Identification des conditions critiques pour Immunocoloration dans le puceron du pois embryons: L'augmentation de la perméabilité des tissus et la diminution de la coloration de fond

Abstract

Le Acyrthosiphon pisum du puceron, avec un génome séquencé et la plasticité phénotypique abondante, est devenue un modèle émergent des études de génomique et de développement. Comme d'autres pucerons, A. Pisum propager rapidement par reproduction vivipare parthénogénétique, où les embryons se développent dans des chambres d'œufs dans une chaîne de montage dans le ovariole. Auparavant, nous avons établi une plate-forme robuste de l'ensemble de montage hybridation in situ permettant la détection de l'expression des ARNm dans les embryons de pucerons. Pour l'analyse de l'expression de la protéine, cependant, les protocoles établis pour immunocoloration les ovarioles de pucerons vivipares asexués n'a pas produit de résultats satisfaisants. Nous rapportons ici des conditions optimisées pour augmenter la perméabilité des tissus et la diminution de la coloration de fond, qui étaient tous deux des problèmes lors de l'application des approches établies. Optimisations incluent: (1) l'incubation de la protéinase K (1 pg / ml, 10 min), qui a été trouvé f essentielleou la pénétration d'anticorps dans les embryons à moyen et pucerons en fin de ligne; (2) le remplacement de sérum-albumine de sérum de chèvre / bovin normal avec un réactif de blocage fourni par un Digoxigénine (DIG) à base de jeu de tampons et (3) l'application de méthanol au lieu du peroxyde d'hydrogène (H _{2 O 2)} pour le blanchiment de peroxydase endogène; qui réduit de manière significative le bruit de fond dans les tissus de pucerons. Ces conditions critiques optimisés pour un marquage permettra une détection efficace des produits de gènes dans les embryons de A. Pisum et autres pucerons.

Introduction

Les pucerons sont des insectes hémiptères avec des petits (1-10 mm) corps mous. Ils se nourrissent de plantes en suçant la sève de phloème pièces buccales perçants. En outre, ils comptent sur ​​une bactérie endosymbiotique obligatoire, Buchnera aphidicola, pour synthétiser des acides aminés essentiels qui sont déficients dans le régime alimentaire de la sève du phloème. Les pucerons ont une histoire de vie complexe qui comprend la reproduction vivipare parthénogénétique au printemps et en photopériode longue journée d'été et la reproduction ovipare sexuelle déclenchée par une photopériode de jours courts pendant laquelle ils pondent un nombre limité de ^1,2 œufs d'hiver. Au printemps ces œufs éclosent pour produire la première génération de toutes les femelles fondatrices (pucerons), à la suite de nombreux cycles de reproduction parthénogénétique jusqu'à l'automne. La parthénogenèse cyclique chez les pucerons, où les phases sexuée et asexuée alternent dans le cycle de vie annuel, a été considéré comme une nouveauté ^1,2 évolutif. Dans les pucerons vivipares parthé, L'embryogenèse a lieu dans des chambres d'œufs des tubules ovariens (de ovarioles). En revanche, les embryons ovipares sexuels se développent dans les œufs fécondés. En dehors de la plasticité de la reproduction, les pucerons peuvent afficher polyphénisme aile transgénérationnel: en réponse aux signaux de la surpopulation et des menaces de prédateurs, les femelles asexuées sans ailes peuvent vivipares produire une descendance ailée pour la migration à longue distance. Publication de la séquence du génome du puceron du pois Acyrthosiphon pisum -la première séquence du génome d'une base insectes permet hémimétaboles poursuite de l'exploration de la plasticité de la reproduction, polyphénisme de l'aile, et d'autres fonctionnalités, y compris les interactions insectes-plantes, vectorisation virale et la symbiose de pucerons sur une moléculaire base ^3.

En plus de la séquence du génome, les outils permettant de caractériser la fonction des gènes et l'expression sont nécessaires pour promouvoir le puceron du pois comme un organisme modèle mûre ^4. Nous avons décrit les protocoles robustes de l'ensemble de montage 5-7. L'interférence ARN (ARNi) par injection d'ARN double brin et de l'alimentation a été utilisée pour le silençage génique dans nymphes de pucerons et les adultes, mais des conditions stables pour knockdown gène dans les embryons ont pas encore été signalé ^8-10. Immunocoloration, une approche basée sur les anticorps qui peuvent détecter l'expression de la protéine dans des échantillons avant et après knockdown ARNi, a été réalisée sur les embryons du puceron du pois ^11-13. Cependant, l'augmentation de la perméabilité des tissus et l'élimination de la coloration de fond sont encore insatisfaisants utilisant des protocoles standards pour immunocoloration dans les embryons asexués vivipares du puceron du pois. Par exemple, nous avons trouvé que la pénétration des anticorps dans les tissus a diminué chez les embryons gastrulating (étapes 8 à 10) et que les embryons avec bourgeons des membres morphologiquement identifiables (étapes 13-14) ont été à peine perméable à l'anticorps. En outre, la coloration de fond a été visualisée dans le vivíparo asexuéenous pois embryons de pucerons colorées utilisant un anticorps contre le marqueur de la lignée germinale Vasa ainsi que celle contre la protéine Engrailed / invected exprimé dans les segments embryonnaires ^12,13. En fait, la coloration de fond était encore bien visible dans les embryons colorées avec l'anticorps secondaire seul.

Afin d'augmenter la perméabilité sans endommager l'intégrité des tissus de pucerons, nous augmentée avec précaution la concentration de protéinase K et déterminé les conditions optimales pour la digestion du tissu sur les embryons de pucerons. Afin d'éviter la coloration non-spécifique dans le puceron du pois, nous avons cherché des composés qui pourraient bloquer efficacement les embryons et supprimer l'activité de peroxydase endogène (POD), une enzyme utilisée pour amplifier des signaux pendant immunocoloration. Un réactif de blocage fourni par un Digoxigénine (DIG) jeu de tampons à base plutôt le sérum de chèvre normal traditionnellement utilisé (NGS) / sérum albumine bovine (BSA), réduit de façon significative la coloration de fond. En outre, le methanol a été trouvé à INHIbit l'activité de POD endogène plus efficace que le peroxyde d'hydrogène (H _{2 O 2).} Les détails concernant ces conditions spécifiques pucerons pour un marquage sur les embryons seront décrits dans les sections suivantes.

Protocol

1. Culture de pucerons

NOTE:. La souche de laboratoire de l'parthénogénétique vivipare puceron du pois A pisum été initialement collectées dans le centre de Taiwan et a été élevé sur les plantes hôtes (le sativum jardin pois Pisum ou la fève Vicia faba) sous photopériode de jours longs pour plus de 300 générations (une génération: ~ 10 jours).

1. Germination des graines
   1. Faire tremper les graines de plantes hôtes dans l'eau du robinet pendant 3-5 jours à température ambiante. Remplir avec de l'eau fraîche une fois par jour.
      NOTE: Vous pouvez également mettre des graines de plantes hôtes directement dans un sol humide peut induire la germination ainsi.
   2. Croître de 10 graines en germination dans un petit pot (9 cm de diamètre x 7 cm de haut) avec le sol dans la chambre de croissance sous photopériode de 16 heures de lumière / 8 h obscurité à 20 ° C.
   3. Environ 10 jours après le début de la croissance, de transférer les pucerons sur les plantes dont la hauteur est de plus de 8 cm.
2. Transfert des pucerons Gardez chaque pot de plantes dans un bécher de 1 L de verre, transférer 8 pucerons adultes sur les plantes à l'aide d'un pinceau, puis sceller le bécher avec une couverture perméable à l'air comme de la gaze mailles pour empêcher les pucerons de se échapper.
3. Incuber les pucerons dans une chambre de croissance sous photopériode de 16 heures de lumière / 8 h obscurité à 20 ° C. Arrosez chaque pot de plantes une fois par jour.
4. Pour l'obtention de la prochaine génération de pucerons, réitérer les étapes 1.1.3-1.2.2 dix jours après le transfert de pucerons primaire.

2. Dissection et la fixation des ovaires

1. Fraîchement préparer paraformaldehyde à 4% (PFA) dans 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) comme tampon de fixation.
2. Remplir un puits d'une plaque de place avec PFA (environ 500 pi), placer la plaque sous un microscope stéréo à faible grossissement, et plonger un puceron adulte au sein de la PFA pour la dissection.
3. Disséquer ovaires en tenant la tête et l'abdomen avec un jeu de pinces, coupe ouverte la dorsalecuticule de l'abdomen, et en faisant glisser les ovaires loin de la cavité abdominale.
4. Fixer trois paires d'ovaires dans un tube de 1,5 ml contenant 1 ml de PFA à température ambiante pendant 20 min.
5. Tampon de fixation Décanter avec une pipette de transfert (verre ou jetable), puis lavez ovaires avec 0,2% de Triton X-100 dans du PBS 1X (PBST) 3 fois pour 10 minutes chacun. Secouant doux sur un mélangeur / rotateur (angle de rotation: 60 ° (F60) / vitesse de rotation: 8 RPM) est recommandée à la fois pour la fixation et le lavage.

3. traitement à la protéinase K (PK) pour augmenter la perméabilité des tissus embryonnaires

NOTE: le traitement de PK est appliquée à partir d'embryons extension de bande de germe en avant (stade 11 de développement). Pour les plus jeunes embryons, cette étape est facultative.

1. Série diluer la solution stock de PK (10 mg / ml) avec 1x PBS à la concentration de travail 1 pg / ml.
2. Incuber ovaires avec 1 ug / ml de PK (environ 500 ul) pendant 10 minutes sous agitation douce.
3. Décanter PK solutisur, puis lavez les ovaires avec 700 pi de glycine (2 mg / ml) 3 fois pendant 5 minutes chacun.
4. Laver ovaires avec 0,2% PBST deux fois pour 10 minutes chacun.
5. Fixer ovaires nouveau avec un tampon de fixation pour 15 min à température ambiante sous agitation légère.
6. Rejeter le surnageant et laver ovaires avec 0,2% PBST deux fois pour 10 minutes chacun.

4. Méthanol incubation pour la répression de la peroxydase endogène (POD) activité

NOTE: Le méthanol incubation est pas appliquée aux embryons soumis à la phalloïdine coloration ou d'anticorps des epitopes qui sont sensibles methanol.

1. Déshydrater en série avec ovaires pourcentage différent de methanol dans du PBST 0,2% (v / v: 1: 3, 1: 1, 3: 1) en incubant les ovaires à chaque concentration de la solution de methanol pendant 10 minutes avec agitation douce.
2. Déshydrater ovaires avec 100% de méthanol pendant 1 heure à température ambiante sous agitation légère.
   REMARQUE: Les résultats satisfaisants des taches pourraient encore être obtenus à partir de tissus de pucerons qui ont été stockées dans 100% de méthanol à -20 &# 176; C pendant un mois.
3. Réhydrater en série avec ovaires pourcentage différent de methanol dans du PBST 0,2% (v / v: 3: 1, 1: 1, 1: 3) en faisant incuber les ovaires à chaque concentration de la solution de methanol pendant 10 minutes avec agitation douce.

5. Anticorps Coloration

1. Diluer la solution 10x de blocage de l'ensemble de tampon à base-DIG (DIG-B) à 1x.
   REMARQUE: La solution de blocage 1x DIG-B est plus efficace pour réduire l'arrière-plan de la coloration que le réactif de type blocage composée de 5% (v / v) de sérum de chèvre normal (NGS) et 0,5% (v / v) de sérum-albumine bovine (BSA ) dans du PBST à 0,2%.
2. Incuber les ovaires avec la solution DIG-B 1x blocage pendant 2,5 à 4 heures à température ambiante ou O / N à 4 ° C avec une agitation douce.
   NOTE: Pour les trois paires d'ovaires dans un tube de 1,5 ml, 200 pl est le volume minimum pour le blocage de l'échantillon et l'anticorps coloration.
3. Décanter le surnageant et la remplacer par une nouvelle solution de blocage 1x DIG-B contenant l'anticorps primaire à diluti appropriéele ratio. Colorer les ovaires pendant 4 heures à la température ambiante ou O / N à 4 ° C avec une agitation légère.
   REMARQUE: Pour l'expérience décrite ici, utiliser les dilutions optimales suivantes d'anticorps primaires: (1) anticorps ApVas1: 1: 500 pour la coloration chromogène, 1:50 pour immunofluorescence; (2) un anticorps anti-tubuline α: 1: 500; (3) anticorps monoclonal 4D9 de: 01:25.
4. Laver ovaires avec 0,2% PBST 4 fois pendant 15 min chacune.
5. Incuber ovaires avec une solution de blocage 1x DIG-B pendant 1 heure à température ambiante avec une agitation douce.
6. Décanter le surnageant et le remplacer par une solution fraîche 1x de blocage DIG-B contenant l'anticorps secondaire à taux de dilution approprié. Colorer les ovaires pendant 4 heures à la température ambiante ou O / N à 4 ° C avec une agitation légère.
   1. Utilisez les rapports de dilution suivantes d'anticorps secondaires: (1) Pour immunofluorescence: 1: 500 pour Alexa Fluor 633 de chèvre anti-IgG de lapin ou Alexa Fluor 488 de chèvre anti-IgG de souris; (2) Pour la coloration chromogène: 1: 200 de chèvre biotinylé anti-IgG de lapin.
      NOTE: L'anticorps secondaire biotinylé est appliquée pour interagir avec l'avidine-biotine-complexe (ABC) dans le (chromogène) détection à base de substrat, à travers laquelle les signaux de coloration sont considérablement amplifiés.
   2. Pour immunofluorescence, effectuer coloration dans l'obscurité parce que l'anticorps secondaire est sensible à la lumière.
7. Laver anticorps secondaire avec 0,2% PBST 4 fois chacune pendant 10 minutes.

6. nucléaire et F-coloration de l'actine

NOTE: Ceci est appliqué seulement pour immunofluorescence.

1. Colorer ovaires avec du PBST contenant 0,2% DAPI (2 ng / ul) et phalloïdine-TRITC (100 nM) pendant 2 heures à la température ambiante dans l'obscurité.
2. Laver ovaires avec 0,2% PBST 4 fois chacune pendant 10 minutes.
3. Incuber ovaires avec le milieu de montage O / N à 4 ° C avec une agitation légère.

7. Développement Signal

Note: Ceci est appliqué uniquement pour la coloration chromogène.

1. Préparer 100 pi deréactif avidine-biotine-complexe (ABC) pour améliorer les signaux en ajoutant 1 pl de réactif A (avidine) dans 98 ul de 0,2% PBST, mélanger soigneusement par pipetage doux, et en ajoutant 1 pl de réactif B (biotine conjugué à la peroxydase de raifort ), suivi par un mélange immédiat. Incuber le mélange pendant 30 min à température ambiante avec une agitation douce.
2. Incuber ovaires (y compris les chambres d'oeuf dissociés) dans le mélange de réactifs A et B pendant 30 min à température ambiante avec une agitation douce.
3. Laver le mélange des réactifs A et B avec du PBST 0,2% 4 fois pendant 10 min chacune.
4. Transfert ovaires immergés dans du PBST à un puits sur la plaque de place avec un compte-gouttes en plastique.
5. Préparer la solution de substrat de la 3,3'-diaminobenzidine (DAB): dissoudre une pastille de DAB plus une autre contenant de l'urée peroxyde d'hydrogène dans 1 ml de O ₂ ddH par tourbillonnement vigoureux pendant 1 min.
   REMARQUE: DAB, un substrat précipitant de peroxydase, est un chromogène populaire pour immunocoloration. Il produit une brprécipité propre et insoluble après avoir été oxydé par la peroxydase. Des signaux faibles peuvent être améliorées par addition de chlorure de nickel à la solution de substrat (concentration finale de 0,05 à 0,08% de).
6. Retirer la solution de PBST restant dans le puits et le remplir avec 100 ul de la solution de substrat DAB pour le développement du signal.
7. Surveiller l'intensité des signaux sous un microscope stéréo à faible grossissement.
8. Arrêtez réactions en retirant la solution DAB, suivie par le remplissage avec 1x PBS immédiatement. Répéter deux fois le lavage.
9. Transfert ovaires vers le tube de 1,5 ml, puis laver avec 1x PBS ou de PBST deux fois pour 15 minutes chacun.
10. Incuber ovaires dans un milieu de montage à base de glycérol (70% de glycerol) O / N à 4 ° C avec une agitation douce.

8. Montage du puceron embryons

REMARQUE: L'épaisseur des embryons de pucerons varie entre stades de développement. Stratégies de montage sont ainsi modifiées pour tenir début (germaria et les étapes 0-10), MID (stades11-18), et des embryons (stades tardifs 19-20), qui sont démontrées sur la figure 2B - D. Mise en scène embryonnaire suivi Miura et al ^12.

1. Transfert des ovaires avec un milieu de montage sur le plateau de la cellule avec un compte-gouttes en plastique et d'observer les échantillons sous un microscope stéréo à faible grossissement.
2. Couper les calices associés à l'oviducte latéral utilisant des broches insectes et ensuite transférer un ovariole isolé à un verre vide bien avec un compte-gouttes. Compléter le volume final à 50-100 ul en utilisant un milieu de montage.
3. Transférer un ovariole sur la lame avec un compte-gouttes de verre et ensuite disséquer chambres d'œufs d'insectes à l'aide de broches.
   NOTE: Pour les embryons âgés de plus de 6 stade du développement, la séparation des chambres d'œufs est suggéré; pour germaria et les deux premières chambres d'œufs de moins de l'étape 6, la séparation est facultative.
4. Relocaliser une chambre d'oeuf disséqué à une lame propre en utilisant un compte-gouttes en verre.
5. Mettez une lamelle (taille: 22 x 22mm) sur les germaria disséqués ou chambres d'œufs (contenant des embryons à des stades du développement 1-10) lentement pour éviter les bulles.
   1. Mont chambres d'œufs (contenant des embryons à des stades du développement 11-18) sur une diapositive avec pont de lamelle d'un côté et de placer une autre lamelle (taille: 18 x 18 mm) sur le dessus de l'échantillon.
   2. Mont chambres d'œufs (contenant des embryons âgés de plus de 19 stade du développement) sur une lame à double-face pont lamelle et placer un autre lamelle (taille: 18 x 18 mm) sur le dessus de l'échantillon.
6. Remplir l'espace sous la lamelle supérieure avec les médias de montage pour éviter le dessèchement de l'échantillon.
7. Légèrement rouler l'embryon en faisant glisser la lamelle pour obtenir le droit d'orientation pour l'observation.
8. Sceller le pourtour de lamelles (y compris les lamelles de pont) avec du vernis à ongles.

9. Analyse d'imagerie

1. Photo contraste d'interférence différentiel (DIC) des images de l'ensemble du montage embryons avec un compound microscope optique équipé d'DIC et une lentille d'objectif sec (10X, 20X, 40X) relié à une caméra. Installez le logiciel de transfert d'image entre la caméra et l'ordinateur en utilisant les instructions du fabricant.
2. Acquérir projections des embryons marqués par fluorescence avec un laser à balayage microscope confocal ^14. Suivez les instructions du fabricant pour photographier, z-empilage, et 3D projection avec un logiciel d'imagerie.
   1. Tournez la lame à l'envers, trouver l'échantillon monté avec objectif 10x, et encercler la zone de l'échantillon avec un stylo à base huilée bien.
      NOTE: Cela rend l'identification de l'échantillon plus facile lors de la recherche à travers des objectifs d'un microscope confocal.
   2. Ajouter une goutte d'huile sur le dessus de la zone de lamelle dont le côté opposé est marqué comme décrit au point 9.2.1.
3. Trouver le plan focal à 40X objectif à immersion d'huile puis changer pour un objectif à immersion d'huile 63X. Déplacer manuellement le réglage fin de mise au point et faireWN pour capturer le meilleur plan focal.
   NOTE: Pour observer des détails structurels de germaria et embryons précoces, nous vous conseillons d'utiliser 40X objectifs ou ceux avec un plus fort grossissement.
4. Balayez l'embryon dans différents canaux d'excitation et d'obtenir une image z-stack.
   NOTE: Pour les tissus de pucerons du pois, de réduire l'épaisseur de chaque section optique jusqu'à 1,5 um ou moins.

Representative Results

Dans cette étude, nous avons effectué tout le montage immunocoloration sur des embryons de pucerons du pois asexuées (figure 1A). Ces femelles produisent progéniture par parthénogenèse et vivipares. Ces embryons femelles se développent dans des chambres d'œufs des tubules ovariens (de ovarioles) (figure 1B et figure 2A). Avant la microscopie, les ovarioles disséqués sont les cibles de coloration; Toutefois, la séparation des chambres d'œufs est nécessaire pour l'observation des embryons au microscope (Figure 2B - D).

Augmentation de la perméabilité des tissus

Proteinase K (PK) de traitement est une approche standard pour améliorer la perméabilité des tissus, mais pour les embryons de certains organismes tels que modèle Caenorhabditis elegans (nématodes), Drosophila melanogaster (mouche), et (Danio reriole pas de poisson zèbre) est facultative. Dans le puceron du pois, l'obligation pour le traitement PK est l'étape-dépendante: pour germaria et embryons avant gastrulation (stades 0-7), le traitement PK peut être omise; mais pour les embryons en extension germband (étape 11) ou dans les étapes ultérieures de cette étape est fortement recommandé. Par exemple, au cours de l'embryogenèse signaux de milieu ont été à peine détectée dans des embryons sans traitement PK (Figure 3A - C). Par contraste, l'intensité de signal a été considérablement améliorée dans les embryons soumis à une digestion avec PK (figure 3A '- C', A "- C").

Réduction de la coloration de fond

Un niveau élevé de l'activité peroxydase endogène (POD) a été identifié dans les tissus embryonnaires de pucerons. Pour supprimer cette activité enzymatique, les embryons de paraformaldehyde fixés ont été incubés en présence de hydrogen peroxyde (H _{2 O} 2), un réactif commun pour l'oxydation de POD. Nos résultats ont montré que le traitement H _{2 O 2} n'a pas supprimé l'activité de POD endogène efficacement dans des embryons à un stade avancé (Figure 4A, D). En revanche, la coloration de fond est largement réduite dans les embryons soumis à incubation methanol (Figure 4B, C, E, F). Avant l'application des embryons d'anticorps primaires ont été bloquées dans une solution contenant de la BSA et NGS comme décrit dans les protocoles pour la coloration d'anticorps. Cependant, fond résiduel coloration dans les embryons de pucerons a été détectée (figure 3A '- C'). Ce problème a été résolu après le remplacement de NGS / BSA avec le réactif de blocage fourni par un ensemble de tampon pour des expériences DIG-étiquetage telles que l'hybridation in situ (figure 3A "- C") dans. Nous concluons donc que post-fixation avec du méthanol et de l'incubation avec le DIG-Bréactif de blocage sont à la fois essentiel pour réduire la coloration de fond dans les embryons de pucerons.

Traitement PK et le réactif de blocage DIG-B sont requis non seulement pour la détection du signal à l'aide des approches efficace chromogènes mais aussi fluorescentes. Coloration actine avec phalloidin ou coloration pour épitope de méthanol-sensible, cependant, ne fonctionne pas dans les embryons soumis à une pré-fixation avec du méthanol, qui peut détruire la forme native de l'actine ou des anticorps. Par conséquent, ce traitement doit être évitée lors de l'exécution de fluorescence immunocoloration. En dehors de l'élimination des étapes de traitement de methanol immunofluorescence permet des expériences multi-étiquetage dans les embryons de pucerons. En utilisant la microscopie confocale, par exemple, la protéine de pois puceron du Vasa1 (ApVas1) dans les cellules germinales, α-tubuline en microtubules, la F-actine dans des microfilaments, et de l'ADN dans les noyaux puisse être en même temps marqués et visualisée (figure 5A, C). En comparaison avec le chrométhode mogenic (figure 5B), confocale sectionnement échantillons d'marquées par fluorescence offre une meilleure résolution des signaux localisées telles que ApVas1 en plasma germinatif et cellularizing cellules germinales dans des embryons de pucerons tôt (Figure 5C ', D - D "). Adopter les conditions d'étiquetage cellules germinales décrits ci-dessus, la protéine Engrailed / invected dans les segments de la bande germinale extension a également été colorées avec l'anticorps 4D9 (Figure 6). Ceci montre que notre protocole d'immunocoloration, y compris chromogènes et fluorescentes méthodes, peut être efficacement appliqué pour signaler la détection à la fois dans la lignée germinale et des lignées de cellules somatiques dans pucerons.

Figure 1. parthénogénèse Les pucerons du pois vivipares. (A) un premier stade nymphe émergeant d'un adulte de sexe féminin vivipares asexuée. (B 12 souches. Un ovariole contient un germarium dans la pointe (flèches), 1-2, et 5-7 ovocytes chambres embryonnaires. Gut et la queue sont généralement associées avec les ovaires disséqués. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2. Illustration des stratégies pour le montage des embryons de pucerons à différentes étapes de développement. (A) Schéma de développement de l'embryon dans le ovariole disséqué d'une femme adulte vivipares parthénogénétique. Brève oogenèse (stade germarial et les étapes 0-2) est suivie par embryogenèse (étapes 3-20). Aperçu de l'embryogenèse: f ormation des syncytial blastoderm (stades 3-5); blastulation (stades 6-7); gastrulation (étapes 8-10); allongement de la bande de germe (stades 11-14); katatrepsis (scène 15); après katatrepsis et le germe bande rétraction (stades 16-17); organogenèse (stades 18-20). Touches de couleur sont en bas de la figure. (B, B ') germarium et les étapes 0-10 embryons. Aucun pont de lamelle est nécessaire. (C, C ') Stages 11-18 embryons. Un pont de lamelle est nécessaire. (D, D ') Stages 19-20 embryons. Ponts à double lamelle sont nécessaires. Rouler les embryons en faisant glisser la lamelle peut créer différents angles d'observation. Les tailles des lamelles couvre-objet de 22 x 22: mm de (B), 18 x 18 mm à (C) et (D). L'épaisseur des lamelles couvre-objet: 0,13 à 0,16 mm. Mise en scène embryonnaire suivi Miura et al ¹² Abréviations: g:. Germarium; ST: scène..com / files / ftp_upload / 53883 / 53883fig2large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

. Figure 3. traitement à la protéinase K et la comparaison des réactifs avec différents effets de blocage antérieur chambres d'oeuf est à gauche; tous les points de vue sont indiquées latérale à l'exception des embryons dans (B ", C ', C"), qui sont dorsale. Les embryons sont toutes colorées en utilisant un anticorps ApVas1 (dilution 1: 500) et les signaux de ApVas1 sont développés au sein de 10-20 sec. Pointes de flèches indiquent l'emplacement des cellules germinales. (A - C) Les embryons sans traitement de protéinase K (PK). ApVas1 signaux dans les cellules germinales sont à peine détectés. (A '- C', A "- C") Comparaison de la coloration de fond dans les embryons blocked avec NGS et BSA (A '- C') et du réactif de blocage commerciale dans le Wash DIG et Block Buffer Set (DIG-B) (A "- C"). Arrière-plan est significativement réduite chez les embryons indiqués dans (A "- C"). Abréviation: b: bactéries. Les barres d'échelle:. 100 um S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

. Figure 4. Minimiser la coloration de fond avec du méthanol antérieure d'embryons est à gauche; tous les points de vue sont dorsale. Les embryons sont traités avec PK pour augmenter la perméabilité de l'anticorps. Pointes de flèches indiquent l'emplacement des cellules germinales. (A, B, D, E) Comparaison des traitementsavec du peroxyde d'hydrogène (H ₂ O ₂₎ et de methanol. Les embryons ne sont colorées avec l'anticorps secondaire. H _{2 O 2} de traitement (0,3% p / v, 10 min): bruit de fond élevé (A, D); traitement de methanol (100%, 60 min): faible bruit de fond (B, E). (C, F) anticorps primaire coloration sur les embryons traités avec du methanol. Conditions de traitement de methanol sont identiques à celles utilisées pour les embryons indiqués dans (B, E). L'anticorps ApVas1 marque préférentiellement les cellules germinales embryonnaires. Les barres d'échelle:. 100 um S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5. Immunofluorescence sur les embryons précoces. (A, C - D) et de 1: 500 dans (B). (A) des signaux de coloration, qui comprennent ApVas1, α-tubuline, la F-actine, et l'ADN nucléaire, sont détectés en utilisant quatre canaux avec différentes longueurs d'onde. Touches de couleur des signaux sont affichés en bas de la figure. L'image (B) DIC d'un résultat chromogène pour la comparaison. ApVas1 est enrichi dans le germarium tandis que l'intensité de contraste de localisation postérieure de ApVas1 (têtes de flèches) à l'étape 3-embryon est pas aussi claire que celle représentée à (C, C '). (C, C ') d'enrichissement de signaux ApVas1 dans la partie postérieure de l'oeuf. Les signaux localisés dans la région postérieure de la chambre d'oeuf (têtes de flèche) sont renforcées par l'image empilage. Parce que les signaux de F-actine et α-tubuline masquent partiellement ceux de ApVas1 dans la partie postérieure (C), une image produite par balayage à un seul canalisée est montré dans (C '). (D - D '') de sectionnement confocale ApVas1 localisée dans la région postérieure de l'étage-4 embryon. Les images présentées dans (D) et (D ') sont détectées dans ApVas1 surface et plans focaux centraux, respectivement. (D ") est l'image fusionnée de toutes les sections de la même embryon comme (D) et (D ') Abréviations: comme: Aster; fc, cellules folliculaires; poc, ovocyte prospective; sp:. Broche; tc, cordons trophiques. Les barres d'échelle:. 10 pm S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6. L'immunocoloration sur des segments embryonnaires. Untérieur des chambres d'œufs est à gauche. Embryons de PK-traités sont colorées avec l'anticorps monoclonal 4D9 contre Engrailed / invected, qui sont exprimés dans les segments embryonnaires. Touches de couleur des signaux sont affichés en bas de la figure. (A, A ') Immunofluorescence sur une platine-13 embryon. (A), une image confocale à partir d'images superposées de Engrailed / invected, α-tubuline, la F-actine, et des colorations d'ADN nucléaire. (A ') une image confocale montrant la coloration de Engrailed / invected seulement. Sans l'interférence des signaux provenant d'autres canaux, les signaux sont plus affichées. (B, C) ​​chromogénique coloration sur les embryons à des stades 13 et 17 du développement, respectivement. (B) Stage-13 embryon. (C) Stage-17 embryon. De stades 13 à 17, le nombre croissant de segments de l'abdomen sont étiquetés par 4D9. (D) de contrôle négatif (-Ctrl) tacheING ne avec un anticorps secondaire conjugué avec Alexa Fluor 633. Presque aucun des signaux d'immunocoloration sont détectés sur ovariole sans anticorps primaire. Cependant, autofluorescence de bactéries (ligne pointillée) dans l'étape 7 et 13 de chambres d'œufs sont détectées à l'onde d'excitation 488 nm. Abréviations: A: l'abdomen; b: bactéries; H: la tête; T: thorax. Les barres d'échelle:. 100 um S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Nous avons identifié des conditions optimales critiques immunocoloration succès dans le puceron du pois A. Pisum, un organisme modèle émergent des études de génomique et de développement ^3,15. Des conditions optimisées pour augmenter la perméabilité du tissu et réduire la coloration de fond amélioré l'intensité et la spécificité des signaux. Ils diffèrent des protocoles standard pour immunocoloration dans d'autres modèles animaux dans les étapes de création de pores dans les membranes cellulaires et bloquer la liaison d'anticorps non spécifique.

Pour l'immunocoloration et hybridation in situ, la protéinase K (PK) digestion est l'une des approches courantes pour augmenter la perméabilité du tissu ^{16 à 19.} En anticorps coloration de tissus de pucerons, nos résultats montrent que: (1) PK digestion améliorée de manière significative des signaux de immunocoloration dans les embryons vivipares parthénogénétiques en extension de bande de germe (étapes 11 à 14) (figure 3B '', C ''), bien quesignaux faibles étaient encore visibles dans les embryons dépourvus de traitement de PK (figure 3B, C); et (2) la digestion PK était obligatoire pour les embryons de katatrepsis en avant (stades 15-20) (figure 4C, F et la figure 6C). Pour les embryons vivipares asexués avant katatrepsis, le volume des chambres d'œufs est peu probable que la cause du problème de pénétration parce immunocoloration succès sur les embryons ovipares sexuelles précoces résidant dans les œufs, qui prévues sont presque équivalente en taille à Chamberland le plus mature d'oeuf asexuée ne nécessite pas de digestion avec PK ^20. Par conséquent, l'allongement et de pliage de la bande de germe (étapes 11 à 14) dans l'espace limité des chambres d'oeufs asexués sont susceptibles d'entraver l'entrée de l'anticorps, et il est PK qui permet la pénétration de l'anticorps par la création de pores dans les membranes cellulaires entre les structures embryonnaires coincé. En revanche, l'extension de la bande de germe dans les œufs sexuels en ligne droite peut expliquer pourquoi il est taché même dansl'absence de PK. Retrait de l'enveloppe vitelline / chorion peut aussi faire embryons ovipares sexuelles plus accessibles aux anticorps. Pour les embryons après katatrepsis (étapes 16 à 20), le traitement PK est essentiel pour les deux formes asexuées et sexuelles parce embryons sont épais cuticled ¹⁹ (figure 4C, F et la figure 6C).

Néanmoins, la condition suggérée pour PK digestion (1 ug / ml pendant 10 min) requiert en outre l'ajustement si l'intégrité des structures embryonnaires ou l'intensité des signaux ne sont pas satisfaisants. Ceci est principalement dû à l'activité de PK qui peuvent varier d'un lot à l'autre. Par exemple, si les tissus embryonnaires sont endommagés après PK digestion, la concentration de PK peut être réduite à 0,5 ug / ml. De même, si l'intensité du signal est faible, l'extension de l'incubation à 15-20 min est donc recommandé. Les embryons les plus matures (étape 20) soumis à l'incubation de PK prolongée jusqu'à 20 min à 1,0 ug / ml de concentration, However, affichent généralement des signaux faibles, ce qui suggère que PK digestion est encore incomplète. Digestion prolongée peut améliorer les signaux de coloration est facultative mais, en particulier lorsque les profils d'expression détectés dans le stade de 18 embryons sont semblables à ceux dans l'étape 20 embryons. En comparaison avec des embryons au stade 20 de développement, l'étape 18 embryons de morphologie analogue encore avec moindre quantité de la cuticule du corps peuvent généralement obtenir l'intensité de signal plus fort.

Au cours du développement du signal, la coloration de fond peut être élevée par l'action d'enzymes endogènes qui peuvent réaction croisée avec les substrats. Dans les embryons de pucerons du pois, de l'activité de la phosphatase alcaline endogène (AP) et de peroxydase (POD), qui sont tous deux conjugués d'anticorps communes pour la digestion des substrats de signal, a été détectée. Activité hydrolase du PA endogène peut être supprimée efficacement tout au long de l'embryogenèse par le lévamisole (données non présentées). Néanmoins, le traitement des embryons avec 0,3-0,6% Hydrogen peroxyde (H _{2 O} 2) ne peut éliminer l'activité de POD endogène avant katatrepsis mais n'a pas été suffisant pour les embryons plus âgés (Figure 4A, D). Méthanol incubation, une approche alternative pour la dénaturation des protéines endogènes, a été démontrée pour être efficace dans les pucerons ²¹ (figure 4B, E). Contrairement à _H 2 O _{2, ce qui endommage} les tissus pucerons pendant l'incubation prolongée de 30 minutes ou plus, le méthanol ne pas digérer ou déformer les embryons au cours d'une étape de développement (figure 4C, F). Par conséquent, le méthanol est une meilleure alternative pour supprimer l'activité de POD endogène dans des embryons de pucerons. Si fond résiduel coloration est détectée, qui se produit habituellement dans les embryons matures avec une couche plus épaisse de la cuticule, O / N incubation dans du méthanol à 4 ° C-selon notre expérience peut encore réduire l'activité de POD endogène.

Fond résiduel coloration a été détecté dansembryons bloqués avec des protéines sériques telles que le sérum normal d'âne (NDS), sérum de chèvre normal (NGS), albumine de sérum bovin (BSA), ou leurs mélanges ¹³ (figure 3A'-C '). L'adoption d'un réactif de blocage fourni dans le commerce utilisés pour l'hybridation in situ, en revanche, le fond restant pendant immunocoloration pourrait être sensiblement éliminé ⁵ (figure 3A '' - C ''). Bien que les ingrédients du réactif de blocage sont exclusifs, il contient probablement des protéines non sériques qui peuvent bloquer epitopes non spécifiques des protéines de pucerons du pois. Le réactif de blocage a également travaillé beaucoup mieux que les sérums des animaux dans le puceron vert du pêcher Myzus persicae. De même, dans la digestion M persicae PK et incubation du methanol ont donné lieu à la pénétration de l'anticorps et de la réduction satisfaisante de fond -. Proche de l'amélioration des résultats obtenus dans A. pisum (données non présentées). Nous prévoyons que les conditions OPTIMIZed pour augmenter la perméabilité des tissus et de réduire fond, que l'on utilise coloration chromogène ou fluorescence, va appliquer à de nombreuses autres espèces de pucerons.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% hydrogen perxidase (H2O2)	Sigma-Aldrich	18304	For bleaching endogenous peroxidase of embryos.
4’6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542	For labeling the double-strand DNA. TOXIC. Wear gloves, dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure
4D9 anti-engrailed/invected mouse monoclonal antibody	Developmental studies hybridoma bank	AB_528224	For labeling the developing segments of embryo.
ApVas1 rabbit polyclonal antibody	Our laboratory	N/A	For labeling the aphid germline specific Vas1 protein in embryos. This antibody was made by our laboratory.
Austerlitz Insect pins	ENTOMORAVIA	N/A	For seperating each egg chambers from an ovariole. Size 000, BLACK ENAMELLED.
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	9048-46-8	For blocking the non-specific binding of antibodies.
Camera connted to compound microscope	Canon	EOS 5D	For photographing of aphid embryos.
Colorimetric 8 cell tray	Kartell Labware	357	For developing the staining signal of aphid embryos. Diameter 95 x 57 mm, cell depth 2 mm.
Compound microscope with DIC optics	Leica Microsystems	DMR	For photographing of aphid embryo mounted on the slides.
DIG Wash and Block Buffer Set	Sigma-Aldrich (Roche)	11585762001	For blocking the non-specific binding of antibodies. We diluted the 10x Blocking solution into 1x as blocking reagent.
Forceps	Ideal-tek	N/A	For dissection of ovaries from aphids. Manufacturer part No 5: 5 SA.
Glass dropper	N/A	N/A	For transfering ovaries of aphids from the splot plate to tubes. 150 mm of total length and 5 3/4" of tip length.
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	For clearing of aphid embryos and mounting.
Glycine	Bioshop	N/A	For blocking the enzyme activity of proteinase K (PK).
Goat anti-mouse IgG conjugated Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11017	For detection of primary antibody from mouse.
Goat anti-rabbit IgG conjugated Alexa Fluor 633	Invitrogen	A21072	For detection of primary antibody from rabbit.
Intelli mixer	ELMI laboratory equipment	RM-2M	For improving the thorughly reaction of reagents with ovaries.
Laser-scanning confocal microscopy	Leica Microsystems	SP5	For photographing of aphid embryo mounted on the slides with florecent tag.
methanol	Burdick and Jackson	AH2304	For bleaching endogenous peroxidase of embryos.
Microscope slides	Thermo scientific	10143560	For mounting of embryos. SUPERFROST ground edges, ca./env. 76 x 26 mm.
Microscope Cover glasses	Marienfeld	0101030	For mounting embryos on the slides. Size 18 x 18 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
Microscope Cover glasses	Marienfeld	0101050	For mounting embryos on the slides. Size 22 x 22 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
mouse monoclonal anti-alphaTubulin antibody (DM1A)	Santa Cruz Biotechnology	sc-32293	For labeling the distrbution of alpha-tubulin of cells.
Nail polish	N/A	N/A	For sealing the coverslips on the slides.
Normal goat serum (NGS)	Sigma-Aldrich	G9023	For blocking the non-specific binding of antibodies.
Paraformaldehyde (PFA)	VWR	MK262159	For fixation of aphid ovaries.
Phalloidin-TRITC	Sigma-Aldrich	P1951	For labeling the distrbution of F-actin on embryos.
Phosphate-buffered saline (PBS)	N/A	N/A	As isotonic solution for aphid ovaries.
Plastic dropper	N/A	N/A	For transfering ovaries of aphids from tube to cell tray. Size 3 ml.
Proteinase K	Merck	124678	For creating pores (punching) on the cell membrane and facilitating the access of antibodies.
Pyrex spot plate	N/A	N/A	For dissection and color reactions of aphid ovaries under microscopy. Each cavity with diameter 22 mm and  depth 7 mm.
SIGMAFAST 3,3’-diaminobenzidine (DAB) tablets	Sigma-Aldrich	D4168	For developing of substrated signals. Also called DAB peroxidase substrate tablet set.
Stereo microscope	Leica Microsystems	EZ4	For dissection and observation of aphid ovaries.
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	T8787	For creating pores (punching) on the cell membrane.
VECTASHIELD Elite ABC Kit (Rabbit IgG)	Vector laboratories	PK-6101	For enhancement of the signal. Including of biotinylated goat anti-rabbit IgG secondary antibody, A and B reagents.
VECTASHIELD mounting medium	Vector laboratories	H1000	For clearing of aphid embryos and mounting.