Identifikation af kritiske forhold for Immunfarvning i Ærten Bladlus embryoner: Stigende Tissue permeabilitet og aftagende baggrundsfarvning

Abstract

Ærten bladlus Acyrthosiphon Pisum, med en sekventeret genom og rigelige fænotypisk plasticitet, er blevet en spirende model for genomiske og udviklingsmæssige undersøgelser. Ligesom andre bladlus, A. Pisum forplanter sig hurtigt via parthenogenetisk viviparous reproduktion, hvor embryonerne udvikle sig inden æg kamre i en forsamling-line mode i ovariole. Tidligere har vi etableret en solid platform af hel-mount in situ hybridisering muliggør påvisning af mRNA ekspression i bladlus embryoner. Til analyse af ekspressionen af ​​protein, selv om, etablerede protokoller til immunfarvning af ovarioles af ukønnede viviparous bladlus gav ikke tilfredsstillende resultater. Her rapporterer vi betingelser optimeret til at øge væv permeabilitet og faldende baggrund farvning, som begge var problemer, når de anvender etablerede tilgange. Optimeringer omfatter: (1) inkubation af proteinase K (1 ug / ml, 10 min), der blev fundet væsentlige feller antistof indtrængen i mellem- og sen-fase bladlus embryoner; (2) udskiftning af normalt gedeserum / bovint serumalbumin med en blokerende reagens leveret af en digoxigenin (DIG) -baseret buffer indstillet og (3) anvendelse af methanol i stedet hydrogenperoxid (H _{2 O 2)} til blegning endogen peroxidase; som reducerede signifikant baggrundsfarvning i bladlus væv. Disse kritiske forhold er optimeret til immunfarvning vil muliggøre en effektiv detektering af genprodukter i embryoner fra A. Pisum og andre bladlus.

Introduction

Bladlus er hemipteran insekter med små (1-10 mm) bløde organer. De lever af planter ved at suge Phloem saft med piercing munddele. Derudover de er afhængige af en obligat endosymbiotic bakterie, Buchnera aphidicola, at syntetisere essentielle aminosyrer, der er mangelfuld i den Phloem saft kost. Bladlus har en kompleks liv historie, der inkluderer parthenogenetisk viviparous reproduktion i løbet af foråret og sommeren lang dag fotoperioder og seksuel oviparous reproduktion udløst af short-dages fotoperioder, hvor de lå et begrænset antal overvintrende æg ^1,2. I foråret disse æg klækkes at producere den første generation af all-kvindelige bladlus (fundatrices), efter mange runder af parthenogenetisk reproduktion indtil efteråret. Den cykliske partenogenese i bladlus, hvor ukønnede og seksuelle faser suppleant i den årlige livscyklus, er blevet betragtet som en evolutionær nyhed ^1,2. I de parthenogenetisk viviparous bladlus, Embryogenese finder sted inden æg kamre i de æggestokkene tubuli (ovarioles). Derimod udvikler seksuelle oviparous embryoner i befrugtede æg. Bortset fra reproduktive plasticitet, kan bladlus vise transgen e fløj polyphenism: som reaktion på overbelægning signaler og rovdyr trusler, kan de unwinged ukønnede hunner viviparously producerer vingede afkom til langdistance-vandring. Offentliggørelse af genomet sekvens af ært bladlus Acyrthosiphon Pisum -den første genom sekvens for en basal hemimetabolous insekt-tillader yderligere udforskning af reproduktive plasticitet, fløj polyphenism og andre funktioner, herunder insekt-plante interaktioner, viral vectoring og symbiose i bladlus på et molekylært grundlag ^3.

Ud over de genom, er redskaber til karakterisering af genekspression og funktion er nødvendig for at fremme ærten bladlus som en moden model organisme ^4. Vi har beskrevet robuste protokoller af hel-mount 5-7. RNA-interferens (RNAi) via dobbeltstrenget RNA injektion og fodring er blevet anvendt til gendæmpning i bladlus nymfer og voksne, men stabile betingelser for genet knockdown i embryonerne endnu ikke blevet rapporteret ^8-10. Immunfarvning et antistof-tilgang, der kan detektere proteinekspression i prøverne før og efter RNAi knockdown, er blevet udført på ært bladlus embryoner ^11-13. Men forøgelse af vævspermeabilitet og eliminering af baggrundsfarvning er endnu utilfredsstillende anvendelse af standardprotokoller til immunfarvning i ukønnede viviparous embryoner af ærten bladlus. For eksempel fandt vi, at indtrængning af antistof til vævene faldt i gastrulating embryoner (stadie 8-10), og at fostre med morfologisk identificerbare Lemanlæggene (trin 13-14) var knap permeabel for antistof. Desuden blev baggrundsfarvning visualiseret i ukønnede viviparoUS ært bladlus embryoner farvet under anvendelse af antistof mod kimcellelinje markør Vasa såvel som mod Engrailed / Invected protein udtrykt i embryonale segmenter ^12,13. Faktisk baggrundsfarvning var stadig klart synlig i embryoner farvet med det sekundære antistof alene.

For at øge permeabiliteten uden at skade integriteten af ​​bladlus væv, vi titreres forsigtigt koncentrationen af ​​proteinase K og bestemmes optimale betingelser for vævsfordøjelse på bladlus embryoner. For at undgå ikke-specifik farvning i ært bladlus, søgte vi for forbindelser, der effektivt kunne blokere embryoner og undertrykker aktiviteten af ​​endogen peroxidase (POD), et enzym der anvendes til at forstærke signaler i immunfarvning. Et blokerende reagens leveres af en digoxigenin (DIG) -baseret buffer sæt, snarere traditionelt anvendes normalt gedeserum (NGS) / bovint serumalbumin (BSA), reducerede signifikant baggrundsfarvning. Desuden blev fundet at methanol inhibit den endogene POD-aktivitet mere effektivt end hydrogenperoxid (H _{2 O 2).} Detaljer vedrørende disse bladlus-specifikke forhold for immunfarvning på embryoner vil blive beskrevet i de følgende afsnit.

Protocol

1. Kultur Bladlus

BEMÆRK:. Laboratoriet stamme af parthenogenetisk viviparous ært bladlus A Pisum oprindeligt blev indsamlet i det centrale Taiwan og er blevet opdrættet på værtsplanter (haven ært Pisum sativum eller brede bønne Vicia faba) under lang dag lysperiode for mere end 300 generationer (en generation: ~ 10 dage).

1. Spiring af frø
   1. Soak frøene af værtsplanter i ledningsvand i 3-5 dage ved stuetemperatur. Fyld op med frisk vand en gang om dagen.
      BEMÆRK: Alternativt kan sætte frø af værtsplanter lige ind fugtig jord fremkalde spiring så godt.
   2. Grow 10 spirende frø i en lille gryde (9 cm i diameter x 7 cm høj) med jord i kammeret vækst under fotoperiode 16 timers lys / 8 timers mørke ved 20 ° C.
   3. Omkring 10 dage efter vækst begynder, overføre bladlus på planter, hvis højden er mere end 8 cm.
2. Overførsel af Bladlus Hold hver potte af planter inden for en 1 L bægerglas, overføre 8 voksne bladlus på anlæg, der anvender en pensel, og derefter forsegle bægeret med en luft-gennemtrængelig dækning såsom gaze maske til at forhindre bladlus i at undslippe.
3. Inkuber bladlus i et vækstkammer under fotoperiode 16 timers lys / 8 timers mørke ved 20 ° C. Vand hver plante pot planter en gang hver dag.
4. For at opnå den næste generation af bladlus, gentager trin 1.1.3-1.2.2 ti dage efter den primære bladlus overførsel.

2. Dissektion og fiksering af ovarier

1. Forberede frisk 4% paraformaldehyd (PFA) i 1x phosphatpufret saltvand (PBS) som fiksering buffer.
2. Fyld en brønd i en plet plade med PFA (ca. 500 ul), anbring pladen under et stereo mikroskop ved lav forstørrelse, og dykke en voksen bladlus i PFA til dissektion.
3. Dissekere æggestokkene ved at holde hovedet og maven med et sæt pincet, opskæring den dorsalekutikula af maven, og trække æggestokkene væk fra bughulen.
4. Fix tre par af ovarier i et 1,5 ml rør indeholdende 1 ml PFA ved stuetemperatur i 20 min.
5. Dekanter fiksering buffer med en overførsel pipette (enten glas eller disponibel) og derefter vaske æggestokke med 0,2% Triton X-100 i 1 x PBS (PBST) 3 gange i 10 minutter hver. Mild ryster på en mixer / rotator (rotation vinkel: 60 ° (F60) / omdrejningshastighed: 8 RPM) anbefales til både fiksering og vask.

3. Behandling med proteinase K (PK) for at øge permeabiliteten af ​​væv fra fostre

BEMÆRK: PK behandling påføres embryoner fra kim band forlængelse fremefter (stadie 11 i udvikling). For yngre embryoner, dette trin er valgfrit.

1. Serielt fortynde stamopløsningen af ​​PK (10 mg / ml) med 1x PBS til arbejdskoncentration 1 ug / ml.
2. Inkuber æggestokkene med 1 ug / ml PK (ca. 500 pi) i 10 minutter med mild omrystning.
3. Dekanteres PK solutipå og derefter vaske æggestokkene med 700 pi glycin (2 mg / ml) 3 gange i 5 minutter hver.
4. Vask æggestokkene med 0,2% PBST to gange i 10 minutter hver.
5. Fix æggestokke igen med fiksering buffer i 15 minutter ved stuetemperatur med let omrystning.
6. Supernatanten kasseres, og vask æggestokke med 0,2% PBST to gange i 10 minutter hver.

4. Methanol Inkubation til undertrykkelse af Endogen peroxidase (POD) aktivitet

BEMÆRK: Methanol inkubation anvendes ikke på fostre udsættes for phalloidin farvning eller antistof epitoper, der er methanol følsomme.

1. Serielt dehydrere æggestokkene med forskellige procentdel af methanol i 0,2% PBST (v / v: 1: 3, 1: 1, 3: 1) ved at inkubere ovarier ved hver koncentration af methanol opløsningen i 10 minutter med mild omrøring.
2. Dehydrere æggestokkene med 100% methanol i 1 time ved stuetemperatur med let omrystning.
   BEMÆRK: Tilfredsstillende resultater af farvning stadig kunne fås fra bladlus væv, der blev opbevaret i 100% methanol ved -20 &# 176; C i en måned.
3. Serielt rehydrere æggestokkene med forskellige procentdel af methanol i 0,2% PBST (v / v: 3: 1, 1: 1, 1: 3) ved at inkubere ovarier ved hver koncentration af methanol opløsningen i 10 minutter med mild omrøring.

5. antistoffarvning

1. 10x blokerende opløsning fra DIG-buffer sæt Fortynd (DIG-B) til 1x.
   BEMÆRK: 1x DIG-B blokerende opløsning er mere effektiv til at reducere farvning baggrund end standard blokeringsreagens sammensat af 5% (v / v) normalt gedeserum (NGS) og 0,5% (v / v) bovint serumalbumin (BSA ) i 0,2% PBST.
2. Inkuber æggestokkene med 1x DIG-B blokeringsopløsning for 2,5 til 4 timer ved stuetemperatur eller O / N ved 4 ° C med mild omrystning.
   BEMÆRK: tre par æggestokke i en 1,5 ml rør, 200 pi er den mindste mængde for prøve blokering og antistoffarvning.
3. Dekanteres supernatanten og erstatte med frisk 1x DIG-B blokerende opløsning indeholdende primært antistof ved passende dilutipå forholdet. Farv æggestokkene i 4 timer ved stuetemperatur eller O / N ved 4 ° C med mild omrystning.
   BEMÆRK: eksperimentet beskrevet her, skal du bruge følgende optimale fortyndinger af primære antistoffer: (1) ApVas1 antistof: 1: 500 for kromogene farvning, 1:50 til immunfluorescensfarvning; (2) anti-α-tubulin antistof: 1: 500; (3) 4D9 monoklonalt antistof: 01:25.
4. Vask æggestokkene med 0,2% PBST 4 gange i 15 minutter hver.
5. Inkuber æggestokkene med 1x DIG-B blokeringsopløsning i 1 time ved stuetemperatur med let omrystning.
6. Dekanteres supernatanten og erstatte med frisk 1x DIG-B blokerende opløsning indeholdende sekundært antistof ved passende fortyndingsforhold. Farv æggestokkene i 4 timer ved stuetemperatur eller O / N ved 4 ° C med mild omrystning.
   1. Brug følgende fortyndingsforhold på sekundære antistoffer: (1) For immunfluorescensfarvning: 1: 500 for Alexa Fluor 633 gede-anti-kanin-IgG eller Alexa Fluor 488 gede-anti-muse-IgG; (2) For kromogent farvning: 1: 200 for biotinyleret gede anti-kanin IgG.
      BEMÆRK: Det biotinylerede sekundære antistof anvendes til at interagere med avidin-biotin-kompleks (ABC) i substratet-baserede (chromogen) påvisning, hvorigennem farvning signalerne betydeligt forstærket.
   2. For immunfluorescensfarvning, udføre farvning i mørke, fordi det sekundære antistof er lysfølsomt.
7. Vask sekundært antistof med 0,2% PBST 4 gange i 10 minutter hver.

6. Nuklear og F-actin farvning

BEMÆRK: Dette er kun ansøgt om immunfluorescensfarvning.

1. Farv æggestokkene med 0,2% PBST med DAPI (2 ng / pi) og Phalloidin-TRITC (100 nM) i 2 timer ved stuetemperatur i mørke.
2. Vask æggestokkene med 0,2% PBST 4 gange i 10 minutter hver.
3. Inkuber æggestokkene med monteringsmediet O / N ved 4 ° C med mild omrystning.

7. Signal Udvikling

BEMÆRK: Dette er kun ansøgt om kromogene farvning.

1. Forbered 100 pireagens avidin-biotin-kompleks (ABC) for at forbedre signalerne ved tilsætning af 1 pi Reagens A (avidin) i 98 pi 0,2% PBST, og bland grundigt via forsigtig pipettering, og tilsætning af 1 pi af reagens B (biotin konjugeret med peberrodsperoxidase ), efterfulgt af øjeblikkelig blanding. Inkuber blandingen i 30 minutter ved stuetemperatur med let omrystning.
2. Inkuber æggestokkene (herunder adskilles æg kamre) i blandingen af ​​reagenserne A og B i 30 minutter ved stuetemperatur med let omrystning.
3. Vaske blandingen af ​​reagenser A og B med 0,2% PBST 4 gange i 10 minutter hver.
4. Overfør æggestokkene nedsænket i PBST til en brønd på stedet plade med en plastik pipette.
5. Forbered substrat opløsning af 3,3'-diaminobenzidin (DAB): opløses en tablet DAB plus en anden indeholdende urea hydrogenperoxid i 1 ml dobbeltdestilleret ₂ O via kraftig omhvirvling i 1 min.
   BEMÆRK: DAB, en præcipiterende substrat af peroxidase, er et populært kromogen til immunfarvning. Det producerer en bregne og uopløseligt bundfald efter at være oxideret af peroxidase. Svage signaler kan forbedres ved tilsætning af nikkelchlorid til substratopløsningen (slutkoncentration 0,05-0,08%).
6. Fjern PBST-opløsning tilbage i brønden og fyld med 100 pi af DAB substratopløsning for signal udvikling.
7. Overvåge intensiteten af ​​signaler under et stereomikroskop ved lav forstørrelse.
8. Stop reaktionerne ved at fjerne DAB-opløsning, efterfulgt af genpåfyldning med 1x PBS straks. Gentag vask to gange.
9. Overfør æggestokkene tilbage til 1,5 ml rør og derefter vaske med 1x PBS eller PBST to gange i 15 minutter hver.
10. Inkuber æggestokke i et glycerol-baseret montering medium (70% glycerol) O / N ved 4 ° C med mild omrystning.

8. Montering af Bladlus Embryoner

BEMÆRK: Tykkelsen af ​​bladlus embryoner varierer mellem udviklingsstadier. Montering strategier er således modificeres til at passe tidligt (germaria og iscenesætter 0-10), midten (etaper11-18), og sene stadier embryoner (19-20), som er demonstreret i figur 2B - D. Embryonale iscenesættelse fulgte Miura et al. ¹²

1. Overfør æggestokke samt til montering medium til cellen bakke med en plastik dropper og observere prøver under et stereo mikroskop ved lav forstørrelse.
2. Skær calyces forbundet med den laterale æggeleder hjælp insekt ben og derefter overføre en isoleret ovariole til en tom glas godt med en pipette. Gøre den endelige volumen til 50-100 pi bruge montering medium.
3. Overfør en ovariole på objektglasset med et glas dropper og derefter dissekere æg kamre ved hjælp af insekt ben.
   BEMÆRK: embryoner ældre end fase 6 i udvikling, adskillelse af æg kamre foreslås; for germaria og de første to æg kamre yngre end fase 6, separation er valgfrit.
4. Flyt en dissekeret æg kammer til et rent objektglas ved hjælp af et glas dropper.
5. Sæt et dækglas (størrelse: 22 x 22mm) i løbet af de dissekerede germaria eller æg kamre (indeholder embryoner i trin 1-10 af udvikling) langsomt for at undgå bobler.
   1. Mount æg kamre (indeholdende embryoner i trin 11-18 udvikling) på et dias med ensidig dækglas bro og placere et andet dækglas (størrelse: 18 x 18 mm) på toppen af ​​prøven.
   2. Mount æg kamre (indeholdende embryoner ældre end stadie 19 i udvikling) på et dias med dobbeltsidet dækglas bro og placere et andet dækglas (størrelse: 18 x 18 mm) på toppen af ​​prøven.
6. Fylde rummet under det øverste dækglas med monteringsmedium at undgå tørring af prøven.
7. Mildt rulle fosteret ved at skubbe dækglasset for at opnå den rette orientering til observation.
8. Seal omkring kanten af ​​dækglas (herunder bro dækglas) med neglelak.

9. Imaging Analysis

1. Fotografi differential interferens kontrast (DIC) billeder af hel-mount embryoner med en compound mikroskop udstyret med DIC optik og en tør objektivlinse (10X, 20X, 40X) forbundet til et kamera. Installation af softwaren til overførsel billedet mellem kameraet og computeren ved hjælp af producentens anvisninger.
2. Erhverve fremskrivninger af fluorescens-mærkede embryoner med en laser-konfokalt ^14. Følg producentens anvisninger for at fotografere, z-stabling, og 3D-projektering med billedbehandling software.
   1. Vend glide på hovedet, finde den monterede prøve med 10X objektiv og cirkel prøveområdet med en fin olieret-baserede pen.
      BEMÆRK: Dette gør at identificere prøven lettere, når du søger efter det gennem mål for et konfokalt mikroskop.
   2. Tilføj en dråbe olie på toppen af ​​dækglasset område, hvis modsatte side er mærket som beskrevet i 9.2.1.
3. Find brændplanet ved 40X olieimmersionsobjektiv derefter skifte til en 63X olieimmersionsobjektiv. Manuelt flytte den fine fokus kontrol op og gørewn at fange den bedste fokale plan.
   BEMÆRK: observere strukturelle detaljer i germaria og tidlige embryoner, foreslår vi at bruge 40X mål eller dem med højere forstørrelse.
4. Scan embryo i forskellige excitation kanaler og få en z-stak billede.
   BEMÆRK: ært bladlus væv, reducere tykkelsen af ​​hvert optisk sektion ned til 1,5 um eller mindre.

Representative Results

I denne undersøgelse, udførte vi hel-mount immunfarvning på embryoner af ukønnede ærtelus (figur 1A). Disse kvinder producerer afkom parthenogenetically og viviparously. Disse kvindelige fostre udvikle sig inden æg kamre i de æggestokkene tubuli (ovarioles) (Figur 1B og figur 2A). Inden mikroskopi, dissekerede ovarioles er farvningsresultaterne mål; imidlertid adskillelse af æg kamre er påkrævet for observation af embryoner under et mikroskop (Figur 2B - D).

Forøgelse af vævspermeabilitet

Proteinase K (PK) behandling er en standard tilgang til forbedring af væv permeabilitet, men for embryoner af visse modelorganismer-såsom Caenorhabditis elegans (nematode), Drosophila melanogaster (flue), og Danio rerio (zebrafisk) -Dette trin er valgfrit. I ært bladlus, kravet om PK behandling er fase-afhængig: for germaria og embryoner før gastrulation (etaper 0-7), kan PK behandling udelades; men for embryoner i henhold germband udvidelse (etape 11), eller i senere faser dette trin er stærkt anbefales. For eksempel blev i midten embryogenese signaler knap påvist i embryoner uden PK behandling (figur 3A - C). Derimod blev signal intensitet væsentligt forbedret i embryoner udsat for PK fordøjelse (figur 3A "- C, A" - C ").

Reduktion af baggrundsfarvning

Blev identificeret i væv fra fostre af bladlus Et højt den endogene peroxidase (POD) aktivitet. At undertrykke denne enzymaktivitet, blev paraformaldehyd-fikserede embryoer inkuberet i nærvær af hydrogen peroxid (H _{2 O 2),} en fælles reagens til oxidation af POD. Vores resultater viste, at H _{2 O 2} behandling ikke undertrykke aktiviteten af endogene POD effektivt i de sene embryoner (figur 4A, D). Derimod blev baggrundsfarvning stærkt reduceret med embryoner udsættes for methanol inkubation (figur 4B, C, E, F). Før anvendelse af det primære antistof embryoer blev blokeret i opløsning indeholdende NGS og BSA som beskrevet i standardprotokoller for antistoffarvning. Imidlertid blev tilbageværende baggrundsfarvning i bladlus embryoner detekteres (figur 3A '- C'). Dette problem blev løst efter udskiftning NGS / BSA med blokerende reagens leveret af en buffer indstillet til DIG-mærkning eksperimenter såsom in situ hybridisering (figur 3A "- C"). Vi konkluderer derfor, at post-fiksering med methanol og inkubering med DIG-Bblokeringsreagens er både væsentligt for at reducere baggrundsfarvning i bladlus embryoner.

PK behandling og DIG-B blokeringsreagens kræves ikke blot for effektiv detekteringssignal anvendelse af den chromogene men også fluorescerende metoder. Actin farvning med phalloidin eller farvning for methanol-sensitive epitop, dog virker ikke i embryoner udsættes for pre-fiksering med methanol, der kan ødelægge den native form af actin eller antistoffer. Derfor bør denne behandling undgås, når du udfører fluorescens immunfarvning. Bortset fra at eliminere de methanol behandlingstrin immunfluorescens tillader multi-mærkning eksperimenter i bladlus embryoner. Brug af konfokal mikroskopi, fx kunne ært bladlus Vasa1 protein (ApVas1) i kimceller, α-tubulin i mikrotubuli, F-actin i microfilaments og DNA i kerner skal samtidigt mærket og visualiseret (figur 5A, C). I sammenligning med CHROmogenic metode (figur 5B), konfokal sektionering af fluorescens-mærkede prøver giver bedre opløsning af lokaliserede signaler såsom ApVas1 i kim plasm og cellularizing kønsceller i begyndelsen af bladlus embryoner (figur 5C ", D - D"). Vedtagelsen af betingelserne for mærkning kimceller ovenfor beskrevne blev Engrailed / Invected protein i segmenter af strækker kim båndet farvet med antistoffet 4D9 (figur 6). Dette viser, at vores protokol for immunfarvning-herunder kromogene og fluorescerende metoder-effektivt kan anvendes til at signalere detektering i både kimcellelinje og somatiske cellelinier i bladlus.

Figur 1. parthenogenetisk viviparous ært bladlus. (A) en første-stadie nymfe på vej ud af en ukønnet viviparous kvindelige voksen. (B 12. En ovariole indeholder en germarium i spidsen (pile), 1-2 oocytter og 5-7 embryonale kamre. Tarm og cauda er normalt forbundet med de dissekerede æggestokkene. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2. Illustration af strategier til montering bladlus embryoner på forskellige stadier af udvikling. (A) Oversigt over embryonale udvikling i ovariole dissekeret fra en parthenogenetisk viviparous kvindelig voksen. Kort oogenesen (germarial scene og trin 0-2) efterfølges af embryogenese (trin 3-20). Oversigt over embryogenese: f ormation af syncytiale blastoderm (trin 3-5); blastulation (trin 6-7); gastrulation (trin 8-10); forlængelsen af ​​kim band (trin 11-14); katatrepsis (iscenesætter 15); indlæg katatrepsis og kim band retraktionsværdien (trin 16-17); organogenesis (iscenesætter 18-20). Farvetasterne er i bunden af ​​figuren. (B, B ') Germarium og iscenesætter 0-10 embryoner. Nr dækglas broen er påkrævet. (C, C ') Stages 11-18 embryoner. Et dækglas broen er påkrævet. (D, D ') Stages 19-20 embryoner. Dobbelt dækglas broer er nødvendige. Rullende embryoner ved at skubbe dækglasset kan skabe forskellige vinkler af observation. Størrelser af dækglas: 22 x 22 mm i (B), 18 x 18 mm i (C) og (D). Tykkelsen af ​​dækglas: 0,13 til 0,16 mm. Embryonale iscenesættelse fulgte Miura et al ¹² Forkortelser: g:. Germarium; st: scenen..com / filer / ftp_upload / 53883 / 53883fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

. Figur 3. Proteinase K-behandling og sammenligning af reagenser med forskellige blokerende virkninger Anterior af æg kamre er til venstre; alle synspunkter er lateral undtagen embryoner, der er vist i (B ", C, C"), som er dorsale. Embryoer alle farves ved anvendelse ApVas1 antistof (fortynding 1: 500) og signaler fra ApVas1 udvikles inden for 10-20 sek. Pilespidser angiver placeringen af ​​kønsceller. (A - C) Embryoner uden behandling af proteinase K (PK). ApVas1 signaler i kimceller er næppe påvises. (A '- C «, A" - C ") Sammenligning af baggrunden farvning i embryoner blokKED med NGS og BSA (A '- C «), og af den kommercielle blokerende reagens i DIG Vask og Block Buffer Set (DIG-B) (A" - C "). Baggrund reduceres betydeligt i embryoner der er vist i (A "- C"). Forkortelse: b: bakterier. Scale barer:. 100 um Klik her for at se en større version af dette tal.

. Figur 4. Minimering baggrundsfarvning med methanol Anterior af embryoner er til venstre; alle synspunkter er dorsale. Æg behandles med PK til forøgelse af permeabiliteten antistof. Pilespidser angiver placeringen af ​​kønsceller. (A, B, D, E) Sammenligning af behandlingermed hydrogenperoxid (H _{2 O 2)} og methanol. Embryoer kun farves med sekundært antistof. H _{2 O 2} behandling (0,3% w / v, 10 min): høj baggrund (A, D); methanol behandling (100%, 60 min): lav baggrund (B, E). (C, F) Primært antistof farvning på embryoer behandlet med methanol. Betingelser for methanol behandling er identiske med dem, der anvendes for embryoner er vist i (B, E). Den ApVas1 antistof fortrinsvis mærker de embryonale kønsceller. Scale barer:. 100 um Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5. Immunfluorescensfarvning på tidlige embryoer. (A, C - D) og 1: 500 i (B). (A) Farvning signaler, som omfatter ApVas1, α-tubulin, F-actin, og nuklear DNA, påvises ved anvendelse af fire kanaler med forskellige bølgelængder. Farvetaster af signaler er vist i bunden af ​​figuren. (B) DIC billede af et chromogent resultat for sammenligning. ApVas1 er beriget i germarium mens kontrasten intensiteten af bageste lokalisering af ApVas1 (pilespidser) i den fase-3 embryo er ikke så klar som der er vist i (C, C '). (C, C ') Berigelse af ApVas1 signaler i ægget posterior. Signaler lokaliseret til posteriore område af ægget kammeret (pilespidser) er forstærket af billedet stabling. Fordi signaler af F-actin og α-tubulin delvist maskere de ApVas1 i den bageste (C), et billede produceret af single-kanaliseret scanning er vist i (C). (D - D '') Konfokal sektionering af ApVas1 lokaliseret i den bageste område af scenen-4 foster. Illustrationerne i (D) og (D) er ApVas1 påvist i overfladen og centrale fokusplaner hhv. (D ") er det flettede billede af alle sektioner fra samme embryo som (D) og (D) Forkortelser: som: aster, fc, follikelceller, POC, prospektive oocyt, sp:. Spindel, tc, trofiske ledninger. Scale barer:. 10 um Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6. Immunfarvning i embryonale segmenter. EnTERIOR af æg kamre er til venstre. PK-behandlede embryoer farves med det monoklonale antistof 4D9 mod Engrailed / Invected, som er udtrykt i embryonale segmenter. Farvetaster af signaler er vist i bunden af ​​figuren. (A, A ') Immunfluorescensfarvning på en scene-13 embryo. (A), et konfokalt billede stablet fra billeder af Engrailed / Invected, α-tubulin, F-actin, og nukleare DNA farvninger. (A ') et konfokalt billede der viser farvning af Engrailed / kun Invected. Uden indblanding af signaler fra andre kanaler, er signaler bedre vises. (B, C) ​​Chromogenic farvning på embryoner i etaper 13 og 17 i udvikling hhv. (B) Stage-13 foster. (C) Stage-17 foster. Fra trin 13 til 17, er det stigende antal segmenter i maven mærket med 4D9. (D) Negativ kontrol (-Ctrl) pleting kun sekundært antistof konjugeret med Alexa Fluor 633. Næsten der ikke registreres Immunofarvning-signaler på ovariole uden primære antistof. Dog er autofluorescens af bakterier (bindestreg linje) inden for etape 7 og 13 af æg kamre detekteret ved excitationsbølgelængden 488 nm. Forkortelser: A: maven; b: bakterier; H: hovedet; T: brystkassen. Scale barer:. 100 um Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Vi identificerede optimale betingelser er afgørende for en vellykket immunfarvning i ært bladlus A. Pisum, en spirende model organisme til genomiske og udviklingsmæssige undersøgelser ^3,15. Optimerede betingelser for at øge vævspermeabilitet og reducere baggrundsfarvning øget intensitet og specificitet af signaler. De adskiller sig fra standardprotokoller for immunfarvning i andre dyremodeller i de faser, for at skabe porer i cellemembraner og blokering af ikke-specifik antistofbinding.

For immunfarvning og in situ hybridisering, proteinase K (PK) fordøjelse er en af de fælles tilgang til at øge vævspermeabilitet ^16-19. I antistof farvning af bladlus væv, viste vores resultater, at: (1) PK fordøjelsen signifikant forøget Immunofarvning signaler i parthenogenetisk viviparous embryoner under kim band forlængelse (trin 11-14) (figur 3B '', C '), selv omsvage signaler var stadig synligt i embryoner blottet for PK behandling (figur 3B, C); og (2) PK fordøjelse var obligatorisk for embryoner fra katatrepsis fremefter (iscenesætter 15-20) (figur 4C, F og figur 6C). For ukønnede viviparous embryoer før katatrepsis, er usandsynligt mængden af ​​æg kamre årsagen til penetration problem, fordi succesfuld immunfarvning på tidlige seksuelle oviparous embryoner, der er bosiddende i de betingelser, æg-som næsten svarer i størrelse til de mest modne ukønnet æg kammer- ikke kræver PK fordøjelse ^20. Derfor forlængende og foldning af kimen båndet (stadie 11 til 14) i den begrænsede plads af ukønnede æg kamre kan hindre indgangen af ​​antistof, og det er PK, der tillader indtrængen af ​​antistof ved at skabe porer i cellemembraner mellem fastklemte embryonale strukturer. Derimod kan den rette linje forlængelse af kimen bandet i de seksuelle æg forklare, hvorfor det er plettet selv ifravær af PK. Fjernelse af vitelline kuverten / chorion kan også gøre seksuelle oviparous embryoner mere tilgængelige for antistof. For embryoner efter katatrepsis (iscenesætter 16 til 20), PK behandling er afgørende for både ukønnede og seksuelle morfer fordi embryoner er tykke cuticled ¹⁹ (figur 4C, F og figur 6C).

Ikke desto mindre, den foreslåede betingelse for PK fordøjelse (1 ug / ml i 10 min) kræver yderligere justering, hvis integritet embryonale strukturer eller intensiteten af ​​signalerne ikke er tilfredsstillende. Dette skyldes primært PK aktivitet, der kan variere fra parti til parti. For eksempel, hvis embryonale væv bliver beskadiget efter PK fordøjelse, koncentration af PK kan reduceres til 0,5 ug / ml. Ligeledes, hvis signalintensiteten er svag, udvidelse af inkubering til 15-20 min anbefales derfor. De mest modne embryoer (fase 20) udsat for langvarig PK inkubation op til 20 minutter ved 1,0 ug / m koncentration, however, vises normalt svage signaler, hvilket tyder på, at PK fordøjelsen er endnu ufuldstændig. Forlænget fordøjelse kan forbedre farvning signaler, men er valgfri, især når ekspressionsmønstre detekteret i trin 18 embryoner ligner dem i trin 20 embryoner. I sammenligning med embryoner på trin 20 for udvikling, scenen 18 fostre med tilsvarende morfologi endnu med mindre mængde kroppen neglebånd generelt kan give stærkere signal intensitet.

Under signal udvikling, kan baggrundsfarvning være forhøjet ved aktiviteten af ​​endogene enzymer, der kan krydsreagere med substraterne. I ært bladlus embryoner, aktivitet af endogen alkalisk phosphatase (AP) og peroxidase (POD), som begge er fælles antistofkonjugater til at fordøje signal substrater, blev påvist. Hydrolase aktivitet af endogent AP kunne undertrykkes effektivt hele embryogenese af levamisol (data ikke vist). Ikke desto mindre, behandling af fostre med 0,3-0,6% hydrogen peroxid (H ₂ O ₂₎ kun kunne eliminere endogen POD-aktivitet før katatrepsis men var ikke tilstrækkeligt til ældre embryoner (figur 4A, D). Methanol inkubation en alternativ metode til denaturering endogene proteiner, blev påvist at være effektiv i bladlusene ²¹ (figur 4B, E). I modsætning til H _{2 O 2,} som skader bladlus væv under langvarig inkubation af 30 minutter eller længere, methanol ikke fordøje eller deformere embryoner under alle stadier af udvikling (figur 4C, F). Derfor methanol er et bedre alternativ for at undertrykke endogene POD aktivitet i bladlus embryoner. Hvis der detekteres, residual baggrundsfarvning hvilket normalt sker til de modne embryoer med en fortykket lag af kutikula, O / N inkubering i methanol ved 4 ° C-ifølge vores erfaring-kan yderligere reducere den endogene POD-aktivitet.

Resterende baggrundsfarvning blev påvist iembryoner blokeret med serumproteiner, såsom normal donkey serum (NDS), normalt gedeserum (NGS), bovint serumalbumin (BSA), eller blandinger deraf ¹³ (fig 3A'-C '). Vedtagelse af kommercielt leveret blokeringsreagens anvendes til in situ hybridisering, derimod, kunne de resterende baggrunden under immunfarvning være signifikant elimineret ⁵ (figur 3A '' - C '). Selvom ingredienserne i blokeringsreagens er proprietære, det sandsynligt indeholder ikke-serumproteiner, der kan blokere ikke-specifikke epitoper af PEA bladlus proteiner. Den blokeringsreagens arbejdede også meget bedre end dyr sera i den grønne fersken bladlus Myzus persicae. Ligeledes i M persicae PK fordøjelse og methanol inkubation resulterede i tilfredsstillende antistof penetration og baggrunden reduktion -. Svarende til det forbedrede resultat er opnået i A. Pisum (data ikke vist). Vi forventer, at betingelserne optimized til at øge væv permeabilitet og reducere baggrund, uanset om man bruger kromogent farvning eller fluorescens, vil gælde for mange andre bladlus arter.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% hydrogen perxidase (H2O2)	Sigma-Aldrich	18304	For bleaching endogenous peroxidase of embryos.
4’6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542	For labeling the double-strand DNA. TOXIC. Wear gloves, dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure
4D9 anti-engrailed/invected mouse monoclonal antibody	Developmental studies hybridoma bank	AB_528224	For labeling the developing segments of embryo.
ApVas1 rabbit polyclonal antibody	Our laboratory	N/A	For labeling the aphid germline specific Vas1 protein in embryos. This antibody was made by our laboratory.
Austerlitz Insect pins	ENTOMORAVIA	N/A	For seperating each egg chambers from an ovariole. Size 000, BLACK ENAMELLED.
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	9048-46-8	For blocking the non-specific binding of antibodies.
Camera connted to compound microscope	Canon	EOS 5D	For photographing of aphid embryos.
Colorimetric 8 cell tray	Kartell Labware	357	For developing the staining signal of aphid embryos. Diameter 95 x 57 mm, cell depth 2 mm.
Compound microscope with DIC optics	Leica Microsystems	DMR	For photographing of aphid embryo mounted on the slides.
DIG Wash and Block Buffer Set	Sigma-Aldrich (Roche)	11585762001	For blocking the non-specific binding of antibodies. We diluted the 10x Blocking solution into 1x as blocking reagent.
Forceps	Ideal-tek	N/A	For dissection of ovaries from aphids. Manufacturer part No 5: 5 SA.
Glass dropper	N/A	N/A	For transfering ovaries of aphids from the splot plate to tubes. 150 mm of total length and 5 3/4" of tip length.
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	For clearing of aphid embryos and mounting.
Glycine	Bioshop	N/A	For blocking the enzyme activity of proteinase K (PK).
Goat anti-mouse IgG conjugated Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11017	For detection of primary antibody from mouse.
Goat anti-rabbit IgG conjugated Alexa Fluor 633	Invitrogen	A21072	For detection of primary antibody from rabbit.
Intelli mixer	ELMI laboratory equipment	RM-2M	For improving the thorughly reaction of reagents with ovaries.
Laser-scanning confocal microscopy	Leica Microsystems	SP5	For photographing of aphid embryo mounted on the slides with florecent tag.
methanol	Burdick and Jackson	AH2304	For bleaching endogenous peroxidase of embryos.
Microscope slides	Thermo scientific	10143560	For mounting of embryos. SUPERFROST ground edges, ca./env. 76 x 26 mm.
Microscope Cover glasses	Marienfeld	0101030	For mounting embryos on the slides. Size 18 x 18 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
Microscope Cover glasses	Marienfeld	0101050	For mounting embryos on the slides. Size 22 x 22 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
mouse monoclonal anti-alphaTubulin antibody (DM1A)	Santa Cruz Biotechnology	sc-32293	For labeling the distrbution of alpha-tubulin of cells.
Nail polish	N/A	N/A	For sealing the coverslips on the slides.
Normal goat serum (NGS)	Sigma-Aldrich	G9023	For blocking the non-specific binding of antibodies.
Paraformaldehyde (PFA)	VWR	MK262159	For fixation of aphid ovaries.
Phalloidin-TRITC	Sigma-Aldrich	P1951	For labeling the distrbution of F-actin on embryos.
Phosphate-buffered saline (PBS)	N/A	N/A	As isotonic solution for aphid ovaries.
Plastic dropper	N/A	N/A	For transfering ovaries of aphids from tube to cell tray. Size 3 ml.
Proteinase K	Merck	124678	For creating pores (punching) on the cell membrane and facilitating the access of antibodies.
Pyrex spot plate	N/A	N/A	For dissection and color reactions of aphid ovaries under microscopy. Each cavity with diameter 22 mm and  depth 7 mm.
SIGMAFAST 3,3’-diaminobenzidine (DAB) tablets	Sigma-Aldrich	D4168	For developing of substrated signals. Also called DAB peroxidase substrate tablet set.
Stereo microscope	Leica Microsystems	EZ4	For dissection and observation of aphid ovaries.
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	T8787	For creating pores (punching) on the cell membrane.
VECTASHIELD Elite ABC Kit (Rabbit IgG)	Vector laboratories	PK-6101	For enhancement of the signal. Including of biotinylated goat anti-rabbit IgG secondary antibody, A and B reagents.
VECTASHIELD mounting medium	Vector laboratories	H1000	For clearing of aphid embryos and mounting.