Abstract
配列決定されたゲノムと豊富な表現型可塑性とエンドウAcyrthosiphonエンドウアブラムシは、ゲノムおよび発達の研究のための新たなモデルとなっています。他のアブラムシ、Aのよう 。 エンドウ胚は卵巣管に組立ライン方式で卵の室内で開発単為生殖胎生再現、を経て急速に伝播します。これまで我々は、アブラムシの胚におけるmRNA発現の検出を可能にするin situハイブリダイゼーションホールマウントの堅牢なプラットフォームを確立しています。タンパク質の発現を分析するために、しかし、満足な結果を生じなかった無性胎生アブラムシのovariolesを免疫染色するためのプロトコルを確立しました。ここでは、組織透過性を増加させ、確立されたアプローチを適用する際に問題があったどちらもバックグラウンド染色を、減少させるための最適化された条件をレポートします。最適化が含まれます：必須のFを発見されたプロテイナーゼK（1 / mlの、10分）、の（1）のインキュベーション中・後期アブラムシ胚または抗体の浸透; （2）ジゴキシゲニン（DIG）により供給されるブロッキング試薬と正常ヤギ血清/ウシ血清アルブミンの交換は、バッファセットと、内因性ペルオキシダーゼを漂白するためにメタノールではなく、過酸化水素（H 2 O 2）、（3）アプリケーションをベース。これはかなりアブラムシ組織におけるバックグラウンド染色を減少させました。免疫染色のために最適化されたこれらの重要な条件は、A。 エンドウ及び他のアブラムシの胚における遺伝子産物の効果的な検出を可能にします。
Introduction
アブラムシは、小さな（1-10 mm）のソフトボディと半翅目の昆虫です。彼らはピアス口器と師部の樹液を吸引することにより、植物を餌に。さらに、彼らは師部樹液の食事で不足している必須アミノ酸を合成するために、必須の細胞内共生細菌、 ブフネラの aphidicolaに依存しています。アブラムシは、春と夏の長日日長、彼らは越冬卵1,2の数が限られて横たわっている間、短日の光周期によってトリガ性的卵生再生時の単為生殖胎生再生を含んで複雑 な生活史を持っています。春に秋まで単為生殖の多くのラウンドに続いて、すべての女性のアブラムシ（fundatrices）の第一世代を生成するために、これらの卵が孵化。毎年恒例のライフサイクルにおける無性生殖と有性段階の代替アブラムシの周期的単為生殖は、進化のノベルティ1,2と見なされてきました。単為生殖胎生アブラムシで、胚発生は、卵巣細管（ovarioles）の卵の室内で行われます。これとは対照的に、性的卵生の胚は受精卵で開発しています。別に生殖可塑性から、アブラムシは、世代間の翼polyphenismを表示することができます。過密信号と捕食者の脅威に対応して、翼のない無性女性はviviparously長距離移動のための翼の子孫を生成することができます。エンドウヒゲナガアブラムシのゲノム配列の公表Acyrthosiphonエンドウ -theの最初のゲノム配列基礎不完全変態の昆虫ができます生殖可塑性、翼polyphenism、分子のアブラムシで昆虫植物の相互作用、ウイルスベクタとの共生など、他の機能のさらなる調査基礎3。
ゲノム配列決定に加えて、遺伝子発現および機能を特徴づけるためのツールは、成熟したモデル生物として4エンドウアブラムシを促進するために必要とされます。我々は全体のマウントの堅牢なプロトコルを記載しています
アブラムシ組織の完全性に損傷を与えることなく、透過性を高めるために、我々は慎重にプロテイナーゼKの濃度を滴定し、アブラムシの胚における組織消化のための最適条件を決定しました。エンドウアブラムシに非特異的な染色を避けるために、我々は、効率的に胚をブロックし、免疫染色の間、信号を増幅するために用いられる酵素の内因性のペルオキシダーゼ（POD）の活性を抑制し得る化合物について検索しました。伝統的に使用される通常のヤギ血清ではなく（NGS）、ジゴキシゲニン（DIG）ベースのバッファセットによって提供されるブロッキング試薬/ウシ血清アルブミン（BSA）は、有意にバックグラウンド染色を減少させました。また、メタノールはINHIことが見出されましたより効果的に過酸化水素（H 2 O 2）に比べ、内因性POD活性をビット。胚の免疫染色のためにこれらのアブラムシ、特定の条件に関する詳細は、以下のセクションで説明します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
アブラムシの1.文化
注：単為生殖胎生エンドウアブラムシAの実験室株エンドウは、もともと台湾中部に回収し、300以上の世代のために長日の光周期の下で宿主植物（エンドウのエンドウのマメやソラマメソラマメ ）で飼育されています（一世代：〜10日）。
- 種子の発芽
- 室温で3〜5日間水道水に宿主植物の種子を浸します。 1日1回、新鮮な水を補充します。
注：別の方法として、ストレート湿った土壌に宿主植物の種子を置くことだけでなく、発芽を誘導することができます。 - 光周期16時間の明/ 20℃で8時間の暗闇の下で成長チャンバー内の土壌を持つ小さなポット（直径9cm×7センチ）で10発芽種子を栽培。
- 成長が始まる約10日後に、その高さが8つ以上センチ、植物にアブラムシを移します。
- 室温で3〜5日間水道水に宿主植物の種子を浸します。 1日1回、新鮮な水を補充します。
- アブラムシの譲渡
- 20℃での光周期16時間明/ 8時間暗下で成長チャンバー内のアブラムシをインキュベートします。毎日一回植物の各植木鉢に水を。
- アブラムシの次の世代を得るために、手順を繰り返す1.1.3-1.2.2 10日の一次アブラムシ転送後。
2.解剖と卵巣の固定
- 新たに固定緩衝液として1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中4％パラホルムアルデヒド（PFA）を調製。
- PFA（約500μL）と、スポットプレートの1つのウェルを記入し、低倍率での立体顕微鏡下でプレートを配置し、解剖用のPFA内の大人のアブラムシを沈めます。
- 背の切開、鉗子の一組で頭と腹部を保持することによって卵巣を解剖腹部のクチクラ、および腹腔から離れて卵巣をドラッグします。
- 室温で20分間PFAの1ミリリットルを含む1.5 mlチューブに卵巣の3組を修正しました。
- トランスファーピペット（ガラスまたは使い捨てのいずれか）で固定バッファをデカントした後、10分間毎に1×PBS（PBST）中で0.2％トリトンX-100で3回卵巣を洗います。マイルドミキサー/ローテーターに揺れ（回転角：60°（F60）/回転数：8 RPM）は、固定および洗浄の両方をお勧めします。
3.プロテイナーゼK（PK）での処置は、胚組織の透過性を高めるために
注：PK処理は、生殖帯域拡張以降（開発段階11）からの胚に適用されます。若い胚の場合、このステップはオプションです。
- 直列作業濃度を1μg/ mlから1×PBSでPKのストック溶液（10mg / ml）に希釈します。
- 穏やかな振盪しながら10分間、PK（約500μL）を1μg/ mlの卵巣をインキュベートします。
- デカントPK solutiそしてその後、グリシン700μlの（2 mg / mlの）5分ごとに、3回と卵巣を洗いに。
- 10分ごとに二回、0.2％PBSTで卵巣を洗ってください。
- 軽度に振盪しながら室温で15分間固定緩衝液で再び卵巣を修正しました。
- 上清を捨て、10分間ずつ二回、0.2％PBSTで卵巣を洗います。
内因性ペルオキシダーゼ（POD）活性を抑制するための4メタノールインキュベーション
注：メタノールのインキュベーションは、メタノールに敏感であるファロイジン染色または抗体エピトープを施した胚には適用されません。
- 直列0.2％PBST中のメタノールの異なる割合で卵巣を脱水（3：1：1：1、3：V / V 1）穏やかに撹拌しながら10分間、メタノール溶液の各濃度で卵巣をインキュベートすることによって。
- 穏やかな振盪しながら室温で1時間、100％メタノールで卵巣を脱水。
注：染色の良好な結果がまだで、100％メタノール中に保存したアブラムシの組織から得ることができる-20＃176; C 1ヶ月。 - 直列0.2％PBST中のメタノールの異なる割合で卵巣を再水和（1：1：3：1：1 v / v 3）穏やかに撹拌しながら10分間、メタノール溶液の各濃度で卵巣をインキュベートすることによって。
5.抗体染色
- 1XのDIGベースのバッファセット（DIG-B）から10倍のブロッキング溶液を希釈します。
注：1×DIG-Bブロッキング溶液は、5％（v / v）の正常ヤギ血清（NGS）からなる標準的なブロッキング試薬に比べ染色のバックグラウンドを低減し、0.5％（v / v）のウシ血清アルブミンに対してより効果的である（BSA ）0.2％PBSTインチ - 穏やかな振盪しながら4℃でRTまたはO / Nで2.5〜4時間、1X DIG-Bブロッキング溶液で卵巣をインキュベートします。
注：1.5ミリリットルチューブ内の卵巣の三対のために、200μlのサンプルブロッキングと抗体染色のための最小量です。 - 上清を除去し、適切なdilutiで一次抗体を含む新鮮な1X DIG-Bのブロッキング溶液と交換比に。穏やかな振盪しながら4℃で、RTまたはO / Nで4時間のために卵巣を染色。
注：ここで説明する実験では、一次抗体の次の最適な希釈液を使用します（1）ApVas1抗体：1：発色性染色のための500を、免疫蛍光染色のために1時50分。 （2）抗αチューブリン抗体：1：500; （3）4D9モノクローナル抗体：1：25。 - 15分ごとに0.2％PBSTで4回の卵巣を洗ってください。
- 1X DIG-Bは、穏やかな振盪しながら室温で1時間ブロッキング溶液で卵巣をインキュベートします。
- 上清を除去し、適切な希釈率で二次抗体を含む新鮮な1X DIG-Bのブロッキング溶液と交換してください。穏やかな振盪しながら4℃で、RTまたはO / Nで4時間のために卵巣を染色。
- 二次抗体の以下の希釈比を使用する：（1）免疫蛍光染色の場合：1：アレクサフルオロ633ヤギ抗ウサギIgGまたはAlexa Fluor 488ヤギ抗マウスIgGについて500。 （2）発色性染色のために1：ビオチン化ヤギ抗ウサギIgG 200。
注：ビオチン化二次抗体を染色シグナルが著しく増幅されるを通して基板ベース（発色）の検出にアビジン - ビオチン複合体（ABC）と対話するために適用されます。 - 二次抗体は、光に敏感であるため、免疫蛍光染色のために、暗所で染色を行います。
- 二次抗体の以下の希釈比を使用する：（1）免疫蛍光染色の場合：1：アレクサフルオロ633ヤギ抗ウサギIgGまたはAlexa Fluor 488ヤギ抗マウスIgGについて500。 （2）発色性染色のために1：ビオチン化ヤギ抗ウサギIgG 200。
- 10分ごとに0.2％PBSTで4回、二次抗体を洗い流します。
6.核とF-アクチン染色
注：これは、免疫蛍光染色のために適用されます。
- 暗所で室温で2時間、DAPI（2 NG /μL）およびファロイジンTRITC（100 nM）を含む0.2％PBSTで染色卵巣。
- 10分ごとに0.2％PBSTで4回の卵巣を洗ってください。
- 穏やかな振盪しながら4℃で封入O / Nで卵巣をインキュベートします。
7.シグナル開発
注：これは、発色性染色のために適用されます。
- 100μlの準備試薬アビジン - ビオチン複合体（ABC）、0.2％PBSTの98μlの試薬A（アビジン）の1μLを加え穏やかにピペッティングを経由して十分に混合し、試薬Bを1μlを追加することにより、信号を向上させるための（西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートビオチン）、即座に混合しました。穏やかな振盪しながら室温で30分間混合物をインキュベートします。
- 穏やかな振盪しながら室温で30分間、試薬AとBの混合物に（関連付けを解除卵室を含む）の卵巣をインキュベートします。
- 10分ごとに0.2％のPBSTで4回試薬A及びBの混合物を洗い流します。
- プラスチックスポイトでスポットプレート上のウェルに、PBST中に沈め卵巣を転送します。
- 3,3'-ジアミノベンジジン（DAB）の基質溶液を調製：1 DABタブレットを加え、1分間激しくボルテックスを経由してのddH 2 O 1ml中の尿素過酸化水素を含む別のものを溶解させます。
注：DAB、ペルオキシダーゼの沈殿させる基板は、免疫染色のために人気の色原体です。これは、BRを生成ペルオキシダーゼによって酸化された後の自分と不溶性の沈殿物。弱い信号は、基質溶液（最終濃度0.05〜0.08％）と塩化ニッケルを添加することによって高めることができます。 - ウェル内に残っているPBST溶液を除去し、信号の開発のためのDAB基質溶液100μlを補充します。
- 低倍率での実体顕微鏡下で信号の強度を監視します。
- すぐに1×PBSで再充填が続くDAB溶液を除去することにより反応を停止します。二回洗浄を繰り返します。
- 1.5mlチューブに戻って卵巣を転送した後、15分間ずつ二回、1×PBSまたはPBSTで洗浄します。
- 穏やかな振盪しながら4℃でグリセロールベースの封入剤（70％グリセロール）、O / Nで卵巣をインキュベートします。
8.アブラムシ胚をマウントします
注：アブラムシ胚の厚さは、開発の段階との間で変化します。マウントの戦略は、このように、中間（ステージ、早期（germariaやステージ0-10）を合わせて変更されています11-18）、および図2Bに示されてい後期胚（ステージ19〜20）、 - D。胚のステージングは、三浦らを追った。12
- プラスチックスポイト付きセルトレイにメディアをマウントするとともに卵巣を移し、低倍率でステレオ顕微鏡でサンプルを観察します。
- 虫ピンを使用して横方向の卵管に関連する腎杯をカットした後、スポイトでよく空のグラスに分離された卵巣管を転送します。マウンティング培地を用いて50〜100μlに最終容量をアップしてください。
- ガラススポイトでスライド上に卵巣管を転送して、虫ピンを使用して卵室を分析。
注：開発のステージ6よりも古い胚の場合、卵室の分離が提案されています。 germariaとステージ6歳未満の最初の二つの卵室のために、分離はオプションです。 - ガラススポイトを使ってきれいなスライドに解剖卵室を再配置します。
- カバースリップ（サイズを置く：22×22ゆっくりと泡を避けるために、解剖germariaまたは卵室mm以上）（発達の段階1-10で胚を含みます）。
- 片側カバーガラスの橋でスライド上の（開発段階11-18で胚を含む）マウント卵室と他のカバーガラス（サイズ：18×18 mm）を置き、試料の上に。
- マウント卵室両面カバーガラスの橋でスライドに（開発のステージ19よりも古い胚を含む）および他のカバーガラス（サイズ：18×18 mm）を置き、試料の上に。
- サンプルの乾燥を避けるために取り付けたメディアとトップカバースリップの下のスペースを埋めます。
- 軽度の観察のための正しい方向を得るために、カバースリップをスライドさせて胚をロールバックします。
- マニキュアと（ブリッジカバーガラスを含む）カバーガラスのエッジの周りにシール。
9.イメージング解析
- compouでホールマウント胚の写真微分干渉コントラスト（DIC）画像NDカメラに接続され、DIC光学系および乾燥系対物レンズ（10X、20X、40X）を備えた顕微鏡。製造元の指示を使用して、カメラとパソコンの画像転送用のソフトウェアをインストールします。
- レーザー走査共焦点顕微鏡14と、蛍光標識された胚の投影を取得します。 、Z-スタッキングを撮影し、3Dがイメージングソフトウェアを投影するための製造元の指示に従ってください。
- 逆さまにスライドを回して、10倍の対物レンズとマウントされたサンプルを見つけ、細かい油を塗ったベースのペンでサンプル領域を一周。
注：これは、共焦点顕微鏡の対物レンズを介してそれを検索するときにサンプルが容易に識別することができます。 - 反対側9.2.1で説明したようにラベル付けされたカバースリップ領域の上に油の滴を追加します。
- 逆さまにスライドを回して、10倍の対物レンズとマウントされたサンプルを見つけ、細かい油を塗ったベースのペンでサンプル領域を一周。
- 63×油浸対物レンズに変更し、その後40X油浸対物レンズで焦点面を検索します。手動で微細なフォーカス制御を移動して行いますWNは、最良の焦点面をキャプチャします。
注：germariaと初期胚の構造の詳細を観察するために、我々は40X目的または高倍率のものを使用することをお勧め。 - 異なる励起チャンネルで胚をスキャンし、zスタック画像を得ます。
注：エンドウアブラムシの組織のために、1.5μm以下にまで、各光学部の厚さを薄くします。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
本研究では、無性エンドウアブラムシ（ 図1A）の胚のホールマウントの免疫染色を行いました。これらの女性は、単為生殖とviviparously子孫を生産します。これらの女性の胚は、卵巣細管（ovarioles）（ 図1Bおよび図2A）の卵の室内で開発しています。顕微鏡検査の前に、解剖ovariolesは染色標的です。しかし、卵室の分離は、顕微鏡（ - D 図2B）の下で胚を観察するために必要とされます。
組織透過性の増加
プロテイナーゼK（PK）の治療は、組織浸透性を高めるため、いくつかのモデル生物-ような線虫 （線虫）として、 キイロショウジョウバエ （フライ）の胚のための標準的なアプローチであり、 ゼブラフィッシュ （ゼブラフィッシュ） - この手順はオプションです。エンドウアブラムシでは、PK処理のための要件は、ステージに依存します：前原腸陥入にgermaria胚（ステージ0-7）のために、PK処理を省略することができます。しかし、胚帯拡張子（ステージ11）の下または後の段階で胚のために、この手順を強くお勧めします。例えば、中間胚信号中かろうじてPK処理（ - C 図3A）なしの胚で検出されました。対照的に、シグナル強度が有意に（ ' - C'、A " - C" 図3A）PK消化に供した胚に増強されました。
バックグラウンド染色の減少
内因性のペルオキシダーゼ（POD）活性のハイレベルは、アブラムシの胚組織で同定されました。この酵素活性を抑制するために、パラホルムアルデヒドで固定した胚は、HYの存在下でインキュベートしました。drogen過酸化水素（H 2 O 2）、PODの酸化のための一般的な試薬。我々の結果は、H 2 O 2処理は、後期胚（ 図4A、D）に効果的に内因性PODの活性を抑制しなかったことを示しました。対照的に、バックグラウンド染色は、主にメタノールのインキュベーション（ 図4B、C、E、F）に供した胚において減少しました。抗体染色のための標準的なプロトコールに記載されているように、一次抗体胚の適用前にNGSおよびBSAを含む溶液中でブロックしました。しかし、アブラムシの胚中の残留バックグラウンド染色は（ ' - C' 図3A）が検出されました。この問題は、このようなin situハイブリダイゼーション （ " - C" 図3A）のように、DIG標識実験のためのバッファセットによって供給されたブロッキング試薬とNGS / BSAを交換した後解決されました。そこで我々は、DIG-Bとメタノールとのインキュベーションでそのポストの固定を締結ブロッキング試薬は、両方のアブラムシ胚におけるバックグラウンド染色を減少させるために必須です。
PK処理およびDIG-B遮断剤は、発色性にも蛍光のアプローチを使用していない唯一の有効な信号検出のために必要とされます。メタノールに敏感なエピトープにファロイジンまたは染色アクチン染色は、しかし、アクチンまたは抗体の天然形態を破壊することができ、メタノール、で前固定後胚では動作しません。蛍光免疫染色を行う際に、この処理は避けるべきです。別にメタノール処理工程をなくすから免疫蛍光は、アブラムシ胚においてマルチ標識実験を可能にします。例えば、共焦点顕微鏡を用いて、エンドウアブラムシVasa1タンパク質（ApVas1）生殖細胞において、αチューブリン、微小管に、F-アクチンマイクロフィラメントにおいて、核中のDNAは、同時にマークされ、可視化することができた（ 図5A、C）。 CHROとの比較において標識化のための条件を採用。 - mogenic方法（ 図5B）は 、の蛍光標識したサンプルを切片の共焦点は、このような早期のアブラムシ胚における生殖細胞質とcellularizing生殖細胞におけるApVas1（D」 図5（c） '、D）としてローカライズされた信号の優れた分解能を提供上記の生殖細胞は、拡張胚帯のセグメントにおけるエングレイルド/半円形の波形のタンパク質は、抗体4D9（ 図6）で染色した。これは、免疫染色-を含む発色性および蛍光のために私たちのプロトコルを効果的検出を信号に適用される方法は、できることを示しています生殖系列とアブラムシにおける体細胞系統の両方インチ
図1.単為生殖胎生エンドウアブラムシ。（A）無性胎生雌成虫から出現する1齢幼虫。 （B 12の間に可変であってもよいです。卵巣管は、先端部（矢印）、1-2卵母細胞、および5-7胚室内の胚腺が含まれています。ガットと尾は通常解剖卵巣に関連している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
開発のさまざまな段階でアブラムシの胚を装着するための戦略の図2.イラスト。単為生殖胎生雌成虫から解剖卵巣管における胚発生の（A）の概要。簡単な卵形成（germarialステージとステージ0-2）は、胚（ステージ3-20）が続いています。胚発生の概要：F合胞体胚盤葉のormation（ステージ3-5）。胞胚形成（ステージ6-7）。原腸形成（ステージ8-10）。生殖バンドの伸び（段階11-14）。 katatrepsis（段階15）。ポストkatatrepsisと胚芽バンド後退（ステージ16〜17）。器官形成（ステージ18〜20）。カラーキーは、図の下にあります。 （B、B '）胚腺および0-10胚をステージ。いいえカバーガラスブリッジは必要ありません。 （C、C '）は 11-18胚をステージ。カバースリップのブリッジが必要とされます。 （D、D '）は、19〜20胚をステージ。ダブルカバースリップのブリッジが必要です。カバースリップをスライドさせて胚をローリング観察の異なる角度を作成することができます。カバーガラスのサイズ：22×22（B）mmで、（C）で18×18ミリ、（D）。カバーガラスの厚さ：0.13 0.16ミリメートル。胚ステージングは三浦に従っら 12略語：G：胚腺; ST：ステージ。.COM /ファイル/ ftp_upload / 53883 / 53883fig2large.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3.プロテイナーゼK処理と異なるブロッキング効果を持つ試薬の比較卵室の前方には、左側にあります。すべてのビューは、背側は（B "、C '、C"）に示されている胚を除いて横方向です。胚は全てApVas1抗体（希釈率1：500）を用いて染色され、ApVas1の信号は、10〜20秒以内に開発されています。矢頭は、生殖細胞の位置を示しています。 （A - C）胚プロテイナーゼK（PK）の処理なし。生殖細胞におけるApVas1信号がほとんど検出されています。 （A ' - C'、A " - C"）胚圏におけるバックグラウンド染色の比較（ ' - C' A）および DIG洗浄およびブロックバッファーセット（DIG-B）（A " - C"）の商業ブロッキング試薬のNGSとBSAでヒツジシラミバエ。バックグラウンドを大幅に（「 - C」A）に示した胚において減少します。略称：B：細菌。スケールバー：100ミクロン、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4は、メタノールとのバックグラウンド染色を最小化胚の前方が左にあります。すべてのビューは、背側です。胚は、抗体の浸透性を高めるためのPKで処理されます。矢頭は、生殖細胞の位置を示しています。処置の（A、B、D、E）の比較過酸化水素（H 2 O 2）、メタノールで。胚は二次抗体のみで染色されています。 H 2 O 2処理 （w / vの0.3％、10分）：高いバックグラウンド（A、D）。メタノール処理（100％、60分）：低バックグラウンド（B、E）。 （C、F）メタノールで処理した胚の一次抗体染色。メタノール処理の条件は、（B、E）に示した胚に使用されるものと同一です。 ApVas1抗体が優先的に胚性生殖細胞を標識します。スケールバー：100ミクロン、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
初期胚の図5.免疫蛍光染色。 （B）で500：1 - ApVas1抗体の希釈率は、（D A、C）で1:50です。 ApVas1、αチューブリン、F-アクチン、および核DNAを含む（A）染色信号は、波長の異なる4つのチャネルを使用して検出されます。信号のカラーキーは、図の下部に示されています。 （B）は、比較のため、発色性、結果のDICイメージ。 ApVas1は、ステージ3の胚にApVas1（矢印）の後部局在のコントラスト強度に対し、胚腺内に濃縮されている（C、C '）に示すもののように明確ではありません。 （C、C '）卵の後部でApVas1信号の充実。卵室（矢印）の後方領域に局在化した信号を画像スタッキングによって強化されています。 F-アクチンおよびαチューブリンの信号が、部分的に（後方にApVas1のものをマスクしているためC）、単チャネリング走査によって生成された画像は、（C '）に示されています。 （D - D ''）ステージ4胚の後部領域に局在ApVas1の共焦点切片。 （D）及び（D '）に示す画像がApVas1はそれぞれ、表面および中央焦点面で検出されます。 （D "）は 、（D）および（D '）と同じ胚からのすべてのセクションのマージされた画像である略語：として：アスター; FC、包細胞; POC、将来の卵母細胞; SP：スピンドル; TC、栄養コード。スケールバー：10μmで、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図6.胚セグメントの免疫染色。アン卵室のteriorは左にあります。 PK処理した胚は、胚のセグメントに発現されるエングレイルド/半円形の波形のに対するモノクローナル抗体4D9で染色されています。信号のカラーキーは、図の下部に示されています。 （A、A '）ステージ13胚の免疫蛍光染色。 （A）、エングレイルド/半円形の波形の、αチューブリン、F-アクチン、および核DNA染色の画像から順に積層共焦点像。 （A '）のみエングレイルド/半円形の波形のの染色を示す共焦点像。他のチャネルからの信号の干渉を受けることなく、信号をより良く表示されます。それぞれのステージ13と開発の17で胚に（B、C）発色染色、。 （B）はステージ13胚。 （C）ステージ17胚。ステージから13〜17に、腹部のセグメントの成長数は4D9によって標識されています。 （D）陰性対照（-Ctrl）染色アレクサフルオロ633と結合した二次抗体は殆ど免疫染色信号は、一次抗体なしで卵巣管で検出されないだけでる。しかし、ステージ7と卵室13内の細菌の自己蛍光（破線）は、励起波長488nmで検出されます。略語：A：腹部。 B：細菌; H：ヘッド。 T：胸部。スケールバー：100ミクロン、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
私たちは、エンドウヒゲナガアブラムシAの成功免疫染色するために重要最適な条件を特定した。 エンドウ 、ゲノムおよび発達研究3,15のための新たなモデル生物。組織透過性を増加させ、バックグラウンド染色を低減するための最適化された条件は、信号の強度および特異性を増強しました。それらは、細胞膜の孔を作成して、非特異的抗体結合をブロックするためのステップの他の動物モデルにおける免疫染色のための標準プロトコルとは異なります。
免疫染色のため、およびin situハイブリダイゼーション 、プロテイナーゼK（PK）消化は、組織浸透性16-19を増加させるための一般的な手法の一つです。 （1）PK消化が大幅ものの、胚芽帯域拡張（ステージ11〜14）（ 図3B ''、C ''）中の単為生殖胎生胚における免疫染色シグナルを強化：アブラムシ組織の抗体染色では、我々の結果は、ことを示しました弱い信号は、PK処理（ 図3B、C）を欠いた胚ではまだ見えていました。 （2）PK消化以降katatrepsisから胚（ステージ15〜20）（ 図4C、Fおよび 図6C）のために必須でした。卵、最も成熟した無性卵chamber-のサイズにほぼ同等であるに常駐している初期の性的卵生の胚のために成功した免疫染色katatrepsis前に無性胎生胚の場合、卵室の容積が浸透問題の原因はほとんどありませんPK消化20を必要としません。従って、無性卵室の限られた空間内の胚帯の延伸及び折り畳みは（11〜14段）の抗体の侵入を妨げることがあり、それが間に、細胞膜の孔を作成することによって、抗体の浸透を可能にPKであります詰まっ胚構造。これとは対照的に、性的卵生殖バンドの直線拡張は、それがあっても中で染色されている理由を説明することができますPKの不在。卵黄封筒/絨毛膜の除去はまた、抗体の性的卵生の胚にアクセスしやすくすることができます。胚は19（ 図4C、Fおよび 図6C）cuticled厚いのでkatatrepsis後の胚（ステージ16〜20）の場合は、PK処理は無性と性的両方モーフに必須です。
胚の構造の整合性や信号の強度が十分でない場合はそれにもかかわらず、PK消化の推奨条件（10分間に1μg/ ml）を、さらに調整が必要。これは主に、バッチからバッチへの変動し得るPK活性によって引き起こされます。胚組織がPK消化後に破損した場合、PKの濃度を0.5μg/ mlに減少させることができます。信号強度が弱い場合同様に、15〜20分のインキュベーションの延長は、このようにお勧めします。 1.0 / mlの濃度、ハウで20分までに延長、PKのインキュベーションにかけ最も成熟した胚（ステージ20）版は、通常、PK消化はまだ不完全であることを示唆し、微弱な信号を表示します。長時間の消化は染色シグナルを強化するが、ステージで検出された発現パターンは18胚がステージ20の胚の場合と同様である場合は特に、任意であることができます。開発の段階20での胚と比較して、身体表皮のより少ない量がまだ類似の形態を有するステージ18の胚は、一般に、より強い信号強度を得ることができます。
信号の発生時に、バックグラウンド染色は、基板と交差反応することができる内因性酵素の活性によって上昇させることができます。エンドウアブラムシの胚では、シグナル基質を消化するための一般的な抗体コンジュゲートであり、どちらも、内因性アルカリホスファターゼ（AP）及びペルオキシダーゼ（POD）の活性が、検出されました。内在性APの加水分解酵素活性を効果的レバミゾール（データは図示せず）によって胚発生を通して抑制することができました。それにもかかわらず、0.3から0.6パーセントのhydrogでの胚の治療過酸化物（H 2 O 2）英語のみkatatrepsis前に内因性POD活性を除去するが、古い胚（ 図4A、D）のために十分ではなかったでした。メタノールインキュベーション、内因性タンパク質を変性させるための別のアプローチは、アブラムシ21（ 図4B、E）において有効であることが実証されました。損害賠償は、30分以上の長時間のインキュベーションの間に組織をアブラムシのH 2 O 2とは異なり、メタノールは、開発のどの段階（ 図4C、F）中の胚を消化し たり変形しません。その結果、メタノールはアブラムシの胚における内因性PODの活性を抑制するためのより良い代替手段です。残留バックグラウンド染色は、通常、表皮の肥厚層を有する成熟胚に発生する、検出された場合には、4°C、私たちに従っでメタノール中でO / Nインキュベートし、さらに内因性POD活性を低下させる経験が、可能です。
残留バックグラウンド染色が検出されました正常なロバ血清（NDS）などの血清タンパク質、正常ヤギ血清（NGS）、ウシ血清アルブミン（BSA）、またはそれらの混合物13（ 図3A'-C '）でブロックした胚。 （ 図3（a）は、 '' - C ''）in situハイブリダイゼーションに使用する市販されてブロッキング試薬を、対照的に、免疫染色時の残りの背景が大幅に5を排除することができる採用します。ブロッキング試薬の成分は独自のものであるが、それはおそらく、エンドウヒゲナガアブラムシのタンパク質の非特異的エピトープをブロックすることができ、非血清タンパク質が含まれています。ブロッキング試薬はまた、モモアカアブラムシのモモアカアブラムシに動物血清よりもはるかに優れていました。同様に、 アブラムシの PK消化とメタノールインキュベーションが良好な抗体の浸透およびバックグラウンドの低減をもたらしたでM -改善された結果と同様で達成A.エンドウ （データは示さず）。私たちは、条件と予想optimizED組織透過性を増加させ、バックグラウンドを低減するために、一つは発色性または蛍光染色を使用しているかどうか、他の多くのアブラムシ種に適用されます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30% hydrogen perxidase (H2O2) | Sigma-Aldrich | 18304 | For bleaching endogenous peroxidase of embryos. |
| 4’6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | For labeling the double-strand DNA. TOXIC. Wear gloves, dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure |
| 4D9 anti-engrailed/invected mouse monoclonal antibody | Developmental studies hybridoma bank | AB_528224 | For labeling the developing segments of embryo. |
| ApVas1 rabbit polyclonal antibody | Our laboratory | N/A | For labeling the aphid germline specific Vas1 protein in embryos. This antibody was made by our laboratory. |
| Austerlitz Insect pins | ENTOMORAVIA | N/A | For seperating each egg chambers from an ovariole. Size 000, BLACK ENAMELLED. |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | For blocking the non-specific binding of antibodies. |
| Camera connted to compound microscope | Canon | EOS 5D | For photographing of aphid embryos. |
| Colorimetric 8 cell tray | Kartell Labware | 357 | For developing the staining signal of aphid embryos. Diameter 95 x 57 mm, cell depth 2 mm. |
| Compound microscope with DIC optics | Leica Microsystems | DMR | For photographing of aphid embryo mounted on the slides. |
| DIG Wash and Block Buffer Set | Sigma-Aldrich (Roche) | 11585762001 | For blocking the non-specific binding of antibodies. We diluted the 10x Blocking solution into 1x as blocking reagent. |
| Forceps | Ideal-tek | N/A | For dissection of ovaries from aphids. Manufacturer part No 5: 5 SA. |
| Glass dropper | N/A | N/A | For transfering ovaries of aphids from the splot plate to tubes. 150 mm of total length and 5 3/4" of tip length. |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | For clearing of aphid embryos and mounting. |
| Glycine | Bioshop | N/A | For blocking the enzyme activity of proteinase K (PK). |
| Goat anti-mouse IgG conjugated Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11017 | For detection of primary antibody from mouse. |
| Goat anti-rabbit IgG conjugated Alexa Fluor 633 | Invitrogen | A21072 | For detection of primary antibody from rabbit. |
| Intelli mixer | ELMI laboratory equipment | RM-2M | For improving the thorughly reaction of reagents with ovaries. |
| Laser-scanning confocal microscopy | Leica Microsystems | SP5 | For photographing of aphid embryo mounted on the slides with florecent tag. |
| methanol | Burdick and Jackson | AH2304 | For bleaching endogenous peroxidase of embryos. |
| Microscope slides | Thermo scientific | 10143560 | For mounting of embryos. SUPERFROST ground edges, ca./env. 76 x 26 mm. |
| Microscope Cover glasses | Marienfeld | 0101030 | For mounting embryos on the slides. Size 18 x 18 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm) |
| Microscope Cover glasses | Marienfeld | 0101050 | For mounting embryos on the slides. Size 22 x 22 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm) |
| mouse monoclonal anti-alphaTubulin antibody (DM1A) | Santa Cruz Biotechnology | sc-32293 | For labeling the distrbution of alpha-tubulin of cells. |
| Nail polish | N/A | N/A | For sealing the coverslips on the slides. |
| Normal goat serum (NGS) | Sigma-Aldrich | G9023 | For blocking the non-specific binding of antibodies. |
| Paraformaldehyde (PFA) | VWR | MK262159 | For fixation of aphid ovaries. |
| Phalloidin-TRITC | Sigma-Aldrich | P1951 | For labeling the distrbution of F-actin on embryos. |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | N/A | N/A | As isotonic solution for aphid ovaries. |
| Plastic dropper | N/A | N/A | For transfering ovaries of aphids from tube to cell tray. Size 3 ml. |
| Proteinase K | Merck | 124678 | For creating pores (punching) on the cell membrane and facilitating the access of antibodies. |
| Pyrex spot plate | N/A | N/A | For dissection and color reactions of aphid ovaries under microscopy. Each cavity with diameter 22 mm and depth 7 mm. |
| SIGMAFAST 3,3’-diaminobenzidine (DAB) tablets | Sigma-Aldrich | D4168 | For developing of substrated signals. Also called DAB peroxidase substrate tablet set. |
| Stereo microscope | Leica Microsystems | EZ4 | For dissection and observation of aphid ovaries. |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | For creating pores (punching) on the cell membrane. |
| VECTASHIELD Elite ABC Kit (Rabbit IgG) | Vector laboratories | PK-6101 | For enhancement of the signal. Including of biotinylated goat anti-rabbit IgG secondary antibody, A and B reagents. |
| VECTASHIELD mounting medium | Vector laboratories | H1000 | For clearing of aphid embryos and mounting. |
References
- Blackman, R. L. Reproduction, cytogenetics and development. Aphids: their biology, natural enemies. Minks, A. K., Harrewijn, P. , Elsevier Press. Amsterdam. 163-195 (1987).
- Davis, G. K. Cyclical parthenogenesis and viviparity in aphids as evolutionary novelties. J. Exp. Zool. 318, 448-459 (2012).
- The International Aphid Genomics Consortium. Genome sequence of the pea aphid Acyrthosiphon pisum. PLoS Biol. 8 (2), e1000313 (2010).
- Abzhanov, A., et al. Are we there yet? Tracking the development of new model systems. Trends Genet. 24 (7), 353-360 (2008).
- Chang, C., et al. Apvasa marks germ-cell migration in the parthenogenetic pea aphid Acyrthosiphon pisum (Hemiptera: Aphidoidea)). Dev. Genes Evol. 217 (4), 275-287 (2007).
- Chang, C., et al. Whole-mount identification of gene transcripts in aphids: Protocols and evaluation of probe accessibility. Arch. Insect Biochem. 68 (4), 186-196 (2008).
- Chung, C. Y., Cook, C. E., Lin, G. W., Huang, T. Y., Chang, C. Reliable protocols for whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) in the pea aphid Acyrthosiphon pisum: a comprehensive survey and analysis. Insect Sci. 21 (3), 265-277 (2014).
- Mutti, N. S., Park, Y., Reese, J. C., Reeck, G. R. RNAi knockdown of a salivary transcript leading to lethality in the pea aphid, Acyrthosiphon pisum. J. Insect Sci. 6, 38 (2006).
- Jaubert-Possamai, S., et al. Gene knockdown by RNAi in the pea aphid Acyrthosiphon pisum. BMC Biotechnol. 7, 63 (2007).
- Sapountzis, P., et al. New insight into the RNA interference response against cathepsin-L gene in the pea aphid, Acyrthosiphon pisum: Molting or gut phenotypes specifically induced by injection or feeding treatments. Insect Biochem. Mol. Biol. 51, 20-32 (2014).
- Braendle, C., et al. Developmental origin and evolution of bacteriocytes in the aphid-Buchnera symbiosis. PLoS Biol. 1 (1), e21 (2003).
- Miura, T., et al. A comparison of parthenogenetic and sexual embryogenesis of the pea aphid Acyrthosiphon pisum (Hemiptera: Aphidoidea). J. Exp. Zool. 295 (1), 59-81 (2003).
- Chang, C., Lee, W. C., Cook, C. E., Lin, G. W., Chang, T. Germ-plasm specification and germline development in the parthenogenetic pea aphid Acyrthosiphon pisum: Vasa and Nanos as markers. Int. J. Dev. Biol. 50 (4), 413-421 (2006).
- Koshy, A. A., Cabral, C. M. 3-D imaging and analysis of neurons infected in vivo with Toxoplasma gondii. J. Vis. Exp. (94), e52237 (2014).
- Brisson, J. A., Stern, D. L. The pea aphid, Acyrthosiphon pisum: an emerging genomic model system for ecological, developmental and evolutionary studies. Bioessays. 28 (7), 747-755 (2006).
- Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
- Harland, R. M. In-situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Method. Cell Biol. 36, 685-695 (1991).
- Wolff, C., Sommer, R., Schroder, R., Glaser, G., Tautz, D. Conserved and divergent expression aspects of the Drosophila segmentation gene hunchback in the short germ band embryo of the flour beetle Tribolium. Development. 121 (12), 4227-4236 (1995).
- Jowett, T. Double in situ hybridization techniques in zebrafish. Methods. 23 (4), 345-358 (2001).
- Lin, G. W., Cook, C. E., Miura, T., Chang, C. Posterior localization of ApVas1 positions the preformed germ plasm in the sexual oviparous pea aphid Acyrthosiphon pisum. Evodevo. 5, 18 (2014).
- Straus, W. Inhibition of peroxidase by methanol and by methanol-nitroferricyanide for use in immunoperoxidase procedures. J. Histochem. Cytochem. 19 (11), 682-688 (1971).
