Identifisering av kritiske forhold for Farging i Pea Aphid Embryoet: Økende Tissue Permeabilitet og Avtagende bakgrunnsfarging

Abstract

Ert aphid Acyrthosiphon Pisum, med en sekvensert genom og rikelig fenotypisk plastisitet, har blitt en ny modell for genomisk og utviklingsstudier. Som andre bladlus, A. Pisum forplante seg raskt via parthenogenetic viviparous reproduksjon, hvor embryoene utvikle innenfor egg kamre i en samlebånds mote i ovariole. Tidligere har vi etablert en robust plattform for hel-mount in situ hybridisering tillater påvisning av mRNA uttrykk i bladlus embryoer. For å analysere uttrykket av protein, men etablerte protokoller for farging de ovarioles av aseksuelle vivipare bladlus ga ikke tilfredsstillende resultater. Her kan vi rapportere forhold som er optimalisert for å øke vev permeabilitet og redusere bakgrunnsfarging, som begge var problemer ved søknad etablerte tilnærminger. Optimaliser omfatter: (1) inkubering av proteinase K (1 ug / ml, 10 min), noe som ble funnet vesentlig feller antistoff penetrasjon i midten og sent stadium bladlus embryoer; (2) erstatning av normalt geiteserum / bovint serumalbumin med en blokkerende reagens leveres av en Digoxigenin (DIG) -basert buffer satt, og (3) anvendelse av metanol i stedet for hydrogenperoksid (H ₂ O ₂₎ for bleking av endogen peroksidase; som i betydelig grad reduserte bakgrunnsfarging i bladlus vev. Disse kritiske forhold optimalisert for immunofarging vil tillate effektiv påvisning av genprodukter i embryoene av A. Pisum og andre bladlus.

Introduction

Bladlus er hemipteran insekter med små (1-10 mm) myke kropper. De lever på planter ved å suge phloem sap med piercing munndeler. I tillegg er de avhengige en obligat endosymbiotic bakterien, Buchnera aphidicola, å syntetisere essensielle aminosyrer som er mangelfull i phloem sap kosthold. Bladlus har en kompleks livshistorie som inkluderer parthenogenetic viviparous reproduksjon i løpet av våren og sommeren lang dag fotoperioder og seksuell oviparous reproduksjon utløst av kort-dagers fotoperioder der de lå et begrenset antall overvintrende egg ^1,2. Våren disse eggene klekkes til å produsere den første generasjonen av alle kvinnelige bladlus (fundatrices), etter mange runder med parthenogenetic reproduksjon til høsten. Konjunktur parthenogenesis i bladlus, hvor aseksuelle og seksuelle faser veksler i den årlige livssyklus, har vært ansett som en evolusjonær nyhet ^1,2. I parthenogenetic vivipare bladlusTar embryogenese sted innenfor egg kamrene i eggstokkene tubuli (ovarioles). I motsetning seksuelle eggleggende embryoer utvikler seg i de befruktede eggene. Bortsett fra reproduktiv plastisitet, kan bladlus vise transgenerational vinge polyphenism: reaksjon på overfylte signaler og rovdyr trusler, kan unwinged aseksuelle kvinner viviparously produsere bevingede avkom for langdistanse migrasjon. Offentliggjøring av genomsekvens av ertebladlus Acyrthosiphon Pisum -den første genomsekvens for en basal hemimetabolous insekt tillater videre utforskning av reproduktiv plastisitet, vinge polyphenism, og andre funksjoner, inkludert insekt-plante-interaksjoner, viral vectoring og symbiose i bladlus på et molekylært basis ^tre.

I tillegg til det sekvenserte genomet, verktøy for karakterisering av gen-ekspresjon og funksjon som er nødvendig for å fremme ert bladlus som et modent modellorganisme ^4. Vi har beskrevet robuste protokoller av hel-mount 5-7. RNA-interferens (RNAi) via dobbeltrådet RNA injeksjon og fôring har blitt brukt for genet Slå i bladlus nymfer og voksne, men stabile forhold for genet knockdown i embryoene har ennå ikke blitt rapportert ^8-10. Farging, et antistoffbasert tilnærming som kan påvise proteinekspresjon i prøvene før og etter RNAi knockdown, har blitt utført på ert bladlus embryoer ^11-13. Men økningen av vev permeabilitet og eliminering av bakgrunnsfarging er foreløpig ikke tilfredsstillende ved bruk av standardprotokoller for farging i de aseksuelle vivipare embryoer av erte bladlus. For eksempel fant vi at penetrasjon av antistoff til vev redusert i gastrulating embryoer (iscenesetter 8-10), og at embryoer med morfologisk identifiserbare lem knopper (trinn 13-14) var knapt gjennomtrengelig for antistoff. I tillegg ble bakgrunnsfarging visualiseres i aseksuell viviparooss ert bladlus embryoer farget ved hjelp av antistoff mot kimlinje markør Vasa samt at mot Engrailed / Invected protein uttrykt i embryonale segmenter ^12,13. Faktisk bakgrunnsfarging var fremdeles synlig i embryoer farget med det sekundære antistoff alene.

For å øke permeabilitet uten å ødelegge integriteten av bladlus vev, vi omhyggelig titrert konsentrasjonen av proteinase K og bestemmes optimale betingelser for vev fordøyelse på bladlus embryoer. For å unngå ikke-spesifikk farging i ertebladlus, søkte vi for forbindelser som effektivt kan blokkere embryoer og hemmer aktiviteten av endogen peroksidase (POD), et enzym som anvendes for forsterkning av signaler i løpet av immunfarging. En blokkerende reagens leveres av en Digoxigenin (DIG) -basert buffersett, heller den tradisjonelt brukt normalt geiteserum (NGS) / bovint serumalbumin (BSA), betydelig redusert bakgrunnsfarging. Videre metanol ble funnet å inhibet endogene POD-aktivitet mer effektivt enn hydrogenperoksid (H ₂ O _2). Detaljer om disse bladlusspesifikke vilkår for farging på embryo vil bli beskrevet i de neste avsnittene.

Protocol

1. Culture of Bladlus

MERK:. Laboratoriet stamme av parthenogenetic viviparous ertebladlus En Pisum ble opprinnelig samlet i den sentrale Taiwan og har blitt oppdratt på vertsplanter (hagen ert Pisum sativum eller bred bønne hestebønne) etter lang dag daglengde for mer enn 300 generasjoner (én generasjon: ~ 10 dager).

1. Spiring av frø
   1. Bløtlegg frøene av vertsplanter i vann fra springen i 3-5 dager på RT. Etterfyll med rent vann en gang per dag.
      MERK: Alternativt kan sette frø av vertsplanter rett inn fuktig jord indusere spiring også.
   2. Grow 10 spirende frø i en liten beholder (9 cm diameter x 7 cm høye) med jord i vekstkammeret i henhold lysperiode 16 timers lys / 8 timers mørke ved 20 ° C.
   3. Ca 10 dager etter at veksten begynner, overføre bladlus på planter som høyden er mer enn 8 cm.
2. Overføring av Bladlus Hold hver pott av planter innenfor en 1 liters glassbeger, overføre 8 voksne bladlus på planter ved hjelp av en pensel, og deretter forsegle beger med en luft-gjennomtrengelig dekke slik som gasbind mesh for å hindre bladlus fra å rømme.
3. Inkuber bladlus i et vekstkammer i henhold lysperiode 16 timers lys / 8 timers mørke ved 20 ° C. Vanne hver plante pott av planter en gang hver dag.
4. For å få den neste generasjonen av bladlus, gjenta trinn 1.1.3-1.2.2 ti dager etter den primære bladlus overføring.

2. Dissection og Fiksering av Eggstokkene

1. Tilbereder 4% paraformaldehyd (PFA) på 1 x fosfatbufret saltvann (PBS) som fikseringsbuffer.
2. Fyll en brønn på en spot plate med PFA (ca 500 mL), plassere plate under en stereo mikroskop ved lav forstørrelse, og senk en voksen bladlus i PFA for disseksjon.
3. Dissekere eggstokkene ved å holde hodet og magen med ett sett med tang, klippe opp ryggskjellaget i magen, og dra eggstokkene bort fra bukhulen.
4. Fix tre par av ovarier i et 1,5 ml rør inneholdende 1 ml av PFA ved RT i 20 min.
5. Dekanter fiksering buffer med en overførings pipette (enten glass eller engangs) og vask eggstokkene med 0,2% TritonX-100 i 1 x PBS (PBST) 3 ganger i 10 min hver gang. Mild risting på en mikser / rotator (rotasjonsvinkel: 60 ° (F60) / rotasjonshastighet: 8 RPM) anbefales for både fiksering og vasking.

3. Behandling med proteinase K (PK) å øke permeabiliteten av embryonale vev

MERK: PK behandling påføres embryoer fra bakterie bandet forlengelse framover (stadium 11 av utvikling). For yngre embryoer, er dette trinnet valgfritt.

1. Serielt fortynne stamløsning av PK (10 mg / ml) med 1 x PBS til arbeidskonsentrasjon 1 pg / ml.
2. Inkuber eggstokkene med 1 ug / ml PK (ca. 500 ul) i 10 minutter med mild rysting.
3. Dekanter PK solutipå og deretter vaske eggstokkene med 700 mL av glycin (2 mg / ml) 3 ganger i 5 minutter hver.
4. Vask eggstokkene med 0,2% PBST to ganger i 10 minutter hver.
5. Fiks eggstokkene igjen med fikseringsbuffer i 15 min ved RT med mild rysting.
6. Kast supernatanten og vask eggstokkene med 0,2% PBST to ganger i 10 minutter hver.

4. Metanol Inkubasjon for å undertrykke endogent peroksidase (POD) aktivitet

MERK: Metanol inkubasjon brukes ikke på embryoer utsatt for phalloidin flekker eller antistoff epitoper som er metanol sensitive.

1. Serielt dehydrere eggstokkene med forskjellig andel av metanol i 0,2% PBST (v / v: 1: 3, 1: 1, 3: 1) ved å inkubere eggstokker ved hver konsentrasjon av metanol-løsning i 10 minutter med svak omrøring.
2. Dehydrere eggstokkene med 100% metanol i 1 time ved RT med mild rysting.
   MERK: Tilfredsstillende resultater av flekker kan fortsatt fås fra bladlus vev som ble lagret i 100% metanol ved -20 &# 176 C i en måned.
3. Serielt rehydrere eggstokkene med forskjellig andel av metanol i 0,2% PBST (v / v 3: 1, 1: 1, 1: 3) ved å inkubere eggstokker ved hver konsentrasjon av metanol-løsning i 10 minutter med svak omrøring.

5. antistoffarging

1. Fortynne 10x blokkering løsning fra DIG-basert buffer sett (-B DIG) til 1x.
   MERK: 1x DIG-B-blokkerende løsning er mer effektive for å redusere farging bakgrunn enn standard blokkerende reagens bestående av 5% (volum / volum) normalt geiteserum (NGS) og 0,5% (v / v) bovint serumalbumin (BSA ) i 0,2% PBST.
2. Inkuber eggstokkene med 1x DIG-B-blokkerende løsning for 2,5 til 4 timer ved romtemperatur eller O / N ved 4 ° C med mild risting.
   MERK: For tre par eggstokkene i en 1,5 ml tube, er 200 mL minimumsvolum for prøve blokkering og antistoffarging.
3. Dekanter supernatanten og erstatte med fersk 1x DIG-B blokkering løsning som inneholder primært antistoff ved passende fortynningenepå forholdet. Flekk eggstokkene i 4 timer ved RT eller O / N ved 4 ° C med mild risting.
   MERK: For eksperimentet beskrevet her, kan du bruke følgende optimale fortynninger av primære antistoffer: (1) ApVas1 antistoff: 1: 500 for kromogen farging, 1:50 for immunfluorescens farging; (2) anti-tubulin α antistoff: 1: 500; (3) 4D9 monoklonalt antistoff: 01:25.
4. Vask eggstokkene med 0,2% PBST 4 ganger i 15 minutter hver.
5. Inkuber eggstokkene med 1x DIG-B-blokkerende løsning i 1 time ved RT med mild rysting.
6. Dekanter supernatanten og erstatte med fersk 1x DIG-B blokkering løsning som inneholder sekundære antistoff på passende fortynning forholdet. Flekk eggstokkene i 4 timer ved RT eller O / N ved 4 ° C med mild risting.
   1. Bruke følgende fortynningsforhold sekundære antistoffer: (1) For immunofluorescens farging: 1: 500 for Alexa Fluor 633 geit-anti-kanin-IgG eller Alexa Fluor 488 geit anti-mus IgG; (2) For kromogent farging: 1: 200 for biotinylert geit-anti-kanin-IgG.
      MERK: biotinylert sekundært antistoff anvendes for å kommunisere med avidin-biotin-kompleks (ABC) i substrat-baserte (kromogent) påvisning, gjennom hvilken fargesignalene blir betydelig forsterket.
   2. For immunfluorescens farging, gjennomføre farging i mørket, fordi det sekundære antistoff er lysfølsom.
7. Vask sekundært antistoff med 0,2% PBST 4 ganger i 10 minutter hver.

6. Kjerne- og F-aktin Farging

MERK: Dette er kun søkt om immunfluorescens farging.

1. Flekk eggstokkene med PBST inneholdende 0,2% DAPI (2 ng / mL) og Phalloidin-TRITC (100 nM) i 2 timer ved romtemperatur i mørket.
2. Vask eggstokkene med 0,2% PBST 4 ganger i 10 minutter hver.
3. Inkuber eggstokkene med monteringsmedium O / N ved 4 ° C med mild risting.

7. Signal Development

MERK: Dette er kun søkt om kromogen farging.

1. Forbered 100 ulreagens avidin-biotin-kompleks (ABC) for å forsterke signalene ved tilsetning av 1 pl av reagens A (avidin) i 98 mL av 0,2% PBST, grundig blanding via forsiktig pipettering, og tilsetning av 1 pl av reagens B (biotin konjugert med pepperrot peroksidase ), etterfulgt av umiddelbar blanding. Inkuber blandingen i 30 minutter ved romtemperatur med mild rysting.
2. Inkuber eggstokkene (inkludert de dissosierte egg kamre) i blandingen av reagensene A og B i 30 minutter ved RT med mild rysting.
3. Vask av blandingen av reagensene A og B med 0,2% PBST 4 ganger i 10 minutter hver.
4. Overfør eggstokkene nedsenket i PBST til en brønn på stedet plate med en plast dropper.
5. Forbered substrat oppløsning av 3,3'-Diaminobenzidin (DAB): Løs opp en DAB tablett pluss en annen inneholdende en urea hydrogenperoksyd i 1 ml _DDH 2 O via kraftig virvling i 1 min.
   MERK: DAB, en utløsende substrat av peroksidase, er et populært kromogenløsningen for farging. Den produserer en bregen og uløselig bunnfall etter å ha blitt oksydert ved peroksidase. Svake signaler kan forsterkes ved tilsetning av nikkelklorid til substratet oppløsning (sluttkonsentrasjon 0,05 til 0,08%).
6. Fjern det gjenværende oppløsning PBST i brønnen og fyll med 100 ul av DAB-substrat-løsning for signalutvikling.
7. Overvåke intensiteten av signaler under et stereo mikroskop ved lav forstørrelse.
8. Stoppe reaksjonene ved å fjerne DAB-løsning, etterfulgt av påfylling med 1 x PBS umiddelbart. Gjenta vaske to ganger.
9. Overfør eggstokkene tilbake til 1,5 ml rør og vask deretter med 1 x PBS eller PBST to ganger i 15 minutter hver.
10. Inkuber eggstokkene hos et glycerol-basert monteringsmedium (70% glycerol) O / N ved 4 ° C med mild risting.

8. Montering av Aphid Embryoet

MERK: Tykkelsen på bladlus embryoer varierer mellom stadier av utviklingen. Monterings strategier er derfor endret for å passe tidlig (germaria og iscenesetter 0-10), mid (stadier11-18), og sene embryoer (faser 19-20), som er vist i figur 2B - D. Embryonic iscenesettelse fulgt Miura et al. ¹²

1. Overfør eggstokkene sammen med monteringsmedium til cellen brett med plast dropper og observere prøvene under en stereo mikroskop ved lav forstørrelse.
2. Skjær calyces forbundet med den laterale oviduct hjelp insekt pins og deretter overføre en isolert ovariole til et tomt glass godt med en dropper. Utgjør den endelige volumet til 50-100 mL bruker monteringsmedium.
3. Overføre en ovariole på lysbilde med et glass dropper og deretter dissekere egg kamre bruker insektnålene.
   MERK: For embryoer eldre enn stadium 6 av utviklingen, er separasjon av egg kamre foreslo; for germaria og de to første egg kamre som er yngre enn 6 stadium, er separasjon valgfritt.
4. Flytte en dissekert egg kammer til en ren lysbilde ved hjelp av et glass dropper.
5. Sett en dekkglass (størrelse: 22 x 22mm) i løpet av de dissekerte germaria eller egg kamre (inneholder embryoer på stadier 1-10 av utvikling) sakte for å unngå bobler.
   1. Mount egg kamre (som inneholder embryo på trinn 11-18 for utvikling) på et lysbilde med ensidig dekk broen og plassere en annen dekkglass (størrelse: 18 x 18 mm) på toppen av prøven.
   2. Mount egg kamre (som inneholder embryo eldre enn stadium 19 av utvikling) på et lysbilde med dobbeltsidig dekk broen og plassere en annen dekkglass (størrelse: 18 x 18 mm) på toppen av prøven.
6. Fylle plassen under toppen dekkglass med monterings media for å unngå å tørke prøven.
7. Mildt rulle embryo ved å skyve dekkglass for å få den riktige retningen for observasjon.
8. Forsegle rundt kanten av dekkglass (inkludert brua Dekk) med neglelakk.

9. Imaging Analyse

1. Foto differensial interferens kontrast (DIC) bilder av hel-mount embryoer med en forbindelsnd mikroskop utstyrt med DIC optikk og en tørr objektivlinse (10X, 20X, 40X) er koblet til et kamera. Installer programvare for bildeoverføring mellom kameraet og datamaskinen ved hjelp av produsentens instruksjoner.
2. Tilegne projeksjoner av de fluorescensmerkede embryoer med en laser-scanning konfokalmikroskop ^14. Følg produsentens instruksjoner for å fotografere, z-stabling, og 3D-prosjektering med bildebehandlingsprogrammer.
   1. Snu lysbilde opp ned, finn montert prøven med 10X objektiv, og sirkle prøven området med et fint oljet basert penn.
      MERK: Dette gjør identifisere prøven lettere når du søker etter det gjennom målene for et konfokal mikroskop.
   2. Tilsette en dråpe olje på toppen av dekkområdet hvis motsatte side er merket som beskrevet i 9.2.1.
3. Finn fokusplanet på 40X olje nedsenking målsetting og deretter bytte til en 63X olje-nedsenking objektiv. Manuelt flytte finfokusen kontrollen opp og gjørewn å fange de beste fokalplanet.
   MERK: For å observere strukturelle detaljer om germaria og tidlig embryo, anbefaler vi å bruke 40X mål eller de med høyere forstørrelse.
4. Skann embryoet i ulike eksitasjon kanaler og få en z-stack bilde.
   MERK: For ert aphid vev, redusere tykkelsen på hver optisk delen ned til 1,5 mikrometer eller mindre.

Representative Results

I denne studien, utførte vi hel-mount immunofarging på befruktede egg av aseksuelle ert bladlus (Figur 1a). Disse hunnene produsere avkom parthenogenetically og viviparously. Disse kvinnelige fostre utvikler innen egg kamrene i eggstokkene tubuli (ovarioles) (Figur 1B og Figur 2A). Før mikroskopi, de dissekerte ovarioles er flekker mål; er imidlertid separeringen av egg kamre som kreves for observasjon av embryoer under et mikroskop (figur 2B - D).

Økning av vev permeabilitet

Proteinase K (PK) behandling er en standard tilnærming for å styrke vev permeabilitet, men for embryo av enkelte modellorganismer-eksempel Caenorhabditis elegans (nematode), bananflue (fly), og Danio rerio (sebrafisk) -dette trinnet er valgfritt. I ert aphid, er kravet for PK rensetrinn avhengig: for germaria og embryo før gastrulation (faser 0-7), kan PK behandling utelates; men for embryoer henhold germband forlengelse (trinn 11) eller i senere stadier dette trinnet er sterkt anbefalt. For eksempel, i løpet av midten av embryogenesen signaler ble knapt påvises i embryoer uten PK-behandling (figur 3A - C). I motsetning til dette, ble signalintensitet betydelig forbedret i embryoer som er utsatt for nedbrytning PK (figur 3A '- C', A "- C").

Reduksjon av bakgrunnsfarging

Et høyt nivå av endogen peroksidase (POD) aktivitet ble identifisert i embryonale vev av bladlus. For å undertrykke denne enzymaktivitet ble de paraformaldehyd-fikserte embryoer inkuberes i nærvær av hyhydrogenperoxyd (H ₂ O _2), et vanlig reagens for oksidasjon av POD. Våre resultater viste at H _to O _to behandling ikke undertrykke aktiviteten av endogent POD effektivt i de sene stadier av embryoer (figur 4A, D). I motsetning til dette ble bakgrunnsfarging i stor grad redusert i embryoer som utsettes for metanol inkubasjon (figur 4B, C, E, F). Før påføring av det primære antistoff embryoene ble blokkert i oppløsning inneholdende NGS og BSA, som beskrevet i standardprotokoller for antistoffarging. Imidlertid ble restbakgrunnsfarging på bladlus embryoer detektert (Figur 3A '- C'). Dette problemet ble løst etter utskifting NGS / BSA med blokkering reagens levert av en buffer sett for DIG-merking eksperimenter slik som in situ hybridisering (figur 3A "- C"). Vi konkluderer derfor at post-fiksering med metanol og inkubasjon med DIG-Bblokkerer reagens er både viktig for å redusere bakgrunnsfarging i bladlus embryoer.

PK behandling og den DIG-B-blokkerende reagens som er nødvendig ikke bare for effektiv signaldeteksjon ved hjelp av de kromogene men også fluorescerende tilnærminger. Actin farging med phalloidin eller farging for metanol følsomme epitop, men virker ikke i embryoer som er utsatt for pre-fiksering med metanol, noe som kan ødelegge den naturlige form av aktin eller antistoffer. Følgelig bør denne behandlingen unngås ved utførelse av fluorescens-immunfarging. Bortsett fra å eliminere metanol behandlingstrinn immunfluorescens tillater multi-merking eksperimenter i bladlus embryoer. Ved hjelp av konfokal mikroskopi, for eksempel, kan ertebladlus Vasa1 protein (ApVas1) i kjønnsceller, α-tubulin i mikrotubuli, F-aktin i mikrofilamenter, og DNA i kjerner samtidig bli merket og visualisert (figur 5A, C). I sammenligning med CHROmogenic metode (figur 5B), konfokal seksjonering av fluorescensmerkede prøvene gir bedre oppløsning på lokaliserte signaler som ApVas1 i bakterie plasm og cellularizing kjønnsceller i tidlig bladlus embryoer (figur 5C ', D - D "). Vedta vilkårene for merking kjønnsceller som er beskrevet ovenfor, den Engrailed / Invected protein i segmenter av det forløpende bakterie bånd ble også farget med antistoffet 4D9 (figur 6). Dette viser at protokollen for immunofarging-, inkludert kromogene og fluorescerende metoder-kan effektivt brukes til å signaldeteksjon både kimlinje og somatiske celle linjene i bladlus.

Figur 1. Parthenogenetic viviparous ert bladlus. (A) En første stadium nymfe dukker opp fra en aseksuell viviparous kvinnelig voksen. (B 12. En ovariole inneholder en germarium i spissen (piler), 1-2 ubefruktede egg og 5-7 embryonale kamre. Gut og cauda er vanligvis forbundet med de dissekerte eggstokkene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. Illustrasjon av strategier for montering bladlus embryoer på ulike stadier av utviklingen. (A) Outline av embryoutvikling i ovariole dissekert fra en parthenogenetic viviparous kvinnelig voksen. Kort oogenesen (germarial scenen og stadier 0-2) etterfølges av embryogenese (trinn 3-20). Omrisset av embryogenese: f ormasjon av syncytialt blastoderm (trinn 3-5); blastulation (trinn 6-7); gastrulation (trinn 8-10); forlengelse av bakterie-band (trinn 11-14); katatrepsis (iscenesetter 15); post katatrepsis og bakterie bandet inntrekk (trinn 16-17); organogenesen (iscenesetter 18-20). Fargetastene er ved bunnen av figuren. (B, B ') Germarium og iscenesetter 0-10 embryoer. Ingen dekk bro er nødvendig. (C, C ') Stages 11-18 embryoer. Et dekkglass bro er nødvendig. (D, D ') Stages 19-20 embryoer. Doble dekk broer er påkrevd. Rolling embryoene ved å skyve dekkglass kan lage forskjellige vinkler for observasjon. Størrelser av Dekk: 22 x 22 mm i (B), 18 x 18 mm i (C) og (D). Tykkelsen på dekkglass: 0,13 til 0,16 mm. Embryonic iscenesettelse fulgt Miura et al ¹² Forkortelser: g. Germarium; st: scenen..com / filer / ftp_upload / 53883 / 53883fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

. Figur 3. Proteinase K-behandling, og sammenligning av reagenser med forskjellige blokkerende effekt Fremre av egg kamre er til venstre; alle visninger er unntatt lateral embryoer som er vist i (B ", C ', C"), som er rygg. Embryoer er alle farget bruker ApVas1 antistoff (fortynning 1: 500) og signaler om ApVas1 er utviklet innen 10-20 sek. Pilspisser indikerer plasseringen av kjønnsceller. (A - C) Embryoer uten behandling med proteinase K (PK). ApVas1 signaler i kjønnsceller er knapt oppdaget. (A '- C', A "- C") Sammenligning av bakgrunnsfarging i embryoer blocked med NGS og BSA (A '- C') og av den kommersielle blokkering reagens i DIG Vask og Block Buffer Set (DIG-B) (A "- C"). Bakgrunnen er betydelig redusert i embryoer som er vist i (A "- C"). Forkortelse: b: bakterier. Skala barer:. 100 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

. Figur 4. Minimizing bakgrunnsfarging med metanol Anterior av embryoer er til venstre; alle visninger er rygg. Embryoer blir behandlet med PK for å øke permeabiliteten av antistoff. Pilspisser indikerer plasseringen av kjønnsceller. (A, B, D, E) Sammenligning av behandlingermed hydrogenperoksyd (H ₂ O ₂₎ og metanol. Embryoer blir bare farget med sekundært antistoff. H _to O _to behandlings (0,3% vekt / volum, 10 min): høy bakgrunn (A, D); metanol behandling (100%, 60 min): lav bakgrunn (B, E). (C, F) Primært antistoff farging på befruktede egg ble behandlet med metanol. Betingelser metanol behandling er identiske med de som brukes for embryoer som er vist i (B, E). Den ApVas1 antistoff etiketter fortrinnsvis de embryonale kjønnsceller. Skala barer:. 100 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5. Immunfluorescens flekker på tidlige embryoer. (A, C - D) og 1: 500 i (B). (A) Farging signaler, som inkluderer ApVas1, α-tubulin, F-aktin, og kjerne-DNA, blir oppdaget med fire kanaler med ulike bølgelengder. Fargetastene av signaler er vist nederst i figuren. (B) DIC bilde av en kromogen resultat for sammenligning. ApVas1 er beriket i germarium mens kontrastintensiteten bakre lokalisering av ApVas1 (pilspisser) i trinnet 3-embryo er ikke så klart som den som er vist i (C, C '). (C, C ') Anrikning av ApVas1 signaler i den bakre egg. Signaler lokalisert til den bakre delen av egget kammeret (pilhoder) er forsterket av bilde stabling. Fordi signalene fra F-aktin og α-tubulin delvis maskere de av ApVas1 i bakre (C), et bilde produsert ved enkelt-kanalisert skanning er vist i (C '). (D - D '') Confocal seksjonering av ApVas1 lokalisert i det bakre området av scenen-4 embryo. Bildene i (D) og (D ') er ApVas1 detektert i overflaten og sentral fokalplanene, respektivt. (D ") er det sammenslåtte bildet av alle deler fra samme embryo som (D) og (D ') Forkortelser: som: aster, fc, hårsekkceller, poc, prospektiv eggcelle, sp. Spindel, tc, trofiske ledninger. skala barer:. 10 mm Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6. Farging på embryonale segmenter. Anutside på egg kamre er til venstre. PK-behandlede embryoer blir farget med det monoklonale antistoff 4D9 mot Engrailed / Invected, som er uttrykt i embryoniske segmenter. Fargetastene av signaler er vist nederst i figuren. (A, A ') Immunofluorescens flekker på en scene-13 embryo. (A), et konfokalt bilde stablet fra bilder av Engrailed / Invected, α-tubulin, F-aktin, og nukleært DNA stainings. (A ') en konfokalt bildet som viser farging av Engrailed / Invected bare. Uten forstyrrelser av signaler fra andre kanaler, er signalene bedre vises. (B, C) ​​Chromogenic flekker på befruktede egg på stadier 13 og 17 i utvikling, henholdsvis. (B) Stage-13 embryo. (C) Trinn-17 embryo. Fra trinn 13 og 17, er det økende antall segmenter i magen merket med 4D9. (D) Negativ kontroll (-Ctrl) flekkening bare med sekundært antistoff konjugert med Alexa Fluor 633. Nesten ingen farging er registrert signaler på ovariole uten primære antistoff. Imidlertid autofluorescens av bakterier (stiplet linje) i stadium 7 og 13 over egg kamre blir detektert ved eksitasjonsbølgelengden 488 nm. Forkortelser: A: magen; b: bakterier; H: hodet; T: thorax. Skala barer:. 100 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Vi identifiserte optimale forhold kritiske til vellykket farging i ertebladlus A. Pisum, en ny modellorganisme for genomisk og utviklingsstudier ^3,15. Optimaliserte betingelser for å øke vev permeabilitet og reduserer bakgrunnsfarging forbedret intensitet og spesifisiteten av signaler. De skiller seg fra standard protokoller for farging i andre dyremodeller i fremgangsmåten for å lage porer i cellemembraner og blokkere ikke-spesifikk antistoffbinding.

For farging og in situ hybridisering, er proteinase K (PK) fordøyelse en av de vanlige fremgangsmåter for å øke vev permeabilitet ^16-19. I antistoff-farging av bladlus vev, våre resultater viste at: (1) PK fordøyelse betydelig forbedret immunfarging signaler i parthenogenetic vivipare embryoene i løpet av bakterie båndet forlengelse (trinn 11-14) (figur 3B '', C ''), selvsvake signaler var fremdeles synlig i embryoer blottet for PK behandling (Figur 3B, C); og (2) PK fordøyelsen var obligatorisk for embryoer fra katatrepsis framover (iscenesetter 15-20) (figur 4C, F og figur 6C). For aseksuelle vivipare embryo før katatrepsis, er volumet av egg kamre usannsynlig årsaken til penetrasjon problem fordi vellykket farging på tidlig seksuell eggleggende embryoer som er bosatt i de lagt egg-som er nesten tilsvarende størrelse som den mest modne aseksuell egg kammer- krever ikke PK fordøyelsen ^20. Derfor (trinn 11 til 14) elongating og bretting av bakterie båndet i den begrensede plass av aseksuelle egg kamre kan hindre inngangen av antistoff, og det er PK som tillater inntrengning av antistoff ved å skape porer i cellemembraner mellom fastkjørte embryonale strukturer. Derimot, kan den rette linjen forlengelse av bakterie bandet i de seksuelle egg forklare hvorfor det er farget selv ifraværet av PK. Fjerning av vitelline konvolutt / chorion kan også gjøre seksuelle eggleggende embryoer mer tilgjengelig for antistoff. For embryoer etter katatrepsis (trinn 16 til 20), er avgjørende for både aseksuelle og seksuelle morphs PK behandling fordi embryoer er tykke cuticled ^{19 (Figur} 4C, F og figur 6C).

Ikke desto mindre, den foreslåtte betingelse for PK fordøyelse (1 ug / ml for 10 min) krever videre justering dersom integriteten til embryonale strukturer eller intensiteten av signalene ikke er tilfredsstillende. Dette er hovedsakelig forårsaket av PK aktivitet som kan variere fra parti til parti. For eksempel, hvis embryonale vev blir skadet etter PK fordøyelse, konsentrasjon av PK kan reduseres til 0,5 ug / ml. Likeledes, hvis signalintensiteten er svak, forlengelse av inkubering i 15-20 min er således anbefalt. De mest modne embryoer (stage 20) utsatt for langvarig PK inkubasjon opp til 20 min på 1,0 mikrogram / ml konsentrasjon, However, vanligvis vise svake signaler, noe som tyder på at PK fordøyelsen er ennå ufullstendig. Langvarig fordøyelse kan forbedre fargings signaler, men er valgfritt, spesielt når ekspresjonsmønster som oppdages i trinnet 18 embryoer er lik de i den fasen 20 embryoer. I sammenligning med embryoer på scenen 20 av utviklingen, scene 18 embryoer med analogt morfologi ennå med mindre mengde kroppen skjellaget generelt kan gi sterkere signal intensitet.

Under signal utvikling, kan bakgrunnsfarging være forhøyet ved aktiviteten av endogene enzymer som kan kryss-reagere med substratene. I ert bladlus embryoer, aktivitet av den endogene alkalisk fosfatase (AP) og peroksidase (POD), som begge er vanlige antistoffkonjugater for bearbeider signal substrater, ble detektert. Hydrolase aktivitet av den endogene AP kan bli effektivt undertrykkes i løpet av embryogenesen levamisol (data ikke vist). Likevel behandling av embryoer med 0,3-0,6% hydrogen peroksyd (H ₂ O ₂₎ kan bare eliminere den endogene POD-aktivitet før katatrepsis, men var ikke tilstrekkelig for eldre embryoer (figur 4A, D). Metanol inkubering, en alternativ metode for denaturerende endogene proteiner, ble vist å være effektiv i bladlus ²¹ (figur 4B, E). I motsetning H _{2 O 2,} som skader bladlus vev under forlenget inkubasjon på 30 minutter eller lenger, metanol ikke fordøye eller deformere embryoene i løpet av en hvilken som helst utviklingstrinn (figur 4C, F). Følgelig er metanol et bedre alternativ for å undertrykke endogen POD-aktivitet i bladlus embryoer. Hvis det oppdages restbakgrunnsfarging, som vanligvis forekommer i de modne embryoer med et fortykket lag av skjellaget, O / N inkubasjon i metanol ved 4 ° C-i henhold til vår erfaring-kan ytterligere redusere endogen POD-aktivitet.

Residual bakgrunnsfarging ble påvist iembryoer blokkert med serumproteiner så som esel normalt serum (NDS), normalt geiteserum (NGS), bovint serum albumin (BSA), eller blandinger av ¹³ (figur 3A'-C '). Å innta en medfølgende kommersielt blokkerende reagens anvendt for in situ hybridisering, derimot, kan den gjenværende bakgrunnen under farging bli vesentlig eliminert ⁵ (figur 3A '' - C ''). Selv om ingrediensene i blokkering reagens er proprietære, trolig inneholder det ikke-serumproteiner som kan blokkere uspesifikke epitoper av de ert bladlus proteiner. Den blokkerer reagent også jobbet mye bedre enn dyr sera i det grønne fersken bladlus Myzus persicae. På samme måte i M persicae PK fordøyelsen og metanol inkubasjon resulterte i tilfredsstillende antistoff penetrasjon og bakgrunn reduksjon -. Lik den forbedrede resultater oppnådd i A. Pisum (data ikke vist). Vi forventer at forholdene optimized for å øke vev permeabilitet og redusere bakgrunn, enten man bruker kromogent farging eller fluorescens, vil gjelde for mange andre bladlusarter.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% hydrogen perxidase (H2O2)	Sigma-Aldrich	18304	For bleaching endogenous peroxidase of embryos.
4’6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542	For labeling the double-strand DNA. TOXIC. Wear gloves, dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure
4D9 anti-engrailed/invected mouse monoclonal antibody	Developmental studies hybridoma bank	AB_528224	For labeling the developing segments of embryo.
ApVas1 rabbit polyclonal antibody	Our laboratory	N/A	For labeling the aphid germline specific Vas1 protein in embryos. This antibody was made by our laboratory.
Austerlitz Insect pins	ENTOMORAVIA	N/A	For seperating each egg chambers from an ovariole. Size 000, BLACK ENAMELLED.
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	9048-46-8	For blocking the non-specific binding of antibodies.
Camera connted to compound microscope	Canon	EOS 5D	For photographing of aphid embryos.
Colorimetric 8 cell tray	Kartell Labware	357	For developing the staining signal of aphid embryos. Diameter 95 x 57 mm, cell depth 2 mm.
Compound microscope with DIC optics	Leica Microsystems	DMR	For photographing of aphid embryo mounted on the slides.
DIG Wash and Block Buffer Set	Sigma-Aldrich (Roche)	11585762001	For blocking the non-specific binding of antibodies. We diluted the 10x Blocking solution into 1x as blocking reagent.
Forceps	Ideal-tek	N/A	For dissection of ovaries from aphids. Manufacturer part No 5: 5 SA.
Glass dropper	N/A	N/A	For transfering ovaries of aphids from the splot plate to tubes. 150 mm of total length and 5 3/4" of tip length.
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	For clearing of aphid embryos and mounting.
Glycine	Bioshop	N/A	For blocking the enzyme activity of proteinase K (PK).
Goat anti-mouse IgG conjugated Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11017	For detection of primary antibody from mouse.
Goat anti-rabbit IgG conjugated Alexa Fluor 633	Invitrogen	A21072	For detection of primary antibody from rabbit.
Intelli mixer	ELMI laboratory equipment	RM-2M	For improving the thorughly reaction of reagents with ovaries.
Laser-scanning confocal microscopy	Leica Microsystems	SP5	For photographing of aphid embryo mounted on the slides with florecent tag.
methanol	Burdick and Jackson	AH2304	For bleaching endogenous peroxidase of embryos.
Microscope slides	Thermo scientific	10143560	For mounting of embryos. SUPERFROST ground edges, ca./env. 76 x 26 mm.
Microscope Cover glasses	Marienfeld	0101030	For mounting embryos on the slides. Size 18 x 18 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
Microscope Cover glasses	Marienfeld	0101050	For mounting embryos on the slides. Size 22 x 22 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
mouse monoclonal anti-alphaTubulin antibody (DM1A)	Santa Cruz Biotechnology	sc-32293	For labeling the distrbution of alpha-tubulin of cells.
Nail polish	N/A	N/A	For sealing the coverslips on the slides.
Normal goat serum (NGS)	Sigma-Aldrich	G9023	For blocking the non-specific binding of antibodies.
Paraformaldehyde (PFA)	VWR	MK262159	For fixation of aphid ovaries.
Phalloidin-TRITC	Sigma-Aldrich	P1951	For labeling the distrbution of F-actin on embryos.
Phosphate-buffered saline (PBS)	N/A	N/A	As isotonic solution for aphid ovaries.
Plastic dropper	N/A	N/A	For transfering ovaries of aphids from tube to cell tray. Size 3 ml.
Proteinase K	Merck	124678	For creating pores (punching) on the cell membrane and facilitating the access of antibodies.
Pyrex spot plate	N/A	N/A	For dissection and color reactions of aphid ovaries under microscopy. Each cavity with diameter 22 mm and  depth 7 mm.
SIGMAFAST 3,3’-diaminobenzidine (DAB) tablets	Sigma-Aldrich	D4168	For developing of substrated signals. Also called DAB peroxidase substrate tablet set.
Stereo microscope	Leica Microsystems	EZ4	For dissection and observation of aphid ovaries.
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	T8787	For creating pores (punching) on the cell membrane.
VECTASHIELD Elite ABC Kit (Rabbit IgG)	Vector laboratories	PK-6101	For enhancement of the signal. Including of biotinylated goat anti-rabbit IgG secondary antibody, A and B reagents.
VECTASHIELD mounting medium	Vector laboratories	H1000	For clearing of aphid embryos and mounting.