Abstract
在豌豆蚜蚜豌豆 ，用基因组测序和丰富的可塑性，已成为一个新兴的模式，基因组和发育研究。像其他蚜虫，A。通过豌豆孤雌胎生繁殖，其中的胚胎在流水作业的方式，在卵巢管内的卵商会发展迅速传播。此前我们已经建立了全安装了一个强大的平台， 原位杂交技术 ，允许在蚜虫胚胎检测mRNA的表达。分析蛋白质的表达，但是，建立的方案进行免疫染色的无性胎生蚜虫的卵巢管没有产生令人满意的结果。这里，我们报告用于增加组织渗透性和减少的背景染色，这两者都施加既定方法时一些问题的优化条件。优化包括：（1）温育的蛋白酶K（1微克/毫升，10分钟），发现其中必不可少˚F在中期和后期蚜虫胚胎或抗体的渗透; （2）替代正常山羊血清/牛血清白蛋白与由地高辛（DIG）供给的封闭试剂的基于缓冲设置和（3）应用的甲醇，而过氧化氢（H 2 O 2）的漂白内源性过氧化物酶;其中显著减少了背景染色的蚜虫组织。对于免疫优化这些关键条件，将允许有效的检测基因产物中的一个， 豌豆等蚜虫胚胎。
Introduction
蚜虫是半翅目昆虫的小（1-10毫米）的软组织。它们以植物为食吸吮韧皮部汁液用口器刺入。此外，他们依靠专性共生细菌，Buchnera aphidicola，合成的必需氨基酸有缺陷的韧皮部汁液饮食。蚜虫有一个复杂的生活史包括春季和夏季长日照光周期和性卵生复制由短日照的光周期期间，他们躺在越冬卵1,2-有限数量的触发期间孤雌胎生再现。春天，这些卵孵化，生产的第一代全女性蚜虫（fundatrices），继多轮孤雌生殖，直到秋天。周期性孤雌生殖蚜虫，凡在每年的生命周期的无性和有性阶段的交替，已被视为一种进化新奇1,2。在孤雌胎生蚜，胚胎发生在卵巢小管（卵巢管）蛋室的地方。相比之下，性卵生胚胎发育的受精卵。除了生殖可塑性，蚜虫可以显示跨代翼多型：针对拥挤信号和捕食者的威胁，在unwinged无性女性可以viviparously产生翼的后代进行远距离迁移。出版豌豆蚜虫的基因组序列的豌豆蚜 -the的第一基因组序列基底hemimetabolous昆虫可以进一步探索生殖可塑性，翼多型，以及其他功能，包括昆虫与植物相互作用，病毒引导和共生的蚜虫在分子的依据3。
除了 基因组测序，需要用于促进豌豆蚜作为一个成熟的模式生物4用于表征基因表达和功能的工具。我们已经描述了整个底座的可靠的协议
为了提高导磁率，而不会损坏蚜组织完整性，我们仔细滴定蛋白酶K的浓度，并确定为对蚜虫的胚胎组织消化的最佳条件。为了避免在豌豆蚜非特异性染色，我们搜寻了的化合物，可以有效地阻止胚胎和抑制内源过氧化物酶（POD）的活性，用于免疫染色过程中放大信号的酶。通过地高辛（DIG）系缓冲器集提供的，而在传统上使用的正常山羊血清（NGS）甲封闭试剂/牛血清白蛋白（BSA），显著降低背景染色。此外，甲醇，发现INHI更有效地咬了内源性过氧化物酶活性比过氧化氢 （H 2 O 2）。关于这些蚜虫特定条件免疫染色对胚胎的细节将在下面的章节进行说明。
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Protocol
蚜虫1.文化
注：孤雌胎生豌豆蚜A的实验室株豌豆最初收集在中央台和在长日照的光周期已经饲养的寄主植物（花园豌豆豌豆或蚕豆蚕豆 ）超过300代（一代：〜10天）。
- 种子发芽
- 浸泡寄主植物的种子在自来水中3-5天在RT。加注新水，每天一次。
注：另外，把寄主植物的种子直接进入潮湿的土壤中可诱发发芽为好。 - 增长10发芽的种子在小火锅（直径9厘米×7厘米高），与土壤中的生长室下光照16小时光照/ 8小时黑暗中，在20℃。
- 生长开始后10天左右，蚜虫转移到植物的高度为8厘米以上。
- 浸泡寄主植物的种子在自来水中3-5天在RT。加注新水，每天一次。
- 蚜虫转移
- 孵育在生长室蚜虫下光照16小时光照/ 8小时黑暗中，在20℃。每天每个水植物盆栽植物的一次。
- 为了获得下一代蚜虫，重申步骤1.1.3-1.2.2主蚜虫转让后十天。
2.解剖和卵巢的固定
- 新鲜在1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）作为固定缓冲器制备4％低聚甲醛（PFA）。
- 填充斑点板与PFA（约500微升）的一个孔中，将板在立体显微镜在低放大倍数下，和在PFA内淹没成年蚜虫解剖。
- 握住头部和腹部有一组镊子，切开背解剖卵巢角质层腹部，并从腹腔拖动卵巢远。
- 固定在1.5ml试管含有1ml的PFA在RT 20分钟3双卵巢。
- 倒出固定缓冲用移液管（玻璃或一次性的），然后洗涤卵巢用0.2％的TritonX-100在1×PBS（PBST）中3次，每次10分钟。温和摇动上的混合器/旋转器（旋转角度：60°（F60）/转速：8 RPM）被推荐用于固定和洗涤。
3.治疗与蛋白酶K（PK），以提高胚胎组织的通透性
注：PK治疗是从胚芽带扩展名以后（发展阶段11）适用于胚胎。对于年轻的胚胎，这一步是可选的。
- 串联稀PK的原液（10毫克/毫升）用1×PBS至工作浓度1μg/ ml的。
- 孵育卵巢与PK（约500微升）的1μg/ ml的10分钟，轻微摇动。
- 倒出PK soluti上，然后用700微升甘氨酸（2毫克/毫升）3次，每次5分钟洗涤卵巢。
- 每10分钟洗涤卵巢用0.2％PBST清洗两次。
- 再次固定卵巢与固定缓冲液15分钟，室温，轻微摇动。
- 弃上清，每10分钟洗涤卵巢用0.2％PBST清洗两次。
4.甲醇孵化为了抑制内源性过氧化物酶的活性
注：甲醇孵育没有施加到胚胎经受鬼笔环肽染色或抗体表位是甲醇敏感。
- 串联脱水卵巢与甲醇的0.2％PBST清洗不同的百分比（体积/体积：1：3,1：1,3：1）通过将卵巢在甲醇溶液各浓度进行10分钟适度搅拌。
- 脱水卵巢用100％甲醇进行1小时，在室温，轻微摇动。
注：染色的满意的结果仍然可以从在存储在100％甲醇中那蚜组织得到-20＆＃176;下一个月。 - 串联再水化卵巢与甲醇的0.2％PBST清洗不同的百分比（体积/体积：3：1，1：1,1：3）通过将卵巢在甲醇溶液各浓度进行10分钟适度搅拌。
5.抗体染色
- 稀释从该DIG基于缓冲器集的10倍封闭溶液（DIG-B）的1倍。
注：1×辛乙封闭溶液是更有效地减少染色背景比标准封闭试剂5％组成（体积/体积）正常山羊血清（NGS）和0.5％（体积/体积）牛血清白蛋白（BSA ）在0.2％PBST清洗。 - 孵育1倍辛乙阻断为2.5至4小时，在室温或O / N溶液在4℃下，轻微摇动卵巢。
注：对于3对在1.5ml管卵巢，200微升是最小体积为样品阻挡和抗体染色。 - 滗上清液和替换与含有适当diluti初级抗体新鲜的1X辛乙封闭溶液对比率。染色在RT或O / N卵巢4小时，在4℃，轻微摇动。
注：对于这里描述的实验中，使用初级抗体的以下最佳稀释度：（1）ApVas1抗体：1：500的显色染色，1:50免疫荧光染色; （2）抗α微管蛋白抗体：1：500; （3）4D9单克隆抗体：1:25。 - 用0.2％PBST清洗，每次15分钟，洗涤卵巢4次。
- 孵育卵巢用1小时1×辛乙封闭溶液在RT，轻微摇动。
- 倒出上清液并更换含二级抗体在适当的稀释比新鲜的1X DIG-B封闭液。染色在RT或O / N卵巢4小时，在4℃，轻微摇动。
- 使用的第二抗体的以下稀释比：（1）对于免疫荧光染色：1：500的Alexa Fluor 633山羊抗兔IgG或的Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG; （2）为显色染色：1：200，用于生物素化的山羊抗兔IgG。
注：生物素化的第二抗体被施加用于与抗生物素蛋白 - 生物素复合物（ABC）在衬底基（生色）检测，通过该染色信号显著扩增相互作用。 - 对于免疫荧光染色，进行染色在黑暗因为二次抗体是对光敏感。
- 使用的第二抗体的以下稀释比：（1）对于免疫荧光染色：1：500的Alexa Fluor 633山羊抗兔IgG或的Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG; （2）为显色染色：1：200，用于生物素化的山羊抗兔IgG。
- 用0.2％PBST清洗，每次10分钟洗掉第二抗体的4倍。
6.核和F-actin的染色
注：这仅适用于免疫荧光染色。
- 卵巢染色用0.2％PBST含DAPI（2纳克/微升）和鬼笔环肽TRITC（100纳米）2小时在室温在黑暗。
- 用0.2％PBST清洗，每次10分钟洗卵巢4次。
- 孵育卵巢与安装介质O / N，在4℃，轻微摇动。
7.信号开发
注：这仅适用于色染色。
- 制备100微升试剂抗生物素蛋白生物素复合物（ABC）通过在98微升0.2％的PBST加1微升试剂A（抗生物素蛋白）中，通过轻柔的移液充分混合，并加入1微升试剂B的增强信号（生物素与辣根过氧化物酶），接着立即混合。对于在室温30分钟，轻微摇动孵育混合物。
- 孵育卵巢（包括解除关联蛋腔室）中的试剂A和B的混合物在室温30分钟，轻微摇动。
- 用0.2％PBST清洗，每次10分钟洗去试剂A和B的混合物的4倍。
- 转移卵巢淹没在PBST一个很好当场板上用塑料滴管。
- 制备的3,3'-二氨基联苯胺（DAB）底物溶液：溶于1的DAB片剂加另一种含过氧化氢 脲在1ml DDH 2 O的经剧烈涡旋1分钟。
注：DAB，过氧化物酶的底物沉淀，是一种流行的发色体的免疫染色。它产生一个BR被氧化的过氧化物酶后自己的和不溶性沉淀物。弱信号可以通过添加氯化镍至底物溶液（终浓度0.05-0.08％）得到增强。 - 除去残留在阱的PBST溶液和填充用100μl的信号发展的DAB底物溶液。
- 监控信号强度的立体显微镜在低倍镜下下。
- 通过除去DAB溶液，随后用1×PBS立即再填充停止反应。重复洗两次。
- 转移卵巢回1.5 ml的试管中，然后用1×PBS或PBST洗两次，每次15分钟。
- 孵育在基于甘油的封固剂（70％甘油）中O / N的卵巢，在4℃，轻微摇动。
8.安装蚜虫胚胎
注：蚜虫胚胎的厚度发展阶段之间变化。因此，安装策略修改，以适应早期（germaria和阶段0-10），中（阶段11月18日），和晚期胚胎（阶段19-20），其演示了在图2B - ð。胚胎分段接着Miura等。12
- 立体显微镜下转移卵巢连同安装介质小区托盘用塑料滴管，观察样品在低倍。
- 切割使用昆虫针的侧输卵管相关盏，然后一个孤立卵巢管用滴管转移到一个空的玻璃很好。补足终体积为50-100微升使用的安装介质。
- 转移的卵巢管到幻灯片用玻璃滴管，然后解剖用昆虫针蛋室。
注：对于早于发展阶段6胚胎，蛋室隔离建议;为germaria和前两个蛋商会年龄小于6级，分离是可选的。 - 重新定位一个解剖卵室用玻璃滴管一个干净的幻灯片。
- 把盖玻片（尺寸：22×22MM）在解剖germaria还是先有蛋室（含胚胎阶段1-10的发展）慢慢来避免气泡。
- 安装蛋室（含有胚胎发育阶段11-18）上的滑动与片面盖玻片桥和放置另一个盖玻片（尺寸：18×18毫米）上的样品的顶部。
- 安装蛋室（含有超过发展阶段19胚胎）上的滑动带双面盖玻片桥和放置另一个盖玻片（尺寸：18×18毫米）上的样品的顶部。
- 填充料顶部盖玻片下方的空间安装媒体，以避免干燥的样品。
- 轻度滑动盖玻片，以获得正确的方向观察滚胚胎。
- 密封围盖玻片与指甲油的边缘（包括桥盖玻片）。
9.成像分析
- 照片微分干涉对比（DIC）的图像整个安装胚胎与compou第二显微镜配备DIC的光学和干物镜（10X，20X，40X），连接到一个摄像机。安装软件使用制造商的说明相机与计算机之间的图像传输。
- 获得用激光扫描共聚焦显微镜14的荧光标记的胚胎的突起。遵循制造商的说明用于拍摄，z轴堆叠，和3D凸出用图像处理软件。
- 打开滑盖倒置，发现有10倍的目标安装的样品，并圈出样品区，配有油基细笔。
注：这使得识别通过共聚焦显微镜的目标，寻找它时，样品容易。 - 添加一滴油盖玻片上区域，其相反侧作为在9.2.1中描述标记的顶部。
- 打开滑盖倒置，发现有10倍的目标安装的样品，并圈出样品区，配有油基细笔。
- 寻找在40X油浸物镜焦平面然后换一个63X油浸物镜。手动移动精细调焦控制起来，做WN捕捉到最佳焦平面。
注：为了观察germaria和早期胚胎的结构细节，我们建议您使用40倍的目标还是那些具有更高的放大倍率。 - 扫描在不同的激发通道胚胎和获得的Z堆栈图像。
注：对于豌豆蚜组织，降低每个光学部的厚度降低到1.5微米或更小。
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Representative Results
在这项研究中，我们进行的无性豌豆蚜虫（ 图1A）的胚胎全安装免疫。这些女性产生后代孤雌及viviparously。这些女性胚胎内的卵巢小管（卵巢管）（ 图1B和 图2A）的蛋商会发展。显微镜之前，解剖卵巢管是染色的目标;然而，需要用显微镜（图2B - D）的下观察胚胎的卵腔室分离。
增加的组织渗透性
蛋白酶K（PK）的治疗是提高组织渗透性的标准方法，但对于某些模式生物-例如胚胎的秀丽隐杆线虫 （线虫）， 黑腹果蝇 （飞），和斑马鱼 （斑马鱼） - 此步骤是可选的。在豌豆蚜，进行PK治疗的要求是阶段依赖性：为前原肠germaria和胚胎（阶段0-7），PK治疗可以省略;但根据germband扩展（11期），或在后期胚胎的这一步是强烈建议。例如，在中期胚胎信号在胚胎未经治疗的PK（ - C图 3A）中几乎检测不到。与此相反，信号强度显著的胚胎进行PK消化（' - C'，A“ - C” 图3A）增强。
减少背景染色
内源性过氧化物酶的活性高级别被确定在蚜虫的胚胎组织。为了抑制这种酶的活性，多聚甲醛固定胚胎培养在HY存在雄激素过氧化物（H 2 O 2），公共试剂POD的氧化。我们的研究结果表明，H 2 O 2的治疗没有有效地抑制了后期的胚胎（ 图4A，D）内源性过氧化物酶的活性。与此相反，背景染色在很大程度上减少了胚胎经受甲醇孵育（图4B，C，E，F）。在应用程序中的一抗胚胎被阻滞于在标准协议描述的抗体染色含NGS和BSA的解决方案。然而，在胚胎蚜虫残留背景染色法检测（图3A' - C'）。与由对DIG标记实验的缓冲液组供给的封闭试剂更换NGS / BSA诸如原位杂交 （“ - C” 图3A）之后这个问题已得到解决。因此，我们得出这样的结论后固定用甲醇和孵化与DIG-B封闭剂都是必不可少的降低背景染色的蚜虫胚胎。
PK治疗和该DIG乙封闭剂使用的生色而且荧光方法不仅需要有效的信号检测。肌动蛋白染色用鬼笔环肽染色或甲醇敏感的表位，但是，不会在胚胎经受预用甲醇固定工作，这可能会破坏肌动蛋白或抗体的天然形式。因此，在执行荧光免疫染色时，应避免这种治疗。除了消除甲醇处理步骤免疫允许多标记实验中的蚜虫胚胎。使用共焦显微镜，例如，豌豆蚜Vasa1蛋白（ApVas1）在生殖细胞，α微管蛋白在微管，F-肌动蛋白微丝和DNA在核可以同时标记和可视化（图5A 中的C）。在与CHRO比较mogenic方法（图5B），共焦切片的荧光标记的样品提供了更好的分辨率的局部信号的诸如ApVas1在种质和cellularizing生殖细胞在早期蚜胚胎（ 图5C'，D - D“）。采用用于标记的条件如上所述生殖细胞中，ENGRAILED / Invected蛋白在延伸胚芽带的节段也沾上了抗体4D9（图6），这表明我们的用于协议免疫染色，包括发色和荧光方法-可以有效地应用到信号检测在这两种生殖细胞和蚜虫体细胞谱系。
图1.孤雌胎生豌豆蚜虫。（A）的一龄若虫摆脱无性胎生雌成虫。 （B 12之间的变量。一个卵巢管包含在尖端germarium（箭头），卵母细胞1-2，和5-7胚胎腔室。肠道和马尾通常与卵巢解剖关联。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.插图安装蚜虫胚胎发育的不同阶段的策略。从一个孤雌胎生雌成虫解剖卵巢管胚胎发育的（A）外形。简要卵子发生（germarial阶段和阶段0-2）之后是胚胎发生（阶段3-20）。胚胎概要：F合胞体胚盘ormation（3-5级）;囊胚（6-7级）;原肠胚形成（8-10级）;胚芽带伸长率（11-14级）; katatrepsis（阶段15）;后katatrepsis和胚芽乐队退缩（16-17级）;器官（18-20级）。色键是在该图的底部。 （B，B'）Germarium和阶段0-10胚胎。没有盖玻片桥是必需的。 （C，C'）阶段11-18胚胎。盖玻片桥是必需的。 （D，D'）阶段19-20胚胎。双盖玻片桥是必需的。通过滑动盖玻片轧胚可以创建不同的观察角度。盖玻片的大小：22×22毫米（B）中，18×18毫米，（C）和（D）中。盖玻片的厚度：0.13至0.16毫米。胚胎分期其次Miura等12缩写：G：germarium; ST：阶段。.COM /文件/ ftp_upload / 53883 / 53883fig2large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
。蛋室图3.蛋白酶K处理和试剂的不同阻塞效应比较前是到左边;所有视图都横向除了在（B“，C'，C”）所示的胚胎，它是背。胚胎使用ApVas1抗体（稀释1：500），所有染色和ApVas1的信号被内：10-20秒开发的。箭头指示生殖细胞的位置。 （A - C）胚胎未经治疗的蛋白酶K（PK）。在生殖细胞ApVas1信号被几乎没有检测到。 （A' - C'，A“ - C”）的背景染色胚胎集团比较糟透了与NGS和BSA（A' - C'）和DIG洗净块缓冲区设置（DIG-B）（A“ - C”）的商业阻断试剂。背景是在（“ - C”A）中所示的胚胎显著减少。缩写：B：细菌。比例尺：100微米请点击此处查看该图的放大版本。
图4.最小化背景染色与胚胎的甲醇前是到左边;所有的意见都背。胚胎与PK治疗增加抗体的渗透性。箭头指示生殖细胞的位置。 （A，B，D，E）的治疗方法比较与过氧化氢（H 2 O 2），和甲醇。胚胎只沾满第二抗体。 H 2 O 2处理（0.3％重量/体积，10分钟）：高背景（A，D）;甲醇处理（100％，60分钟）：低背景（B，E）。 （C，F）与甲醇处理的胚胎主抗体染色。甲醇处理的条件是相同的用于在（B，E）示出胚胎。该ApVas1抗体优先标记胚胎生殖细胞。比例尺：100微米请点击此处查看该图的放大版本。
图5.免疫荧光染色对早期胚胎。 1:50（A，C - D）和 1：500（B）。 （A）的染色信号，这些信号包括ApVas1，α微管蛋白，F-肌动蛋白，和核DNA，使用四个信道具有不同波长进行检测。信号彩色键显示在该图的底部。的显色结果进行比较（B）的DIC图像。 ApVas1是丰富了germarium内，而ApVas1后路本地化（箭头）在阶段3胚胎的对比强度不明确的，因为在（C，C'）中。 （C，C'）在鸡蛋后ApVas1信号的富集。定位于卵室（箭头）的后部区域的信号由图像堆叠增强。因为F-肌动蛋白，α微管蛋白的信号部分屏蔽那些ApVas1的在后（C）中，由单引导扫描产生的图象示于（C'）。 （D - D''）共焦ApVas1的切片定位在阶段4胚胎的后部区域。在（D）和（D'）所示的图像ApVas1检测表面和中央焦面，分别。 （D“）是所有部分的来自同一胚为（D）和（D'）合并图像缩写：如：翠菊; FC，卵泡细胞; POC，前瞻性的卵母细胞;藻：主轴; TC，营养帘线。比例尺：10微米请点击此处查看该图的放大版本。
图6.免疫染色对胚胎部分。一个的卵腔terior是向左。 PK-处理的胚胎都沾满了单克隆抗体4D9对ENGRAILED / Invected，这是表示在胚胎段。信号彩色键显示在该图的底部。 （A，A'）上的一个阶段13 胚胎免疫荧光染色。 （A）中，从ENGRAILED / Invected，α微管蛋白，F-肌动蛋白，和核DNA染色的图像堆叠的共焦图像。 （A'）共焦图像只显示ENGRAILED / Invected的染色。没有从其它信道信号的干扰，信号被更好显示。 （B，C）显色染色上胚胎阶段13 和17的发展分别。 （b）第二阶段 -13胚胎。 （ 三）第一阶段17胚胎。从阶段13至17，在腹部段的越来越多的由4D9标记。 （D）阴性对照组（-Ctrl）染色荷兰国际集团只用偶联的Alexa Fluor 633二级抗体几乎没有免疫信号在卵巢管没有主要抗体检测。然而，在阶段7和13的卵腔菌（虚线）的自发荧光是在激发波长488纳米检测。缩写：A：腹部; B：细菌; H：头; T：胸部。比例尺：100微米请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
我们确定了最佳条件，以成功的免疫染色豌豆蚜虫的一个关键 ， 豌豆 ，一个新兴的模式生物基因组和发育研究3,15。用于增加组织渗透性和减少的背景染色优化条件下增强的强度和信号的特异性。他们从标准协议有所不同免疫染色在其他动物模型中的步骤创建于细胞膜毛孔和阻断非特异性抗体结合。
用于免疫染色和原位杂交，蛋白酶K（PK）消化是用于增加组织渗透性16-19的常见的方法之一。在蚜组织抗体染色，我们的结果表明：（1）PK消化显著增强免疫染色信号在期间胚芽频带扩展（阶段11-14）（图3B''，C''）的孤雌胎生胚，虽然信号弱仍处于胚胎缺乏PK处理（ 图3B，C）中可见;和（2）的PK消化是强制性从katatrepsis向前胚胎（阶段15-20）（图4C，F和 图6C）。对于无性胎生胚胎之前katatrepsis，卵腔的体积是不太可能的渗透问题的原因是因为对居住在产卵 - 这是几乎在尺寸上最成熟无性蛋chamber-等效早期性卵生胚胎成功免疫染色不需要的PK消化20。因此，胚芽带的伸长和折叠（阶段11〜14）中的无性蛋室的有限空间可能阻碍抗体的入口处，并且它是PK的，允许通过创建在之间的细胞膜细孔抗体的渗透卡住的胚胎结构。与此相反，在性蛋胚芽频带的直线延伸部可以解释为什么它被染色的，即使在没有PK的。去除卵黄膜/绒毛膜也可以使性卵生的胚胎更容易获得抗体。对于katatrepsis后胚胎（级16〜20），PK治疗是为无性和有性变种必不可少的，因为胚胎是厚cuticled 19（ 图4C中，F和 图6C）。
尽管如此，对PK消化建议的条件（1微克/毫升，10分钟）需要进一步调整，如果胚胎结构的完整性和信号强度是不能令人满意的。这主要是由于在PK活性可能有所不同批次。例如，如果胚胎组织成为PK消化后损坏，PK的浓度可以降低到0.5微克/毫升。同样，如果信号强度较弱，潜伏期延长至15-20分钟是因此建议。最成熟的胚胎（级20）经受延长的PK孵育最多20分钟，在1.0微克/毫升浓度，豪版本，通常会显示信号弱，这表明PK消化又是不完整的。延长的消化可以增强染色信号，但是可选的，特别是当在阶段检测到的表达模式18胚胎类似于在级20的胚胎。在发展阶段20胚胎相比，舞台18胚胎类似的形态却与身体的角质层较少量通常可以产生更强的信号强度。
期间信号发展，背景染色可以通过内源性酶可以与底物发生交叉反应的活性升高。在豌豆蚜胚胎，内源性碱性磷酸酶（AP）和过氧化物酶（POD），这两者都是共同的标记抗体用于消化信号基板的活性，进行检测。内源AP的水解酶活性可以在整个胚胎发生由左旋咪唑被有效地抑制（数据未显示）。然而，治疗用胚胎0.3-0.6％hydrog的恩过氧化氢（H 2 O 2）只能消除之前katatrepsis内源性过氧化物酶活性，但不足以对老年人的胚胎（ 图4A，D）。甲醇孵化，用于变性内源性蛋白的另一种方法，被证明是有效的蚜虫21（图4B 中的E）。不像的 H 2 O 2，或30分钟或更长的延长的温育过程中被损坏的组织蚜虫，甲醇不在消化或在任何发育阶段（图4C 中的F）变形的胚胎。因此，甲醇是抑制内源性过氧化物酶活性的蚜虫胚胎更好的选择。如果残留背景染色检测，这通常发生于成熟胚与加厚层的角质层，O / N培养在甲醇中，在4℃ - 根据我们的经验，可以进一步降低内源性过氧化物酶活性。
在检测到残留背景染色阻止与血清蛋白的胚胎如正常驴血清（NDS）正常山羊血清（NGS），牛血清白蛋白（BSA），或它们的混合物13（图3A'-C'）。采用原位杂交用于商业供应阻断剂，相比之下，免疫染色过程中其余的背景可以是显著消除5（图3A'' - C''）。虽然封闭剂的成分是专有的，它有可能包含非血清蛋白质，可以阻止豌豆蚜蛋白质的非特异性的表位。该封闭试剂也可以在桃蚜桃蚜工作比动物血清好得多。同样， 在并购蚜 PK消化甲醇孵化导致了令人满意的抗渗透和减少的背景-在A.类似改进取得的成果豌豆 （数据未显示）。我们预计，在条件optimiz编辑为增加组织通透性，减少的背景下，一个人是否使用显色染色或荧光，将适用于许多其他蚜虫。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30% hydrogen perxidase (H2O2) | Sigma-Aldrich | 18304 | For bleaching endogenous peroxidase of embryos. |
| 4’6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | For labeling the double-strand DNA. TOXIC. Wear gloves, dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure |
| 4D9 anti-engrailed/invected mouse monoclonal antibody | Developmental studies hybridoma bank | AB_528224 | For labeling the developing segments of embryo. |
| ApVas1 rabbit polyclonal antibody | Our laboratory | N/A | For labeling the aphid germline specific Vas1 protein in embryos. This antibody was made by our laboratory. |
| Austerlitz Insect pins | ENTOMORAVIA | N/A | For seperating each egg chambers from an ovariole. Size 000, BLACK ENAMELLED. |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | For blocking the non-specific binding of antibodies. |
| Camera connted to compound microscope | Canon | EOS 5D | For photographing of aphid embryos. |
| Colorimetric 8 cell tray | Kartell Labware | 357 | For developing the staining signal of aphid embryos. Diameter 95 x 57 mm, cell depth 2 mm. |
| Compound microscope with DIC optics | Leica Microsystems | DMR | For photographing of aphid embryo mounted on the slides. |
| DIG Wash and Block Buffer Set | Sigma-Aldrich (Roche) | 11585762001 | For blocking the non-specific binding of antibodies. We diluted the 10x Blocking solution into 1x as blocking reagent. |
| Forceps | Ideal-tek | N/A | For dissection of ovaries from aphids. Manufacturer part No 5: 5 SA. |
| Glass dropper | N/A | N/A | For transfering ovaries of aphids from the splot plate to tubes. 150 mm of total length and 5 3/4" of tip length. |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | For clearing of aphid embryos and mounting. |
| Glycine | Bioshop | N/A | For blocking the enzyme activity of proteinase K (PK). |
| Goat anti-mouse IgG conjugated Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11017 | For detection of primary antibody from mouse. |
| Goat anti-rabbit IgG conjugated Alexa Fluor 633 | Invitrogen | A21072 | For detection of primary antibody from rabbit. |
| Intelli mixer | ELMI laboratory equipment | RM-2M | For improving the thorughly reaction of reagents with ovaries. |
| Laser-scanning confocal microscopy | Leica Microsystems | SP5 | For photographing of aphid embryo mounted on the slides with florecent tag. |
| methanol | Burdick and Jackson | AH2304 | For bleaching endogenous peroxidase of embryos. |
| Microscope slides | Thermo scientific | 10143560 | For mounting of embryos. SUPERFROST ground edges, ca./env. 76 x 26 mm. |
| Microscope Cover glasses | Marienfeld | 0101030 | For mounting embryos on the slides. Size 18 x 18 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm) |
| Microscope Cover glasses | Marienfeld | 0101050 | For mounting embryos on the slides. Size 22 x 22 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm) |
| mouse monoclonal anti-alphaTubulin antibody (DM1A) | Santa Cruz Biotechnology | sc-32293 | For labeling the distrbution of alpha-tubulin of cells. |
| Nail polish | N/A | N/A | For sealing the coverslips on the slides. |
| Normal goat serum (NGS) | Sigma-Aldrich | G9023 | For blocking the non-specific binding of antibodies. |
| Paraformaldehyde (PFA) | VWR | MK262159 | For fixation of aphid ovaries. |
| Phalloidin-TRITC | Sigma-Aldrich | P1951 | For labeling the distrbution of F-actin on embryos. |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | N/A | N/A | As isotonic solution for aphid ovaries. |
| Plastic dropper | N/A | N/A | For transfering ovaries of aphids from tube to cell tray. Size 3 ml. |
| Proteinase K | Merck | 124678 | For creating pores (punching) on the cell membrane and facilitating the access of antibodies. |
| Pyrex spot plate | N/A | N/A | For dissection and color reactions of aphid ovaries under microscopy. Each cavity with diameter 22 mm and depth 7 mm. |
| SIGMAFAST 3,3’-diaminobenzidine (DAB) tablets | Sigma-Aldrich | D4168 | For developing of substrated signals. Also called DAB peroxidase substrate tablet set. |
| Stereo microscope | Leica Microsystems | EZ4 | For dissection and observation of aphid ovaries. |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | For creating pores (punching) on the cell membrane. |
| VECTASHIELD Elite ABC Kit (Rabbit IgG) | Vector laboratories | PK-6101 | For enhancement of the signal. Including of biotinylated goat anti-rabbit IgG secondary antibody, A and B reagents. |
| VECTASHIELD mounting medium | Vector laboratories | H1000 | For clearing of aphid embryos and mounting. |
References
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