Individuazione di condizioni critiche per Immunostaining nel pisello afide embrioni: l'aumento del tessuto Permeabilità e diminuire la colorazione di fondo

Abstract

Il Acyrthosiphon pisum pisello afide, con un genoma sequenziato e abbondante plasticità fenotipica, è diventata un modello emergente per studi di genomica e di sviluppo. Come altri afidi, Un. Pisum propagarsi rapidamente tramite riproduzione vivipara partenogenetica, dove gli embrioni si sviluppano all'interno di camere d'uovo in maniera catena di montaggio nel ovariole. In precedenza abbiamo stabilito una solida piattaforma di tutto il montaggio ibridazione in situ che consente il rilevamento di espressione di mRNA negli embrioni afidi. Per analizzare l'espressione della proteina, però, i protocolli stabiliti per immunocolorazione i ovarioli di afidi vivipari asessuati non ha prodotto risultati soddisfacenti. Qui riportiamo condizioni ottimizzate per aumentare la permeabilità dei tessuti e la diminuzione colorazione di fondo, entrambi i quali erano i problemi quando l'applicazione di approcci consolidati. Ottimizzazioni includono: (1) incubazione di proteasi K (1 mg / ml, 10 min), che è stato trovato f essenzialeo la penetrazione degli anticorpi negli embrioni metà e in fase avanzata di afidi; (2) la sostituzione di siero normale di capra / albumina sierica bovina con un reagente bloccante fornito da un digossigenina (DIG) a base di tamponamento impostato e (3) l'applicazione di metanolo piuttosto perossido di idrogeno (H _{2 O 2)} per candeggio perossidasi endogena; che ha ridotto in modo significativo la colorazione di fondo nei tessuti afidi. Queste condizioni critiche ottimizzate per immunostaining permetteranno efficace rilevazione dei prodotti genici negli embrioni di A. Pisum e altri afidi.

Introduction

Gli afidi sono insetti hemipteran con piccoli (1-10 mm) corpi morbidi. Si nutrono di piante succhiando linfa floema con apparato boccale di piercing. Inoltre, si basano su un batterio endosimbiontica obbligato, Buchnera aphidicola, per sintetizzare aminoacidi essenziali che sono carenti nella dieta linfa floematica. Afidi hanno una storia di vita complesso che comprende partenogenetica riproduzione vivipara durante la primavera e l'estate fotoperiodo lungo il giorno e sessuale riproduzione ovipara innescato dal fotoperiodo breve-day, durante il quale essi definite un numero limitato di uova svernanti ^1,2. In primavera queste uova si schiudono per produrre la prima generazione di tutto al femminile afidi (fundatrices), dopo molti cicli di riproduzione partenogenesi fino all'autunno. La partenogenesi congiunturale afidi, dove le fasi asessuata e sessuale si alternano nel ciclo di vita annuale, è stato considerato come un ^1,2 novità evolutiva. Nei afidi vivipari partenogenetiche, Embriogenesi avviene entro le camere di uova dei tubuli ovariche (ovarioli). Al contrario, gli embrioni sessuali ovipare sviluppano nelle uova fecondate. A parte la plasticità riproduttiva, gli afidi possono visualizzare transgenerazionale ala polyphenism: in risposta a segnali di sovraffollamento e minacce predatori, le femmine asessuate unwinged possono vivipare produrre prole alato per la migrazione a lunga distanza. Pubblicazione della sequenza del genoma del afide del pisello Acyrthosiphon pisum -la prima sequenza del genoma di un basale insetti permette emimetaboli un'ulteriore esplorazione della plasticità riproduttiva, ala polyphenism, e altre funzioni, tra cui le interazioni insetto-pianta, vectoring virale e simbiosi di afidi su un molecolare base ^3.

Oltre al genoma sequenziato, strumenti per la caratterizzazione espressione e funzione del gene sono necessari per la promozione del pisello come modello maturo organismo ^4. Abbiamo descritto robusti protocolli di tutto-mount 5-7. RNA interference (RNAi) via a doppio filamento iniezione di RNA e l'alimentazione è stato utilizzato per il silenziamento genico in ninfe afidi e negli adulti, ma condizioni stabili per gene atterramento negli embrioni non sono ancora stati segnalati ^8-10. Immunocolorazione, un approccio a base di anticorpi in grado di rilevare l'espressione della proteina in campioni prima e dopo RNAi smontabile, è stata eseguita su embrioni pisello afide ^11-13. Tuttavia, l'aumento di permeabilità dei tessuti e l'eliminazione di colorazione di fondo sono ancora insoddisfacenti utilizzando protocolli standard per immunocolorazione negli embrioni vivipare asessuate del pisello. Per esempio, abbiamo scoperto che la penetrazione di anticorpi ai tessuti diminuita negli embrioni gastrulating (stadi 8-10) e che gli embrioni con germogli arti morfologicamente identificabili (fasi 13-14) erano appena permeabile all'anticorpo. Inoltre, la colorazione di fondo è stato visualizzato nel viviparo asessuatanoi pisello embrioni afidi colorate usando anticorpi contro il marcatore linea germinale Vasa così come quella contro la proteina engrailed / Invected espressa nei segmenti embrionali ^12,13. In realtà la colorazione di fondo era ancora chiaramente visibile in embrioni colorati con il solo anticorpo secondario.

Al fine di aumentare la permeabilità senza danneggiare l'integrità dei tessuti afidi, abbiamo titolato accuratamente la concentrazione di proteinasi K e determinati condizioni ottimali per la digestione tessuto su embrioni afidi. Per evitare marcatura non specifica del pisello, abbiamo cercato composti che potrebbero bloccare efficacemente embrioni e sopprimere l'attività di perossidasi endogena (POD), un enzima impiegato per amplificare segnali durante la immunocolorazione. Un reagente di blocco fornita da un digossigenina (DIG) gruppo di tamponi based, piuttosto il siero di capra normale usato tradizionalmente (NGS) / albumina di siero bovino (BSA), ha ridotto significativamente la colorazione di fondo. Inoltre, il metanolo è stato trovato per INHIbit dell'attività POD endogena più efficacemente di perossido di idrogeno (H _{2 O 2).} I dettagli riguardanti queste condizioni specifiche di afidi per immunocolorazione sugli embrioni verranno descritti nelle sezioni seguenti.

Protocol

1. Cultura di Afidi

NOTA:. Il ceppo di laboratorio del partenogenetica vivipara pisello afide Un pisum sono stati originariamente raccolti nel centro di Taiwan ed è stato allevato su piante ospiti (sativum giardino di piselli Pisum o fava favino) sotto-giorno lungo fotoperiodo per più di 300 generazioni (una generazione: ~ 10 giorni).

1. Germinazione dei semi
   1. Mettere a bagno i semi di piante ospiti in acqua di rubinetto per 3-5 giorni a temperatura ambiente. Riempire con acqua fresca una volta al giorno.
      NOTA: In alternativa, mettendo semi di piante ospiti direttamente nel terreno umido può indurre la germinazione pure.
   2. Crescere 10 semi in germinazione in una piccola pentola (alto 9 cm di diametro x 7 cm) con terreno nella camera di crescita sotto fotoperiodo 16 ore luce / 8 ore buio a 20 ° C.
   3. Circa 10 giorni dopo l'inizio della crescita, trasferire gli afidi sulle piante la cui altezza è più di 8 cm.
2. Trasferimento di Afidi Mantenere ogni vaso di piante all'interno di un bicchiere di vetro da 1 L, trasferire 8 afidi adulti sulle piante utilizzando un pennello, e quindi sigillare il bicchiere con una copertura permeabile all'aria come maglia garza per evitare la fuoriuscita di afidi.
3. Incubare afidi in una camera di crescita a fotoperiodo 16 ore luce / 8 ore buio a 20 ° C. Acqua ogni vaso di piante una volta al giorno.
4. Per ottenere la prossima generazione di afidi, ribadire passi 1.1.3-1.2.2 dieci giorni dopo il trasferimento afide primario.

2. Dissezione e fissazione di ovaie

1. Appena preparare 4% paraformaldeide (PFA) in 1x tampone fosfato salino (PBS) come tampone fissazione.
2. Riempire un pozzetto di una piastra spot con PFA (circa 500 ml), posizionare la lastra sotto un microscopio stereo a basso ingrandimento, e immergere un afide adulti all'interno della PFA per la dissezione.
3. Sezionare ovaie tenendo la testa e all'addome, con un set di pinze, tagliare aperto dorsalecuticole dell'addome, e trascinando le ovaie lontano dalla cavità addominale.
4. Fissare tre coppie di ovaie in una provetta da 1,5 ml contenente 1 ml di PFA a temperatura ambiente per 20 min.
5. Buffer fissazione decantare con un trasferimento pipetta (vetro o monouso) e poi lavare le ovaie con 0,2% TritonX-100 in PBS 1x (PBST) 3 volte per 10 minuti ciascuno. Lieve tremante di un mixer / rotatore (angolo di rotazione: 60 ° (F60) / Velocità di rotazione: 8 giri) è consigliato sia per la fissazione e il lavaggio.

3. Il trattamento con proteinasi K (PK) per aumentare la permeabilità dei tessuti embrionali

NOTA: il trattamento PK viene applicata agli embrioni da estensione di banda germe in avanti (fase 11 di sviluppo). Per gli embrioni più giovani, questo passaggio è facoltativo.

1. In serie diluire la soluzione stock di PK (10 mg / ml) con PBS 1x alla concentrazione di lavoro 1 ug / ml.
2. Incubare ovaie con 1 mg / ml di PK (circa 500 ml) per 10 minuti con lieve agitazione.
3. Decantare PK solution e quindi lavare le ovaie con 700 ml di glicina (2 mg / ml) 3 volte per 5 minuti ciascuno.
4. Lavare le ovaie con lo 0,2% PBST due volte per 10 minuti ciascuno.
5. Fissare le ovaie ancora con tampone fissazione per 15 minuti a temperatura ambiente con lieve agitazione.
6. Gettare il surnatante e lavare le ovaie con lo 0,2% PBST due volte per 10 minuti ciascuno.

4. Metanolo incubazione per Soppressione della perossidasi endogena (POD) di attività

NOTA: Il metanolo incubazione non si applica agli embrioni sottoposti a Colorazione falloidina o anticorpi epitopi che sono il metanolo sensibili.

1. Di serie disidratare ovaie con diversa percentuale di metanolo in PBST 0,2% (v / v: 1: 3, 1: 1, 3: 1) incubando ovaie a ciascuna concentrazione della soluzione di metanolo per 10 min con blanda agitazione.
2. Disidratare ovaie con 100% di metanolo per 1 ora a temperatura ambiente con lieve agitazione.
   NOTA: I risultati soddisfacenti di colorazione potrebbero ancora essere ottenuti da tessuti di afidi che sono stati memorizzati nel 100% di metanolo a -20 &# 176; C per un mese.
3. Di serie reidratare ovaie con diversa percentuale di metanolo in PBST 0,2% (v / v: 3: 1, 1: 1, 1: 3) incubando ovaie a ciascuna concentrazione della soluzione di metanolo per 10 min con blanda agitazione.

5. anticorpi colorazione

1. Diluire la soluzione 10x blocco dal set tampone-DIG (DIG-B) a 1x.
   NOTA: La soluzione di saturazione 1x DIG-B è più efficace per ridurre la colorazione di fondo del reagente standard blocco composto 5% (v / v) di siero di capra normale (NGS) e 0,5% (v / v) di albumina di siero bovino (BSA ) in 0,2% PBST.
2. Incubare le ovaie con la soluzione 1x DIG-B di blocco per da 2,5 a 4 ore a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C con lieve agitazione.
   NOTA: Per tre coppie di ovaie in una provetta da 1,5 ml, 200 ml è il volume minimo per il blocco di campione e colorazione anticorpale.
3. Decantare il surnatante e sostituirlo con soluzione fresca 1x DIG-B blocco contenente l'anticorpo primario adeguato dilutistechiometrica. Colorare le ovaie per 4 ore a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C con lieve agitazione.
   NOTA: Per l'esperimento descritto qui, utilizzare i seguenti diluizioni ottimali di anticorpi primari: (1) ApVas1 anticorpo: 1: 500 per la colorazione cromogenico, 1:50 per immunofluorescenza; (2) anti-α tubulina anticorpo: 1: 500; (3) l'anticorpo monoclonale 4D9: 01:25.
4. Lavare le ovaie con lo 0,2% PBST 4 volte per 15 minuti ciascuno.
5. Incubare ovaie con soluzione di saturazione 1x DIG-B per 1 ora a temperatura ambiente con lieve agitazione.
6. Decantare il surnatante e sostituirlo con fresco soluzione DIG-B blocco 1x contenente anticorpo secondario in adeguato rapporto di diluizione. Colorare le ovaie per 4 ore a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C con lieve agitazione.
   1. Utilizzare i seguenti rapporti di diluizione di anticorpi secondari: (1) Per immunofluorescenza: 1: 500 per Alexa Fluor 633 capra anti-IgG di coniglio o Alexa Fluor 488 capra anti-IgG di topo; (2) Per la colorazione cromogeno: 1: 200 per IgG anti-coniglio di capra biotinilato.
      NOTA: L'anticorpo secondario biotinilato è applicata per interagire con l'avidina-biotina-complesso (ABC) nella (cromogenico) rilevazione substrato a base, attraverso cui i segnali di colorazione sono notevolmente amplificati.
   2. Per immunofluorescenza, effettuare colorazione al buio perché l'anticorpo secondario è sensibile alla luce.
7. Lavare anticorpo secondario con lo 0,2% PBST 4 volte per 10 minuti ciascuno.

6. nucleare e F-actina Colorazione

NOTA: Questo si applica solo per immunofluorescenza.

1. Stain ovaie con lo 0,2% PBST contenente DAPI (2 ng / mL) e falloidina-TRITC (100 nM) per 2 ore a RT nel buio.
2. Lavare le ovaie con lo 0,2% PBST 4 volte per 10 minuti ciascuno.
3. Incubare ovaie con il mezzo di montaggio O / N a 4 ° C con lieve agitazione.

7. Sviluppo di segnale

NOTA: Questo si applica solo per la colorazione cromogenico.

1. Preparare 100 ml direagente avidina-biotina-complesso (ABC) per migliorare i segnali con l'aggiunta di 1 ml di reagente A (avidina) in 98 ml di 0,2% PBST, mescolando bene con dolce pipettaggio, e l'aggiunta di 1 ml di Reagente B (biotina coniugato con perossidasi di rafano ), seguita da miscelazione immediata. Incubare la miscela per 30 min a temperatura ambiente con delicata agitazione.
2. Incubare ovaie (comprese le camere di uovo dissociati) nella miscela dei reagenti A e B per 30 minuti a RT con lieve agitazione.
3. Lavare la miscela dei reagenti A e B con lo 0,2% PBST 4 volte per 10 minuti ciascuno.
4. Trasferimento ovaie sommersi in PBST a un pozzo sul piatto posto con un contagocce di plastica.
5. Preparare la soluzione di substrato di 3,3'-diaminobenzidina (DAB): sciogliere una compressa DAB più un'altra contenente urea perossido di idrogeno in 1 ml di _DDH 2 O tramite vortex vigorosa per 1 min.
   NOTA: DAB, un substrato di precipitazione di perossidasi, è un cromogeno popolare per immunocolorazione. Produce un brproprio e insolubile precipitato dopo essere ossidato dalla perossidasi. Segnali deboli può essere migliorata con l'aggiunta di cloruro di nichel per la soluzione di substrato (concentrazione finale 0,05-0,08%).
6. Rimuovere la soluzione PBST rimanente nel pozzo e riempire con 100 microlitri della soluzione di substrato DAB per lo sviluppo del segnale.
7. Monitorare l'intensità dei segnali in un microscopio stereo a basso ingrandimento.
8. Arrestare reazioni rimuovendo la soluzione DAB, seguita da riempimento con PBS 1x immediatamente. Ripetere il lavaggio due volte.
9. Trasferimento ovaie di nuovo al tubo 1,5 ml e poi lavare con PBS 1x o PBST due volte per 15 minuti ciascuno.
10. Incubare ovaie in un mezzo a base di montaggio glicerolo (70% glicerolo) O / N a 4 ° C con lieve agitazione.

8. Montaggio del afide Embrioni

NOTA: Lo spessore di embrioni afidi varia tra stadi di sviluppo. Strategie di montaggio sono quindi modificati per adattarsi precoce (germaria e palchi 0-10), Mid (stadi11-18), e in ritardo embrioni (stadi 19-20), di cui sia dimostrato in Figura 2B - D. Messa in scena embrionali seguito Miura et al. ¹²

1. Trasferimento ovaie insieme con mezzo di montaggio per vassoio di cella con un contagocce di plastica e osservare i campioni al microscopio stereo a basso ingrandimento.
2. Tagliare i calici associati al ovidotto laterali con perni di insetti e quindi trasferire una ovariole isolato di un bicchiere vuoto bene con un contagocce. Portare il volume finale di 50-100 microlitri con mezzo di montaggio.
3. Trasferire un ovariole sul vetrino con un contagocce di vetro e poi sezionare camere uovo con perni di insetti.
   NOTA: per gli embrioni di età superiore a 6 fase di sviluppo, la separazione di camere d'uovo è suggerito; per germaria e le prime due camere uovo di età inferiore ai 6 fase, la separazione è opzionale.
4. Riposizionare una camera di uovo sezionato ad un vetrino pulito con un contagocce di vetro.
5. Metti un coprioggetto (dimensioni: 22 x 22mm) sui germaria sezionato o camere d'uovo (che contiene gli embrioni in fasi 1-10 di sviluppo) lentamente per evitare le bolle.
   1. Camere di Monte d'uovo (che contiene gli embrioni in fasi 11-18 di sviluppo) su una diapositiva con unilaterale ponte coprioggetto e inserire un altro vetrino (dimensioni: 18 x 18 mm) sulla parte superiore del campione.
   2. Camere di Monte d'uovo (che contiene gli embrioni di età superiore ai 19 della fase di sviluppo) su una diapositiva con doppia faccia ponte coprioggetto e inserire un altro vetrino (dimensioni: 18 x 18 mm) sulla parte superiore del campione.
6. Riempire lo spazio sotto il vetrino superiore con supporti di montaggio per evitare l'essiccamento del campione.
7. Lievemente rotolare l'embrione facendo scorrere il vetrino per ottenere il giusto orientamento per l'osservazione.
8. Sigillare attorno al bordo del coprioggetto (compresi i coprioggetti ponte) con smalto.

Analisi 9. Imaging

1. Fotografia contrasto interferenziale differenziale (DIC) immagini di tutto il montaggio degli embrioni con un compound microscopio dotato ottica DIC e una lente obiettivo secca (10X, 20X, 40X) collegato ad una telecamera. Installare il software per il trasferimento delle immagini tra la fotocamera e il computer utilizzando le istruzioni del produttore.
2. Acquisire le proiezioni degli embrioni fluorescente con confocale a scansione laser microscopio ^14. Seguire le istruzioni del produttore per fotografare, z-stacking, e 3D proiettando con software di imaging.
   1. Ruotare la slitta a testa in giù, trovare il campione montato con 10X obiettivo, e il giro della zona del campione con una multa penna-based oliato.
      NOTA: Questo rende più facile l'identificazione del campione durante la ricerca di esso attraverso gli obiettivi di un microscopio confocale.
   2. Aggiungere una goccia di olio sulla parte superiore della zona coprioggetto cui lato opposto è etichettato come descritto in 9.2.1.
3. Trova il piano focale a 40X obiettivo ad immersione in olio poi passare a un obiettivo ad immersione in olio 63X. Spostare manualmente il controllo del fuoco multa e farewn per catturare la migliore piano focale.
   NOTA: Per osservare i dettagli strutturali di germaria e dei primi embrioni, si consiglia di utilizzare 40X obiettivi o quelli con maggiore ingrandimento.
4. Eseguire la scansione del embrione in diversi canali di eccitazione e ottenere un'immagine z-stack.
   NOTA: Per i tessuti afide del pisello, ridurre lo spessore di ogni sezione ottica fino a 1,5 micron o inferiore.

Representative Results

In questo studio, abbiamo eseguito tutto il monte-immunocolorazione sugli embrioni di afidi pisello asessuati (Figura 1A). Queste femmine producono prole per partenogenesi e vivipare. Questi embrioni di sesso femminile si sviluppano all'interno di camere d'uovo dei tubuli ovariche (ovarioli) (Figura 1B e Figura 2A). Prima di microscopia, i ovarioli sezionato sono gli obiettivi di colorazione; tuttavia, è necessaria la separazione di camere di uova per l'osservazione di embrioni al microscopio (Figura 2B - D).

Aumento della permeabilità dei tessuti

Proteinase K (PK) di trattamento è un approccio standard per migliorare la permeabilità dei tessuti, ma per gli embrioni di alcuni organismi, come modello il Caenorhabditis elegans (nematodi), Drosophila melanogaster (volo) e Danio rerio (zebrafish) -questo passaggio è opzionale. Nel afide del pisello, la necessità di trattamento PK è fase-dipendente: per germaria e gli embrioni prima di gastrulazione (stadi 0-7), il trattamento PK può essere omesso; ma per gli embrioni sotto estensione germband (fase 11) o in fasi successive è altamente raccomandato questo passo. Per esempio, durante i segnali embriogenesi metà sono stati appena rilevati in embrioni senza trattamento PK (Figura 3A - C). Al contrario, l'intensità del segnale è significativamente migliorata in embrioni sottoposti a digestione PK (Figura 3A '- C', A "- C").

Riduzione della colorazione di fondo

Un alto livello della perossidasi endogena (POD) è stato identificato nei tessuti embrionali di afidi. Per eliminare tale attività enzimatica, gli embrioni paraformaldeide fissati sono state incubate in presenza di hydrogen perossido (H _{2 O 2),} un reagente comune per l'ossidazione di POD. I nostri risultati hanno mostrato che il trattamento H ₂ O _{2 non} ha soppresso l'attività endogena POD efficace negli embrioni in fase avanzata (Figura 4A, D). Per contro, la colorazione di fondo è stata ampiamente ridotta in embrioni sottoposti a metanolo incubazione (Figura 4B, C, E, F). Prima dell'applicazione degli embrioni anticorpi primari sono stati bloccati in soluzione contenente NGS e BSA come descritto in protocolli standard per colorazione anticorpale. Tuttavia, fondo residuo colorazione negli embrioni afide è stato rilevato (Figura 3A '- C'). Questo problema è stato risolto dopo la sostituzione NGS / BSA con il reagente di bloccaggio fornita da un insieme di buffer per esperimenti DIG-etichettatura come ibridazione in situ (Figura 3A "- C"). Abbiamo così concludere che post-fissazione con metanolo e incubazione con il DIG-Bbloccando reagente sono entrambi essenziali per ridurre la colorazione di fondo negli embrioni afidi.

Trattamento PK e il DIG-B reagente bloccante sono necessari non solo per il rilevamento del segnale efficace utilizzando i metodi cromogenico ma anche fluorescenti. Colorazione actina con falloidina o colorazione per metanolo-sensibile epitopi, però, non funziona in embrioni sottoposti a pre-fissazione con metanolo, che può distruggere la forma nativa di actina o di anticorpi. Di conseguenza, questo trattamento deve essere evitato durante l'esecuzione di fluorescenza immunocolorazione. Oltre ad eliminare le fasi del trattamento metanolo immunofluorescenza permette esperimenti multi-etichettatura negli embrioni afidi. Utilizzando microscopia confocale, per esempio, pisello afide Vasa1 proteina (ApVas1) nelle cellule germinali, α-tubulina in microtubuli, F-actina microfilamenti, e DNA in nuclei potrebbe essere contemporaneamente segnalato e visualizzate (Figura 5A, C). In confronto con il croMetodo mogenic (Figura 5B), confocale sezionamento campioni di fluorescente fornisce una migliore risoluzione dei segnali localizzati come ApVas1 nelle germoplasma e cellularizing cellule germinali in embrioni precoce di afidi (Figura 5C ', D - D "). Adottando le condizioni per l'etichettatura cellule germinali sopra descritte, la proteina engrailed / Invected in segmenti di banda germe estende era macchiato con l'anticorpo 4D9 (Figura 6). Questo dimostra che il nostro protocollo per-immunostaining compresi cromogenici e fluorescenti metodi possono essere efficacemente applicata al segnale di rilevamento sia in linea germinale e linee cellulari somatiche nel afidi.

Figura 1. partenogenetiche afidi pisello vivipara. (A) Un primo instar ninfa che emerge da un asessuata vivipara femmina adulta. (B 12 ceppi. Un ovariole contiene un germarium nella punta (frecce), 1-2 ovociti e 5-7 camere embrionali. Gut e cauda sono di solito associati con le ovaie dissezionati. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Illustrazione delle strategie per il montaggio embrioni afidi a diversi stadi di sviluppo. (A) Schema di sviluppo embrionale nel ovariole sezionato da un partenogenetica vivipara femmina adulta. Breve oogenesi (fase germarial e fasi 0-2) è seguita da embriogenesi (stadi 3-20). Schema di embriogenesi: f ormazione di sinciziale blastoderma (stadi 3-5); blastulation (stadi 6-7); gastrulazione (fasi 8-10); allungamento della fascia germe (stadi 11-14); katatrepsis (stadi 15); alberino katatrepsis e germe banda retrazione (stadi 16-17); organogenesi (fasi 18-20). Tasti colorati sono nella parte inferiore della figura. (B, B ') Germarium e palchi 0-10 embrioni. Non è richiesto alcun ponte vetrino. (C, C ') Stages 11-18 embrioni. È necessaria una bridge vetrino. (D, D ') Stages 19-20 embrioni. Sono necessari ponti doppi coprioggetto. Rotolando gli embrioni facendo scorrere il vetrino in grado di creare diversi angoli di osservazione. Misure di lamelle: 22 x 22 mm di (B), 18 x 18 mm a (C) e (D). Lo spessore del coprioggetto: 0.13 a 0.16 mm. Messa in scena embrionali seguito Miura et al ¹² Abbreviazioni: g:. Germarium; st: palco..com / files / ftp_upload / 53883 / 53883fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

. Figura 3. trattamento Proteinasi K e confronto dei reagenti con differenti effetti di blocco anteriore alloggiamenti uovo è a sinistra; tutte le viste sono laterali, tranne embrioni esposti a (B ", C ', C"), che sono dorsale. Gli embrioni sono tutte testate in base ApVas1 anticorpo (diluizione 1: 500) e segnali di ApVas1 sono sviluppate all'interno di 10-20 sec. Punte di freccia indicano posizione delle cellule germinali. (A - C) Embrioni senza trattamento di proteinasi K (PK). Segnali ApVas1 nelle cellule germinali sono appena rilevati. (A '- C', A "- C") Confronto di colorazione di fondo negli embrioni blocked con NGS e BSA (A '- C') e del reagente di blocco commerciale nel DIG Lavare e blocchetto Set (DIG-B) (A "- C"). Sfondo è significativamente ridotta in embrioni mostrato in (A "- C"). Abbreviazione: b: batteri. Bar Scala:. 100 micron Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

. Figura 4. Minimizzare la colorazione di fondo con metanolo anteriore embrioni è a sinistra; tutte le viste sono dorsale. Gli embrioni sono trattati con PK per aumentare la permeabilità di anticorpo. Punte di freccia indicano posizione delle cellule germinali. (A, B, D, E) Confronto di trattamenticon perossido di idrogeno (H _{2 O 2)} e metanolo. Gli embrioni sono macchiati solo con l'anticorpo secondario. H ₂ O ₂ trattamento (0,3% w / v, 10 min): alto background (A, D); trattamento di metanolo (100%, 60 min): basso background (B, E). (C, F) anticorpo primario colorazione sugli embrioni trattati con metanolo. Condizioni di trattamento metanolo sono identici a quelli utilizzati per gli embrioni mostrati in (B, E). L'anticorpo ApVas1 etichette preferenzialmente le cellule germinali embrionali. Bar Scala:. 100 micron Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5. immunofluorescenza su embrioni precoci. (A, C - D) e 1: 500 in (B). (A) i segnali di colorazione, che includono ApVas1, α-tubulina, F-actina, e DNA nucleare, vengono rilevati utilizzando quattro canali con differenti lunghezze d'onda. Chiavi colore dei segnali sono riportati nella parte inferiore della figura. (B) DIC immagine di un risultato di confronto cromogenico. ApVas1 è arricchito nel germarium mentre l'intensità di contrasto della localizzazione posteriore ApVas1 (punte di freccia) nella fase-3 embrione non è chiara come quella mostrata in (C, C '). (C, C ') Arricchimento dei segnali ApVas1 nel posteriore dell'uovo. Segnali localizzate alla regione posteriore della camera di uovo (punte di freccia) sono arricchite da immagini di sovrapposizione. Poiché i segnali di F-actina e α-tubulina parzialmente maschera quelli della ApVas1 nel posteriore (C), l'immagine prodotta dalla scansione singola canalizzato è mostrato in (C '). (D - D '') sezionamento confocale di ApVas1 localizzato nella regione posteriore del palco-4 embrionale. Le immagini mostrate in (D) e (D ') sono ApVas1 rilevati in superficie e piani focali centrali, rispettivamente. (D ") è l'immagine risultante dalla fusione di tutte le sezioni dello stesso embrione come (D) e (D ') Abbreviazioni: come: aster, fc, cellule del follicolo, poc, prospettico di ovociti; sp. Mandrino, tc, corde trofiche. bar Scala:. 10 micron Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6. Immunostaining sui segmenti embrionali. UnTERIOR di camere d'uovo è a sinistra. Embrioni PK-trattati sono colorate con l'anticorpo monoclonale 4D9 contro engrailed / Invected, che sono espressi in segmenti embrionali. Chiavi colore dei segnali sono riportati nella parte inferiore della figura. (A, A ') Immunofluorescenza su un palco-13 embrionale. (A), una immagine confocale impilato da immagini di engrailed / Invected, α-tubulina, F-actina, e colorazioni del DNA nucleare. (A ') un'immagine confocale che mostra la colorazione di engrailed / solo Invected. Senza l'interferenza di segnali provenienti da altri canali, i segnali sono meglio visualizzate. (B, C) ​​Chromogenic colorazione su embrioni a stadi 13 e 17 di sviluppo rispettivamente. (B) Stage-13 embrione. (C) Stage-17 embrione. Dal 13 al 17 tappe, il crescente numero di segmenti nell'addome sono etichettati da 4D9. (D) Controllo negativo (-Ctrl) macchiaing solo con anticorpo secondario coniugato con Alexa Fluor 633. Quasi nessun segnale di immunoistochimica sono rilevati su ovariole senza anticorpo primario. Tuttavia, autofluorescenza di batteri (linea tratteggiata) all'interno fase 7 e 13 delle camere d'uovo vengono rilevati al di eccitazione lunghezza d'onda di 488 nm. Abbreviazioni: A: l'addome; b: batteri; H: Testa; T: torace. Bar Scala:. 100 micron Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

Abbiamo identificato condizioni ottimali critiche dell'immunocolorazione successo nel pisello afide A. Pisum, un organismo modello emergente per studi di genomica e di sviluppo ^3,15. Condizioni ottimizzate per aumentare la permeabilità dei tessuti e ridurre la colorazione di fondo migliorato l'intensità e la specificità dei segnali. Si differenziano dai protocolli standard per immunocolorazione in altri modelli animali nei passaggi per la creazione di pori nella membrana cellulare e bloccando un legame di anticorpi non specifico.

Per immunostaining e ibridazione in situ, proteinasi K (PK) digestione è uno degli approcci comuni per aumentare la permeabilità dei tessuti ^16-19. In anticorpi colorazione dei tessuti afidi, i nostri risultati hanno mostrato che: (1) PK digestione migliorato significativamente i segnali di immunoistochimica negli embrioni vivipare partenogenesi durante germe estensione di banda (tappe 11-14) (figura 3B '', C ''), anche sesegnali deboli erano ancora visibili in embrioni privi di trattamento PK (figura 3B, C); e (2) digestione PK era obbligatorio per gli embrioni di katatrepsis in poi (Tappe 15-20) (Figura 4C, F e Figura 6C). Per asessuali embrioni vivipari prima katatrepsis, il volume delle camere di uova è improbabile che la causa del problema di penetrazione perché immunocolorazione successo su embrioni precoci ovipare sessuali residenti nelle uova-che di cui sono quasi equivalenti nel formato al più maturo chamber- uovo asessuata non richiede PK digestione ^20. Pertanto, l'allungamento e la piegatura della banda germe (fasi da 11 a 14) nello spazio limitato delle camere uovo asessuali possono ostacolare l'ingresso di anticorpi, ed è PK che permette la penetrazione di anticorpo creando pori nelle membrane cellulari tra la strutture embrionali inceppate. Per contro, l'estensione della linea retta della banda germe nelle uova sessuale può spiegare perché è macchiato anche inl'assenza di PK. La rimozione della busta vitellina / chorion può anche fare degli embrioni sessuali ovipare più accessibile all'anticorpo. Per gli embrioni dopo katatrepsis (stadi da 16 a 20), il trattamento PK è essenziale sia per i morph asessuale e sessuale, perché gli embrioni sono spesse cuticled ¹⁹ (Figura 4C, F e Figura 6C).

Tuttavia, la condizione suggerita PK digestione (1 ug / ml per 10 min) richiede ulteriori regolazioni se l'integrità delle strutture embrionali o l'intensità dei segnali non è soddisfacente. Ciò è dovuto principalmente dall'attività PK che può variare da lotto a lotto. Ad esempio, se i tessuti embrionali diventano danneggiati dopo la digestione PK, concentrazione di PK può essere ridotta a 0,5 mg / ml. Allo stesso modo, se l'intensità del segnale è debole, è quindi raccomandato l'estensione di incubazione di 15-20 minuti. Gli embrioni più mature (fase 20) sottoposte a incubazione PK prolungata fino a 20 min a 1,0 mg / ml concentrazione, However, di solito visualizzare segnali deboli, il che suggerisce che PK digestione è ancora incompleta. Digestione prolungato può migliorare i segnali di colorazione ma è facoltativo, soprattutto quando modelli di espressione rilevati nella fase 18 embrioni sono simili a quelli nella fase 20 embrioni. In confronto con gli embrioni in fase di sviluppo 20, la tappa 18 embrioni con morfologia analoga ma con minore quantità di corpo cuticola generalmente possono produrre intensità del segnale più forte.

Durante lo sviluppo del segnale, la colorazione di fondo può essere elevato per l'attività degli enzimi endogeni in grado di reattività crociata con i substrati. Negli embrioni pisello afide, l'attività della fosfatasi alcalina endogena (AP) e perossidasi (POD), entrambi i quali sono coniugati anticorpo comuni per digerire substrati di segnale, è stato rilevato. Attività idrolasi dell'AP endogena potrebbe essere efficacemente soppressa durante l'embriogenesi da levamisolo (dati non riportati). Tuttavia, il trattamento di embrioni con 0,3-0,6% HYDROGen perossido (H _{2 O 2)} potrebbe eliminare solo l'attività endogena POD prima katatrepsis ma non era sufficiente per embrioni grandi (Figura 4A, D). Metanolo incubazione, un approccio alternativo per la denaturazione delle proteine ​​endogene, ha dimostrato di essere efficace nel afidi ²¹ (Figura 4B, E). A differenza di _H 2 O _2, che danneggia i tessuti afide durante l'incubazione prolungata di 30 minuti o più a lungo, metanolo non digerire o deformare gli embrioni in ogni fase di sviluppo (Figura 4C, F). Di conseguenza, il metanolo è un'alternativa migliore per sopprimere l'attività POD endogena negli embrioni di afidi. Se viene rilevato sfondo residua colorazione, che avviene di solito per gli embrioni maturi con uno strato di ispessimento della cuticola, O / N in metanolo incubazione a 4 ° C-secondo la nostra esperienza può ridurre ulteriormente l'attività POD endogena.

Sfondo residua colorazione è stata individuata inembrioni bloccati con proteine ​​del siero, come siero normale asino (NDS), siero di capra normale (NGS), albumina di siero bovino (BSA), o loro miscele ¹³ (Figura 3A'-C '). Adottando un reagente bloccante fornito commercialmente utilizzati per l'ibridazione in situ, al contrario, lo sfondo rimanente durante immunostaining potrebbe essere significativamente eliminato ⁵ (Figura 3A '' - C ''). Anche se gli ingredienti del reagente di blocco sono proprietari, che probabilmente contiene proteine ​​non siero in grado di bloccare epitopi non specifici delle proteine ​​pisello afide. Il reagente di blocco ha anche lavorato molto meglio di siero animale nel verde pesco afide Myzus persicae. Analogamente, in M persicae PK digestione e metanolo incubazione determinato anticorpo penetrazione soddisfacente e riduzione background -. Simile ai migliori risultati conseguiti in A. pisum (dati non mostrati). Prevediamo che le condizioni Optimized per aumentare la permeabilità dei tessuti e la riduzione di fondo, se si utilizza la colorazione cromogeno o fluorescenza, si applicherà a molte altre specie di afidi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% hydrogen perxidase (H2O2)	Sigma-Aldrich	18304	For bleaching endogenous peroxidase of embryos.
4’6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542	For labeling the double-strand DNA. TOXIC. Wear gloves, dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure
4D9 anti-engrailed/invected mouse monoclonal antibody	Developmental studies hybridoma bank	AB_528224	For labeling the developing segments of embryo.
ApVas1 rabbit polyclonal antibody	Our laboratory	N/A	For labeling the aphid germline specific Vas1 protein in embryos. This antibody was made by our laboratory.
Austerlitz Insect pins	ENTOMORAVIA	N/A	For seperating each egg chambers from an ovariole. Size 000, BLACK ENAMELLED.
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	9048-46-8	For blocking the non-specific binding of antibodies.
Camera connted to compound microscope	Canon	EOS 5D	For photographing of aphid embryos.
Colorimetric 8 cell tray	Kartell Labware	357	For developing the staining signal of aphid embryos. Diameter 95 x 57 mm, cell depth 2 mm.
Compound microscope with DIC optics	Leica Microsystems	DMR	For photographing of aphid embryo mounted on the slides.
DIG Wash and Block Buffer Set	Sigma-Aldrich (Roche)	11585762001	For blocking the non-specific binding of antibodies. We diluted the 10x Blocking solution into 1x as blocking reagent.
Forceps	Ideal-tek	N/A	For dissection of ovaries from aphids. Manufacturer part No 5: 5 SA.
Glass dropper	N/A	N/A	For transfering ovaries of aphids from the splot plate to tubes. 150 mm of total length and 5 3/4" of tip length.
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	For clearing of aphid embryos and mounting.
Glycine	Bioshop	N/A	For blocking the enzyme activity of proteinase K (PK).
Goat anti-mouse IgG conjugated Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11017	For detection of primary antibody from mouse.
Goat anti-rabbit IgG conjugated Alexa Fluor 633	Invitrogen	A21072	For detection of primary antibody from rabbit.
Intelli mixer	ELMI laboratory equipment	RM-2M	For improving the thorughly reaction of reagents with ovaries.
Laser-scanning confocal microscopy	Leica Microsystems	SP5	For photographing of aphid embryo mounted on the slides with florecent tag.
methanol	Burdick and Jackson	AH2304	For bleaching endogenous peroxidase of embryos.
Microscope slides	Thermo scientific	10143560	For mounting of embryos. SUPERFROST ground edges, ca./env. 76 x 26 mm.
Microscope Cover glasses	Marienfeld	0101030	For mounting embryos on the slides. Size 18 x 18 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
Microscope Cover glasses	Marienfeld	0101050	For mounting embryos on the slides. Size 22 x 22 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
mouse monoclonal anti-alphaTubulin antibody (DM1A)	Santa Cruz Biotechnology	sc-32293	For labeling the distrbution of alpha-tubulin of cells.
Nail polish	N/A	N/A	For sealing the coverslips on the slides.
Normal goat serum (NGS)	Sigma-Aldrich	G9023	For blocking the non-specific binding of antibodies.
Paraformaldehyde (PFA)	VWR	MK262159	For fixation of aphid ovaries.
Phalloidin-TRITC	Sigma-Aldrich	P1951	For labeling the distrbution of F-actin on embryos.
Phosphate-buffered saline (PBS)	N/A	N/A	As isotonic solution for aphid ovaries.
Plastic dropper	N/A	N/A	For transfering ovaries of aphids from tube to cell tray. Size 3 ml.
Proteinase K	Merck	124678	For creating pores (punching) on the cell membrane and facilitating the access of antibodies.
Pyrex spot plate	N/A	N/A	For dissection and color reactions of aphid ovaries under microscopy. Each cavity with diameter 22 mm and  depth 7 mm.
SIGMAFAST 3,3’-diaminobenzidine (DAB) tablets	Sigma-Aldrich	D4168	For developing of substrated signals. Also called DAB peroxidase substrate tablet set.
Stereo microscope	Leica Microsystems	EZ4	For dissection and observation of aphid ovaries.
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	T8787	For creating pores (punching) on the cell membrane.
VECTASHIELD Elite ABC Kit (Rabbit IgG)	Vector laboratories	PK-6101	For enhancement of the signal. Including of biotinylated goat anti-rabbit IgG secondary antibody, A and B reagents.
VECTASHIELD mounting medium	Vector laboratories	H1000	For clearing of aphid embryos and mounting.