Bezelye Afit Embriyolar immün için kritik Koşulların Belirlenmesi: Doku geçirgenliğini arttırarak ve Arka Plan Boyama azaltılması

Abstract

Bezelye yaprak biti Acyrthosiphon Pisum, bir sıralı genom ve bol fenotipik plastisite ile genomik ve gelişimsel çalışmalar için gelişmekte olan bir model haline gelmiştir. Diğer yaprak bitleri, A gibi. Pisum embriyoları ovaryol bir montaj hattı moda yumurta odaları içinde geliştirmek partenogenetik doğuran üreme yoluyla hızla yaymak. Daha önce biz yaprak biti embriyolarda mRNA ifadesinin tespiti sağlayan in situ hibridizasyon tam mount güçlü bir platform kurduk. Protein ifadesini analiz etmek için olsa da, tatmin edici sonuçlar üretmek değil aseksüel viviparous Yaprakbitlerinin ovaryolden immün için protokol kurdu. Burada doku geçirgenliğini artırarak ve kurulan yaklaşımları uygularken sorunlarla her ikisi de arka plan boyama, azaltmak için optimize edilmiş koşulları bildirmektedir. Optimizasyon içerir: esas f bulunmuştur proteinaz K (1 ug / ml, 10 dakika), (1) inkübasyonorta ve geç evre yaprak biti embriyolarda veya antikor penetrasyon; Bir digoxigenin (DIG) tarafından tedarik edilen bir bloke edici tepkin madde ile normal keçi serumu / büyükbaş hayvan serum albümin (2) yerine ayarlanmış tampon ve endojenez peroksidazı ağartılması için, metanol yerine hidrojen peroksit _{(H2O 2),} (3) bir uygulama merkezli; bu anlamlı biti dokularda bir arka plan renklendirmesini azaltmıştır. Immün için optimize Bu kritik şartlar A. Pisum ve diğer Yaprakbitlerinin embriyolar gen ürünlerinin etkin algılama sağlayacaktır.

Introduction

Yaprak bitleri küçük (1-10 mm) yumuşak organları ile hemipteran böceklerdir. Onlar piercing, ağız parçaları ile floem öz suyunu emerek bitkiler üzerinde beslenirler. Ek olarak, floem özsuyu diyet eksiktir esansiyel amino asitleri sentezlemek için, bir zorunlu endosimbiyotik bakterinin, Buchnera aphidicola güveniyor. Yaprak bitleri bahar ve yaz uzun gün fotoperiyodların ve kışlama yumurta ^1,2 sınırlı sayıda yatıyordu sırasında kısa gün fotoperiyodların tarafından tetiklenen cinsel yumurtlayarak çoğalan üreme sırasında partenogenetik viviparous üreme içeren karmaşık bir hayat öyküsü var. İlkbaharda bu yumurtalar sonbahara kadar partenogenetik üreme çok sayıda mermi takip, hepsi kadın yaprak bitleri (fundatrices) birinci nesil üretmek için yumurtadan. Yıllık yaşam döngüsünde eşeysiz ve cinsel fazlar alternatif, evrimsel yenilik ^1,2 olarak kabul edilmiştir yaprak bitleri, devresel parthenogenesis. Partenogenetik viviparous yaprak bitleri içinde, Embryogenesis yumurtalık tübül (ovaryolden) yumurta odaları içinde yer alır. Buna karşılık, cinsel yumurtlayarak çoğalan embriyolar döllenmiş yumurtanın içinde gelişir. Ayrı üreme plastisite gelen, yaprak bitleri kuşaklararası kanat polyphenism görüntüleyebilirsiniz: kalabalık sinyalleri ve predatör tehditlerine yanıt olarak, unwinged aseksüel dişiler viviparously uzun mesafe göç kanatlı yavrular üretebilir. Bezelye yaprak biti genom dizisinin Yayın Acyrthosiphon Pisum -the ilk genom sekansı, bir bazal hemimetabolus böcek sağlar üreme plastisitesi, kanat polyphenism ve molekül üzerindeki yaprak biti böcek bitki etkileşimleri viral vektör ve ortak yaşam dahil olmak üzere diğer özelliklerin daha da araştırma temeli ^3.

Sıralı genom ek olarak, gen ekspresyonu ve fonksiyonunu karakterize etmek için araçlar, olgun bir model organizma olarak ⁴ bezelye yaprak biti teşvik etmek için gereklidir. Biz bütün-mount sağlam protokoller tanımlamışlardır 5-7 mRNA ekspresyonunu tespit etmek için in situ hibridizasyon. Çift kollu bir RNA enjeksiyon ve besleme ile RNA interferans (RNAi) biti nimf ve yetişkinlerde gen susturma kullanılmaktadır, ancak embriyolar demonte gen için stabil şartlar yapılmamış ^8-10 rapor edilmemiştir. Immün ve RNAi demonte sonra bezelye yaprak biti embriyolar ^11-13 yapılmadan önce numuneler içindeki protein ifadesi tespit edebilir bir antikor-bazlı yaklaşım. Ancak, doku geçirgenliği ve arka plan boyama ortadan kaldırılması artış bezelye yaprak biti aseksüel viviparous embriyolar immün standart protokolleri kullanarak henüz tatmin edici değildir. Örneğin, dokulara antikorun bu penetrasyon Gastrulasyon embriyolarda azaldığı bulundu (8-10 evre) ve morfolojik olarak tanımlanabilir ekstremite tomurcukları (aşamaları 13-14) ile embriyolar antikor zorlukla geçirgen olduğunu. Buna ek olarak, arka plan renklenmesi eşeysiz viviparo görüntülenmiştir edildigerm işaretleyici Vasa yanı sıra buna karşı embriyonik segmentlerde ^12,13 olarak ifade Engrailed / Invected proteinine karşı antikor kullanılarak boyandı bize bezelye yaprak biti embriyolar. Aslında arka plan renklenmesi yine tek başına ikincil antikor ile boyandı embriyolar açıkça görülebilir.

Yaprak biti dokuların bütünlüğünü bozmadan geçirgenliğini arttırmak için dikkatli bir şekilde proteinaz K konsantrasyonunun titre edildi ve yaprak biti embriyolar Doku sindirimi için en uygun koşulları belirlendi. Bezelye yaprak biti spesifik olmayan lekelenmenin engellenmesi için, etkili bir şekilde bloke eder ve embriyolar endojen peroksidaz (POD) aktivitesini, immün sırasında sinyallerini yükseltmek için kullanılan bir enzim baskılayabilir bileşikleri aramışlardır. Geleneksel olarak kullanılan normal keçi serumu yerine (NGS) bir digoxigenin (DIG) bazlı tampon seti tarafından temin edilen bir bloke edici tepkin maddesi / sığır serum albümini (BSA), önemli ölçüde bir arka plan renklendirmesini azalttı. Ayrıca, metanol inhi bulunmuşturHidrojen peroksit daha etkili endojen POD faaliyetini bit (H _{2 O 2).} Embriyoların üzerinde immün için bu yaprak biti özgü koşullarına ilişkin ayrıntılar aşağıdaki bölümlerde açıklanacaktır.

Protocol

Yaprak bitleri 1. Kültür

NOT:. Partenogenetik viviparous bezelye yaprak biti A laboratuvar zorlanma Pisum başlangıçta merkezi Tayvan'da toplandı ve 300'den fazla nesiller için uzun gün fotoperiyodunda konak bitkileri (bahçe bezelye Pisum sativum veya bakla Vicia faba) yetiştirilen olmuştur (bir kuşak: ~ 10 gün).

1. Tohum Çimlenme
   1. Oda sıcaklığında 3-5 gün boyunca musluk suyu konakçı bitkilerin tohumlarının bekletin. Günde bir kez temiz su ile doldurun.
      NOT: Alternatif olarak, düz nemli toprağa konukçu bitkilerin tohumları koyarak yanı sıra çimlenme neden olabilir.
   2. Işık periyodu 16 saat aydınlık / 20 ° C'de 8 saat karanlık altında bir büyüme odasında toprak ile küçük bir kap (9 cm çapında x 7 cm boyunda) içinde 10 çimlenme tohum büyütün.
   3. Büyüme başlıyor Yaklaşık 10 gün sonra, kimin yüksekliği en fazla 8 cm bitkiler üzerine kurtları aktarmak.
2. Yaprak bitleri Devri , 1 L'lik bir cam beher içinde bitkilerin her saksı tutun bir boya fırçası ile bitkiler üzerine 8, yetişkin kurtları aktarmak ve sonra kaçmasını önlemek için yaprak bitleri gibi gazlı mesh olarak hava geçirgen bir kapak ile beher mühür.
3. Işık periyodu 16 saat aydınlık / 20 ° C'de 8 saat karanlık altında bir büyüme odasında inkübe yaprak bitleri. Her gün bir kez bitkilerin her bitki pot sulayın.
4. Yaprakbitlerinin nesil elde etmek için, adımları 1.1.3-1.2.2 on gün birincil yaprak biti transferinden sonra yineliyoruz.

2. Diseksiyon ve Yumurtalıkların Fiksasyon

1. Taze sabitleme tampon 1x fosfat tamponlu tuz (PBS) içinde% 4 paraformaldehit (PFA) hazırlar.
2. PFA (yaklaşık 500 ul) ile bir nokta plakasının bir kuyu doldurun düşük büyütme stereo mikroskop altında plaka yerleştirin ve diseksiyon için PFA içinde yetişkin bir afidi daldırın.
3. , Forseps bir set ile baş ve karın tutan dorsal açık keserek yumurtalıkların teşrihKarın manikür ve karın boşluğunun uzak yumurtalıklar sürükleyerek.
4. 20 dakika boyunca oda sıcaklığında PFA 1 ml ihtiva eden 1.5 ml bir tüp içinde yumurtalık üç çift sabitleyin.
5. Bir transfer pipet (cam ya da tek kullanımlık) 1x PBS içinde% 0.2 TritonX-100 (PBST) 10 dakika her 3 kez yumurtalıkların yıkayın ve sonra birlikte Durusu sabitleme tampon. Hafif (dönüş açısı: 60 ° (F60) / devir hızı: 8 RPM) bir mikser / rotator sallayarak sabitleme ve yıkama hem de tavsiye edilir.

3. proteinaz K (PK) ile tedavi Embriyonik Dokuların Geçirgenlik Artırma

NOT: PK tedavisi ileriye mikrop bant uzantısı (evre gelişme 11) embriyolar uygulanır. Genç embriyoların için, bu adım isteğe bağlıdır.

1. Seri olarak çalışma konsantrasyonu 1 mg / ml'ye 1x PBS ile PK'nin stok solüsyonu (10 mg / ml) seyreltin.
2. Hafif çalkalama ile 10 dakika için PK (yaklaşık 500 ul) 1 ug / ml yumurtalık inkübe edin.
3. Durusu PK solutive Glisin 700 ul (2 mg / ml) 5 dakika her biri için 3 kez yumurtalıkların yıkama ile.
4. 10 dakika her biri iki kez% 0.2 PBST ile yumurtalıkları yıkayın.
5. Hafif çalkalama ile oda sıcaklığında 15 dakika boyunca sabitleme tamponu ile tekrar yumurtalıkların sabitleyin.
6. Süpernatantı atın ve 10 dakika her biri için iki kez% 0.2 PBST ile yumurtalıkların yıkayın.

4. Metanol Kuluçka Endojen peroksidaz Bastırma (POD) faaliyeti için

Not: Metanol inkübasyon metanol duyarlı Phalloidin boyama veya antikor epitoplarının tutulan embriyolarda uygulanmaz.

1. Seri olarak% 0.2 PBST içinde metanol farklı yüzdesi yumurtalıkların dihidrat (3: 1: 1: 1, 3: 1 h / h) hafif ajitasyon ile, 10 dakika boyunca metanol çözeltisinin her konsantrasyonunda yumurtalıkları inkübe edilerek.
2. Hafif çalkalama ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 100 metanol ile yumurtalıkları kurutmak.
   Not: boyama tatmin edici sonuçları hala% 100 metanol içinde depolanmıştır biti dokulardan elde edilebilir ve -20# 176; C bir ay.
3. Seri olarak% 0.2 PBST içinde metanol farklı yüzdesi yumurtalıkların rehidrate (1: 1: 1: 3, 1: hac / hac 3) hafif ajitasyon ile, 10 dakika boyunca metanol çözeltisinin her konsantrasyonunda yumurtalıkları inkübe edilerek.

5. Antikor Boyama

1. DIG-tabanlı tampon kümesinden 10x engelleme çözümü sulandırmak (DIG-B) 1x için.
   Not: 1x DIG-B bloke edici solüsyonu (BSA standardı bloke% 5 oranında reaktif maddesi (hac / hac) normal keçi serumu (NGS) ve% 0.5 (v / v) inek serumu albümini daha boyama arka azaltmak için daha etkilidir )% 0.2 PBST içinde.
2. Hafif çalkalanarak 4 ^ 'de oda sıcaklığında ya da O / N oranında 2,5 saat 4 için 1x DIG-B bloke edici bir solüsyonuyla yumurtalıkların inkübe edin.
   NOT: 1.5 ml tüp içinde yumurtalıkların üç çift için 200 ul örnek engelleme ve antikor boyama için minimum hacimdir.
3. Süpernatant Durusu ve uygun diluti birincil antikor içeren taze 1x DIG-B engelleme çözümü ile değiştirinoranı. Hafif çalkalanarak 4 ^ 'de oda sıcaklığında ya da O / N 4 saat boyunca yumurtalıkları Leke.
   Not: (1) ApVas1 antikoru: 1: Burada anlatılan deney için, primer antikorların müteakip optimum dilüsyonları kullanımı kromojenik boyama 500, immünofloresan boyama 1:50; (2) anti-α tübülin antikoru: 1: 500; (3) 4D9 monoklonal antikoru: 01:25.
4. 15 dakika her biri için,% 0.2 PBST ile 4 kez yumurtalıkların yıkayın.
5. Hafif çalkalama ile oda sıcaklığında 1 saat süre ile 1x DIG-B bloke edici bir solüsyonuyla yumurtalıkların inkübe edin.
6. Süpernatant Durusu ve taze 1x DIG-B engelleme çözümü uygun seyreltme oranında ikincil antikor içeren değiştirin. Hafif çalkalanarak 4 ^ 'de oda sıcaklığında ya da O / N 4 saat boyunca yumurtalıkları Leke.
   1. İkincil antikor, aşağıdaki seyreltme oranları kullanın: (1) için immünofloresan boyama: 1: Alexa Fluor 633 keçi anti-tavşan IgG veya Alexa Fluor 488 keçi anti-fare IgG ile 500; (2) boyama için kromojenik: 1: 200 biyotinile keçi anti-tavşan IgG.
      Not: biyotinlenmiş sekonder antikor boyama sinyalleri önemli ölçüde güçlendirilmiş olan, alt-tabaka bazlı (kromojenik) algılama bölgesi avidin-biyotin-kompleksi (ABC) etkileşime girmek için uygulanır.
   2. Ikincil antikor duyarlı hafif olduğu için immünofloresan boyama için, karanlıkta boyama yürütmek.
7. 10 dakika her biri için% 0.2 PBST ile 4 kez ikincil antikor yıkayın.

6. Nükleer ve F-aktin Boyama

Not: Bu yalnızca immünofloresan boyama uygulanır.

1. Karanlıkta oda sıcaklığında DAPI (2 ng / | il) ve 2 saat Phalloidin-TRITC (100 nM) ihtiva eden% 0.2 PBST ile yumurtalıkları Leke.
2. 10 dakika her biri için,% 0.2 PBST ile 4 kez yumurtalıkların yıkayın.
3. Hafif çalkalanarak 4 ^ 'de montaj orta O / N yumurtalıkların inkübe edin.

7. Sinyal Geliştirme

Not: Bu yalnızca kromojenik boyanması için uygulanır.

1. 100 ul hazırlayınbiyotin yaban turpu peroksidaz ile konjüge edilmiş (Reaktif B 1 ul,% 0.2 PBST 98 ul Reaktif A (avidin) 1 ul ekleyerek yumuşak pipetleme ile iyice karıştırarak ve ekleyerek sinyali artırmak için (ABC) reaktif avidin-biyotin-kompleksi ), anında karıştırılması, ardından. Hafif çalkalama ile oda sıcaklığında 30 dakika süreyle inkübe karışımı.
2. Hafif çalkalama ile oda sıcaklığında 30 dakika boyunca belirteç, A ve B karışımı içinde (kopuk yumurta odaları dahil) yumurtalık inkübe edin.
3. 10 dakika her biri için,% 0.2 PBST ile 4 kez belirteç, A ve B karışımı yıkayın.
4. Plastik damlalık ile nokta plaka üzerinde bir kuyuya PBST batmış yumurtalıklar aktarın.
5. 3,3'-diaminobenzidin (DAB) içinde alt-tabaka çözeltisi hazırlayın: Bir DAB tablet artı 1 dakika boyunca güçlü döndürülerek ile _GKD 2 O, 1 ml bir tane ihtiva eden üre hidrojen peroksit çözülür.
   NOT: DAB, peroksidaz bir tetikleyici substrat, immün için popüler bir Kromojen olduğunu. Bir br üretirperoksidaz tarafından okside sonra kendi ve çözünmez çökelti. Zayıf sinyalleri alt-tabaka çözeltisi (nihai konsantrasyon 0,05-0,08%) nikel klorit ilave edilerek artırılabilir.
6. Oyuk kalan PBST solüsyonu çıkarın ve sinyal gelişimi için DAB alt-tabaka çözeltisi 100 ul ile doldurun.
7. Düşük büyütme stereo mikroskop altında sinyallerin yoğunluğunu izleyin.
8. Hemen 1x PBS ile dolum ardından DAB çözüm kaldırarak tepkilerini durdurun. İki kez yıkama tekrarlayın.
9. 1,5 ml'lik bir tüpe geri yumurtalıkların aktarın ve daha sonra 15 dakika her biri için iki kez 1 x PBS veya PBST ile yıkanır.
10. Hafif çalkalanarak 4 ^ 'de, bir gliserol tabanlı bir montaj ortamına (70% gliserol) O / N olarak yumurtalıkların inkübe edin.

8. Yaprak biti Embriyolar Montaj

NOT: Yaprak biti embriyoların kalınlığı gelişim aşamaları arasında değişmektedir. Montaj stratejileri, böylece erken uyacak şekilde modifiye (germaria ve 0-10 aşamaları), orta (aşamaları vardırŞekil 2B gösterilmiştir 11-18), ve geç embriyolar (aşamaları 19-20), - D. Embriyonik evreleme Miura ve ark izledi. ¹²

1. Düşük büyütme stereo mikroskop altında örnekleri plastik damlalık ile hücre tepsisine montaj orta ile birlikte yumurtalıkların aktarın ve gözlemleyin.
2. Böcek pimleri kullanarak yan yumurtalık ile ilgili kaliksi kesin ve daha sonra bir damlalık ile de boş cam bir izole ovaryol aktarın. Montaj orta kullanarak ul 50-100 son hacim Makyaj.
3. Cam damlalık ile slayt üzerine bir ovaryol aktarın ve ardından böcek pimleri kullanarak yumurta odaları incelemek.
   NOT: geliştirme aşamasında 6 yaşından büyük embriyolar için yumurta odaları ayrılması tavsiye edilir; germaria ve evre 6 yaşından küçük ilk iki yumurta odaları için, ayrılık isteğe bağlıdır.
4. Cam damlalık kullanarak temiz bir slayt bir disseke yumurta odasına yerini değiştirin.
5. Bir Lamel (boyut koyun: 22 x 22disseke germaria ya da yavaş kabarcıkları önlemek için yumurta odaları (aşamaları gelişimin 1-10 embriyolar içeren) üzerinden mm).
   1. Dağı yumurta odaları tek taraflı lamel köprü ile bir slayt (aşamaları gelişimin 11-18 embriyolar içeren) ve başka bir lamel yerleştirin: numune üstünde (boyut 18 x 18 mm).
   2. Dağı yumurta odaları çift taraflı lamel köprü ile bir slayt (geliştirme aşamasında 19 yaşından büyük embriyoları içeren) ve başka bir lamel yerleştirin: numune üstünde (boyut 18 x 18 mm).
6. Numuneyi kurumasını önlemek için montaj medya ile üst lamel altında boşluğu doldurmak.
7. Hafif gözlem için doğru yönlendirmeyi elde etmek için lamel kaydırarak embriyo döndürün.
8. Oje ile (köprü lamelleri dahil) lamelleri kenarına etrafında mühür.

9. Görüntüleme Analizi

1. Fotoğraf diferansiyel girişim kontrast (DIC) görüntüleri compou ile embriyolar tüm montajnd mikroskop DIC optik ve kameraya bağlı bir kuru objektif lens (10X, 20X, 40X) ile donatılmış. Üreticinin talimatlarını kullanarak kamera ve bilgisayar arasındaki görüntü aktarımı için yazılımı yükleyin.
2. Bir lazer-tarama konfokal mikroskop ¹⁴ floresan etiketli embriyoların projeksiyonlar elde edin. , Fotoğraf z-istifleme ve 3D görüntüleme yazılımı ile projelendirme için üreticinin yönergelerini izleyin.
   1. 10X amacı ile monte örneği bulmak, baş aşağı slayt çevirin ve ince yağlı bazlı kalem ile örnek alan daire.
      NOT: Bu konfokal mikroskop hedefleri doğrultusunda bunun ararken örnek daha kolay belirlenmesi yapar.
   2. Karşı tarafta 9.2.1 de açıklandığı gibi etiketlenmiş lamel alanının üstünde bir damla yağ ekleyin.
3. 40X yağ daldırma amaca odak düzlemi daha sonra bir 63X yağ daldırma hedefi değiştirmek bulun. Manuel olarak ince odak denetimi taşımak ve yapılacakwn iyi odak düzlemi yakalamak için.
   NOT: germaria ve erken embriyo yapısal ayrıntıları gözlemleyerek için, 40X hedefleri veya daha yüksek büyütme olanlar kullanmanızı öneririz.
4. Farklı uyarma kanallarda embriyo tarayın ve z-yığın görüntü elde.
   Not: bezelye yaprak biti dokuları, 1.5 um ya da daha az kadar her bir optik bölümünde kalınlığını azaltır.

Representative Results

Bu çalışmada, biz aseksüel bezelye yaprak bitleri (Şekil 1A) embriyolar üzerinde tüm montaj immün uygulandı. Bu dişiler partenogenetik ve viviparously yavrular üretirler. Bu kadın embriyolar yumurtalık tübül (ovaryolden) (Şekil 1B ve Şekil 2A) yumurta odaları içinde gelişir. Mikroskopi önce disseke ovaryolden boyama hedefleri; Bununla birlikte, yumurta bölmelerinin ayrılması, bir mikroskop (- D Şekil 2B) altında embriyo gözlem için gereklidir.

Doku geçirgenliğinin artması

Proteinaz K (PK) tedavisi doku geçirgenliğini arttırmak için standart bir yaklaşımdır, ancak-bu tür organizmalar Caenorhabditis elegans (nematod), Drosophila melanogaster (sinek) ve Danio rerio gibi bazı model embriyoların (içinZebra balığı) -Bu adım isteğe bağlıdır. Bezelye yaprak biti olarak, PK tedavisi için gereksinim sahne bağlıdır: önce gastrulasyon için germaria ve embriyoların (aşamaları 0-7) için, PK tedavisi ihmal edilebilir; ancak germband uzantısı (evre 11) altında veya sonraki aşamalarında embriyo için bu adımı şiddetle tavsiye edilir. Örneğin, ortası embriyojenez sinyalleri boyunca zar zor PK tedavisi için (- C Şekil 3A) olmayan embriyolar tespit edilmiştir. Buna karşılık, sinyal yoğunluğu belirgin bir şekilde ('- C' bir "- C" Şekil 3A) PK sindirimi tutulan embriyolarda geliştirilmiştir.

Arka plan boyama azaltılması

Endojen peroksidaz (POD) aktivitesi, yüksek düzeyde bir yaprak bitleri embriyonik dokuda tespit edilmiştir. Bu enzim etkinliğinin engellemek için, paraformaldehid ile sabitlenmiş embriyolar hy mevcudiyetinde kuluçkalanmıştırPOD oksidasyonu için sahip hidrojen peroksit _{(H2O 2),} ortak bir reajanı. Sonuçlarımız H _{2 O 2} tedavisi son aşama embriyoların (Şekil 4A, D) etkili endojen POD aktivitesini bastırmak olmadığını gösterdi. Buna karşılık, arka plan renklenmesi büyük ölçüde metanol inkübasyon (Şekil 4B, C, E, F) tutulan embriyolarda indirgendi. Birincil antikor embriyoların uygulama antikor boyama standart protokoller de tarif edildiği gibi NGS ve BSA ihtiva eden çözelti içinde bloke edildi önce. Bununla birlikte, yaprak biti embriyolar bakiye arka boyama ('- C' Şekil 3A) tespit edilmiştir. Bu sorun, in situ hibridizasyon ("- C" Şekil 3A) olarak DIG-etiketleme deneyleri için bir tampon seti tarafından verilen engelleme maddesi ile NGS / BSA değiştirildikten sonra çözüldü. Böylece DIG-B ile metanol ve inkübasyon ile post-fiksasyon sonuçlandırmakbloke edici ayıracı biti embriyolar arka lekelemenin azaltılması için gerekli her ikisi de.

PK işleme ve DIG-B engelleme reaktif kromogenik değil, aynı zamanda floresan yaklaşımlar kullanılarak etkin sinyal tespiti için değil, sadece gereklidir. Metanol-duyarlı bir epitopu için falloidinle veya boyama ile Aktin boyama, ancak, aktin ya da antikor doğal şekli yok edebilir, önceden tespit metanol ile tutulan embriyolarda çalışmaz. Floresan immün yaparken Bu duruma göre, bu tedavi kaçınılmalıdır. Apart metanol tedavi adımları ortadan kaldırarak gelen immunofloresan yaprak biti embriyolar çoklu etiketleme deneyleri verir. Örneğin, konfokal mikroskopi kullanılarak, germ hücreleri, çekirdekte mikrotüplerin, α-tubulin, mikrofilamentlerin F-aktin ve DNA bezelye yaprak biti Vasa1 proteini (ApVas1) eş zamanlı olarak işaretlenmiş ve (Şekil 5A, C) gözlemlenebildi. Kromo ile karşılaştırıldığındaEtiketleme için koşullar benimsemek. - mogenic metodu (Şekil 5B), bir floresan etiketli örnekleri kesit konfokal, erken yaprak biti embriyolar germ plazma ve cellularizing germ hücrelerinde ApVas1 (D "Şekil 5C ', D) olarak lokalize sinyallerin daha iyi çözünürlük sağlar Yukarıda tarif edilen germ hücreleri, uzanan germ bant segmentleri Engrailed / Invected proteini antikor 4D9 (Şekil 6) ile boyanmıştır. Bu da gösteriyor ki yönelik protokol, imüno-içeren kromojenik floresan yöntemler-olabilir etkili bir algılama sinyali uygulanabilir germline ve yaprak bitlerinin somatik hücre soyları, hem de.

Şekil 1. partenogenetik viviparous bezelye yaprak biti. (A) aseksüel viviparous kadın yetişkin çıkan bir ilk evre perisi. (B 12 arasındaki değişken olabilir. Bir ovaryol ucunda bir germarium (oklar), 1-2 oosit ve 5-7 embriyonik odaları bulunmaktadır. Gut ve kauda genellikle disseke yumurtalıklar ile ilişkilidir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Farklı gelişim aşamalarında yaprak biti embriyolar monte etmek için stratejiler Şekil 2. İllüstrasyon. Bir partenogenetik viviparous kadın yetişkin disseke ovaryol embriyonik gelişim (A) Anahat. Kısa oogenesis (germarial sahne ve aşamaları 0-2) embriyogenez (aşamaları 3-20) takip ediyor. Embriyojenezin Anahat: f sinsityal blastodermin arasında ormation (aşamalar 5/3); blastula (aşamalar 7/6); Gastrulasyon (aşamalar 8-10); germ bandının uzaması (aşamalar 11-14); katatrepsis (15 aşamaları); sonrası katatrepsis ve mikrop bant retraksiyon (aşamaları 16-17); organogenesis (18-20 aşamaları). Renk tuşları şeklin alt kısmında bulunmaktadır. (B, B ') Germarium ve 0-10 embriyolar aşamaları. Hiçbir lamel köprü gereklidir. (C, C ') 11-18 embriyolar Aşamaları. Bir lamel köprüsü gereklidir. (D, D ') 19-20 embriyolar Aşamaları. Çift lamel köprüler gereklidir. Lamel kaydırarak embriyoların Rolling gözlem farklı açılardan oluşturabilirsiniz. Lamelleri Boyutlar: 22 x 22 (B) 'de aa, (C)' de 18 x 18 mm ve (D). Lamelleri kalınlığı: 0.13 0.16 mm. Embriyonik evreleme Miura takip ark ¹² Kısaltmalar: g. Germarium; st: aşama..com / files / ftp_upload / 53883 / 53883fig2large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

. Şekil 3. Proteinaz K işleme ve farklı engelleme etkileri olan reaktif karşılaştırılması ön yumurta odaları solunda ise; Tüm görünümler dorsal olan (B ", C ', C") olarak gösterilen embriyolar dışında yan vardır. Embriyolar Tüm ApVas1 antikoru (seyreltme 1: 500) kullanılarak boyandı ve ApVas1 sinyalleri 10-20 saniye içinde geliştirilmektedir. Ok uçları germ hücrelerinin yerini göstermektedir. (A - C) Embriyolar proteinaz K (PK) tedavisinde olmadan. Germ hücrelerinde ApVas1 sinyalleri zor tespit edilir. (A '-' C, A "- C") embriyolar bloğa arka plan boyama Karşılaştırılması('- C' A) ve DIG Wash ve Blok Tamponu Set (DIG-B), (A "- C") ticari önleyici reaktifin NGS ve BSA ile ked. Arka plan anlamlı ("- C" A) gösterilen embriyolar azalır. Kısaltma: b: bakteri. Ölçek çubukları:. 100 mikron bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

. Embriyoların metanol Anterior ile Şekil 4. Aza arka plan boyama solunda; Tüm görünümler dorsal vardır. Embriyolar antikorun geçirgenliğini artırmak PK ile muamele edilir. Ok uçları germ hücrelerinin yerini göstermektedir. Tedavilerin (A, B, D, E) Karşılaştırmahidrojen peroksit _{(H2O 2)} ve metanol ile. Embriyolar, sadece sekonder antikor ile boyandı. _{H2O 2} tedavisi (w / v% 0.3, 10 dk): yüksek arkaplan (A, D); Metanol tedavisi (% 100, 60 dk): düşük arka plan (B, D). (C, F), metanol ile muamele edilmiş embriyoların Birincil antikor boyama. Metanol tedavi koşulları (B, D) 'de gösterilen embriyolar için kullanılanlar ile aynıdır. ApVas1 antikor tercihen embriyonik germ hücreleri etiketler. Ölçek çubukları:. 100 mikron bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Erken embriyolar üzerinde Şekil 5. İmmünfloresan boyama. (B) 'de: ve 1 - ApVas1 Antikorun seyreltilmesi oranları (D, A, C) içinde 1:50 bulunmaktadır. ApVas1, α-tubulin, F-aktin, ve nükleer DNA içerir (A) Boyama sinyalleri, farklı dalga boylarına sahip dört kanal kullanılarak tespit edilir. Sinyallerin renk tuşları rakamın altında gösterilir. Karşılaştırma için kromojenik bir sonucu (B) DIC görüntüsü. Evre-3 embriyo ApVas1 posterior lokalizasyonu (ok başları) kontrast yoğunluğu (C, C ')' de gösterildiği bu kadar açık değildir oysa ApVas1 germarium içinde zenginleştirilmiştir. (C, C ') yumurta posterior ApVas1 sinyallerinin zenginleştirilmesi. Yumurta odasının (ok başları) posterior bölgeye lokalize sinyaller görüntü istifleme tarafından geliştirilmiştir. F-aktin ve α-tubulin sinyalleri kısmen (posterior ApVas1 olanlar maske ÇünküC), tek-kanallı tarama ile elde edilmiş bir görüntüsüdür (C ')' de gösterilmektedir. Evre-4 embriyonun arka bölgede lokalize ApVas1 arasında - (D D '') Konfokal kesit. (D) ve (D ')' de gösterilen Çıkan ApVas1 sırasıyla yüzeyi ve merkezi odak düzlemlerinde tespit edilir. (D ") (D) ve (D ') aynı embriyodan tüm kesimlerinin birleştirilmiş görüntü Kısaltmalar: olarak: aster, fc, folikül hücreleri, poc, müstakbel oosit; sp. Iğ; tc, trofik kordonlar. Ölçek çubukları:. 10 mikron bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6. embriyonik segmentlere immün. BirYumurta odaları anterior solunda. PK ile muamele edilmiş embriyolar embriyo segmentleri ifade edilmiştir Engrailed / Invected karşı monoklonal antikor 4D9 ile boyanır. Sinyallerin renk tuşları rakamın altında gösterilir. (A, A '), bir sahne 13 embriyo üzerinde imüno lekeleme. (A), Engrailed / Invected, α-tubulin, F-aktine ve nükleer DNA boyamalar görüntüleri yığılmış konfokal görüntüsü. (A ') yalnızca Engrailed / Invected lekelenmesini gösteren bir konfokal görüntü. Diğer kanalların sinyallerin müdahalesi olmadan, sinyaller daha iyi görüntülenir. Aşamaları 13 ve sırasıyla gelişme 17, embriyo üzerinde (B, C) ​​Kromojenik boyama. (B) Sahne 13 embriyo. (C) Sahne 17 embriyo. Aşamalarında 13 ila 17, karın segmentleri artan sayıda 4D9 tarafından etiketlenir. (D) Negatif kontrol (-Ctrl) boyamaAlexa Fluor 633. ile konjuge sekonder antikor Neredeyse hiçbir immün sinyalleri primer antikor olmadan ovaryol üzerine tespit edilir yalnızca ing. Ancak, evre 7 ve yumurta odalarından 13 içinde bakteri (çizgi hat) otofloresans emisyon dalga boyu 488 nm tespit edilir. Kısaltmalar: A: karın; b: bakteriler; H: Baş; T: toraks. Ölçek çubukları:. 100 mikron bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

Biz bezelye yaprak biti A başarılı immün kritik uygun koşulları belirledi. Pisum, genomik ve gelişim çalışmalarında ^3,15 için gelişmekte olan bir model organizmadır. Doku geçirgenliğini artırarak ve arka plan boyama azaltmak için optimize edilmiş koşullar yoğunluğu ve sinyallerin özgüllüğünü geliştirilmiş. Bunlar, hücre zarlarında gözenekleri oluşturma ve spesifik olmayan bağlanma bloke edici antikor için aşamalar diğer hayvan modellerinde immün için standart protokollere göre farklılık göstermektedir.

Immün için ve in situ melezleme, proteinaz K (PK) sindirim doku geçirgenliğini ^16-19 artırmak için ortak yaklaşımların biridir. (1) PK sindirimi belirgin olmasına rağmen, tohum bandı uzatma (aşamalar 11-14) (Şekil 3B '', C '') ne partenogenetik viviparous embriyolar imüno sinyalleri geliştirilmiş: yaprak biti dokuların antikor boyama olarak, sonuçlar göstermektedirzayıf sinyaller de PK tedavisi (Şekil 3B, C) ​​yoksun embriyolar görünür; ve (2) PK sindirim itibaren katatrepsis embriyolar (15-20 evre) (Şekil 4C, F ve Şekil 6C) için zorunlu oldu. Önce katatrepsis için aseksüel doğuran embriyolar için yumurta odaları hacmi penetrasyon sorununun nedeni olası değildir, çünkü koydu yumurta-en olgun aseksüel yumurta chamber- boyutu neredeyse eşdeğer ikamet eden erken cinsel yumurtlayarak çoğalan embriyoların başarılı immün PK sindirim ²⁰ gerektirmez. Bu nedenle, tohum bandının uzama ve katlanır antikorun giriş engelleyebilir eşeysiz yumurta odalarının dar alanda (11 ila 14 evre), ve hücre membranları arasındaki gözenekler oluşturarak antikorun nüfuz edebilir PK Sıkışan embriyonik yapılar. Buna karşılık, cinsel yumurtalarda germ bandın doğrusal uzantısı bile lekeli neden açıklayabilirPK yokluğu. Vitellin zarf / koryon çıkarılması da antikora cinsel yumurtlayarak çoğalan embriyolar daha erişilebilir yapabilirsiniz. Embriyolar ¹⁹ cuticled kalın olduğundan katatrepsis sonra embriyolar (20 16 aşamaları) için PK tedavisi hem eşeysiz ve cinsel morphs için gerekli olan (Şekil 4C, F ve Şekil 6C).

Embriyonik yapıların bütünlüğünün veya sinyallerinin yoğunluğu tatmin edici değilse, Yine de, PK sindirim için önerilen durumu (10 dakika boyunca 1 ug / ml) daha fazla ayarlanması gerekir. Bu esas olarak partiden partiye değişebilir PK aktivitesine neden olur. Embriyonik dokular PK sindirimden sonra hasar görmesi durumunda, örneğin, PK konsantrasyonu 0.5 ug / ml 'ye indirgenebilir. Sinyal yoğunluğu zayıftır, benzer şekilde, 15-20 dakika inkübasyon uzatılması, böylece tavsiye edilir. 1.0 ug / ml konsantrasyonda, howe 20 dakikaya kadar uzamış PK inkübasyon tabi en olgun embriyolar (evre 20)ver, genellikle PK sindirim henüz tamamlanmamış olduğunu düşündüren, zayıf sinyalleri görüntüler. Uzun süreli sindirim boyama sinyalleri arttırır fakat aşamada tespit ekspresyon modelleri 18 embriyolar aşamada 20 embriyo benzerdir, özellikle de isteğe bağlı olabilir. Geliştirme aşamasında 20 embriyo ile karşılaştırıldığında, henüz vücut manikür az miktarda benzer morfolojiye sahip evre 18 embriyolar genellikle güçlü sinyal yoğunluğu elde edebilirsiniz.

Sinyal gelişimi sırasında, arka plan renklenmesi alt tabakalar ile çapraz reaksiyona girebilen endojen enzimlerin etkinliği ile yükseltilebilir. Bezelye yaprak biti embriyolar, sinyal alt tabakaların sindirilmesi için ortak antikor konjügatları, her ikisi de endojen alkalin fosfataz (AP) ve peroksidaz (POD) aktivitesi, belirlenmiştir. Endojen AP hidrolaz faaliyeti etkili bir levamizol ile embriyojenez içinde bastırılır edilebilir (veri gösterilmemiştir). Bununla birlikte,% 0.3-0.6 Hidrojen embriyoların tedavisiperoksit (H _{2 O 2)} tr sadece katatrepsis öncesinde endojen POD faaliyetini ortadan kaldırmak ama eski embriyolar (Şekil 4A, D) için yeterli değildi başladı. Metanol inkübasyon, endojen proteinlerin denatüre etmek için alternatif bir yaklaşım, yaprak bitleri ²¹ (Şekil 4B, D) 'de etkili olduğu gösterilmiştir. _{H2O 2,} farklı olarak, 30 dakika veya daha uzun bir uzun süreli inkübasyon sırasında zarar veren biti dokular, metanol sindirim ya da büyümesinin herhangi bir aşamasında (Şekil 4C, F) sırasında embriyoların deforme olmaz. Sonuç olarak, metanol yaprak biti embriyolar endojen POD aktivitesinin bastırmak için daha iyi bir alternatiftir. Artık arka plan boyama genellikle 4 metanol içinde manikür kalınlaşmış bir tabaka, O / N inkübasyon olgun embriyolar meydana geldiği tespit edilirse ° C uygun bizim için tecrübe-can daha endojen POD aktivitesini azaltır.

Kalıntı arka plan boyama saptandıbu normal eşek serumu (NDS), normal keçi serumu (NGS), büyükbaş hayvan serum albümini (BSA) ya da bunların karışımları ¹³ (Şekil 3A'-C ') gibi serum proteinleri ile bloke embriyolar. (- 'Şekil 3A' C ') aksine in situ hibridizasyon için kullanılan bir ticari verilen engelleme ayıracı, benimseyen, immün sırasında kalan arka belirgin olmak ⁵ elimine olabilir. Bloke edici tepkin madde katkı maddeleri özel olmakla birlikte, olasılıkla bezelye yaprak biti proteinlerinin spesifik olmayan epitoplar bloke olmayan serum proteinleri içerir. Engelleme reaktif de yeşil şeftali yaprak biti Myzus persicae hayvan serasında daha iyi çalıştı. Aynı şekilde, persicae PK sindirim ve metanol inkübasyon tatmin edici antikor penetrasyon ve arka plan azalma ile sonuçlandı M -. Iyileştirilmiş sonuçlara benzer A'da elde Pisum (veriler gösterilmemiştir). Biz koşulların Optimiz tahmined doku geçirgenliğini artırarak ve arka plan azaltmak için bir kromojenik boyama veya floresan kullanan olsun, diğer birçok yaprak biti türlerinin uygulanacaktır.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% hydrogen perxidase (H2O2)	Sigma-Aldrich	18304	For bleaching endogenous peroxidase of embryos.
4’6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542	For labeling the double-strand DNA. TOXIC. Wear gloves, dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure
4D9 anti-engrailed/invected mouse monoclonal antibody	Developmental studies hybridoma bank	AB_528224	For labeling the developing segments of embryo.
ApVas1 rabbit polyclonal antibody	Our laboratory	N/A	For labeling the aphid germline specific Vas1 protein in embryos. This antibody was made by our laboratory.
Austerlitz Insect pins	ENTOMORAVIA	N/A	For seperating each egg chambers from an ovariole. Size 000, BLACK ENAMELLED.
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	9048-46-8	For blocking the non-specific binding of antibodies.
Camera connted to compound microscope	Canon	EOS 5D	For photographing of aphid embryos.
Colorimetric 8 cell tray	Kartell Labware	357	For developing the staining signal of aphid embryos. Diameter 95 x 57 mm, cell depth 2 mm.
Compound microscope with DIC optics	Leica Microsystems	DMR	For photographing of aphid embryo mounted on the slides.
DIG Wash and Block Buffer Set	Sigma-Aldrich (Roche)	11585762001	For blocking the non-specific binding of antibodies. We diluted the 10x Blocking solution into 1x as blocking reagent.
Forceps	Ideal-tek	N/A	For dissection of ovaries from aphids. Manufacturer part No 5: 5 SA.
Glass dropper	N/A	N/A	For transfering ovaries of aphids from the splot plate to tubes. 150 mm of total length and 5 3/4" of tip length.
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	For clearing of aphid embryos and mounting.
Glycine	Bioshop	N/A	For blocking the enzyme activity of proteinase K (PK).
Goat anti-mouse IgG conjugated Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11017	For detection of primary antibody from mouse.
Goat anti-rabbit IgG conjugated Alexa Fluor 633	Invitrogen	A21072	For detection of primary antibody from rabbit.
Intelli mixer	ELMI laboratory equipment	RM-2M	For improving the thorughly reaction of reagents with ovaries.
Laser-scanning confocal microscopy	Leica Microsystems	SP5	For photographing of aphid embryo mounted on the slides with florecent tag.
methanol	Burdick and Jackson	AH2304	For bleaching endogenous peroxidase of embryos.
Microscope slides	Thermo scientific	10143560	For mounting of embryos. SUPERFROST ground edges, ca./env. 76 x 26 mm.
Microscope Cover glasses	Marienfeld	0101030	For mounting embryos on the slides. Size 18 x 18 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
Microscope Cover glasses	Marienfeld	0101050	For mounting embryos on the slides. Size 22 x 22 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
mouse monoclonal anti-alphaTubulin antibody (DM1A)	Santa Cruz Biotechnology	sc-32293	For labeling the distrbution of alpha-tubulin of cells.
Nail polish	N/A	N/A	For sealing the coverslips on the slides.
Normal goat serum (NGS)	Sigma-Aldrich	G9023	For blocking the non-specific binding of antibodies.
Paraformaldehyde (PFA)	VWR	MK262159	For fixation of aphid ovaries.
Phalloidin-TRITC	Sigma-Aldrich	P1951	For labeling the distrbution of F-actin on embryos.
Phosphate-buffered saline (PBS)	N/A	N/A	As isotonic solution for aphid ovaries.
Plastic dropper	N/A	N/A	For transfering ovaries of aphids from tube to cell tray. Size 3 ml.
Proteinase K	Merck	124678	For creating pores (punching) on the cell membrane and facilitating the access of antibodies.
Pyrex spot plate	N/A	N/A	For dissection and color reactions of aphid ovaries under microscopy. Each cavity with diameter 22 mm and  depth 7 mm.
SIGMAFAST 3,3’-diaminobenzidine (DAB) tablets	Sigma-Aldrich	D4168	For developing of substrated signals. Also called DAB peroxidase substrate tablet set.
Stereo microscope	Leica Microsystems	EZ4	For dissection and observation of aphid ovaries.
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	T8787	For creating pores (punching) on the cell membrane.
VECTASHIELD Elite ABC Kit (Rabbit IgG)	Vector laboratories	PK-6101	For enhancement of the signal. Including of biotinylated goat anti-rabbit IgG secondary antibody, A and B reagents.
VECTASHIELD mounting medium	Vector laboratories	H1000	For clearing of aphid embryos and mounting.