Identificatie van de kritische Voorwaarden voor Immunokleuring in de erwtenbladluis Embryo's: Toenemende Tissue permeabiliteit en Afnemende Achtergrond kleuring

Abstract

De erwt Acyrthosiphon pisum, met een gefaseerde genoom en overvloedige fenotypische plasticiteit, is uitgegroeid tot een opkomende model voor genomische en ontwikkelingsstudies. Net als andere bladluizen, A. Pisum verspreiden zich snel via parthenogenetische levendbarende voortplanting, waar de embryo's ontwikkelen binnen ei kamers in een lopende band mode in de ovariole. Eerder hebben we een robuust platform van whole-mount in situ hybridisatie waardoor detectie van mRNA expressie in de bladluis embryo's vastgesteld. Voor het analyseren van de expressie van eiwitten, hoewel, vastgestelde protocollen voor immunokleuring de ovarioles van ongeslachtelijke levendbarende bladluizen leverde geen bevredigende resultaten te produceren. Hier melden wij voorwaarden geoptimaliseerd voor toenemende weefsel permeabiliteit en dalende achtergrond kleuring, die beide waren problemen bij het toepassen van gevestigde benaderingen. Optimalisaties omvatten: (1) incubatie van proteïnase K (1 ug / ml, 10 min) en bleek essentieel fof antilichaam penetratie in de midden- en late fase bladluis embryo's; (2) vervanging van normale geit serum / runderserumalbumine met een digoxigenine (DIG) toegevoerd blokkerend reagens gebaseerde buffer set en (3) de toepassing van methanol eerder waterstofperoxide (H ₂ O ₂₎ voor het bleken endogeen peroxidase; die aanzienlijk verminderde de achtergrondkleuring in de bladluis weefsels. Deze kritische omstandigheden geoptimaliseerd voor immunokleuring zal doeltreffende detectie van genproducten mogelijk maken in de embryo's van A. Pisum en andere bladluizen.

Introduction

Bladluizen zijn Hemipteran insecten met kleine (1-10 mm) zachte lichamen. Ze voeden zich met planten door zuigen phloem sap met piercing monddelen. Bovendien, ze vertrouwen op een obligaat endosymbiotic bacterie, Buchnera aphidicola, essentiële aminozuren die een tekort aan het floëem sap dieet te synthetiseren. Bladluizen hebben een complexe leven geschiedenis die parthenogenetische levendbarende voortplanting in het voorjaar en de zomer lange dag fotoperiodiciteit en seksuele ovipaar voortplanting veroorzaakt door korte-dag fotoperiodiciteit waarin zij lag een beperkt aantal overwinterende eieren ^1,2 omvat. In het voorjaar van deze eieren uitkomen van de eerste generatie van de all-female bladluizen (fundatrices) te produceren, na vele rondes van parthenogenetische voortplanting tot de herfst. De cyclische parthenogenese in bladluizen, waar de aseksuele en seksuele fasen wisselen elkaar af in de jaarlijkse levenscyclus, is beschouwd als een evolutionaire nieuwigheid ^1,2. In de parthenogenetische levendbarende bladluizen, Embryogenese plaatsvindt binnen ei kamers van de ovariële buisjes (ovarioles). Daarentegen seksuele oviparous embryo's ontwikkelen in de bevruchte eieren. Afgezien van reproductieve plasticiteit, kunnen bladluizen transgenerationele vleugel polyfenisme weer te geven: in reactie op overbevolking signalen en roofdier bedreigingen, kan het ongevleugelde aseksuele vrouwtjes levendbarende produceren gevleugelde nakomelingen voor migratie over lange afstand. Publicatie van de genoomsequentie van de erwt Acyrthosiphon pisum -het eerste genoom sequentie voor een basale hemimetabolous insect-maakt verdere verkenning van reproductieve plasticiteit, vleugel polyfenisme, en andere functies, waaronder insect-plant interacties, virale vectoring en symbiose in bladluizen op een moleculaire basis ^3.

Naast het genoom gesequenced, zijn hulpmiddelen voor het karakteriseren genexpressie en functie vereist voor het bevorderen van de erwtenbladluis als volwassen modelorganisme ^4. We hebben robuuste protocollen van de hele-mount beschreven 5-7. RNA interferentie (RNAi) via dubbelstrengs RNA injectie en voeding is gebruikt voor silencing in bladluis nimfen en volwassenen, maar stabiele omstandigheden voor gentherapie knockdown in de embryo's nog niet gerapporteerd ^8-10. Immunokleuring, een antilichaam-gebaseerde aanpak die eiwitexpressie kan detecteren in monsters voor en na RNAi knock-down, is uitgevoerd op erwtenbladluis embryo ^11-13. Echter, verhoging van weefsel permeabiliteit en de eliminatie van de achtergrond vlekken zijn nog onvoldoende gebruik van standaard protocollen voor immunokleuring in de aseksuele levendbarende embryo's van erwtenbladluis. Zo vonden we dat penetratie van antilichaam aan het weefsel afgenomen gastrulating embryo (stadia 8-10) en embryo morfologisch identificeerbare ledematen (fasen 13-14) was nauwelijks permeabel voor antilichaam. Bovendien werd achtergrondkleuring gevisualiseerd in de aseksuele viviparoons erwtenbladluis embryo's gekleurd met behulp van antilichaam tegen het marker kiemlijn Vasa evenals die tegen Engrailed / Invected eiwit tot expressie gebracht in embryonale segmenten ^12,13. Eigenlijk achtergrondkleuring nog duidelijk zichtbaar in embryo's gekleurd met het secundaire antilichaam alleen.

Om de permeabiliteit verhogen zonder beschadiging van de integriteit van bladluis weefsels we zorgvuldig getitreerde de concentratie van proteinase K en bepaalde optimale omstandigheden voor weefsel digestie op bladluis embryo. Om niet-specifieke kleuring in de erwtenbladluis te vermijden, hebben we gezocht naar verbindingen die effectief embryo's kunnen blokkeren en onderdrukken de activiteit van endogene peroxidase (POD), een enzym gebruikt voor het versterken van signalen tijdens immunokleuring. Een blokkerende reagens geleverd door een digoxigenine (DIG) -gebaseerde bufferset plaats de traditioneel gebruikte normaal geitenserum (NGS) / bovine serum albumine (BSA), aanzienlijk verminderd achtergrondkleuring. Bovendien werd gevonden dat methanol inhibeet de endogene activiteit POD effectiever dan waterstofperoxide (H ₂ O _2). Details betreffende deze bladluis-specifieke voorwaarden voor immunokleuring op embryo's worden beschreven in de volgende paragrafen.

Protocol

1. Cultuur van bladluizen

NB. Het laboratorium stam van de parthenogenetische levendbarende erwtenbladluis Een pisum werd oorspronkelijk verzameld in het centrum van Taiwan en is grootgebracht op waardplanten (de tuin erwt Pisum sativum of tuinboon Vicia faba) op basis van lange-dag fotoperiode voor meer dan 300 generaties (één generatie: ~ 10 dagen).

1. Kieming van zaden
   1. Week de zaden van de waardplanten in leidingwater gedurende 3-5 dagen bij RT. Vullen met vers water een keer per dag.
      OPMERKING: U zet zaden van waardplanten recht in vochtige grond kan ontkiemen en veroorzaken.
   2. Kweek 10 kiemende zaden in een kleine pot (9 cm diameter x 7 cm lang) met de bodem in de groeikamer onder lichtperiode 16 uur licht / 8 uur donker bij 20 ° C.
   3. Ongeveer 10 dagen na de groei begint, overdragen bladluizen op planten waarvan de hoogte is meer dan 8 cm.
2. Overdracht van bladluizen Houd elke pot planten binnen een 1 liter glazen beker, overdragen 8 volwassen bladluizen op planten met behulp van een penseel, en dan sluit de beker met een luchtdoorlatende hoes zoals gaas gaas om bladluizen voorkomen ontsnappen.
3. Incubeer bladluizen in een groeikamer onder lichtperiode 16 uur licht / 8 uur donker bij 20 ° C. Water per pot planten eenmaal per dag.
4. Voor het verkrijgen van de volgende generatie van bladluizen, herhaal stappen 1.1.3-1.2.2 tien dagen na de primaire bladluis overdracht.

2. Dissection en Fixatie van Eierstokken

1. Vers bereiden 4% paraformaldehyde (PFA) in 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) als fixatie buffer.
2. Vul een putje van een plek plaat met PFA (ongeveer 500 pl), plaatst u de plaat onder een stereomicroscoop bij een lage vergroting, en dompel een volwassen bladluis binnen de PFA voor dissectie.
3. Ontleden eierstokken door het houden van het hoofd en buik met een set van een tang, opensnijden van de dorsalecuticula van de buik en het slepen van de eierstokken verwijderd uit de buikholte.
4. Bevestig drie paar eierstokken in een 1,5 ml buis die 1 ml PFA bij kamertemperatuur gedurende 20 min.
5. Decant fixatie buffer met een transfer pipet (ofwel glas of wegwerp) en was daarna de eierstokken met 0,2% Triton-100 in 1x PBS (PBST) 3 keer voor 10 minuten elk. Milde schudden op een mixer / rotator (draaihoek: 60 ° (F60) / rotatiesnelheid: 8 RPM) wordt aanbevolen voor zowel fixatie en wassen.

3. De behandeling met Proteinase K (PK) om de permeabiliteit van embryonale weefsels verhogen

OPMERKING: PK behandeling wordt toegepast om embryo's uit kiem band uitbreiding verder (fase 11 van de ontwikkeling). Voor jongere embryo's, deze stap is optioneel.

1. In serie verdunde voorraadoplossing van het PK (10 mg / ml) met 1 x PBS om de werking concentratie 1 gg / ml.
2. Incubeer eierstokken met 1 ug / ml PK (ongeveer 500 ui) gedurende 10 min met lichte schudden.
3. Decant PK Solutiop en spoel daarna de eierstokken met 700 gl Glycine (2 mg / ml) 3 maal gedurende 5 min elk.
4. Was eierstokken met 0,2% PBST tweemaal gedurende 10 min elk.
5. Bevestig eierstokken opnieuw met fixatie buffer gedurende 15 min bij kamertemperatuur met milde schudden.
6. Gooi supernatant en was eierstokken met 0,2% PBST tweemaal gedurende 10 min elk.

4. Methanol Incubatie onderdrukken de endogene peroxidase-activiteit (POD)

OPMERKING: Methanol incubatie wordt niet toegepast op embryo's onderworpen aan Phalloidin vlekken of antilichaam epitopen die methanol gevoelig zijn.

1. In serie dehydrateren eierstokken met verschillende percentage methanol in PBST 0,2% (v / v: 1: 3, 1: 1, 3: 1) door incubatie eierstokken bij elke concentratie van methanol gedurende 10 minuten onder zacht roeren.
2. Dehydrateren eierstokken met 100% methanol gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met milde schudden.
   OPMERKING: Bevredigende resultaten van de kleuring kan nog worden verkregen van bladluis weefsels die werden opgeslagen in 100% methanol bij -20 &# 176; C gedurende één maand.
3. In serie hydrateren eierstokken met verschillende percentage methanol in PBST 0,2% (v / v: 3: 1, 1: 1, 1: 3) door incubatie eierstokken bij elke concentratie van methanol gedurende 10 minuten onder zacht roeren.

5. antilichaamkleuring

1. Verdun de 10x blokkerende oplossing van de DIG-based buffer set (DIG-B) naar 1x.
   Opmerking: De 1x DIG-B blokkerende oplossing effectiever voor het reduceren van de kleuring achtergrond dan de standaard blokkerende reagens bestaande uit 5% (v / v) normaal geitenserum (NGS) en 0,5% (v / v) runderserumalbumine (BSA ) in 0,2% PBST.
2. Incubeer de eierstokken met 1 x DIG-B blokkerende oplossing gedurende 2,5-4 uur bij kamertemperatuur of O / N bij 4 ° C onder mild schudden.
   LET OP: Voor de drie paren van de eierstokken in een 1,5 ml tube, 200 pi is het minimale volume voor het monster blokkeren en antilichaam kleuring.
3. Giet supernatant en te vervangen door verse 1x DIG-B blokkerende oplossing die primaire antilichaam op geschikte dilution ratio. Vlekken de eierstokken voor 4 uur bij kamertemperatuur of O / N bij 4 ° C onder mild schudden.
   OPMERKING: Voor de hier beschreven experiment, gebruikt u de volgende optimale verdunningen van primaire antilichamen: (1) ApVas1 antilichaam: 1: 500 voor chromogene kleuring, 01:50 voor immunofluorescentiekleuring; (2) anti-α tubuline antilichaam: 1: 500; (3) 4D9 monoklonaal antilichaam: 01:25.
4. Was eierstokken met 0,2% PBST 4 keer gedurende 15 minuten elk.
5. Incubeer eierstokken met 1x DIG-B blokkerende oplossing gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met milde schudden.
6. Giet supernatant en te vervangen door verse 1x DIG-B blokkerende oplossing die secundair antilichaam op geschikte verdunningsverhouding. Vlekken de eierstokken voor 4 uur bij kamertemperatuur of O / N bij 4 ° C onder mild schudden.
   1. Gebruik de volgende verdunningsverhoudingen van secundaire antilichamen: (1) Voor immunofluorescentiekleuring: 1: 500 van Alexa Fluor 633 geit anti-konijn IgG of Alexa Fluor 488 geit anti-muis IgG; (2) Voor chromogene kleuring: 1: 200 van gebiotinyleerd geit anti-konijn IgG.
      Opmerking: Het gebiotinyleerde secundaire antilichaam wordt toegepast voor interactie met het avidine-biotine-complex (ABC) in het substraat-gebaseerde (chromogene) detectie, waardoor de kleuring signalen aanzienlijk versterkt.
   2. Voor immunofluorescentiekleuring, voeren vlekken in het donker, omdat het secundaire antilichaam is lichtgevoelig.
7. Afwassen secundair antilichaam met 0,2% PBST 4 keer voor 10 minuten elk.

6. Nucleaire en F-actine kleuring

NB: Dit wordt alleen toegepast voor immunofluorescentiekleuring.

1. Vlek eierstokken met 0,2% PBST dat DAPI (2 ng / ul) en Phalloidin-TRITC (100 nM) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur in het donker.
2. Was eierstokken met 0,2% PBST 4 keer gedurende 10 minuten elk.
3. Incubeer eierstokken de montage medium O / N bij 4 ° C onder mild schudden.

7. Signaal Ontwikkeling

NB: Dit wordt alleen toegepast voor chromogene kleuring.

1. Bereid 100 pireagens avidine-biotine-complex (ABC) teneinde de signalen door toevoeging van 1 pi van Reagens A (avidine) in 98 pl 0,2% PBST, grondig mengen via zacht pipetteren, en het toevoegen van 1 pi van Reagens B (biotine geconjugeerd met mierikswortelperoxidase ), gevolgd door onmiddellijk mengen. Incubeer het mengsel gedurende 30 min bij kamertemperatuur met milde schudden.
2. Incubeer eierstokken (inclusief gedissocieerd ei kamers) in het mengsel van reagentia A en B gedurende 30 min bij kamertemperatuur met milde schudden.
3. Wassen het mengsel van reagentia A en B met 0,2% PBST 4 keer gedurende 10 minuten elk.
4. Transfer eierstokken ondergedompeld in PBST tot een goed op de plek plaat met een plastic druppelaar.
5. Bereid substraat oplossing van 3,3'-diaminobenzidine (DAB): los een tablet DAB plus een andere die ureum waterstofperoxide in 1 ml van DDH ₂ O via krachtig vortexen gedurende 1 min.
   OPMERKING: DAB, een substraat neerslaan van peroxidase, is een populaire chromogen voor immunokleuring. Het produceert een breigen en onoplosbare neerslag na geoxideerd door het peroxidase. Zwakke signalen kunnen worden verbeterd door toevoeging van nikkelchloride de substraatoplossing (eindconcentratie 0,05-0,08%).
6. Verwijder de PBST oplossing achterblijft in de put en vul met 100 ul van de DAB substraatoplossing voor signaalverwerking ontwikkeling.
7. Monitor intensiteit van signalen onder een stereomicroscoop bij een lage vergroting.
8. Stop reacties door het verwijderen van de DAB-oplossing, gevolgd door het bijvullen met 1x PBS onmiddellijk. Herhaal het wassen twee keer.
9. Transfer eierstokken terug naar de 1,5 ml buis en daarna wassen met 1x PBS of PBST tweemaal voor 15 minuten elk.
10. Incubeer eierstokken in een glycerol-based montage medium (70% glycerol) O / N bij 4 ° C onder mild schudden.

8. Montage van de Bladluis Embryo

OPMERKING: De dikte van bladluis embryo varieert ontwikkelingsstadia. Montage strategieën worden dus gewijzigd om vroeg te passen (germaria en stadia 0-10), mid (stadia11-18), en late embryo (stadia 19-20), die zijn getoond in Figuur 2B - D. Embryonale enscenering gevolgd Miura et al ^12.

1. Transfer eierstokken samen met montage medium aan de cel dienblad met een plastic druppelaar en acht monsters onder een stereomicroscoop bij een lage vergroting.
2. Snijd de kelken in verband met de laterale eileider met insect pinnen en vervolgens over een geïsoleerde ovariole naar een leeg glas goed met een druppelaar. Deel uitmaken van de uiteindelijke volume op 50-100 pi met montage medium.
3. Transfer een ovariole op de dia met een dropper en vervolgens ontleden ei kamers met insect pinnen.
   LET OP: Voor embryo's ouder dan 6 fase van de ontwikkeling, de scheiding van ei kamers wordt gesuggereerd; voor germaria en de eerste twee ei kamers jonger dan 6 fase scheiding is optioneel.
4. Verplaats een ontleed ei kamer een schone dia met behulp van een glazen pipet.
5. Zet een dekglaasje (afmetingen: 22 x 22mm) over de ontleed germaria of ei kamers (met embryo's in stadia van ontwikkeling 1-10) langzaam om luchtbellen te vermijden.
   1. Mount ei kamers (met embryo's in stadium 18/11 ontwikkeling) op een dia met eenzijdige dekglaasje bridge en plaats een dekglaasje (grootte: 18 x 18 mm) boven het monster.
   2. Mount ei kamers (met embryo's ouder dan 19 stadium van ontwikkeling) op een dia met dubbelzijdig dekglaasje brug en plaats een ander dekglaasje (afmetingen: 18 x 18 mm) op de bovenkant van het monster.
6. Vullen de ruimte onder de top dekglaasje met montage media om te voorkomen dat het drogen van het monster.
7. Mild roll het embryo door de dekglaasje te schuiven om de juiste oriëntatie voor observatie te verkrijgen.
8. Afdichting rond de rand van de dekglaasjes (met inbegrip van de brug dekglaasjes) met nagellak.

9. Imaging Analyse

1. Foto differentieel interferentie contrast (DIC) beelden van de hele-mount embryo's met een compound microscoop uitgerust met DIC optiek en een droge objectieflens (10X, 20X, 40X) verbonden met een camera. Installeer de software voor beeldoverdracht tussen de camera en de computer met behulp van instructies van de fabrikant.
2. Verwerven projecties van de fluorescent gelabelde embryo's met een laser-scanning confocale microscoop ^14. De instructies van de fabrikant voor het fotograferen, z-stapelen en 3D uitsteken beeldverwerkingssoftware.
   1. Draai de dia ondersteboven, vinden de gemonteerde monster met 10X objectieve en omcirkelen het monster met een fijn geoliede-gebaseerde pen.
      NB: Dit maakt het identificeren van het monster gemakkelijker bij het zoeken naar deze doelstellingen door middel van een confocale microscoop.
   2. Een druppeltje olie op de bovenkant van het dekglaasje gebied waarvan tegenoverliggende zijde gelabeld zoals beschreven in 9.2.1.
3. Vind de focal plane op 40X olie-immersie objectief dan overstappen op een 63x olie-immersie objectief. Handmatig verplaatsen van de fijne scherpstelling controle op en doenwn om de beste focal plane vangen.
   LET OP: Voor het observeren van structurele details van germaria en vroege embryo's, raden wij u 40X doelstellingen of mensen met een hogere vergroting.
4. Scan de embryo in verschillende excitatie kanalen en het imago van een z-stack te verkrijgen.
   OPMERKING: Bij erwtenbladluis weefsels verminderen dikte van elke optische gedeelte neer op 1,5 urn of minder.

Representative Results

In deze studie hebben we uitgevoerd whole-mount immunokleuring op embryo's van aseksueel erwt bladluizen (Figuur 1A). Deze vrouwen produceren nakomelingen parthenogenetisch en levendbarende. Deze vrouwelijke embryo's ontwikkelen binnen ei kamers van de ovariële buisjes (ovarioles) (Figuur 1B en figuur 2A). Voordat microscopie, de ontleed ovarioles zijn de vlekken doelstellingen; echter gescheiden ei kamers vereist voor observatie van embryo's onder een microscoop (Figuur 2B - D).

Toename van weefsel permeabiliteit

Proteinase K (PK) behandeling is een standaard aanpak voor het verbeteren van weefsel permeabiliteit, maar om embryo's van een aantal model-organismen, zoals Caenorhabditis elegans (nematoden), Drosophila melanogaster (vlieg) en Danio rerio (zebravis) -dit stap is optioneel. In de erwtenbladluis, de eis voor PK behandeling fase-afhankelijk: voor germaria en embryo's voorafgaand aan de gastrulatie (fasen 0-7), kan PK behandeling worden weggelaten; maar voor de embryo's onder germband uitbreiding (fase 11) of in latere stadia deze stap wordt sterk aanbevolen. Bijvoorbeeld, in het midden embryogenese signalen werden nauwelijks gedetecteerd in embryo zonder PK behandeling (Figuur 3A - C). Daarentegen werd signaalintensiteit significant verbeterd in embryo's die zijn PK digestie (Figuur 3A - C ', A "- C").

Reductie van achtergrond kleuring

Een hoge activiteit endogeen peroxidase (POD) werd geïdentificeerd in de embryonale weefsels van bladluizen. Om deze enzymactiviteit onderdrukken, werden de paraformaldehyde gefixeerd embryo's geïncubeerd in aanwezigheid van hydrogen peroxide (H ₂ O _2), een gemeenschappelijke reagens voor oxidatie van POD. Onze resultaten toonden dat H ₂ O ₂ behandeling niet effectief de activiteit van endogene POD niet onderdrukken eind-stadium embryo's (Figuur 4A, D). Daarentegen werd achtergrondkleuring mate verminderd in embryo's blootgesteld aan methanol incubatie (Figuur 4B, C, E, F). Voordat het primaire antilichaam embryo's werden geblokkeerd in een oplossing bevattende NGS en BSA zoals beschreven in standaardprotocollen voor antilichaamkleuring. Echter, residuele achtergrondkleuring in de bladluis embryo's werd waargenomen (Figuur 3A - C '). Dit probleem werd opgelost na vervanging NGS / BSA met een buffer die voor DIG-labeling experimenten geleverde blokkerend reagens zoals in situ hybridisatie (Figuur 3A "- C"). We concluderen dan ook dat de post-fixatie met methanol en incubatie met de DIG-Bblokkeringsreagens zijn beide essentieel voor het verminderen achtergrondkleuring in de bladluis embryo.

PK behandeling en DIG-B blokkerend reagens vereist niet alleen effectief signaaldetectie met het chromogene ook fluorescerende benaderingen. Actine kleuring met falloïdine of kleuring voor methanol epitoop, echter niet in embryo's die zijn pre-fixatie met methanol, waarbij de natieve vorm van actine of antilichamen kan vernietigen. Derhalve dient deze behandeling te worden vermeden bij het uitvoeren fluorescentie immunokleuring. Naast het elimineren van de methanol behandelingsstappen immunofluorescentie maakt multi-labeling experimenten in de bladluis embryo. Met behulp van confocale microscopie, kan bijvoorbeeld erwtenbladluis Vasa1 eiwit (ApVas1) in kiemcellen, α-tubuline in microtubuli, F-actine in microfilamenten en DNA in kernen gelijktijdig gemarkeerd en zichtbaar (figuur 5A, C). In vergelijking met de chromogenic methode (Figuur 5B), confocale snijden van fluorescent gelabelde monsters zorgt voor een betere resolutie van gelokaliseerde signalen zoals ApVas1 in het kiemplasma en cellularizing kiemcellen in het begin van bladluis embryo's (Figuur 5C ', D - D "). De goedkeuring van de voorwaarden voor de etikettering kiemcellen hierboven beschreven, werd de Engrailed / Invected eiwit in segmenten van de verlenging kiem band ook gekleurd met het antilichaam 4D9 (Figuur 6). Dit toont aan dat ons protocol voor immunokleuring zoals chromogene en fluorescerende methodes-effectief kunnen worden toegepast signaaldetectie in zowel de kiembaan en somatische cellijnen in bladluizen.

Figuur 1. Parthenogenetische levendbarende erwt bladluizen. (A) een eerste-instar nimf die uit een aseksueel levendbarende vrouwelijke volwassen. (B 12 zijn. Een ovariole bevat een germarium in de punt (pijlen), 1-2 eicellen en 5-7 embryonale kamers. Darm en cauda worden meestal geassocieerd met de ontleed eierstokken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. Illustratie van strategieën voor montage bladluis embryo's in verschillende ontwikkelingsstadia. (A) Overzicht van de embryonale ontwikkeling in het ovariole ontleed uit parthenogenetische vivipare vrouwelijke volwassen. Korte oögenese (germarial podium en stadia 0-2) wordt gevolgd door embryogenese (etappes 3-20). Overzicht van embryogenese: f ormatie van syncytieel blastoderm (fasen 3-5); blastulation (fasen 6-7); gastrulatie (stadia 10/08); rek van kiem band (etappes 11-14); katatrepsis (stadia 15); Post katatrepsis en de kiem band terugtrekken (etappes 16-17); organogenese (stadia 18-20). Kleur toetsen onderin de figuur. (B, B ') Germarium en podia 0-10 embryo's. Geen dekglaasje brug nodig. (C, C ') Stages 11-18 embryo's. Een dekglaasje brug is vereist. (D, D ') Stages 19-20 embryo's. Dubbele dekglaasje bruggen vereist. Het rollen van de embryo's door te schuiven het dekglaasje kan verschillende hoeken van de waarneming te maken. Groottes van dekglaasjes: 22 x 22 mm (B), 18 x 18 mm (C) en (D). De dikte van dekglaasjes: 0,13-0,16 mm. Embryonale enscenering gevolgd Miura et al ¹² Afkortingen: G:. Germarium; st: podium..com / files / ftp_upload / 53.883 / 53883fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

. Figuur 3. Proteinase K behandeling en vergelijking van reagentia met verschillende blokkerende effecten Anterior van ei kamers naar links; alle weergaven zijn laterale behalve embryo getoond in (B ', C', C '), die rug aan. Embryo's zijn allemaal gekleurd met behulp van ApVas1 antilichaam (verdunning 1: 500) en de signalen van ApVas1 worden ontwikkeld binnen 10-20 sec. Pijlpunten wijzen locatie van kiemcellen. (A - C) Embryo's zonder behandeling van proteïnase K (PK). ApVas1 signalen in kiemcellen worden nauwelijks ontdekt. (A - C ', A "- C") Vergelijking van de achtergrond kleuring in embryo blocked met NGS en BSA (A - C) en de commerciële blokkerend reagens in de DIG Wash en Block Buffer Set (DIG-B) (A "- C"). De achtergrond is in embryo getoond in ("- C" A) aanzienlijk verminderd. Afkorting: b: bacteriën. Schaal bars. 100 micrometer Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

. Figuur 4. Het minimaliseren achtergrond kleuring met methanol Anterior van embryo's is aan de linkerzijde; Alle standpunten zijn rug. Embryo's worden behandeld met PK voor het verhogen van de permeabiliteit van antilichaam. Pijlpunten wijzen locatie van kiemcellen. (A, B, D, E) Vergelijking van behandelingenmet waterstofperoxide (H ₂ O ₂₎ en methanol. Embryo's worden alleen gekleurd met secundair antilichaam. H ₂ O ₂ behandeld (0,3% w / v, 10 min): hoge achtergrond (A, D); methanol behandeling (100%, 60 min): laag achtergrond (B, E). (C, F) Primair antilichaam kleuring op embryo's behandeld met methanol. Algemene methanol behandeling identiek aan die voor embryo getoond in (B, E). De ApVas1 antilichaam voorkeur labelt de embryonale kiemcellen. Schaal bars. 100 micrometer Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5. Immunofluorescentiekleuring van vroege embryo's. (A, C - D) en 1: 500 in (B). (A) Kleuring signalen die ApVas1, α-tubuline, F-actine, en nucleair DNA bevatten worden gedetecteerd met behulp van vier kanalen met verschillende golflengtes. Kleurtoetsen signalen worden aan de onderkant van de figuur. (B) DIC beeld van een chromogeen resultaat voor vergelijking. ApVas1 verrijkt in de germarium terwijl het contrast intensiteit van posterior lokalisatie van ApVas1 (pijlpunten) in de fase-3 embryo niet zo duidelijk als getoond in (C, C '). (C, C ') Verrijking van ApVas1 signalen in het ei posterior. Signalen gelokaliseerd in het achterste deel van de ei kamer (pijlpunten) worden versterkt door het stapelen. Door signalen van F-actine en α-tubuline gedeeltelijk maskeren van de ApVas1 in de achterste (C), een beeld door één scan gekanaliseerde weergegeven in (C). (D - D '') confocale snijden van ApVas1 gelokaliseerd in het achterste deel van de etappe-4 embryo. Beelden weergegeven in (D) en (D) zijn ApVas1 gedetecteerd in oppervlakte en centrale focale vlakken resp. (D ") is het samengevoegde beeld van alle secties van dezelfde embryo als (D) en (D) Afkortingen: als: aster, fc, follikel cellen; poc, prospectieve eicel, sp. Spindel, tc, trofische snoeren. Schaal bars. 10 um Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6. Immunokleuring op embryonale segmenten. AnTERIOR ei kamers is aan de linkerzijde. PK-behandelde embryo's gekleurd met het monoklonale antilichaam 4D9 tegen Engrailed / Invected, worden uitgedrukt in embryonale segmenten. Kleurtoetsen signalen worden aan de onderkant van de figuur. (A, A ') Immunofluorescentiekleuring op een stadium-13 embryo. (A), een confocale beeld gestapeld van afbeeldingen Engrailed / Invected, α-tubuline, F-actine, en nucleair DNA kleuringen. (A) een confocale afbeelding met de kleuring van enige Engrailed / Invected. Zonder de inmenging van de signalen van andere kanalen, worden de signalen beter weergegeven. (B, C) ​​Chromogene kleuring op embryo's in stadium 13 en 17 ontwikkeling, respectievelijk. (B) Stage-13 embryo. (C) Stage-17 embryo. Van stappen 13 tot 17, wordt het groeiende aantal segmenten in de buik gelabeld door 4D9. (D) Negatieve controle (-Ctrl) vleking alleen secundair antilichaam geconjugeerd met Alexa Fluor 633. Bijna geen immunokleuring signalen worden gedetecteerd op ovariole zonder primaire antilichaam. Echter, autofluorescentie van bacteriën (onderbroken lijn) in fase 7 en 13 van ei kamers worden gedetecteerd op de golflengte 488 nm. Afkortingen: A: buik; b: bacteriën; H: het hoofd; T: thorax. Schaal bars. 100 micrometer Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

We identificeerden optimale omstandigheden van cruciaal belang voor een succesvolle immunokleuring in de erwtenbladluis A. Pisum, een opkomende modelorganisme voor genomische en ontwikkelingsstudies ^3,15. Geoptimaliseerde omstandigheden voor toenemende weefsel permeabiliteit en verminderen achtergrondkleuring verhoogde intensiteit en specificiteit van signalen. Zij verschillen van standaardprotocollen voor immunokleuring in andere dierlijke modellen in de stappen voor het creëren van poriën in celmembranen en het blokkeren van niet-specifieke antilichaambinding.

Voor immunokleuring en in situ hybridisatie, proteïnase K (PK) spijsvertering een conventionele benaderingen voor het verhogen weefsel permeabiliteit ^16-19. In antilichaam kleuring van bladluis weefsels onze resultaten toonden aan dat: (1) PK digestie aanzienlijk verbeterd immunokleuring signalen in de parthenogenetische viviparous embryo tijdens germ band verlenging (fasen 11-14) (Figuur 3B ', C'), ofschoonzwakke signalen waren nog zichtbaar in embryo zonder PK behandeling (figuur 3B, C); en (2) PK spijsvertering was verplicht voor embryo's uit katatrepsis verder (stadia 15-20) (Figuur 4C, F en figuur 6C). Aseksuele embryo viviparous vóór katatrepsis, het volume van het ei kamers waarschijnlijk de oorzaak van het probleem, omdat penetratie succesvolle immunokleuring op vroege seksuele oviparous embryo's die in de gelegde eieren-die bijna gelijk in grootte aan de rijpe aseksuele egg kamer- zijn geen PK vertering ²⁰ vereisen. Daarom is de verlengende en vouwen van de kiem band (stadia 11-14) in de beperkte ruimte van de aseksuele ei kamers kan de ingang van antilichaam belemmeren en het PK dat de penetratie van antilichamen mogelijk maakt door het creëren van poriën in celmembranen tussen de vastgelopen embryonale structuren. Daarentegen kan de rechte lijn uitbreiding van de kiem band in de seksuele eieren leggen waarom het is gekleurd, zelfs inAangezien PK. Verwijdering van de vitelline envelop / chorion kan ook seksuele eierleggende embryo's meer toegankelijk voor antilichaam. Voor embryo na katatrepsis (stadia 16-20), PK behandeling is essentieel voor zowel aseksuele en seksuele morphs omdat embryo's dik cuticled ¹⁹ (Figuur 4C, F en figuur 6C).

Desalniettemin, de voorgestelde voorwaarde PK digestie (1 ug / ml gedurende 10 min) vereist verdere aanpassing als de integriteit van embryonale structuren of de intensiteit van de signalen niet bevredigend. Dit wordt vooral veroorzaakt door de PK-activiteit die kan variëren van partij tot partij. Als bijvoorbeeld embryonale weefsels worden beschadigd na digestie PK, PK concentratie kan worden verlaagd tot 0,5 ug / ml. Evenzo, als signaalintensiteit zwak, uitbreiding van incubatie 15-20 min is wordt aanbevolen. De rijpe embryo's (stap 20) onderworpen aan langdurige PK incubatie tot 20 min bij 1,0 ug / ml concentratie However, meestal weer te zwakke signalen, wat suggereert dat PK spijsvertering is nog niet compleet. Langdurige ontsluitingsbom kleuring signalen verbeteren maar facultatief, vooral wanneer expressiepatronen gedetecteerd in het stadium 18 embryo's komen overeen met die in de fase 20 embryo. In vergelijking met embryo's in stadium 20 van ontwikkeling, het podium 18 embryo's met soortgelijke morfologie maar met kleinere hoeveelheid lichaam cuticula algemeen kan sterker signaalintensiteit opleveren.

Tijdens signaal ontwikkeling achtergrondkleuring kan worden verhoogd door de activiteit van endogene enzymen die kruisreageren met de substraten. In het erwtenbladluis embryo, de activiteit van de endogene alkalische fosfatase (AP) en peroxidase (POD), die beide gemeenschappelijke antilichaamconjugaten voor de vertering signaal substraten werd gedetecteerd. Hydrolase activiteit van de endogene AP effectief kan worden onderdrukt tijdens embryogenese van levamisool (data niet getoond). Niettemin behandeling van embryo's met 0,3-0,6% hydrogen peroxide (H ₂ O ₂₎ kan alleen verwijderen van de endogene POD activiteit vóór katatrepsis maar was niet voldoende voor oudere embryo's (Figuur 4A, D). Methanol incubatie, een alternatieve benadering voor het denatureren endogene eiwitten werd aangetoond effectief de bladluizen ²¹ (figuur 4B, E) zijn. In tegenstelling tot de H _{2 O 2,} die schade bladluis weefsels tijdens langdurige incubatie van 30 minuten of langer, methanol niet verteren of vervormen de embryo's tijdens elk stadium van ontwikkeling (Figuur 4C, F). Dientengevolge methanol een beter alternatief voor het onderdrukken van endogene POD activiteit bladluis embryo. Als resterende achtergrondkleuring wordt gedetecteerd, wat gewoonlijk de rijpe embryo's met een verdikte laag cuticula, O / N incubatie in methanol bij 4 ° C-volgens onze ervaring-verder de endogene POD activiteit te verminderen.

Resterend achtergrondkleuring waargenomen inembryo geblokkeerd met serum eiwitten zoals normaal donkey serum (NDS), normaal geitenserum (NGS), runderserumalbumine (BSA), of mengsels ¹³ (figuur 3A'-C "). Het aannemen van een commercieel geleverd blokkerende reagens toegepast voor in situ hybridisatie, daarentegen, de overblijvende achtergrond tijdens immunokleuring aanzienlijk worden geëlimineerd ⁵ (Figuur 3A '"- C"). Hoewel de ingrediënten van het blokkerende reagens zijn eigendom, het waarschijnlijk bevat niet-serum-eiwitten die niet-specifieke epitopen van de erwtenbladluis eiwitten blokkeren. Het blokkeren van reagens werkte ook veel beter dan dierlijke sera in de groene perzikluis groene perzikluis. Ook in M persicae PK spijsvertering en methanol incubatie resulteerde in bevredigende antilichaam penetratie en achtergrond verminderen. - Vergelijkbaar met de verbeterde resultaten in A. Pisum (gegevens niet getoond). We verwachten dat de omstandigheden Optimized voor toenemende weefsel permeabiliteit en verminderen achtergrond, of men gebruikt chromogene kleuring of fluorescentie, geldt voor vele andere soorten bladluizen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% hydrogen perxidase (H2O2)	Sigma-Aldrich	18304	For bleaching endogenous peroxidase of embryos.
4’6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542	For labeling the double-strand DNA. TOXIC. Wear gloves, dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure
4D9 anti-engrailed/invected mouse monoclonal antibody	Developmental studies hybridoma bank	AB_528224	For labeling the developing segments of embryo.
ApVas1 rabbit polyclonal antibody	Our laboratory	N/A	For labeling the aphid germline specific Vas1 protein in embryos. This antibody was made by our laboratory.
Austerlitz Insect pins	ENTOMORAVIA	N/A	For seperating each egg chambers from an ovariole. Size 000, BLACK ENAMELLED.
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	9048-46-8	For blocking the non-specific binding of antibodies.
Camera connted to compound microscope	Canon	EOS 5D	For photographing of aphid embryos.
Colorimetric 8 cell tray	Kartell Labware	357	For developing the staining signal of aphid embryos. Diameter 95 x 57 mm, cell depth 2 mm.
Compound microscope with DIC optics	Leica Microsystems	DMR	For photographing of aphid embryo mounted on the slides.
DIG Wash and Block Buffer Set	Sigma-Aldrich (Roche)	11585762001	For blocking the non-specific binding of antibodies. We diluted the 10x Blocking solution into 1x as blocking reagent.
Forceps	Ideal-tek	N/A	For dissection of ovaries from aphids. Manufacturer part No 5: 5 SA.
Glass dropper	N/A	N/A	For transfering ovaries of aphids from the splot plate to tubes. 150 mm of total length and 5 3/4" of tip length.
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	For clearing of aphid embryos and mounting.
Glycine	Bioshop	N/A	For blocking the enzyme activity of proteinase K (PK).
Goat anti-mouse IgG conjugated Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11017	For detection of primary antibody from mouse.
Goat anti-rabbit IgG conjugated Alexa Fluor 633	Invitrogen	A21072	For detection of primary antibody from rabbit.
Intelli mixer	ELMI laboratory equipment	RM-2M	For improving the thorughly reaction of reagents with ovaries.
Laser-scanning confocal microscopy	Leica Microsystems	SP5	For photographing of aphid embryo mounted on the slides with florecent tag.
methanol	Burdick and Jackson	AH2304	For bleaching endogenous peroxidase of embryos.
Microscope slides	Thermo scientific	10143560	For mounting of embryos. SUPERFROST ground edges, ca./env. 76 x 26 mm.
Microscope Cover glasses	Marienfeld	0101030	For mounting embryos on the slides. Size 18 x 18 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
Microscope Cover glasses	Marienfeld	0101050	For mounting embryos on the slides. Size 22 x 22 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
mouse monoclonal anti-alphaTubulin antibody (DM1A)	Santa Cruz Biotechnology	sc-32293	For labeling the distrbution of alpha-tubulin of cells.
Nail polish	N/A	N/A	For sealing the coverslips on the slides.
Normal goat serum (NGS)	Sigma-Aldrich	G9023	For blocking the non-specific binding of antibodies.
Paraformaldehyde (PFA)	VWR	MK262159	For fixation of aphid ovaries.
Phalloidin-TRITC	Sigma-Aldrich	P1951	For labeling the distrbution of F-actin on embryos.
Phosphate-buffered saline (PBS)	N/A	N/A	As isotonic solution for aphid ovaries.
Plastic dropper	N/A	N/A	For transfering ovaries of aphids from tube to cell tray. Size 3 ml.
Proteinase K	Merck	124678	For creating pores (punching) on the cell membrane and facilitating the access of antibodies.
Pyrex spot plate	N/A	N/A	For dissection and color reactions of aphid ovaries under microscopy. Each cavity with diameter 22 mm and  depth 7 mm.
SIGMAFAST 3,3’-diaminobenzidine (DAB) tablets	Sigma-Aldrich	D4168	For developing of substrated signals. Also called DAB peroxidase substrate tablet set.
Stereo microscope	Leica Microsystems	EZ4	For dissection and observation of aphid ovaries.
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	T8787	For creating pores (punching) on the cell membrane.
VECTASHIELD Elite ABC Kit (Rabbit IgG)	Vector laboratories	PK-6101	For enhancement of the signal. Including of biotinylated goat anti-rabbit IgG secondary antibody, A and B reagents.
VECTASHIELD mounting medium	Vector laboratories	H1000	For clearing of aphid embryos and mounting.