Identifizierung kritischer Bedingungen für die Immunfärbung in der Erbsenblattlaus Embryos: Erhöhung Gewebepermeabilität und abnehmender Hintergrundfärbung

Abstract

Die Erbsenblattlaus Erbsenlaus, mit einem sequenzierten Genoms und reichlich phänotypische Plastizität, hat sich zu einem aufstrebenden Modell für genomische und Entwicklungsstudien. Wie andere Blattläuse, A. Pisum ausbreiten schnell über parthenogenetic viviparous Vervielfältigung, in denen die Embryonen im Ei Kammern in einem Fließband in der Ovariole. Bisher haben wir eine robuste Plattform von ganzen-mount in situ Hybridisierung ermöglicht Detektion von mRNA-Expression in den Blattlaus Embryonen etabliert. Zur Analyse der Expression von Protein, obwohl, etablierten Protokolle für die Immunfärbung der Ovariolen der asexuellen viviparous Blattläuse nicht zu befriedigenden Ergebnissen. Bedingungen für die Erhöhung der Gewebepermeabilität und Verringern der Hintergrundfärbung, die beide Probleme bei der Anwendung von etablierten Ansätzen optimiert berichten wir hier. Optimierungen umfassen: (1) Inkubation mit Proteinase K (1 ug / ml, 10 min), die wesentlich f gefunden wurdeoder Antikörper-Penetration in mittleren und späten Stadium Blattlaus Embryonen; (2) Austausch von normalem Ziegenserum / Rinderserumalbumin mit einem Blockierungsreagenz durch eine Digoxigenin (DIG) geliefert -basierte Puffer gesetzt und (3) Anwendung von Methanol statt Wasserstoffperoxid (H _{2 O 2)} zum Bleichen von endogenen Peroxidase; welche deutlich reduziert die Hintergrundfärbung in der Blattlaus Gewebe. Diese kritischen Bedingungen für die Immunfärbung optimiert werden effektive Erkennung von Genprodukten in den Embryonen von A. Pisum und andere Blattläuse zu ermöglichen.

Introduction

Blattläuse sind hemipteran Insekten mit kleinen (1-10 mm) weichen Körper. Sie ernähren sich von Pflanzen durch das Saugen Phloemsaft mit stechenden Mundwerkzeuge. Darüber hinaus setzen sie auf eine obligate Endosymbionten Bakterium, Buchnera aphidicola, um essentiellen Aminosäuren, die einen Mangel an der Phloemsaft Ernährung sind zu synthetisieren. Blattläuse haben einen komplexen Lebensgeschichte, die parthenogenetic viviparous Reproduktion im Frühjahr und Sommer Langtagsphotoperioden und sexuelle oviparous Wiedergabe durch Kurztagsphotoperioden, in denen sie eine begrenzte Anzahl von überwinternden Eiern ^1,2 lag ausgelöst umfasst. Im Frühjahr diesen Eiern schlüpfen, um die erste Generation der rein weiblichen Blattläusen (fundatrices) zu produzieren, nach vielen Runden parthenogenetic Wiedergabe bis in den Herbst. Die zyklische Parthenogenese in Blattläuse, wo asexuelle und sexuelle Phasen wechseln im jährlichen Lebenszyklus hat sich als eine evolutionäre Neuheit ^1,2 angesehen. In den parthenogenetic viviparous BlattläuseNimmt der Embryogenese innerhalb Ei Kammern der Eierstock-Tubuli (Ovariolen). Im Gegensatz dazu entwickeln sexuelle oviparous Embryonen in die befruchtete Eier. Abgesehen von der reproduktiven Plastizität kann Blattläuse transgeneFlügel polyphenism Anzeigen: als Antwort auf Überbelegung Signale und Raubtier-Bedrohungen können die unwinged asexuelle Weibchen lebendgebärender produzieren geflügelten Nachkommen für Langstreckenwanderung. Veröffentlichung der Genomsequenz des Erbsenblattlaus Erbsenlaus -die erste Genomsequenz für eine basale hemimetabolous insekten ermöglicht die weitere Erforschung der reproduktiven Plastizität Flügel polyphenism und weitere Funktionen, darunter Insekten-Pflanzen-Interaktionen, virale Vectoring und Symbiose in Blattläuse auf molekularer Basis ^3.

Zusätzlich zu dem sequenzierten Genoms werden Werkzeuge zum Charakterisieren Genexpression und die Funktion zur Förderung der Erbsenblattlaus als reife Modellorganismus ⁴ erforderlich. Wir haben robuste Protokolle der ganzen-mount beschrieben 5-7. RNA-Interferenz (RNAi) durch doppelsträngige RNA-Injektion und Fütterung für Gen-Silencing in Blattlaus Nymphen und Erwachsene verwendet worden, aber stabilen Bedingungen für die Gen in den Embryonen Knockdown noch nicht gemeldet ^8-10. Immunfärbung, ein Antikörper-basierten Ansatz, der Protein-Expression in Proben nachweisen kann vor und nach RNAi hat auf Erbsenblattlaus Embryonen ^11-13 durchgeführt. , Erhöhung der Gewebe Durchlässigkeit und Eliminierung von Hintergrundfärbung sind jedoch noch nicht zufriedenstellend Verwendung von Standardprotokollen für die Immunfärbung in der asexuellen viviparous Embryonen von Erbsenblattlaus. Beispielsweise fanden wir, dass das Eindringen von Antikörper zu den Geweben verringert in gastrulating Embryonen (Stufen 8-10), und dass Embryonen morphologisch identifizierbaren Extremitätenknospen (Stufen 13-14) waren kaum durchlässig für Antikörper. Darüber hinaus wurde die Hintergrundfärbung in der ungeschlechtlichen viviparo visualisiertus Erbsenblattlaus Embryonen färbt unter Verwendung von Antikörper gegen die Keimbahn Marker Vasa als auch die gegen das Engrailed / Invected Protein in den embryonalen Segmente ^12,13 ausgedrückt. Tatsächlich Hintergrundfärbung noch in Embryonen mit dem sekundären Antikörper allein gefärbt deutlich sichtbar.

Um die Durchlässigkeit ohne Beschädigung Integrität Blattlaus Geweben erhöhen wir sorgfältig titriert die Konzentration von Proteinase K und bestimmt optimale Bedingungen für die Gewebeverdauungs auf Blattläuse Embryonen. Um nicht-spezifische Färbung in der Erbsenblattlaus zu vermeiden, suchten wir nach Verbindungen, die effektiv blockieren könnten Embryonen und zu unterdrücken Aktivität von endogenen Peroxidase (POD), ein Enzym zur Verstärkung von Signalen während der Immunfärbung eingesetzt. Ein Blockierungsmittel durch eine Digoxigenin (DIG) basierende Puffersatz vorgesehen ist, sondern die traditionell verwendet normalem Ziegenserum (NGS) / Rinderserumalbumin (BSA), deutlich reduziert Hintergrundfärbung. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass Methanol InHiBit des endogenen POD-Aktivität wirksamer als Wasserstoffperoxid (H _{2 O 2).} Einzelheiten bezüglich dieser Blattlaus-spezifischen Bedingungen für die Immunfärbung an Embryonen wird in den folgenden Abschnitten beschrieben werden.

Protocol

1. Kultur der Blattläuse

. HINWEIS: Der Laborstamm des parthenogenetic viviparous Erbsenblattlaus A pisum wurde ursprünglich in der Zentral-Taiwan gesammelt und hat sich auf Wirtspflanzen (der Gartenerbse Pisum sativum oder Saubohne Vicia faba) unter Langtagsphotoperiode für mehr als 300 Generationen erzogen worden (einer Generation: ~ 10 Tage).

1. Keimung von Samen
   1. Weichen Sie die Samen der Wirtspflanzen in Leitungswasser für 3-5 Tage bei RT. Nachfüllen mit frischem Wasser einmal pro Tag.
      HINWEIS: Alternativ setzen Samen der Wirtspflanzen direkt in feuchten Boden kann die Keimung sowie zu induzieren.
   2. Wachsen 10 keimenden Samen in einem kleinen Topf (Durchmesser von 9 cm x 7 cm hoch) mit Erde in der Wachstumskammer unter Photoperiode 16 Stunden Licht / 8 Stunden Dunkelheit bei 20 ° C.
   3. Über 10 Tage nach Wachstum beginnt, übertragen Blattläuse auf Pflanzen, deren Höhe mehr als 8 cm.
2. Übertragung der Blattläuse Halten Sie jeden Topf von Pflanzen in einem 1 L Becherglas, übertragen 8 erwachsene Blattläuse auf Pflanzen mit einem Pinsel, und dann verschließen Sie den Becher mit einem luftdurchlässigen Abdeckung wie Gaze Mesh Blattläuse der Flucht zu hindern.
3. Blattläuse in einer Wachstumskammer inkubieren Photoperiode 16 Stunden Licht / 8 Stunden Dunkelheit bei 20 ° C. Wasser jeden Blumentopf von Pflanzen jeden Tag neu.
4. Zum Erhalt der nächsten Generation von Blattläusen, wiederhole Schritte 1.1.3-1.2.2 zehn Tage nach der primären Blattlaus Übertragung.

2. Dissection und Fixierung der Eierstöcke

1. Frisch in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) als Fixierungspuffer Herstellung von 4% Paraformaldehyd (PFA).
2. Füllen Sie eine Vertiefung einer Tüpfelplatte mit PFA (etwa 500 ul), legen Sie die Platte unter einem Stereomikroskop bei geringer Vergrößerung, und tauchen Sie ein Erwachsener Blattlaus in der PFA für die Präparation.
3. Sezieren Eierstöcken, indem Sie den Kopf und Bauch mit einem Satz von Zangen, Aufschneiden der RückenKutikula des Bauches, und Ziehen der Eierstöcke von der Bauchhöhle.
4. Fix drei Paare von Eierstöcken in ein 1,5 ml Röhrchen, enthaltend 1 ml PFA bei RT für 20 min.
5. Dekantieren Fixierungspuffer mit einer Transferpipette (Glas- oder Einweg) und waschen Sie die Eierstöcke mit 0,2% Triton X-100 in 1 × PBS (PBST) 3-mal für jeweils 10 min dann. Mild Schütteln auf einem Mischer / Rotator (Drehwinkel: 60 ° (F60) / Drehzahl: 8 RPM) ist sowohl für die Fixierung und spülmaschinengeeignet.

3. Die Behandlung mit Proteinase K (PK), die Permeabilität Embryonalgewebe Erhöhen

HINWEIS: PK Behandlung Embryonen aus Keimband Erweiterung Weiter (Stufe 11 der Entwicklung) angewandt. Für die jüngeren Embryonen, ist dieser Schritt optional.

1. Seriell verdünnter die Stammlösung von PK (10 mg / ml) mit 1x PBS auf die Arbeitskonzentration 1 ug / ml.
2. Eierstöcke mit 1 ug / ml PK (etwa 500 ul) Inkubieren für 10 min mit leichtem Schütteln.
3. Dekantieren PK solutiauf und dann waschen die Eierstöcke mit 700 & mgr; l von Glycine (2 mg / ml) 3 Mal für jeweils 5 Minuten.
4. Zweimal waschen Eierstöcke mit 0,2% PBST 10 min je.
5. Fix Eierstöcke wieder mit Fixations Puffer für 15 min bei RT mit mildem Schütteln.
6. Überstand verwerfen und waschen Eierstöcke mit 0,2% PBST zweimal je 10 min.

4. Methanol Inkubation zur Unterdrückung der endogenen Peroxidase (POD) Aktivität

HINWEIS: Methanol Inkubation ist nicht auf Embryonen Phalloidin-Färbung oder Antikörper-Epitope, die Methanol empfindlich sind zogen angewendet.

1. Seriell dehydratisieren Ovarien mit unterschiedlichen Prozentsatz von Methanol in 0,2% PBST (v / v: 1: 3, 1: 1, 3: 1) durch Inkubation Ovarien bei jeder Konzentration von Methanol-Lösung für 10 min unter leichtem Schütteln.
2. Dehydratisieren Ovarien mit 100% Methanol für 1 h bei RT mit mildem Schütteln.
   HINWEIS: Zufriedenstellende Ergebnisse der Färbung konnte immer noch von Blattlaus Gewebe, die in 100% Methanol bei gespeichert wurden erhalten -20 &# 176; C für einen Monat.
3. Seriell rehydrieren Ovarien mit unterschiedlichen Prozentsatz von Methanol in 0,2% PBST (v / v: 3: 1, 1: 1, 1: 3) durch Inkubation Ovarien bei jeder Konzentration von Methanol-Lösung für 10 min unter leichtem Schütteln.

5. Antikörper-Färbung

1. Verdünnen Sie den 10x Blockierungslösung aus dem DIG-basierten Puffersatz (DIG-B) auf 1x.
   HINWEIS: Die 1x DIG-B Blockierungslösung ist effektiver zur Verringerung des Hintergrundfärbung als die Standard-Blockierungsmittel aus 5% (v / v) normales Ziegenserum (NGS) und 0,5% (v / v) Rinderserumalbumin (BSA ) in 0,2% PBST.
2. Inkubieren der Eierstöcke mit dem 1x DIG-B Blockierungslösung für 2,5 bis 4 h bei RT oder O / N bei 4 ° C mit mildem Schütteln.
   HINWEIS: drei Paare von Eierstöcke in einem 1,5-ml-Röhrchen, beträgt 200 & mgr; l und dem minimalen Volumen für Proben Sperrung und Antikörperfärbung.
3. Überstand dekantieren und ersetzen mit frischem 1x DIG-B Sperrlösung, die primären Antikörper in geeigneten dilutiauf Verhältnis. Färben die Eierstöcke 4 h bei RT oder O / N bei 4 ° C mit mildem Schütteln.
   HINWEIS: Bei dem hier beschriebenen Experiment, verwenden Sie die folgenden optimalen Verdünnungen des primären Antikörper: (1) ApVas1 Antikörper: 1: 500 für chromogene Färbung 1.50 für Immunfluoreszenzfärbung; (2) Anti-α Tubulin-Antikörper: 1: 500; (3) 4D9 monoklonale Antikörper: 1:25.
4. Waschen Sie die Eierstöcke mit 0,2% PBST 4-mal für 15 Minuten jeweils.
5. Inkubieren Ovarien 1x DIG-B Blockierungslösung für 1 Stunde bei RT mit mildem Schütteln.
6. Überstand dekantieren und ersetzen mit frischem 1x DIG-B Sperrlösung, die Sekundär-Antikörper in geeigneten Verdünnungsverhältnis. Färben die Eierstöcke 4 h bei RT oder O / N bei 4 ° C mit mildem Schütteln.
   1. Verwenden Sie die folgenden Verdünnungsverhältnisse von Sekundärantikörper: (1) Für die Immunfluoreszenzfärbung: 1: 500 für Alexa Fluor 633 Ziege-Anti-Kaninchen-IgG oder Alexa Fluor 488 Ziege-Anti-Maus-IgG; (2) Für chromogene Färbung: 1: 200 zur biotinyliertem Ziege-Anti-Kaninchen-IgG.
      HINWEIS: Der biotinylierte sekundäre Antikörper wird zur Wechselwirkung mit dem Avidin-Biotin-Komplex (ABC) in dem Substrat-basierten (chromogenen) Erkennung, durch die die Färbung Signale signifikant verstärkt angewendet.
   2. Für Immunfluoreszenzfärbung durchzuführen Färbung im Dunkeln, weil der sekundäre Antikörper lichtempfindlich ist.
7. Abwaschen sekundären Antikörpers mit 0,2% PBST 4 mal je 10 min.

6. Nuclear und F-Aktin-Färbung

HINWEIS: Dies ist nur für Immunfluoreszenzfärbung angewendet.

1. Fleck Ovarien mit 0,2% PBST mit DAPI (2 ng / ul) und Phalloidin-TRITC (100 nM) für 2 h bei RT im Dunkeln.
2. Waschen Sie die Eierstöcke mit 0,2% PBST 4 mal je 10 min.
3. Inkubieren Eierstöcke mit dem Eindeckmedium O / N bei 4 ° C mit mildem Schütteln.

7. Signal Entwicklung

HINWEIS: Dies ist nur für chromogene Färbung aufgetragen.

1. Vorzubereiten 100 ulReagenz Avidin-Biotin-Komplex (ABC) zum Verstärken der Signale, die durch Zugabe von 1 ul des Reagenz A (Avidin) in 98 ul 0,2% PBST über vorsichtiges Pipettieren gründlich gemischt und die Zugabe von 1 ul Reagenz B (Biotin konjugiert mit Meerrettichperoxidase ), gefolgt von sofortigem Mischen. Inkubieren des Gemisches für 30 min bei RT mit mildem Schütteln.
2. Ovarien (einschließlich der dissoziierten Eikammern) in der Mischung der Reagenzien A und B Inkubation 30 min bei RT mit mildem Schütteln.
3. Waschen Sie die Mischung von Reagenzien A und B mit 0,2% PBST 4 mal je 10 min.
4. Übertragen Sie die Eierstöcke in PBST eingetaucht, um eine gut auf der Tüpfelplatte mit einem Kunststoff-Pipette.
5. Bereiten Substratlösung von 3,3'-Diaminobenzidin (DAB): Lösen Sie eine DAB Tablet Plus über heftiges Vortexen ein anderes enthält Harnstoff-Wasserstoffperoxid in 1 ml _ddH 2 O für 1 min.
   HINWEIS: DAB, ein Ausfällen von Peroxidase-Substrat, ist eine populäre Chromogen Immunfärbung. Es produziert eine brEigen- und unlöslicher Niederschlag, nachdem er durch die Peroxidase oxidiert wird. Schwache Signale können durch Zugabe von Nickelchlorid zu der Substratlösung (Endkonzentration 0,05-0,08%) verbessert werden.
6. Entfernen Sie die in der gut restlichen PBST-Lösung und füllen mit 100 ul der DAB Substratlösung für die Signalentwicklung.
7. Überwachen Intensität der Signale unter einem Stereomikroskop bei geringer Vergrößerung.
8. Stopp-Reaktionen durch Entfernen des DAB-Lösung, gefolgt von der Wiederbefüllung mit 1x PBS sofort. Wiederholen Sie zweimal die Wäsche.
9. Übertragen Sie die Eierstöcke zurück in die 1,5-ml-Tube und dann mit 1x PBS oder PBST waschen zweimal für jeweils 15 min.
10. Eierstöcke in einem Glycerin-basierten Mounting Medium (70% Glycerin) O / N Inkubieren bei 4 ° C unter mildem Schütteln inkubiert.

8. Montage der Blattlaus Embryos

HINWEIS: Die Dicke der Blattlaus Embryonen variiert zwischen Entwicklungsstadien. Montagestrategien werden so modifiziert, dass frühe passen (germaria und Stufen 0-10), Mitte (Stufen11-18), und am späten Embryonen (Stufen 19-20), die in 2B gezeigt sind - D. Embryonalen Staging gefolgt Miura et al. ¹²

1. Übertragen Sie die Eierstöcke mit Eindeckmedium auf die Zelle Tablett mit einer Plastiktropfen und beobachten Proben unter einem Stereomikroskop bei geringer Vergrößerung.
2. Schneiden Sie die Kelche mit der seitlichen Eileiter mit Insektenstifte zugeordnet und dann auch über eine isoliert Ovariole in ein leeres Glas mit einer Pipette. Bilden Sie das Endvolumen auf 50 bis 100 & mgr; l mit Eindeckmedium.
3. Übertragen Sie eine Ovariole auf den Objektträger mit einem Glas Tropf und dann zu sezieren Eikammern mit Insekten Pins.
   HINWEIS: Bei Embryonen älter als Stufe 6 der Entwicklung, Trennung von Eikammern vorgeschlagen; für germaria und die ersten beiden Eikammern jünger als Stufe 6 ist die Trennung optional.
4. Verlagern einen seziert Ei Kammer auf einen sauberen Objektträger mit einem Glas Tropf.
5. Setzen Sie ein Deckglas (Größe: 22 x 22mm) in den sezierten germaria oder Eierkammern (mit Embryonen im Stufen 1-10 von Entwicklungs) langsam, um Blasen zu vermeiden.
   1. Halterung Eikammern (enthaltend Embryonen in den Stufen 11-18 der Entwicklung) auf einer Folie mit einseitiger Deck Brücke und Stelle noch ein Deckglas (Größe: 18 x 18 mm) oben auf der Probe.
   2. Berg Eikammern (mit Embryonen älter als Stufe 19 der Entwicklung) auf einem Objektträger mit beidseitigem Deckbrücke und legen Sie eine weitere Deckglas (Größe: 18 x 18 mm) auf der Oberseite der Probe.
6. Füllen Sie den Raum unter der oberen Deckglas mit Montage Medien zu vermeiden, Trocknen der Probe.
7. Mild rollen den Embryo durch Verschieben des Deckglases, um die richtige Ausrichtung für die Beobachtung zu erhalten.
8. Dichtung um den Rand des Deckgläser (einschließlich der Brückendeckgläser) mit Nagellack.

9. Imaging Analysis

1. Fotografisches Differentialinterferenzkontrast (DIC) Bilder der ganze-mount Embryonen mit einem compound Mikroskop mit DIC Optik und einem Trockenobjektivlinse (10X, 20X, 40X) mit einer Kamera verbunden ausgestattet. Installieren Sie die Software für die Bildübertragung zwischen Kamera und Computer mit den Anweisungen des Herstellers.
2. Erwerben Projektionen der fluoreszenzmarkierten Embryonen mit einem Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop ^14. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers für das Fotografieren, z-Stapeln und 3D Projizieren mit Imaging-Software.
   1. Drehen Sie den Schieber auf den Kopf, finden Sie den montierten Probe mit 10X-Objektiv, und kreisen Sie die Probenfläche mit einer feinen geölt-basierte Stift.
      HINWEIS: Das macht die Identifizierung der Probe leichter bei der Suche nach es durch Ziele eines konfokalen Mikroskops.
   2. Einen Tropfen Öl auf der Oberseite der Deckfläche, dessen gegenüberliegende Seite ist, wie in 9.2.1 beschrieben markiert.
3. Finden Sie die Fokusebene bei 40X Ölimmersionsobjektiv dann zu einem 63X Ölimmersionsobjektiv zu ändern. Manuell die Feinfokussteuerung nach oben zu verschieben und zu tunwn um das beste Brennebene zu erfassen.
   HINWEIS: Für die Beobachtung strukturelle Details germaria und frühen Embryonen, empfehlen wir, 40X Ziele oder solche mit höherer Vergrößerung.
4. Scannen Sie den Embryo in verschiedenen Anregungskanäle und Bild einen z-Stack zu erhalten.
   HINWEIS: Erbsenblattlaus Gewebe zu reduzieren Dicke jeder optischen Schnitt auf 1,5 um oder weniger.

Representative Results

In dieser Studie, führten wir ganze-mount Immunfärbung an Embryonen der asexuellen Erbsen Blattläuse (Abbildung 1A). Diese weibliche Nachkommen zu produzieren parthenogenetisch und lebendgebärender. Diese weibliche Embryonen im Ei Kammern der Eierstock-Tubuli (Ovariolen) (Abbildung 1B und 2A). Vor der Mikroskopie, die seziert Ovariolen sind die Färbung Ziele; jedoch wird die Trennung Eikammern zur Beobachtung von Embryonen unter einem Mikroskop (- D 2B) erforderlich.

Erhöhung der Gewebepermeabilität

Proteinase K (PK) Behandlung ist eine Standard-Ansatz zur Verbesserung Gewebedurchlässigkeit, sondern auch für Embryonen von einigen Modellorganismen-wie Caenorhabditis elegans (Fadenwurm), Drosophila melanogaster (fly) und Danio rerio (Zebrafisch) -einem Schritt ist optional. Im Erbsenblattlaus, die Voraussetzung für PK-Behandlung ist stufenabhängigen denn germaria und Embryos vor der Gastrulation (Stufen 0-7) kann PK-Behandlung verzichtet werden kann; sondern auch für Embryonen unter germband Verlängerung (Stufe 11) oder in späteren Stadien dieser Schritt ist sehr zu empfehlen. Beispielsweise in der Zwischenembryo Signale kaum in Embryonen ohne PK-Behandlung (- C 3A) detektiert. Im Gegensatz dazu wurde die Signalintensität deutlich in Embryonen PK Verdauung ('- C', A "- C" 3A) unterzogen verbessert.

Reduzierung der Hintergrundfärbung

Ein hohes Niveau der endogenen Peroxidase (POD) Aktivität wurde in den embryonalen Geweben der Blattläuse festgestellt. Um diese Enzymaktivität zu unterdrücken, wurden die Paraformaldehyd-fixierte Embryonen in Gegenwart von hy inkubiertserstoffperoxid (H _{2 O 2),} einer gemeinsamen Reagens für die Oxidation von POD. Unsere Ergebnisse haben gezeigt, dass _H 2 _O 2 -Behandlung nicht die Aktivität von endogenen POD effektiv zu unterdrücken in der späten Phase der Embryonen (4A, D). Dagegen wurde die Hintergrundfärbung weitgehend Embryonen in Methanol inkubiert (4B, C, E, F) unterworfen wird reduziert. Vor dem Aufbringen des primären Antikörpers Embryonen wurden in Lösung, die NGS und BSA wie in Standardprotokollen für Antikörper-Färbung beschrieben blockiert. Wurde jedoch Resthintergrundfärbung in den Blattläusen Embryonen nachgewiesen (3A '- C'). Dieses Problem wurde nach Ersetzen NGS / BSA mit dem Blockierungsreagenz durch einen Puffersatz für DIG-Markierungsexperimenten zugeführt, wie in situ-Hybridisierung ("- C" 3A) gelöst. Wir schließen daher, dass nach der Fixierung mit Methanol und Inkubation mit dem DIG-BBlockierungsreagenz sind sowohl zum Reduzieren der Hintergrundfärbung in den Blattläusen Embryonen wesentlich.

Verwendung des chromogenen sondern fluoreszierende Ansätze sind nicht nur für eine effektive Signalerfassungs PK-Behandlung und die DIG-B Blockierungsreagenz erforderlich. Aktin-Färbung mit Phalloidin oder Färbung für Methanol empfindlichen Epitop, jedoch nicht in Embryonen unterzogen, um mit Methanol vor, eine Fixierung zu arbeiten, die die native Form von Aktin oder Antikörper zerstören kann. Dementsprechend sollte diese Behandlung bei der Durchführung von Fluoreszenz-Immunfärbung vermieden werden. Neben der Beseitigung der Methanol-Behandlungsschritte Immunfluoreszenz ermöglicht Multi-Markierungsexperimente in den Blattlaus Embryonen. Mittels konfokaler Mikroskopie, beispielsweise könnte Erbsenblattlaus Vasa1 Protein (ApVas1) in Keimzellen, α-Tubulin in Mikrotubuli, F-Actin in Mikrofilamente und DNA in Kerne gleichzeitig markiert und visualisiert (5A, C) werden kann. Im Vergleich mit der chromogenic Verfahren (5B) bietet konfokalen Schneiden von fluoreszenzmarkierten Proben bessere Auflösung von lokalisierten Signale wie ApVas1 im Keimplasma und cellularizing Keimzellen in frühen Blattlaus Embryonen (5C ', D - D'). Die Übernahme der Bedingungen für die Etikettierung oben beschriebenen Keimzellen wurde die Engrailed / Invected Protein in Segmenten des sich erstreckenden Keim Band auch mit dem Antikörper 4D9 (Abbildung 6) angefärbt. Dies zeigt, dass unser Protokoll für die Immunfärbung einschließlich chromogene und Fluoreszenzmethoden-effektiv angewendet werden, um Signalerfassung sowohl in der Keimbahn und somatischen Zelllinien in Blattläusen.

Abbildung 1. Parthenogenetische viviparous Erbsen Blattläuse. (A) eine erste Larvenstadium Nymphe, die sich aus einer asexuellen viviparous weibliche Erwachsene. (B 12 sein. Ein Ovariole enthält eine Germarium in der Spitze (Pfeile), 1-2 Eizellen und 5-7 embryonalen Kammern. Gut und Cauda sind in der Regel mit den seziert Eierstöcke verbunden sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2. Abbildung der Strategien für die Montage Blattlaus Embryonen in verschiedenen Stadien der Entwicklung. (A) Gliederung der Embryonalentwicklung im Ovariole von einem parthenogenetic viviparous weibliche erwachsene seziert. Kurze Oogenese (germarial Bühne und Stufen 0-2) wird von der Embryogenese (Stufen 3-20) gefolgt. Gliederung der Embryogenese: f ormationen von Syncytial Blastoderm (Stufen 3-5); blastulation (Stufen 6-7); Gastrulation (Stufen 8-10); Dehnung von Keimband (Stufen 11-14); katatrepsis (Stufen 15); Beitrag katatrepsis und Keim Band verlassen (Stufen 16-17); Organogenese (Stufen 18-20). Farbtasten sind an der Unterseite der Figur. (B, B ') Germarium und inszeniert 0-10 Embryonen. Kein Deckbrücke notwendig. (C, C ') Bühnen 11-18 Embryonen. Ein Deckbrücke notwendig. (D, D ') Bühnen 19-20 Embryonen. Doppeldeckbrücken erforderlich. Rollen der Embryonen, indem das Deckglas können verschiedene Beobachtungswinkeln zu erstellen. Größen Deck: 22 x 22 mm (B), 18 x 18 mm (C) und (D). Die Dicke der Deck: 0,13 bis 0,16 mm. Embryonale Inszenierung folgte Miura et al ¹² Abkürzungen: g:. Germarium; st: Bühne..com / files / ftp_upload / 53.883 / 53883fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

. Figur 3. Proteinase K-Behandlung und Vergleich von Reagenzien mit verschiedenen Blockierungseffekte Anterior von Ei Kammern nach links; Alle Ansichten sind seitliche außer Embryonen in (B ", C ', C") gezeigt, der dorsalen sind. Embryonen werden alle unter Verwendung ApVas1 Antikörper (Verdünnung 1: 500) gefärbt und Signale ApVas1 werden innerhalb von 10-20 s entwickelt. Pfeilspitzen zeigen Ort der Keimzellen. (A - C) Embryos ohne Behandlung mit Proteinase K (PK). ApVas1 Signale in Keimzellen sind kaum festgestellt. (A '- C', A "- C") Vergleich der Hintergrundfärbung in Embryonen blocund der kommerziellen Blockierungsreagenz in der DIG waschen und Block-Puffer-Set (DIG-B) (A "- C") - mit NGS und BSA ('C' A) ked. Hintergrund wird deutlich in Embryonen ("- C" A) gezeigt, reduziert. Abkürzung: b: Bakterien. Maßstabsbalken:. 100 & mgr; m Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

. Figur 4. Die Minimierung der Hintergrundfärbung mit Methanol Anterior von Embryonen nach links; Alle Ansichten sind Rücken. Die Embryonen werden mit PK zur Erhöhung der Durchlässigkeit der Antikörper behandelt. Pfeilspitzen zeigen Ort der Keimzellen. (A, B, D, E) Vergleich der Behandlungenmit Wasserstoffperoxid (H _{2 O 2)} und Methanol. Embryonen werden nur mit sekundären Antikörper gefärbt. _H 2 _O 2 -Behandlung (0,3% w / v, 10 min): hohen Hintergrund (A, D); Methanol-Behandlung (100%, 60 min): niedrige Hintergrund (B, E). (C, F) Primärantikörperfärbung an Embryonen mit Methanol behandelt. Bedingungen der Methanolbehandlung sind identisch mit denen für die Embryonen in (B, E) gezeigt ist, verwendet. Die ApVas1 Antikörper vorzugsweise beschriftet die embryonale Keimzellen. Maßstabsbalken:. 100 & mgr; m Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5. Immunfluoreszenzfärbung von frühen Embryonen. (A, C - D) und 1: 500 in (B). (A) Färbung von Signalen, die ApVas1, α-Tubulin, F-Actin und Zellkern-DNA enthalten, werden detektiert unter Verwendung von vier Kanälen mit unterschiedlichen Wellenlängen. Farbtasten der Signale an der Unterseite der Figur gezeigt ist. (B) DIC Bild eines chromogenen Ergebnis zum Vergleich. ApVas1 innerhalb des Germarium bereichert, während die Kontrastintensität der hinteren Lokalisierung ApVas1 (Pfeilspitzen) in der Phase-3-Embryonen ist nicht so klar wie bei (C, C ') dargestellt. (C, C ') Anreicherung ApVas1 Signale im Ei posterior. Signale an den hinteren Bereich des Eies Kammer (Pfeilspitzen) lokalisiert werden durch Bildstapel verbessert. Da Signale von F-Actin und α-Tubulin teilweise überdecken denjenigen ApVas1 im hinteren (C), eine durch einkanalig Abtastung erzeugte Bild wird in (C ') dargestellt ist. (D - D '') konfokale Schnitte von ApVas1 im hinteren Bereich der Bühne-4 Embryo lokalisiert. Bilder in (D) und (D ') dargestellt sind ApVas1 in Oberfläche und den zentralen Brennebenen erkannt sind. (D ") ist das zusammengefügte Bild aller Abschnitte aus der gleichen Embryo als (D) und (D ') Abkürzungen: als: aster, fc, Follikelzellen; poc, prospektive Eizelle; sp. Spindel; tc, trophische Kabel. Maßstabsbalken:. 10 & mgr; m Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 6. Immunfärbung an embryonalen Segmente. EineTERIOR von Ei Kammern nach links. PK-behandelten Embryonen werden mit dem monoklonalen Antikörper 4D9 gegen Engrailed / Invected, die in embryonalen Segmente exprimiert werden, angefärbt. Farbtasten der Signale an der Unterseite der Figur gezeigt ist. (A, A ') Immunfluoreszenzfärbung auf einer Stufe-13-Embryonen. (A), ein konfokales Bild von den Bildern der Engrailed / Invected, α-Tubulin, F-Actin und Zellkern-DNA-Färbungen gestapelt. (A ') ein konfokales Bild, das die Färbung des Engrailed / nur Invected. Ohne die Einmischung von Signalen von anderen Kanälen werden die Signale besser angezeigt. (B, C) ​​chromogene Färbung an Embryonen in den Stufen 13 und 17 der Entwicklung, auf. (B) Stufe-13-Embryo. (C) Stufe-17-Embryo. Aus den Stufen 13 bis 17 werden die wachsende Zahl der Segmente in der Unterleib von 4D9 markiert. (D) Negativkontrolle (-Ctrl) staining nur mit sekundärem Antikörper mit Alexa Fluor 633 konjugiert Fast keine Immunsignale auf Ovariole ohne primären Antikörper nachgewiesen. Jedoch die Autofluoreszenz von Bakterien (gestrichelte Linie), die innerhalb der Bühne 7 und 13 der Eier Kammern bei der Anregungswellenlänge von 488 nm detektiert. Abkürzungen: A: Bauch; b: Bakterien; H: Kopf; T: Thorax. Maßstabsbalken:. 100 & mgr; m Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Wir identifizierten optimalen Bedingungen für eine erfolgreiche Immunfärbung in der Erbsenblattlaus A. Pisum, ein aufstrebendes Modellorganismus für genomische und Entwicklungsstudien ^3,15. Optimierten Bedingungen für die Erhöhung der Gewebepermeabilität und Reduzieren der Hintergrundfärbung verstärkt die Intensität und Spezifität von Signalen. Sie unterscheiden sich von Standardprotokollen für die Immunfärbung in anderen Tiermodellen in den Schritten zum Erzeugen von Poren in Zellmembranen und Blockieren nicht-spezifischer Antikörperbindung.

Für die Immunfärbung und in situ Hybridisierung ist Proteinase K (PK) der Verdauung einer der gemeinsame Ansätze zur Erhöhung Gewebepermeabilität ^16-19. Bei der Antikörperfärbung von Blattlaus Geweben zeigten unsere Ergebnisse, dass: (1) PK Verdau deutlich verbesserte Immunsignale in den parthenogenetic viviparous Embryonen bei der Keimbandverlängerung (Stufen 11-14) (3B '', C ''), wobeischwache Signale noch in Embryonen frei von PK-Behandlung (3B, C) ​​sichtbar ist; und (2) PK Verdauung war für Embryonen aus katatrepsis Weiter (Stufen 15-20) (4C, F und 6C) obligatorisch. Für asexuelle viviparous Embryonen vor katatrepsis ist das Volumen der Eikammern wahrscheinlich die Ursache für das Eindringen Problem, weil erfolgreiche Immunfärbung auf frühe sexuelle oviparous Embryonen mit Wohnsitz in der gelegten Eier-die fast gleichwertig in der Größe der reifsten asexuelle Ei Kammer- sind erfordert keine Verdauung PK ^20. Daher (Stufen 11 bis 14) der Verlängerungs und Faltung des Keimband in dem begrenzten Raum des asexuellen Eikammern kann den Eingang des Antikörpers zu verhindern, und es ist PK, die das Eindringen des Antikörpers ermöglicht, indem sie die Poren in Zellmembranen zwischen gestaute embryonalen Strukturen. Im Gegensatz dazu kann die Gerade Verlängerung der Keimband in den Geschlechts Eier erklären, warum es auch in Buntdie Abwesenheit PK. Die Entfernung des Dotter Umschlag / Chorion können auch sexuelle oviparous Embryonen besser zugänglich zu Antikörper. Für Embryonen nach katatrepsis (Stufen 16 bis 20), ist PK-Behandlung wesentlich für sowohl asexuelle und sexuelle Morphs, weil Embryonen sind dick cuticled ¹⁹ (4C, F und 6C).

Dennoch ist die vorgeschlagene Bedingung für PK-Verdau (1 ug / ml für 10 min) erfordert eine weitere Einstellung, wenn die Integrität der embryonalen Strukturen oder die Intensität der Signale ist nicht zufriedenstellend. Dies wird hauptsächlich durch die PK-Aktivität, die von Charge zu Charge variieren kann, verursacht wird. Wenn zum Beispiel der embryonalen Gewebe wird nach dem PK Verdau beschädigt Konzentration des PK auf 0,5 & mgr; g / ml reduziert werden. Ebenso, wenn die Signalintensität ist schwach, Verlängerung der Inkubationszeit auf 15-20 min wird daher empfohlen. Die reifen Embryonen (Stufe 20) bei 1,0 & mgr; g / ml Konzentration, Howe bis 20 min unterzogen, um die verlängerte Inkubation PKver, in der Regel angezeigt werden schwache Signale, was darauf hindeutet, dass PK Verdauung ist noch unvollständig. Verlängerte Verdauung Färbung Signale zu verbessern, sondern ist optional, besonders wenn Expressionsmuster in der Stufe 18 erkannt Embryos ähnlich denen in der Stufe 20 Embryonen. Im Vergleich zu Embryonen im Stadium 20 der Entwicklung, die Stufe 18 Embryonen mit analogen Morphologie noch mit geringerer Menge an Körpernagelhaut kann in der Regel stärkere Signalintensität zu erhalten.

Während der Signalentwicklung können die Hintergrundfärbung durch die Aktivität von endogenen Enzymen, die mit den Substraten und quer reagieren kann, erhöht werden. In den Erbsenblattlaus Embryonen Aktivität der endogenen alkalischen Phosphatase (AP) und Peroxidase (POD), die beide gemeinsam Antikörperkonjugate zum Aufschließen Signal Substrate sind, wurde festgestellt. Hydrolase-Aktivität der endogenen AP effektiv gesamten Embryogenese von Levamisol drückt werden (Daten nicht gezeigt). Dennoch Behandlung der Embryonen mit 0,3-0,6% HYDROGen Wasserstoffperoxid (H _{2 O 2)} kann das nur über das endogene POD-Aktivität vor katatrepsis aber nicht ausreichend war für ältere Embryonen (4A, D). Methanol Inkubation ein alternativer Ansatz zur Denaturierung endogenen Proteinen wurde gezeigt, dass sie wirksam bei der Blattläuse ²¹ (4B, E). Anders als _H 2 _O 2, welche Schäden Blattlaus Gewebe während längerer Inkubation von 30 min oder mehr, Methanol nicht verdauen oder verformt die Embryonen während einer Entwicklungsstufe (4C, F). Folglich ist Methanol eine bessere Alternative zur Unterdrückung endogener POD-Aktivität in Blattlaus Embryonen. Wenn Resthintergrundfärbung erkannt wird, was in der Regel zu den reifen Embryos mit einem verdickten Schicht der Oberhaut, O / N Inkubation in Methanol bei 4 ° C-nach unseren Erfahrungen-weiter reduzieren die körpereigenen POD-Aktivität.

Resthintergrundfärbung wurde erfasstEmbryonen mit Serumproteinen blockiert wie normale Eselserum (NDS), normalem Ziegenserum (NGS), Rinderserumalbumin (BSA), oder deren Gemische ¹³ (Abbildung 3a'-C '). Annahme eines kommerziell gelieferten Blockierungsreagenz zur in situ-Hybridisierung verwendet werden, hingegen könnte die verbleibende Hintergrund während der Immunfärbung deutlich sein eliminiert ⁵ (3A '' - C ''). Obwohl die Bestandteile des Blockierungsreagenz proprietär enthält es wahrscheinlich nicht-Serum-Proteinen, die nicht-spezifische Epitope der Erbsenblattlaus Proteine ​​blockieren. Das Blockierungsreagenz arbeitete auch viel besser als tierische Seren in der grünen Pfirsichblattlaus Myzus persicae. Ebenso in M persicae PK Verdauung und Methanol Inkubation führte zu zufriedenstellenden Antikörper-Penetration und Hintergrundreduktion. - Ähnlich wie die verbesserten Ergebnisse in A. erreicht pisum (Daten nicht gezeigt). Wir gehen davon aus, dass die Bedingungen Optimized zur Erhöhung der Gewebedurchlässigkeit und die Verringerung der Hintergrund, ob man chromogene Färbung oder Fluoreszenz verwendet werden, um viele andere Blattlaus-Arten gelten.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% hydrogen perxidase (H2O2)	Sigma-Aldrich	18304	For bleaching endogenous peroxidase of embryos.
4’6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542	For labeling the double-strand DNA. TOXIC. Wear gloves, dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure
4D9 anti-engrailed/invected mouse monoclonal antibody	Developmental studies hybridoma bank	AB_528224	For labeling the developing segments of embryo.
ApVas1 rabbit polyclonal antibody	Our laboratory	N/A	For labeling the aphid germline specific Vas1 protein in embryos. This antibody was made by our laboratory.
Austerlitz Insect pins	ENTOMORAVIA	N/A	For seperating each egg chambers from an ovariole. Size 000, BLACK ENAMELLED.
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	9048-46-8	For blocking the non-specific binding of antibodies.
Camera connted to compound microscope	Canon	EOS 5D	For photographing of aphid embryos.
Colorimetric 8 cell tray	Kartell Labware	357	For developing the staining signal of aphid embryos. Diameter 95 x 57 mm, cell depth 2 mm.
Compound microscope with DIC optics	Leica Microsystems	DMR	For photographing of aphid embryo mounted on the slides.
DIG Wash and Block Buffer Set	Sigma-Aldrich (Roche)	11585762001	For blocking the non-specific binding of antibodies. We diluted the 10x Blocking solution into 1x as blocking reagent.
Forceps	Ideal-tek	N/A	For dissection of ovaries from aphids. Manufacturer part No 5: 5 SA.
Glass dropper	N/A	N/A	For transfering ovaries of aphids from the splot plate to tubes. 150 mm of total length and 5 3/4" of tip length.
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	For clearing of aphid embryos and mounting.
Glycine	Bioshop	N/A	For blocking the enzyme activity of proteinase K (PK).
Goat anti-mouse IgG conjugated Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11017	For detection of primary antibody from mouse.
Goat anti-rabbit IgG conjugated Alexa Fluor 633	Invitrogen	A21072	For detection of primary antibody from rabbit.
Intelli mixer	ELMI laboratory equipment	RM-2M	For improving the thorughly reaction of reagents with ovaries.
Laser-scanning confocal microscopy	Leica Microsystems	SP5	For photographing of aphid embryo mounted on the slides with florecent tag.
methanol	Burdick and Jackson	AH2304	For bleaching endogenous peroxidase of embryos.
Microscope slides	Thermo scientific	10143560	For mounting of embryos. SUPERFROST ground edges, ca./env. 76 x 26 mm.
Microscope Cover glasses	Marienfeld	0101030	For mounting embryos on the slides. Size 18 x 18 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
Microscope Cover glasses	Marienfeld	0101050	For mounting embryos on the slides. Size 22 x 22 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
mouse monoclonal anti-alphaTubulin antibody (DM1A)	Santa Cruz Biotechnology	sc-32293	For labeling the distrbution of alpha-tubulin of cells.
Nail polish	N/A	N/A	For sealing the coverslips on the slides.
Normal goat serum (NGS)	Sigma-Aldrich	G9023	For blocking the non-specific binding of antibodies.
Paraformaldehyde (PFA)	VWR	MK262159	For fixation of aphid ovaries.
Phalloidin-TRITC	Sigma-Aldrich	P1951	For labeling the distrbution of F-actin on embryos.
Phosphate-buffered saline (PBS)	N/A	N/A	As isotonic solution for aphid ovaries.
Plastic dropper	N/A	N/A	For transfering ovaries of aphids from tube to cell tray. Size 3 ml.
Proteinase K	Merck	124678	For creating pores (punching) on the cell membrane and facilitating the access of antibodies.
Pyrex spot plate	N/A	N/A	For dissection and color reactions of aphid ovaries under microscopy. Each cavity with diameter 22 mm and  depth 7 mm.
SIGMAFAST 3,3’-diaminobenzidine (DAB) tablets	Sigma-Aldrich	D4168	For developing of substrated signals. Also called DAB peroxidase substrate tablet set.
Stereo microscope	Leica Microsystems	EZ4	For dissection and observation of aphid ovaries.
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	T8787	For creating pores (punching) on the cell membrane.
VECTASHIELD Elite ABC Kit (Rabbit IgG)	Vector laboratories	PK-6101	For enhancement of the signal. Including of biotinylated goat anti-rabbit IgG secondary antibody, A and B reagents.
VECTASHIELD mounting medium	Vector laboratories	H1000	For clearing of aphid embryos and mounting.