buken; b: bakterier; H: head; T: bröstkorgen. Skala barer:. 100 pm klicka Vänligen här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Vi identifierade optimala förhållanden avgörande för framgångsrik immunfärgning i ärt bladlöss A. Pisum, en framväxande modellorganism för iska och utvecklingsstudier ^3,15. Optimerade betingelser för att öka vävnads permeabilitet och minska bakgrundsfärgning ökat intensiteten och specificitet signaler. De skiljer sig från standardprotokoll för immunfärgning i andra djurmodeller i stegen för att skapa porer i cellmembran och blockera icke-specifik antikroppsbindning.

För immunfärgning och in situ hybridisering, är proteinas K (PK) matsmältningen en av de gemensamma strategier för att öka vävnads permeabilitet ^16-19. I antikroppsfärgning av bladlöss vävnader, visade våra resultat att: (1) PK-digerering förbättras signifikant immunfärgning signaler i de partenogenetiska viviparous embryon under grodden bandet förlängning (stadier 11-14) (Figur 3B '', C '), även omsvaga signaler var fortfarande synliga i embryon som saknar PK behandling (Figur 3B, C); och (2) PK uppslutning var obligatoriskt för embryon från katatrepsis framåt (stegen 15-20) (Figur 4C, F och figur 6C). För asexuella Viviparous embryon före katatrepsis är osannolikt volymen av ägg kamrarna orsaken till penetrations problem eftersom framgångsrik immunfärgning på tidiga sexuella oviparous embryon som är bosatta i de lagda ägg-som är nästan lika stor som den mest mogna asexuella ägg kammar- inte kräver PK matsmältningen ^20. Därför förlängning och vikning av grodden bandet (steg elva till 14) i det begränsade utrymmet i de asexuella ägg kamrarna kan hindra ingången av antikropp, och det är PK som tillåter genomträngning av antikroppen genom att skapa porer i cellmembran mellan fastnat embryonala strukturer. Å andra sidan kan den raka linjen förlängning av grodden bandet i de sexuella äggen förklara varför det är målat även ifrånvaron av PK. Borttagning av vitelline kuvert / chorion kan också göra sexuella oviparous embryon mer tillgängliga för antikropp. För embryon efter katatrepsis (steg 16-20), är avgörande för både asexuella och sexuella morfar PK behandling eftersom embryon är tjocka cuticled ¹⁹ (Figur 4C, F och figur 6C).

Trots den föreslagna villkor för PK rötning (1 mikrogram / ml för 10 min) kräver ytterligare justering om integritet embryonala strukturer eller intensiteten av signaler är inte tillfredsställande. Detta beror främst på PK aktivitet som kan variera från parti till parti. Om exempelvis embryonala vävnader skadas efter PK digestion, koncentration av PK kan reduceras till 0,5 | ig / ml. Likaså om signalstyrka är svag, förlängning av inkubation till 15-20 min rekommenderas därför. De mest mogna embryon (stadium 20) utsätts för långvarig PK inkubation upp till 20 minuter på 1,0 mikrogram / ml koncentration, however, visar vanligtvis svaga signaler, vilket tyder på att PK matsmältning är ännu ofullständig. Långvarig digestion kan förbättra färgningssignaler men är valfri, speciellt när uttrycksmönster detekteras i steget 18 embryon liknar dem i steget 20 embryon. I jämförelse med embryon vid steg 20 av utvecklingsfas, den 18 embryon med analog morfologi ännu med mindre mängd kroppsnagelbanden i allmänhet kan ge starkare signalstyrka.

Under signalutveckling, kan bakgrundsfärgning höjas genom aktiviteten av endogena enzymer som kan korsreagera med substraten. I ärt bladlöss embryon, aktivitet av den endogena alkaliskt fosfatas (AP) och peroxidas (POD), vilka båda är vanliga antikropps konjugat för digesting signalsubstrat, upptäcktes. Hydrolasaktivitet av den endogena AP effektivt kunde undertryckas under hela embryogenesen genom levamisol (data ej visade). Trots behandling av embryon med 0,3-0,6% hydrogsv peroxid _{(H2O 2)} kunde bara eliminera den endogena POD aktivitet före katatrepsis men var inte tillräcklig för äldre embryon (figur 4A, D). Metanol inkubation ett alternativt tillvägagångssätt för att denaturera endogena proteiner, visade sig vara effektiva i de bladlöss ²¹ (fig 4B och E). Till skillnad från _{H2O 2,} som skadar bladlus vävnader under långvarig inkubation av 30 minuter eller längre, metanol inte smälta eller deformeras embryon under något skede i utvecklingen (Figur 4C, F). Följaktligen är metanol ett bättre alternativ för att undertrycka endogen POD aktivitet i bladlöss embryon. Om restbakgrundsfärgning detekteras, vilket vanligtvis sker till de mogna embryon med en förtjockad skikt av nagelband, O / N inkubation i metanol vid 4 ° C-enligt vår erfarenhet-kan ytterligare reducera den endogena POD-aktivitet.

Återstående bakgrundsfärgning upptäcktes iembryon blockerade med serumproteiner, såsom normalt åsna serum (NDS), normalt getserum (NGS), bovint serumalbumin (BSA), eller deras blandningar ¹³ (fig 3A'-C "). Att anta en tillhandahålles kommersiellt blockeringsreagens användes för in situ hybridisering, däremot, skulle den återstående bakgrunden under immunofärgning vara signifikant eliminerat ⁵ (figur 3A '' - C ''). Även om ingredienserna i blockeringsreagens är egenutvecklade, sannolikt innehåller det icke-serumproteiner som kan blockera icke-specifika epitoper av ärter bladlöss proteinerna. Den blockeringsreagens arbetade också mycket bättre än djursera i det gröna persika bladlöss Myzus persicae. På samma sätt, i M persicae PK matsmältningen och metanol inkubation resulterade i tillfredsställande penetration antikropp och bakgrundsreduktion -. Liknar de förbättrade resultat som uppnåtts i A. Pisum (data ej visade). Vi räknar med att villkoren Optimeed för att öka vävnads permeabilitet och minska bakgrund, oavsett om man använder kromogent färgning eller fluorescens, kommer att gälla för många andra bladlöss arter.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% hydrogen perxidase (H2O2)	Sigma-Aldrich	18304	For bleaching endogenous peroxidase of embryos.
4’6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542	For labeling the double-strand DNA. TOXIC. Wear gloves, dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure
4D9 anti-engrailed/invected mouse monoclonal antibody	Developmental studies hybridoma bank	AB_528224	For labeling the developing segments of embryo.
ApVas1 rabbit polyclonal antibody	Our laboratory	N/A	For labeling the aphid germline specific Vas1 protein in embryos. This antibody was made by our laboratory.
Austerlitz Insect pins	ENTOMORAVIA	N/A	For seperating each egg chambers from an ovariole. Size 000, BLACK ENAMELLED.
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	9048-46-8	For blocking the non-specific binding of antibodies.
Camera connted to compound microscope	Canon	EOS 5D	For photographing of aphid embryos.
Colorimetric 8 cell tray	Kartell Labware	357	For developing the staining signal of aphid embryos. Diameter 95 x 57 mm, cell depth 2 mm.
Compound microscope with DIC optics	Leica Microsystems	DMR	For photographing of aphid embryo mounted on the slides.
DIG Wash and Block Buffer Set	Sigma-Aldrich (Roche)	11585762001	For blocking the non-specific binding of antibodies. We diluted the 10x Blocking solution into 1x as blocking reagent.
Forceps	Ideal-tek	N/A	For dissection of ovaries from aphids. Manufacturer part No 5: 5 SA.
Glass dropper	N/A	N/A	For transfering ovaries of aphids from the splot plate to tubes. 150 mm of total length and 5 3/4" of tip length.
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	For clearing of aphid embryos and mounting.
Glycine	Bioshop	N/A	For blocking the enzyme activity of proteinase K (PK).
Goat anti-mouse IgG conjugated Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11017	For detection of primary antibody from mouse.
Goat anti-rabbit IgG conjugated Alexa Fluor 633	Invitrogen	A21072	For detection of primary antibody from rabbit.
Intelli mixer	ELMI laboratory equipment	RM-2M	For improving the thorughly reaction of reagents with ovaries.
Laser-scanning confocal microscopy	Leica Microsystems	SP5	For photographing of aphid embryo mounted on the slides with florecent tag.
methanol	Burdick and Jackson	AH2304	For bleaching endogenous peroxidase of embryos.
Microscope slides	Thermo scientific	10143560	For mounting of embryos. SUPERFROST ground edges, ca./env. 76 x 26 mm.
Microscope Cover glasses	Marienfeld	0101030	For mounting embryos on the slides. Size 18 x 18 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
Microscope Cover glasses	Marienfeld	0101050	For mounting embryos on the slides. Size 22 x 22 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
mouse monoclonal anti-alphaTubulin antibody (DM1A)	Santa Cruz Biotechnology	sc-32293	For labeling the distrbution of alpha-tubulin of cells.
Nail polish	N/A	N/A	For sealing the coverslips on the slides.
Normal goat serum (NGS)	Sigma-Aldrich	G9023	For blocking the non-specific binding of antibodies.
Paraformaldehyde (PFA)	VWR	MK262159	For fixation of aphid ovaries.
Phalloidin-TRITC	Sigma-Aldrich	P1951	For labeling the distrbution of F-actin on embryos.
Phosphate-buffered saline (PBS)	N/A	N/A	As isotonic solution for aphid ovaries.
Plastic dropper	N/A	N/A	For transfering ovaries of aphids from tube to cell tray. Size 3 ml.
Proteinase K	Merck	124678	For creating pores (punching) on the cell membrane and facilitating the access of antibodies.
Pyrex spot plate	N/A	N/A	For dissection and color reactions of aphid ovaries under microscopy. Each cavity with diameter 22 mm and  depth 7 mm.
SIGMAFAST 3,3’-diaminobenzidine (DAB) tablets	Sigma-Aldrich	D4168	For developing of substrated signals. Also called DAB peroxidase substrate tablet set.
Stereo microscope	Leica Microsystems	EZ4	For dissection and observation of aphid ovaries.
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	T8787	For creating pores (punching) on the cell membrane.
VECTASHIELD Elite ABC Kit (Rabbit IgG)	Vector laboratories	PK-6101	For enhancement of the signal. Including of biotinylated goat anti-rabbit IgG secondary antibody, A and B reagents.
VECTASHIELD mounting medium	Vector laboratories	H1000	For clearing of aphid embryos and mounting.