Identificación de las condiciones críticas para inmunotinción en el guisante áfido embriones: El aumento del tejido Permeabilidad y disminución de la tinción de fondo

Abstract

El Acyrthosiphon pisum pulgón del guisante, con un genoma secuenciado y abundante plasticidad fenotípica, se ha convertido en un modelo emergente para estudios genómicos y de desarrollo. Al igual que otros pulgones, A. Pisum propaga rápidamente a través de la reproducción vivípara partenogenética, donde los embriones se desarrollan dentro de las cámaras de huevo en forma de línea de montaje en el ovariole. Anteriormente hemos establecido una plataforma robusta de todo el montaje hibridación in situ que permite la detección de la expresión de mRNA en los embriones de áfidos. Para el análisis de la expresión de la proteína, sin embargo, establecido protocolos para inmunotinción los ovarioles de áfidos vivíparos asexuales no produjo resultados satisfactorios. Aquí mostramos condiciones optimizadas para aumentar la permeabilidad de los tejidos y la disminución de la tinción de fondo, los cuales eran los problemas en la aplicación de enfoques establecidos. Optimizaciones incluyen: (1) incubación de proteinasa K (1 mg / ml, 10 min), que se encontró f esencialo la penetración de anticuerpos en embriones de mediados y finales de etapa de áfidos; (2) la sustitución de albúmina de suero de suero de cabra / bovino normal con un reactivo de bloqueo suministrada por un digoxigenina (DIG) a base de juego de tampones y (3) la aplicación de metanol en lugar de peróxido de hidrógeno (H ₂ O ₂₎ para el blanqueo de la peroxidasa endógena; que redujo significativamente la tinción de fondo en los tejidos de áfidos. Estas condiciones críticas optimizados para inmunotinción permitirá la detección eficaz de los productos de los genes en los embriones de A. Pisum y otros pulgones.

Introduction

Los áfidos son insectos hemípteros con pequeñas (1.10 mm) cuerpos blandos. Se alimentan de las plantas al chupar la savia del floema con piezas bucales penetrantes. Además, se basan en una bacteria endosimbiótica obligado, Buchnera aphidicola, para sintetizar aminoácidos esenciales que son deficientes en la dieta savia del floema. Los áfidos tienen una historia de vida complejo que incluye la reproducción vivípara partenogenética durante la primavera y el fotoperíodo largo día de verano y la reproducción ovípara sexual provocada por fotoperiodos de día corto durante el cual se ponen un número limitado de huevos invernantes ^1,2. En la primavera de estos huevos eclosionan para producir la primera generación de la todo-hembra áfidos (fundatrices), después de muchas rondas de reproducción partenogenética hasta el otoño. La partenogénesis cíclica de áfidos, donde las fases asexuales y sexuales se alternan en el ciclo de vida anual, ha sido considerado como un ^1,2 novedad evolutiva. En los áfidos vivíparos partenogenéticos, La embriogénesis se lleva a cabo dentro de las cámaras de huevo de los túbulos de ovario (ovarioles). Por el contrario, los embriones ovíparos sexuales se desarrollan en los huevos fertilizados. Aparte de la plasticidad reproductiva, los áfidos pueden mostrar polyphenism ala transgeneracional: en respuesta a señales de hacinamiento y las amenazas de depredadores, las hembras sin alas asexuales pueden producir vivíparas descendiente alado para la migración de larga distancia. La publicación de la secuencia del genoma del pulgón del guisante Acyrthosiphon pisum -la primera secuencia del genoma de un basal insectos permite hemimetabolous mayor exploración de la plasticidad reproductiva, ala polyphenism, y otras características que incluyen interacciones insecto-planta, vectorización viral y la simbiosis de áfidos en una molecular base ^3.

Además de la secuencia del genoma, se requieren herramientas para la caracterización de la expresión génica y la función de promover el pulgón del guisante como un organismo modelo madura ^4. Hemos descrito los protocolos robustos de todo el montaje 5-7. ARN de interferencia (RNAi) a través de la inyección de ARN de doble cadena y la alimentación se ha utilizado para el silenciamiento de genes en ninfas de áfidos y adultos, pero las condiciones estables para el gen desmontables en los embriones aún no se ha informado de ^8-10. La inmunotinción, un enfoque basado en anticuerpos que puede detectar la expresión de proteínas en las muestras antes y después de RNAi desmontables, se ha realizado en embriones pulgón del guisante ^11-13. Sin embargo, el aumento de la permeabilidad de los tejidos y la eliminación de la tinción de fondo es aún insatisfactoria utilizando protocolos estándar para la inmunotinción en los embriones vivíparos asexuales del pulgón del guisante. Por ejemplo, hemos encontrado que la penetración de los anticuerpos a los tejidos disminuyó en embriones gastrulating (etapas 8-10) y que los embriones con yemas de las extremidades morfológicamente identificables (etapas 13-14) eran apenas permeable al anticuerpo. Además, la tinción de fondo se visualizó en el vivíparo asexualnosotros los embriones pulgón del guisante teñidas utilizando el anticuerpo contra el marcador de la línea germinal Vasa, así como que contra la proteína Engrailed / Invected expresado en los segmentos embrionarias ^12,13. En realidad la tinción de fondo seguía siendo claramente visible en los embriones teñidos con el anticuerpo secundario solo.

Con el fin de aumentar la permeabilidad sin dañar la integridad de los tejidos de áfidos, que valora cuidadosamente la concentración de proteinasa K y se determinó las condiciones óptimas para la digestión del tejido con embriones de áfidos. Con el fin de evitar la tinción no específica en el pulgón del guisante, se realizaron búsquedas de compuestos que podrían bloquear con eficacia los embriones y reprimir la actividad de la peroxidasa endógena (POD), una enzima utilizada para amplificar señales durante inmunotinción. Un reactivo de bloqueo proporcionada por un digoxigenina (DIG) juego de tampones con base, en lugar del suero normal de cabra utilizado tradicionalmente (NGS) / albúmina de suero bovino (BSA), redujo significativamente la tinción de fondo. Por otra parte, el metanol se encontró que INHImordió la actividad POD endógena de manera más eficaz que el peróxido de hidrógeno (H _{2 O 2).} Los detalles relativos a estas condiciones de áfidos específica para la inmunotinción con embriones se describen en las siguientes secciones.

Protocol

1. Cultura de áfidos

NOTA:. La cepa de laboratorio de la partenogenética vivíparos pulgón del guisante Un pisum se recogió originalmente en el centro de Taiwan, y se ha criado en las plantas hospedantes (la sativum jardín guisante Pisum o haba Vicia faba) bajo largo día fotoperiodo para más de 300 generaciones (una generación: ~ 10 días).

1. La germinación de las semillas
   1. Remoje las semillas de plantas hospederas en agua del grifo durante 3-5 días a temperatura ambiente. Vuelva a llenar con agua dulce una vez al día.
      NOTA: Como alternativa, poniendo semillas de plantas huéspedes directamente en el suelo húmedo puede inducir la germinación también.
   2. Crece 10 semillas que germinan en una olla pequeña (9 cm de diámetro x 7 cm de altura) con el suelo en la cámara de crecimiento bajo fotoperíodo de 16 h luz / 8 h oscuridad a 20 ° C.
   3. Unos 10 días después empieza el crecimiento, transferir los áfidos sobre las plantas cuya altura es de más de 8 cm.
2. Transferencia de áfidos Mantenga cada maceta de plantas dentro de un vaso de vidrio de 1 litro, transferir 8 pulgones adultos sobre las plantas utilizando un pincel, y luego sellar el vaso con una cubierta permeable al aire como malla de gasa para evitar que los áfidos se escape.
3. Incubar pulgones en una cámara de crecimiento bajo fotoperíodo de 16 h luz / 8 h oscuridad a 20 ° C. Riegue cada maceta de plantas una vez al día.
4. Para la obtención de la próxima generación de pulgones, reiterar pasos 1.1.3-1.2.2 diez días después de la transferencia de áfidos primaria.

2. La disección y fijación de Ovarios

1. Recién preparar 4% de paraformaldehído (PFA) en 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) como tampón de fijación.
2. Llenar un pocillo de una placa de lugar con PFA (aproximadamente 500 l), colocar la placa bajo un microscopio estereoscópico a bajo aumento, y sumergir un áfido adulto dentro de la PFA para la disección.
3. Diseccionar ovarios mediante la celebración de la cabeza y el abdomen con un juego de pinzas, cortar y abrir el dorsalcutícula del abdomen, y arrastrando los ovarios lejos de la cavidad abdominal.
4. Fijar tres pares de ovarios en un tubo de 1,5 ml que contiene 1 ml de PFA a TA durante 20 min.
5. Tampón fijación Decantar con una pipeta de transferencia (ya sea de vidrio o desechables) y luego lavar ovarios con 0,2% Triton X-100 en PBS 1x (PBST) 3 veces durante 10 minutos cada uno. Leve temblor en un mezclador / rotador (ángulo de rotación: 60 ° (F60) / velocidad de rotación: 8 RPM) se recomienda tanto para la fijación y lavado.

3. El tratamiento con proteinasa K (PK) para aumentar la permeabilidad de los tejidos embrionarios

NOTA: El tratamiento PK se aplica a los embriones de extensión de banda de germen en adelante (etapa 11 del desarrollo). Para los embriones más jóvenes, este paso es opcional.

1. En serie diluir la solución madre de PK (10 mg / ml) con PBS 1x a la concentración de trabajo 1 g / ml.
2. Incubar ovarios con 1 mg / ml de PK (aproximadamente 500 l) durante 10 minutos con agitación suave.
3. Decantar PK solutiy luego lavar los ovarios con 700 l de glicina (2 mg / ml) 3 veces durante 5 minutos cada uno.
4. Lave ovarios con 0,2% PBST dos veces durante 10 minutos cada uno.
5. Fijar ovarios de nuevo con tampón de fijación durante 15 min a RT con agitación suave.
6. Desechar el sobrenadante y lavar ovarios con 0,2% PBST dos veces durante 10 minutos cada uno.

4. El metanol incubación para Suprimir la actividad de peroxidasa endógena (POD)

NOTA: incubación metanol no se aplica a los embriones sometidos a faloidina de tinción de anticuerpos o epítopos que son metanol sensible.

1. En serie deshidratar ovarios con diferente porcentaje de metanol en 0,2% PBST (v / v: 1: 3, 1: 1, 3: 1) mediante la incubación de los ovarios en cada concentración de la solución de metanol durante 10 min con agitación suave.
2. Deshidratar ovarios con 100% de metanol durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación suave.
   NOTA: Los resultados satisfactorios de tinción aún podían obtenerse a partir de tejidos de áfidos que se almacenaron en el 100% de metanol a -20 y# 176; C durante un mes.
3. En serie rehidratar ovarios con diferente porcentaje de metanol en 0,2% PBST (v / v: 3: 1, 1: 1, 1: 3) mediante la incubación de los ovarios en cada concentración de la solución de metanol durante 10 min con agitación suave.

5. Anticuerpo tinción

1. Diluir la solución 10x bloqueo del conjunto de búfer basado en DIG (DIG-B) a 1x.
   NOTA: La solución de bloqueo 1x DIG-B es más eficaz para reducir el fondo de tinción que el reactivo estándar de bloqueo compuesta de 5% (v / v) de suero de cabra normal (NGS) y 0,5% (v / v) de albúmina de suero bovino (BSA ) en 0,2% PBST.
2. Incubar los ovarios con la solución 1x DIG-B de bloqueo para 2,5 a 4 horas a RT o O / N a 4 ° C con agitación suave.
   NOTA: Para los tres pares de ovarios en un tubo de 1,5 ml, 200 l es el volumen mínimo para el bloqueo de la muestra y la tinción de anticuerpos.
3. Decantar el sobrenadante y reemplazarlo con solución de bloqueo 1x DIG-B fresco que contiene anticuerpo primario a diluti apropiadaen relación. Manchar los ovarios durante 4 horas a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C con agitación suave.
   NOTA: Para el experimento descrito aquí, utilice las siguientes diluciones óptimas de anticuerpos primarios: (1) anticuerpos ApVas1: 1: 500 para la tinción cromogénico, 1:50 para la tinción de inmunofluorescencia; (2) anticuerpo anti-tubulina α: 1: 500; (3) anticuerpo monoclonal 4D9: 1:25.
4. Lave ovarios con 0,2% PBST 4 veces durante 15 minutos cada uno.
5. Incubar ovarios con solución de bloqueo 1x DIG-B durante 1 hora a RT con agitación suave.
6. Decantar el sobrenadante y reemplazarlo con solución fresca bloqueo DIG-B 1x contiene anticuerpo secundario en relación de dilución apropiado. Manchar los ovarios durante 4 horas a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C con agitación suave.
   1. Utilice las siguientes relaciones de dilución de anticuerpos secundarios: (1) Para la tinción de inmunofluorescencia: 1: 500 de Alexa Fluor 633 cabra anti-IgG de conejo o Alexa Fluor 488 cabra anti-IgG de ratón; (2) Para la tinción cromogénico: 1: 200 para biotinilado de cabra anti-IgG de conejo.
      NOTA: El anticuerpo secundario biotinilado se aplica para interactuar con la avidina-biotina-complejo (ABC) en el (cromogénico) la detección basada en sustrato, a través del cual las señales de tinción se amplifican de manera significativa.
   2. Para la tinción de inmunofluorescencia, llevar a cabo la tinción en la oscuridad debido a que el anticuerpo secundario es sensible a la luz.
7. Lavar anticuerpo secundario con 0,2% PBST 4 veces durante 10 min cada uno.

6. Nuclear y F-actina tinción

NOTA: Esto sólo se aplica para la tinción de inmunofluorescencia.

1. Tinción de ovarios con 0,2% PBST que contiene DAPI (2 ng / l) y faloidina-TRITC (100 nM) durante 2 horas a RT en la oscuridad.
2. Lave ovarios con 0,2% PBST 4 veces durante 10 minutos cada uno.
3. Incubar ovarios con el medio de montaje O / N a 4 ° C con agitación suave.

7. Desarrollo de señal

NOTA: Esto sólo se aplica para la tinción cromogénico.

1. Preparar 100 l dereactivo de avidina-biotina-complejo (ABC) para la mejora de las señales mediante la adición de 1 l de Reactivo A (avidina) en 98 l de 0,2% PBST, mezclando bien a través de pipeteo suave, y la adición de 1 l de Reactivo B (biotina conjugado con peroxidasa de rábano picante ), seguido de una mezcla inmediata. Incubar la mezcla durante 30 min a TA con agitación suave.
2. Incubar ovarios (incluyendo las cámaras de huevo disociados) en la mezcla de los reactivos A y B durante 30 min a RT con agitación suave.
3. Lavar la mezcla de los reactivos A y B con 0,2% PBST 4 veces durante 10 min cada uno.
4. Transferencia de los ovarios sumergidas en PBST a un pocillo en la placa de punto con un cuentagotas de plástico.
5. Prepare la solución de sustrato de 3,3 'diaminobencidina (DAB): disolver una tableta DAB más otro que contiene peróxido de hidrógeno de urea en 1 ml de _ddH2O mediante vórtex vigorosamente durante 1 min.
   NOTA: DAB, precipitando un sustrato de peroxidasa, un cromógeno es popular para la inmunotinción. Produce una brpropia precipitado insoluble y después de ser oxidado por la peroxidasa. Las señales débiles se pueden mejorar mediante la adición de cloruro de níquel a la solución de sustrato (concentración final 0,05 a 0,08%).
6. Retire la solución PBST que queda en el pozo y vuelva a llenar con 100 l de la solución de sustrato DAB para el desarrollo de la señal.
7. Supervisar la intensidad de las señales bajo un microscopio estereoscópico a bajo aumento.
8. Deja de reacciones mediante la eliminación de la solución DAB, seguido por el rellenado de 1x PBS inmediatamente. Repita el lavado dos veces.
9. Traslado ovarios de nuevo al tubo de 1,5 ml y lavar con 1x PBS o PBST dos veces durante 15 minutos cada uno.
10. Incubar ovarios en un medio basado en glicerol de montaje (70% de glicerol) O / N a 4 ° C con agitación suave.

8. Montaje del áfido embriones

NOTA: El espesor de embriones de áfidos varía entre las etapas de desarrollo. Estrategias de montaje están por lo tanto modificarse para adaptarse a tempranas (germaria y etapas 0-10), MID (etapas11-18), y finales de embriones (etapas 19-20), que se demuestra en la Figura 2B - D. Puesta en escena embrionarias siguió Miura et al. ¹²

1. Traslado ovarios junto con medio de montaje a la bandeja de la célula con un gotero plástico y observar las muestras bajo un microscopio estereoscópico a bajo aumento.
2. Cortar los cálices asociados con el oviducto lateral con alfileres de insectos y luego transferir una ovariole aislado a un vaso vacío y con un gotero. Completar el volumen final a 50 a 100 l usando medio de montaje.
3. Transferir una ovariole sobre el portaobjetos con un gotero de vidrio y luego diseccionar cámaras de huevo utilizando pasadores de insectos.
   NOTA: Para los embriones mayores de la etapa 6 del desarrollo, se sugiere la separación de las cámaras de huevo; para germaria y las dos primeras cámaras de huevos menores de etapa 6, la separación es opcional.
4. Cambie de una cámara de huevos disecados a un portaobjetos limpio usando un gotero de vidrio.
5. Ponga un cubreobjetos (tamaño: 22 x 22mm) en los germaria disecados o cámaras de huevo (que contiene los embriones en etapas 1-10 del desarrollo) lentamente para evitar burbujas.
   1. Cámaras Monte de huevo (que contiene los embriones en etapas 11-18 del desarrollo) en una diapositiva con el puente cubreobjetos unilateral y colocar otro cubreobjetos (tamaño: 18 x 18 mm) en la parte superior de la muestra.
   2. Cámaras Monte de huevo (que contiene los embriones mayores de la etapa 19 del desarrollo) en un portaobjetos con dos caras puente cubreobjetos y colocar otro cubreobjetos (tamaño: 18 x 18 mm) en la parte superior de la muestra.
6. Llenar el espacio debajo de la parte superior cubreobjetos con medio de montaje para evitar el secado de la muestra.
7. Ligeramente rodar el embrión deslizando el cubreobjetos para obtener la orientación correcta para la observación.
8. Selle alrededor del borde del cubreobjetos (incluyendo los cubreobjetos puente) con esmalte de uñas.

Análisis 9. Imaging

1. Fotografía de contraste de interferencia diferencial (DIC) imágenes de todo el montaje embriones con un compound microscopio equipado con óptica DIC y una lente objetivo seco (10X, 20X, 40X) conectado a una cámara. Instalar el software para la transferencia de imágenes entre la cámara y el ordenador con las instrucciones del fabricante.
2. Adquirir las proyecciones de los embriones marcados con fluorescencia con un microscopio confocal láser de barrido ^14. Siga las instrucciones del fabricante para fotografiar, z-apilamiento, y 3D se proyecta con software de imágenes.
   1. Gire la corredera al revés, encontrar la muestra montada con 10 veces más objetiva, y la vuelta al área de la muestra con una pluma a base engrasada bien.
      NOTA: Esto hace que la identificación de la muestra más fácil cuando se busca a través de los objetivos de un microscopio confocal.
   2. Añadir una gota de aceite en la parte superior del área cubreobjetos cuyo lado opuesto se etiqueta como se describe en 9.2.1.
3. Encuentra el plano focal a 40X objetivo de inmersión en aceite y luego cambiar a un objetivo de inmersión en aceite 63X. Mueva manualmente el control de enfoque fino y hacerwn para capturar el mejor plano focal.
   NOTA: Para la observación de detalles estructurales de germaria y principios de los embriones, sugerimos usar 40X objetivos o aquellos con mayor aumento.
4. Analiza el embrión en diferentes canales de excitación y de obtener una imagen de z-stack.
   NOTA: Para los tejidos de pulgón del guisante, reducir el espesor de cada sección óptica hasta 1,5 micras o menos.

Representative Results

En este estudio, hemos realizado todo el montaje-inmunotinción con embriones de áfidos del guisante asexuales (Figura 1A). Estas hembras producen crías partenogenéticamente y vivíparas. Estos embriones femeninos se desarrollan dentro de las cámaras de huevo de los túbulos de ovario (ovarioles) (Figura 1B y la Figura 2A). Antes de la microscopía, las ovarioles disecados son los objetivos de tinción; sin embargo, se requiere la separación de cámaras de huevos para la observación de los embriones en el microscopio (Figura 2B - D).

Aumento de la permeabilidad del tejido

Tratamiento con proteinasa K (PK) es un enfoque estándar para la mejora de la permeabilidad del tejido, pero para los embriones de algunos organismos, tales como modelo Caenorhabditis elegans (nematodos), Drosophila melanogaster (mosca), y (Danio rerio-Este pez cebra) paso es opcional. En el pulgón del guisante, el requisito de tratamiento PK es dependiente de la etapa: para germaria y embriones antes de la gastrulación (etapas 0-7), el tratamiento PK se puede omitir; pero para los embriones menores de extensión germband (etapa 11) o en etapas posteriores es muy recomendable este paso. Por ejemplo, durante la embriogénesis señales mediados apenas se detectó en los embriones sin tratamiento PK (Figura 3A - C). Por el contrario, la intensidad de la señal fue significativamente mayor en los embriones sometidos a digestión con PK (Figura 3A '- C', A "- C").

La reducción de la tinción de fondo

Un alto nivel de la actividad peroxidasa endógena (POD) fue identificado en los tejidos embrionarios de áfidos. Para suprimir esta actividad enzimática, los embriones paraformaldehído fijo se incubaron en presencia de HYdrogen peróxido (H _{2 O 2),} un reactivo común para la oxidación de POD. Nuestros resultados mostraron _que el H 2 _O 2 tratamiento no suprimió la actividad endógena de POD con eficacia en los embriones en etapa tardía (Figura 4A, D). Por el contrario, la tinción de fondo se redujo en gran medida en los embriones sometidos a incubación metanol (Figura 4B, C, E, F). Antes de la aplicación de los embriones de anticuerpos primarios fueron bloqueados en solución que contiene NGS y BSA como se describe en los protocolos estándar para la tinción de anticuerpos. Sin embargo, la tinción de fondo residual en los embriones de áfidos se detectó (Figura 3A '- C'). Este problema se resolvió después de reemplazar NGS / BSA con el reactivo de bloqueo suministrado por un conjunto de amortiguación para los experimentos de etiquetado DIG tales como la hibridación in situ (Figura 3A "- C"). Por lo tanto, concluimos que después de la fijación con metanol y la incubación con el DIG-Breactivo de bloqueo son esenciales para reducir la tinción de fondo en los embriones de áfidos.

Tratamiento PK y el reactivo de bloqueo DIG-B son necesarios no sólo para la detección de la señal efectiva utilizando los métodos cromogénicos sino también fluorescentes. Tinción con faloidina o Actina tinción para epítopo de metanol sensible, sin embargo, no funciona en los embriones sometidos a pre-fijación con metanol, que puede destruir la forma nativa de la actina o anticuerpos. Por consiguiente, este tratamiento se debe evitar cuando se realiza la inmunotinción de fluorescencia. Aparte de la eliminación de las etapas de tratamiento metanol inmunofluorescencia permite experimentos multi-etiquetado en los embriones de áfidos. Usando microscopía confocal, por ejemplo, proteína de guisante áfido Vasa1 (ApVas1) en las células germinales, α-tubulina en microtúbulos, F-actina en los microfilamentos, y el ADN en los núcleos podría ser al mismo tiempo marcado y se visualizó (Figura 5A, C). En comparación con la CHROmétodo mogenic (Figura 5B), confocal seccionar muestras de la etiqueta fluorescente proporciona una mejor resolución de las señales localizadas como ApVas1 en las células germinales de germoplasma y cellularizing en embriones de áfidos temprano (Figura 5C ', D - D "). La adopción de las condiciones de etiquetado células germinales descritos anteriormente, la proteína Engrailed / Invected en los segmentos de la banda de germen se extiende también estaba manchada con el anticuerpo 4D9 (Figura 6). Esto demuestra que nuestro protocolo de inmunotinción-incluyendo cromogénicos y fluorescentes métodos se pueden aplicar de manera efectiva a la señal de detección tanto en la línea germinal y linajes de células somáticas en áfidos.

Figura 1. partenogenética áfidos del guisante vivíparos. (A) Un primer estadío ninfa que emerge de una asexual hembra adulta vivíparos. (B 12. Un ovariole contiene una germarium en la punta (flechas), 1-2 y 5-7 ovocitos cámaras embrionarias. Gut y cauda se asocian generalmente con los ovarios disecados. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Ilustración de las estrategias para el montaje de áfidos embriones en diferentes etapas de desarrollo. (A) Esquema de desarrollo embrionario en el ovariole diseccionado a partir de una hembra adulta partenogenética vivíparos. Ovogénesis Breve (escenario y etapas 0-2 germarial) es seguido por embriogénesis (etapas 3-20). Esquema de la embriogénesis: f ormación del blastodermo sincitial (estadios 3-5); blastulación (estadios 6-7); gastrulación (etapas 8-10); alargamiento de la banda de germen (etapas 11-14); katatrepsis (etapas 15); puesto katatrepsis y germen de retracción banda (etapas 16-17); organogénesis (etapas 18-20). Teclas de color son en la parte inferior de la figura. (B, B ') germarium y etapas 0-10 embriones. No se requiere ningún puente cubreobjetos. (C, C ') Etapas 11-18 embriones. Se requiere un puente cubreobjetos. (D, D ') Etapas 19-20 embriones. Se requieren puentes dobles cubreobjetos. Rueda de los embriones deslizando el cubreobjetos puede crear diferentes ángulos de observación. Los tamaños de los cubreobjetos: 22 x 22 mm en (B), 18 x 18 mm en (C) y (D). El espesor de cubreobjetos: 0,13 a 0,16 mm. Puesta en escena embrionarias siguió Miura et al ¹² Abreviaturas: g:. Germarium; st: etapa..com / files / ftp_upload / 53883 / 53883fig2large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

. Figura 3. proteinasa K tratamiento y comparación de los reactivos con diferentes efectos de bloqueo anterior de cámaras de huevo es a la izquierda; todas las vistas lateral, excepto embriones son mostrados en (B ", C ', C"), que son dorsal. Los embriones están teñidas utilizando anticuerpos ApVas1 (dilución 1: 500) y las señales de ApVas1 se desarrollan dentro de 10-20 seg. Las puntas de flecha indican la ubicación de las células germinales. (A - C) Los embriones sin tratamiento de proteinasa K (PK). Señales ApVas1 en células germinales apenas se detectan. (A '- C', A "- C") Comparación de la tinción de fondo en bloque embrionesked con NGS y BSA (A '- C') y del reactivo de bloqueo comercial en el DIG Lavado y Block Buffer Set (DIG-B) (A "- C"). Antecedentes se reduce significativamente en embriones que se muestran en (A "- C"). Abreviatura: b: las bacterias. Las barras de escala:. 100 m Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

. Figura 4. Reducción al mínimo la tinción de fondo con metanol anterior de embriones está a la izquierda; todas las opiniones son dorsal. Los embriones se trataron con PK para aumentar la permeabilidad de anticuerpo. Las puntas de flecha indican la ubicación de las células germinales. (A, B, D, E) Comparación de los tratamientoscon peróxido de hidrógeno (H _{2 O 2)} y metanol. Los embriones solamente se tiñen con el anticuerpo secundario. H _{2 O 2} de tratamiento (0,3% w / v, 10 min): alto fondo (A, D); tratamiento con metanol (100%, 60 min): bajo fondo (B, E). (C, F) tinción de anticuerpos primaria en embriones tratados con metanol. Condiciones de tratamiento con metanol son idénticos a los utilizados para los embriones que se muestran en (B, E). El anticuerpo ApVas1 marca preferentemente las células germinales embrionarias. Las barras de escala:. 100 m Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5. tinción de inmunofluorescencia en embriones tempranos. (A, C - D) y 1: 500 en (B). (A) señales de tinción, que incluyen ApVas1, α-tubulina, actina F, y el ADN nuclear, se detectan utilizando cuatro canales con diferentes longitudes de onda. Teclas de color de las señales se muestran en la parte inferior de la figura. Imagen (B) DIC de un resultado cromogénico para la comparación. ApVas1 se enriquece en el germarium mientras que la intensidad de contraste de la localización posterior de ApVas1 (puntas de flecha) en la etapa-3 embrión no es tan clara como la que se muestra en (C, C '). (C, C ') Enriquecimiento de señales ApVas1 en la parte posterior de huevo. Las señales localizadas en la región posterior de la cámara de huevos (puntas de flecha) se ven reforzadas por imagen de apilamiento. Debido a que las señales de F-actina y α-tubulina parcialmente enmascaran los de ApVas1 en el posterior (C), una imagen producida por la exploración de un solo canalizado se muestra en (C '). (D - D '') de seccionamiento confocal de ApVas1 localizada en la región posterior de la etapa-4 embrión. Las imágenes mostradas en (D) y (D ') se ApVas1 detectados en la superficie y planos focales centrales, respectivamente. (D ") es la imagen resultante de la concentración de todas las secciones de la misma embrión como (D) y (D ') Abreviaturas: como: aster; fc, las células del folículo; poc, prospectivo ovocito; sp:. Husillo; tc, cuerdas tróficos. Las barras de escala:. 10 micras Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6. La inmunotinción en los segmentos embrionarias. Unterior de las cámaras de huevo está a la izquierda. PK embriones tratados se tiñen con el anticuerpo monoclonal 4D9 contra Engrailed / Invected, que se expresan en los segmentos embrionarias. Teclas de color de las señales se muestran en la parte inferior de la figura. (A, A ') La tinción de inmunofluorescencia en un escenario-13 embrión. (A), una imagen confocal apilada a partir de imágenes de Engrailed / Invected, α-tubulina, F-actina, y tinciones de ADN nuclear. (A ') una imagen confocal que muestra la tinción de sólo el Engrailed / Invected. Sin la interferencia de señales de otros canales, están mejor muestran señales. Tinción (B, C) ​​cromogénico en embriones en las etapas 13 y 17 del desarrollo, respectivamente. (B) Etapa 13 embriones. (C) Etapa 17 embriones. Desde las etapas 13 a 17, el creciente número de segmentos en el abdomen son etiquetados por 4D9. (D) Control negativo (-Ctrl) manchaing solamente con el anticuerpo secundario conjugado con Alexa Fluor 633. Casi no hay señales de inmunotinción se detectan en ovariole sin anticuerpo primario. Sin embargo, la autofluorescencia de bacterias (línea discontinua) dentro de la etapa 7 y 13 cámaras de huevo se detectan en la longitud de onda de excitación de 488 nm. Abreviaturas: A: el abdomen; b: bacterias; H: la cabeza; T: tórax. Las barras de escala:. 100 m Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Identificamos óptimas condiciones críticas para la inmunotinción éxito en el pulgón del guisante A. Pisum, un organismo modelo emergente para estudios genómicos y de desarrollo ^3,15. Condiciones optimizadas para aumentar la permeabilidad del tejido y la reducción de la tinción de fondo mejorado la intensidad y especificidad de las señales. Se diferencian de los protocolos estándar para la inmunotinción en otros modelos animales en los pasos para la creación de poros en las membranas celulares y anticuerpo bloqueante unión no específica.

Para la inmunotinción e hibridación in situ, proteinasa K (PK) digestión es uno de los enfoques comunes para el aumento de la permeabilidad del tejido ^{de 16-19.} En la tinción de anticuerpos de los tejidos de áfidos, nuestros resultados mostraron que: (1) digestión con PK mejora de forma significativa las señales de inmunotinción en los embriones vivíparos parthenogenetic durante germen de extensión de banda (etapas 11-14) (Figura 3B '', C ''), aunqueseñales débiles eran todavía visibles en los embriones que carecen de tratamiento PK (Figura 3B, C); y (2) la digestión PK era obligatorio para los embriones de katatrepsis en adelante (etapas 15-20) (Figura 4 C, F y Figura 6C). Para los embriones vivíparos asexuales antes katatrepsis, el volumen de las cámaras de huevo es poco probable que la causa del problema de penetración debido a inmunotinción con éxito en embriones tempranos ovíparos sexuales que residen en los huevos -que establecidas son casi equivalentes en tamaño a la más madura chamber- huevo asexual no requiere digestión con PK ^20. Por lo tanto, la elongación y el plegado de la banda de germen (etapas 11 a 14) en el espacio limitado de las cámaras de huevo asexuales puede dificultar la entrada de anticuerpo, y es PK que permite la penetración de anticuerpo mediante la creación de poros en las membranas celulares entre el estructuras embrionarias atascadas. Por el contrario, la extensión de la línea recta de la banda de germen en los huevos sexuales puede explicar por qué se tiñó incluso enla ausencia de PK. La eliminación de la envoltura vitelina / corion también puede hacer que los embriones ovíparos sexuales más accesible a los anticuerpos. Para los embriones después katatrepsis (etapas 16 a 20), el tratamiento de PK es esencial para ambos morfos asexuales y sexuales porque los embriones son gruesas cuticled ¹⁹ (Figura 4 C, F y Figura 6C).

No obstante, la condición sugerido para la digestión PK (1 mg / ml para 10 min) requiere un ajuste si la integridad de las estructuras embrionarias o la intensidad de las señales no es satisfactoria. Esto es causado principalmente por la actividad de PK que puede variar de lote a lote. Por ejemplo, si se dañan los tejidos embrionarios PK después de la digestión, la concentración de PK se puede reducir a 0,5 mg / ml. Del mismo modo, si la intensidad de la señal es débil, por lo tanto se recomienda la extensión de la incubación de 15 a 20 min. Los embriones más maduros (etapa 20) sometidos a la incubación PK prolongada hasta 20 min a / ml de concentración 1,0 mg, However, por lo general muestra señales débiles, lo que sugiere que la digestión PK es todavía incompleta. La digestión prolongada puede mejorar las señales de tinción, pero es opcional, especialmente cuando los patrones de expresión detectado en la etapa 18 embriones son similares a los de la etapa 20 embriones. En comparación con los embriones en la etapa 20 del desarrollo, la etapa 18 embriones con morfología similar pero con menor cantidad de la cutícula del cuerpo en general, puede producir una intensidad de señal más fuerte.

Durante el desarrollo de la señal, la tinción de fondo puede ser elevado por la actividad de las enzimas endógenas que puedan reacción cruzada con los sustratos. En los embriones pulgón del guisante, la actividad de la fosfatasa alcalina endógena (AP) y peroxidasa (POD), ambos de los cuales son conjugados de anticuerpos comunes para digerir sustratos de señal, se detectó. Actividad de la hidrolasa endógena del AP podría ser suprimida de manera efectiva a lo largo de la embriogénesis por levamisol (datos no mostrados). Sin embargo, el tratamiento de embriones con 0,3 hasta 0,6% Hydrogen peróxido (H _{2 O 2) sólo} podría eliminar la actividad POD endógena antes de katatrepsis pero no fue suficiente para los embriones de más edad (Figura 4A, D). El metanol de la incubación, un enfoque alternativo para desnaturalizar proteínas endógenas, se demostró ser eficaz en los áfidos ²¹ (Figura 4B, E). A diferencia de H _{2 O 2, que daña} pulgón tejidos durante la incubación prolongada de 30 minutos o más, el metanol no digerir o deformar los embriones durante cualquier etapa de desarrollo (Figura 4 C, F). En consecuencia, el metanol es una mejor alternativa para la supresión de la actividad de POD endógena en embriones de áfidos. Si se detecta la tinción de fondo residual, que generalmente ocurre a los embriones maduros con una capa engrosada de la cutícula, O / N en metanol de incubación a 4 ° C-acuerdo con nuestra experiencia-puede reducir aún más la actividad de POD endógeno.

Tinción de fondo residual se detectó enembriones bloqueados con proteínas de suero tales como suero normal de burro (NDS), suero de cabra normal (NGS), albúmina de suero bovino (BSA), o sus mezclas ¹³ (Figura 3A'-C '). La adopción de un reactivo de bloqueo suministrado comercialmente utilizado para la hibridación in situ, por el contrario, el fondo restante durante la inmunotinción podría ser significativamente eliminado ⁵ (Figura 3A '' - C ''). Aunque los ingredientes del reactivo de bloqueo son propiedad, es probable que contiene proteínas no séricas que pueden bloquear epítopos no específicos de las proteínas pulgón del guisante. El reactivo de bloqueo también trabajó mucho mejor que los sueros de los animales en el pulgón del durazno Myzus persicae verde. Asimismo, en M digestión con PK persicae y la incubación metanol dio lugar a la penetración satisfactoria de anticuerpo y la reducción de fondo -. Similares a los resultados mejorados obtenidos en A. pisum (datos no mostrados). Anticipamos que las condiciones Optimized para aumentar la permeabilidad de los tejidos y la reducción de fondo, si se utiliza tinción cromogénico o fluorescencia, se aplicará a muchas otras especies de áfidos.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% hydrogen perxidase (H2O2)	Sigma-Aldrich	18304	For bleaching endogenous peroxidase of embryos.
4’6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542	For labeling the double-strand DNA. TOXIC. Wear gloves, dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure
4D9 anti-engrailed/invected mouse monoclonal antibody	Developmental studies hybridoma bank	AB_528224	For labeling the developing segments of embryo.
ApVas1 rabbit polyclonal antibody	Our laboratory	N/A	For labeling the aphid germline specific Vas1 protein in embryos. This antibody was made by our laboratory.
Austerlitz Insect pins	ENTOMORAVIA	N/A	For seperating each egg chambers from an ovariole. Size 000, BLACK ENAMELLED.
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	9048-46-8	For blocking the non-specific binding of antibodies.
Camera connted to compound microscope	Canon	EOS 5D	For photographing of aphid embryos.
Colorimetric 8 cell tray	Kartell Labware	357	For developing the staining signal of aphid embryos. Diameter 95 x 57 mm, cell depth 2 mm.
Compound microscope with DIC optics	Leica Microsystems	DMR	For photographing of aphid embryo mounted on the slides.
DIG Wash and Block Buffer Set	Sigma-Aldrich (Roche)	11585762001	For blocking the non-specific binding of antibodies. We diluted the 10x Blocking solution into 1x as blocking reagent.
Forceps	Ideal-tek	N/A	For dissection of ovaries from aphids. Manufacturer part No 5: 5 SA.
Glass dropper	N/A	N/A	For transfering ovaries of aphids from the splot plate to tubes. 150 mm of total length and 5 3/4" of tip length.
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	For clearing of aphid embryos and mounting.
Glycine	Bioshop	N/A	For blocking the enzyme activity of proteinase K (PK).
Goat anti-mouse IgG conjugated Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11017	For detection of primary antibody from mouse.
Goat anti-rabbit IgG conjugated Alexa Fluor 633	Invitrogen	A21072	For detection of primary antibody from rabbit.
Intelli mixer	ELMI laboratory equipment	RM-2M	For improving the thorughly reaction of reagents with ovaries.
Laser-scanning confocal microscopy	Leica Microsystems	SP5	For photographing of aphid embryo mounted on the slides with florecent tag.
methanol	Burdick and Jackson	AH2304	For bleaching endogenous peroxidase of embryos.
Microscope slides	Thermo scientific	10143560	For mounting of embryos. SUPERFROST ground edges, ca./env. 76 x 26 mm.
Microscope Cover glasses	Marienfeld	0101030	For mounting embryos on the slides. Size 18 x 18 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
Microscope Cover glasses	Marienfeld	0101050	For mounting embryos on the slides. Size 22 x 22 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
mouse monoclonal anti-alphaTubulin antibody (DM1A)	Santa Cruz Biotechnology	sc-32293	For labeling the distrbution of alpha-tubulin of cells.
Nail polish	N/A	N/A	For sealing the coverslips on the slides.
Normal goat serum (NGS)	Sigma-Aldrich	G9023	For blocking the non-specific binding of antibodies.
Paraformaldehyde (PFA)	VWR	MK262159	For fixation of aphid ovaries.
Phalloidin-TRITC	Sigma-Aldrich	P1951	For labeling the distrbution of F-actin on embryos.
Phosphate-buffered saline (PBS)	N/A	N/A	As isotonic solution for aphid ovaries.
Plastic dropper	N/A	N/A	For transfering ovaries of aphids from tube to cell tray. Size 3 ml.
Proteinase K	Merck	124678	For creating pores (punching) on the cell membrane and facilitating the access of antibodies.
Pyrex spot plate	N/A	N/A	For dissection and color reactions of aphid ovaries under microscopy. Each cavity with diameter 22 mm and  depth 7 mm.
SIGMAFAST 3,3’-diaminobenzidine (DAB) tablets	Sigma-Aldrich	D4168	For developing of substrated signals. Also called DAB peroxidase substrate tablet set.
Stereo microscope	Leica Microsystems	EZ4	For dissection and observation of aphid ovaries.
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	T8787	For creating pores (punching) on the cell membrane.
VECTASHIELD Elite ABC Kit (Rabbit IgG)	Vector laboratories	PK-6101	For enhancement of the signal. Including of biotinylated goat anti-rabbit IgG secondary antibody, A and B reagents.
VECTASHIELD mounting medium	Vector laboratories	H1000	For clearing of aphid embryos and mounting.