Идентификация критических условий для Иммуноокрашивание в гороховой тли эмбрионов: Повышение проницаемости тканей и уменьшения фонового окрашивания

Abstract

Гороха тля гороховая тля, с геномом, последовательность и обильным фенотипической пластичности, стала моделью для новых геномных исследований и развития. Как и другие тли, А. Pisum быстро распространяться с помощью партеногенетической живородящих воспроизводства, где эмбрионы развиваются в течение яичных камер в сборочной линии в яйцевая трубка. Ранее мы создали надежную платформу всей горе-гибридизация, позволяющий обнаруживать экспрессии мРНК в эмбрионы тлей. Для анализа экспрессии белка, хотя, разработали протоколы иммуноокрашивания в овариол бесполого живородящих тлей не дает удовлетворительных результатов. Здесь мы сообщаем условия, оптимизированные для увеличения проницаемости тканей и уменьшения фонового окрашивания, оба из которых были проблемы при применении установленных подходов. Оптимизация включает: (1) инкубацию протеиназы К (1 мкг / мл, 10 мин), который был найден существенный Fили проникновение антител в середине и в конце этапа тли эмбрионов; (2) замена нормальной козьей сыворотке / бычьего сывороточного альбумина с блокирующим реагентом, подаваемой дигоксигенином (DIG) основе буфера установить и (3) применение метанола, а перекись водорода (H _{2 O 2)} для отбеливания эндогенной пероксидазы; что значительно уменьшило окрашивание фона в тлей тканей. Эти критические условия, оптимизированные для иммуноокрашивания позволит осуществлять эффективное выявление генных продуктов в эмбрионах а. PISUM и других тлей.

Introduction

Тли hemipteran насекомые с небольшой (1-10 мм) мягких тел. Они питаются растениями, высасывая сок флоэмы с пронзительными ротового аппарата. Кроме того, они полагаются на облигатной эндосимбиотических бактерии, Buchnera aphidicola, синтезировать незаменимые аминокислоты, которые испытывают дефицит флоэмы сока диеты. Тли имеют сложную историю жизни, что включает в себя партеногенетическое живородящих воспроизведение весной и летом длинного дня фотопериодов и сексуальной яйцекладущие воспроизводства, вызванного короткого дня фотопериодов в течение которого они лежали ограниченное количество зимующих яиц ^1,2. Весной эти яйца люк, чтобы произвести первое поколение все женщины тлей (fundatrices), следующая много раундов партеногенетической воспроизводства до осени. Циклический партеногенез в тлей, где бесполое и половое фазы чередуются в годичном цикле жизни, была расценена как эволюционный новизны ^1,2. В партеногенетических живородящие тлей, Эмбриогенез происходит внутри яйца палат яичников канальцев (овариол). Напротив, сексуальные яйценосные эмбрионы развиваются в удобренных яиц. Помимо репродуктивного пластичности, тли может отображать трансгенерационной крыло polyphenism: в ответ на перенаселенность сигналов и хищников угроз, то unwinged бесполые самки могут производить viviparously крылатого потомства для дальней миграции. Публикация генома в гороховой тли гороховая тля -Первый последовательность генома для базальной hemimetabolous насекомых позволяет дальнейшее изучение репродуктивного пластичности, крыла polyphenism и других функций, включая насекомых растений взаимодействий, вирусной векторизации и симбиоза в тлей на молекулярном Основой ^3.

В дополнение к геномом, последовательность, методов структурного гена и экспрессию функцию необходимы для содействия гороховой тли как зрелый модельного организма ^4. Мы описали надежные протоколы всей горе- 5-7. РНК-интерференция (RNAi) с помощью двухцепочечной РНК инъекции и кормления был использован для генной глушителей в тлей нимф и взрослых, но стабильные условия для гена нокдаун в эмбрионов пока не сообщается ^8-10. Иммуноокрашивание, подход на основе антител, которые можно обнаружить экспрессию белка в образцах до и после RNAi нокдауна, была выполнена на гороховой тли эмбрионов ^11-13. Тем не менее, увеличение проницаемости тканей и ликвидации фоне окрашивания пока еще неудовлетворительно, используя стандартные протоколы для иммуноокрашивания в бесполых живородящих эмбрионов гороховой тли. Например, мы обнаружили, что проникновение антител к тканям снизилась в gastrulating эмбрионов (стадии 8-10) и, что эмбрионы с морфологически идентифицируемые почки конечностей (стадии 13-14) были едва проницаемой для антител. Кроме того, фон окрашивание визуализировали в бесполого viviparoкомпании эмбрионы гороховой тли окрашенные с помощью антитела против зародышевой линии маркера Васа, а также, что против белка Engrailed / внесенный выраженной в эмбриональных сегментов ^12,13. На самом деле фон окрашивание еще ясно видны в эмбрионах, окрашенных только вторичным антителом.

Для того чтобы увеличить проницаемость без повреждения целостности тканей тли, мы тщательно титруют концентрации протеиназы К, и определяют оптимальные условия для переваривания тканей эмбрионов на тлей. Для того чтобы избежать неспецифического окрашивания в гороховой тли, мы искали соединений, которые могли бы эффективно блокируют эмбрионов и подавления активности эндогенной пероксидазы (POD), фермент, используемый для усиления сигналов во иммунное окрашивание. Блокирующий реагент обеспечивается дигоксигенином (DIG) основе набора буфера, а традиционно используемой нормальной козьей сыворотки (NGS) / бычий сывороточный альбумин (БСА), значительно уменьшается фоновое окрашивание. Кроме того, метанол было обнаружено inhiбит эндогенного POD деятельность более эффективно, чем перекись водорода _(H 2 O _2). Подробнее об этих тлей конкретных условий иммуноокрашивания на зародышах будут описаны в следующих разделах.

Protocol

1. Культура тлей

ПРИМЕЧАНИЕ:. Лаборатория штамм партеногенетической живородящих гороховой тли А Pisum был первоначально собраны в центральной части Тайваня и была дыбы на растениях-хозяевах (Сад горох Pisum посевного или бобы Vicia аба) под длинного дня фотопериода более чем 300 поколений (одно поколение: ~ 10 дней).

1. Прорастание семян
   1. Замочите семена растений-хозяев в водопроводной воде в течение 3-5 дней при комнатной температуре. Залейте свежей водой один раз в день.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, положив семена растений-хозяев прямо в влажную почву может вызвать прорастание, а также.
   2. Вырастить 10 прорастающие семена в небольшой горшок (диаметром 9 см х 7 см высотой) с почвой в камере роста при фотопериод 16 ч света / 8 ч темноты при 20 ° С.
   3. Около 10 дней после начала роста, передачи тлей на растениях, высота которых составляет более 8 см.
2. Передача тлей Храните каждый горшок растений в 1 л стеклянный стакан, передавать 8 взрослых тлей на растениях с использованием кисти, а затем запечатать стакан с воздухопроницаемой крышкой, такой как марля сетки для предотвращения тлей от побега.
3. Инкубируйте тлей в ростовой камере при фотопериод 16 ч света / 8 ч темноты при 20 ° С. Воды каждый цветочный горшок растений один раз в день.
4. Для получения следующего поколения тлей, повторяем шаги 1.1.3-1.2.2 десять дней после первичного переноса тли.

2. Разбор и фиксации яичников

1. Свежий получение 4% параформальдегида (PFA) в 1X фосфатно-солевом буфере (PBS) в качестве буфера фиксации.
2. Заполните одну скважину пятна пластины с PFA (около 500 мкл), поместите пластину под стерео микроскоп на малом увеличении, и погрузите взрослую тля в PFA для вскрытия.
3. Проанализируйте яичники, удерживая голову и живот с одним набором щипцов, разрезав спиннойкутикула живота, и перетащив яичники от брюшной полости.
4. Исправление три пары яичников в 1,5 мл пробирку, содержащую 1 мл PFA при комнатной температуре в течение 20 мин.
5. Слить буфер фиксация с пипетки (из стекла или одноразовые), а затем вымыть яичники с 0,2% Тритон-100 в 1x PBS (PBST) 3 раза в течение 10 минут каждый. Легкая дрожь на смеситель / ротатора (угол поворота: 60 ​​° (F60) / скорость вращения: 8 оборотов в минуту) рекомендуется как для фиксации и стирки.

3. Лечение протеиназы К (PK), чтобы увеличить проницаемость эмбриональных тканей

ПРИМЕЧАНИЕ: лечение ПК применяется для эмбрионов с расширением зоны зародышей дальнейшей стадии (11 развития). Для младших эмбрионов, этот шаг не является обязательным.

1. Серийно разбавить исходный раствор PK (10 мг / мл) с 1x PBS в концентрации 1 рабочий мкг / мл.
2. Инкубируйте яичники с 1 мкг / мл PK (около 500 мкл) в течение 10 мин с умеренным встряхивании.
3. Слить ПК Solutiна и затем промыть яичники 700 мкл глицина (2 мг / мл) 3 раза в течение 5 минут каждый.
4. Промыть яичники с 0,2% PBST в два раза в течение 10 мин каждый.
5. Исправление яичники снова фиксации буфера в течение 15 мин при комнатной температуре при умеренном встр хивании.
6. Удалите супернатант и мыть яичники с 0,2% PBST в два раза в течение 10 мин каждый.

4. Метанол Инкубационный для подавления эндогенной пероксидазы (POD) деятельности

Примечание: Метанол инкубации не применяется к эмбрионов, подвергнутых фаллоидином окрашивания или антитела эпитопов, которые чувствительны метанола.

1. Серийно обезвоживают яичники с различным процентным метанола в 0,2% PBST (объем / объем: 1: 3, 1: 1, 3: 1) путем инкубации яичники при каждой концентрации раствора метанола в течение 10 мин с умеренном перемешивании.
2. Высушить яичники с 100% -ным метанолом в течение 1 часа при комнатной температуре при умеренном встр хивании.
   Примечание: Удовлетворительные результаты окрашивания еще может быть получена из тли тканей, которые были сохранены в 100% метаноле при -20 &# 176; С в течение одного месяца.
3. Серийно увлажняет яичники с различным процентным метанола в 0,2% PBST (объем / объем: 3: 1, 1: 1, 1: 3) путем инкубации яичники при каждой концентрации раствора метанола в течение 10 мин с умеренном перемешивании.

5. Антитела Окрашивание

1. Развести 10x блокирующий раствор из DIG-основе набора буфера (DIG-B), 1x.
   Примечание: Блокирующий раствор 1x DIG-B является более эффективным для снижения фоновое окрашивание, чем стандартным блокирующим реагентом, состоящей из 5% (объем / объем) нормальной козьей сыворотки (NGS) и 0,5% (об / об) альбумина бычьей сыворотки (BSA ) в 0,2% PBST.
2. Инкубируйте яичники с 1x DIG-B блокирующим раствором в течение 2,5 до 4 часов при комнатной температуре или O / N при 4 ° С с мягким встряхиванием.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для трех пар яичников в 1,5 мл трубки, 200 мкл минимальный объем для блокирования образца и окрашивания антител.
3. Слейте супернатант и заменить свежим блокирующего 1x DIG-B раствор, содержащий первичное антитело на соответствующей dilutiна соотношение. Пятно яичники в течение 4 ч при комнатной температуре или O / N при 4 ° С с мягким встряхиванием.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для эксперимента, описанного здесь, используйте следующие оптимальные разведения первичных антител: (1) ApVas1 антител: 1: 500 для окрашивания хромогенным, 1:50 для иммунофлуоресцентного; (2) анти-α тубулина антитела: 1: 500; (3) 4D9 моноклональное антитело: 1:25.
4. Вымойте яичники 0,2% PBST 4 раза в течение 15 мин каждый.
5. Инкубируйте яичники с 1x DIG-B блокирующим раствором в течение 1 часа при комнатной температуре при умеренном встр хивании.
6. Слейте супернатант и заменить свежим 1x блокирование DIG-B раствор, содержащий вторичное антитело на соответствующий коэффициент разбавления. Пятно яичники в течение 4 ч при комнатной температуре или O / N при 4 ° С с мягким встряхиванием.
   1. Используйте следующие коэффициенты разбавления вторичных антител: (1) Для иммунофлюоресцентного окрашивания: 1: 500 для Alexa Fluor 633 козьего анти-кроличьего IgG или Alexa Fluor 488 козьего антитела против IgG мыши; (2) Для хромогенного окрашивания: 1: 200 для биотинилированного козьего антитела IgG кролика.
      Примечание: биотинилированный вторичное антитело применяется для взаимодействия с авидин-биотин-комплекса (ABC) в обнаружении подложки на основе (хромогенного), через которые окрашивающие сигналы значительно усиливается.
   2. Для иммунофлуоресцентного, провести окрашивание в темноте, потому что вторичное антитело является светочувствительным.
7. Смыть вторичного антитела с 0,2% PBST 4 раза в течение 10 мин каждый.

6. Ядерная и F-актин Окрашивание

ПРИМЕЧАНИЕ: Это применяется только для иммунофлуоресцентного.

1. Пятно яичники с 0,2% PBST, содержащем DAPI (2 нг / мкл) и фаллоидином-TRITC (100 нм) в течение 2 ч при комнатной температуре в темноте.
2. Вымойте яичники 0,2% PBST 4 раза в течение 10 мин каждый.
3. Инкубируйте яичники с монтажной средней O / N при 4 ° С с мягким встряхиванием.

7. Разработка сигнала

ПРИМЕЧАНИЕ: Это применяется только для хромогенным окрашивания.

1. Подготовьте 100 мклРеагент авидин-биотин комплекса (ABC) для усиления сигналов, добавляя 1 мкл реагента А (авидин) в 98 мкл 0,2% PBST, тщательно перемешивая с помощью нежного пипетки, и добавление 1 мкл реагента В (биотин, конъюгированного с пероксидазой хрена ), с последующим немедленным перемешиванием. Выдержите смесь в течение 30 мин при комнатной температуре при умеренном встр хивании.
2. Инкубируйте яичников (в том числе диссоциированного яиц камер) в смеси реагентов А и В в течение 30 мин при комнатной температуре при умеренном встр хивании.
3. Смыть смесь реагентов А и В с 0,2% PBST 4 раза в течение 10 мин каждый.
4. Передача яичники погружен в PBST, чтобы хорошо на месте пластины с пластиковой капельницы.
5. Готовят раствор субстрата 3,3'-диаминобензидина (DAB): растворить одну таблетку DAB плюс еще один, содержащий перекись водорода мочевины в 1 мл DDH _{2 O} через энергичном вортексе в течение 1 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: DAB, осаждающим субстрат пероксидазы, является популярным Хромоген для иммунной окраски. Она производит BRсамостоятельно и нерастворимый осадок после окисления с пероксидазой. Слабые сигналы могут быть расширены путем добавления хлорида никеля в растворе субстрата (конечная концентрация 0,05-0,08%).
6. Удалить PBST Раствор, оставшийся в скважине и залить 100 мкл субстрата DAB раствора для развития сигнала.
7. Монитор интенсивности сигналов с помощью стереомикроскопа при малом увеличении.
8. Остановка реакции путем удаления раствора DAB, с последующим заполнением 1х PBS немедленно. Повторите мыть два раза.
9. Перевести яичники обратно в 1,5 мл трубки и затем промыть 1x PBS или ФБРТ дважды в течение 15 мин каждый.
10. Инкубируйте яичники в глицериновой основе монтажа среды (70% глицерин) O / N при 4 ° С с мягким встряхиванием.

8. Монтаж тли эмбрионов

Примечание: толщина эмбрионов варьирует от тли стадиях развития. Монтажные стратегии, таким образом, модифицированный в соответствии рано (germaria и этапы 0-10), середине (этапы11-18), и в конце эмбрионов (стадии 19-20), которые демонстрируются на рис 2B - D. Эмбриональные постановка последовал Miura и др. ¹²

1. Передача яичники вместе с монтажной среды в лоток клеток с пластиковой капельницы и наблюдать образцы с помощью стереомикроскопа при малом увеличении.
2. Разрежьте чашечек, связанные с боковой яйцевода с использованием насекомых булавками, а затем передать изолированных яйцевая трубка с пустой стакан хорошо капельницей. Составьте окончательный объем до 50-100 мкл при помощи монтажного среду.
3. Перенесите яйцевая трубка на слайде со стеклянной пипетки, а затем рассекают яичные камеры, используя насекомых булавками.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для эмбрионов старше этапе 6 развития, отделение яиц камер предложил; для germaria и первых двух яичных камер моложе этапе 6, разделение не является обязательным.
4. Переезд в расчлененный яйцо камеру на чистую слайд с помощью стеклянной пипетки.
5. Положите покровное (размер: 22 х 22мм) над расчлененным germaria или яйцо камер (содержащий эмбрионов на стадии 1-10 развития) медленно, чтобы избежать пузырей.
   1. Гора яйцо камеры (содержащий эмбрионов на стадии развития 11-18) на слайде с односторонним покровного моста и поместите другой покровное (размер: 18 х 18 мм) в верхней части образца.
   2. Гора яйцо камеры (содержащий эмбрионов старше этапе 19 развития) на слайде с двухсторонней покровного моста и поместите другой покровное (размер: 18 х 18 мм) в верхней части образца.
6. Заполните пространство под верхней покровное с монтажными СМИ, чтобы избежать высыхания образца.
7. Мягко катите эмбрион, сдвинув покровное, чтобы получить правильный ориентацию для наблюдения.
8. Печать по краям покровных (в том числе мостовых покровные) с лаком для ногтей.

9. Анализ изображений

1. Фотография дифференциальный интерференционный контраст (DIC) изображений целом монтажа эмбрионов с compouго микроскопа, снабженного DIC оптики и сухой объектива (10X, 20X, 40X) подключен к камере. Установка программного обеспечения для передачи изображений между камерой и компьютером, используя инструкции производителя.
2. Приобретать проекции флуоресцентно меченных эмбрионов с лазерной сканирующей конфокальной микроскопии ^14. Следуйте инструкциям производителя для фотографирования, г-укладка, проектирование и 3D с программным обеспечением обработки изображений.
   1. Включите слайд вниз, найти установленный образец с 10-кратным цель, и обведите область образец с ручкой маслом на основе тонкой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это делает идентификации образца легче при поиске его через целей конфокальной микроскопии.
   2. Добавить каплю масла в верхней части области покровное которого противоположная сторона обозначается как описано в разделе 9.2.1.
3. Найти фокальной плоскости при 40-кратном нефти погружения цели, то изменить к 63x нефти погружения цели. Двигаться вручную мелкий контроля фокуса и сделатьWn, чтобы захватить лучший фокальной плоскости.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для соблюдения структурные детали germaria и ранних эмбрионов, мы предлагаем использовать 40х или тех, с большим увеличением.
4. Сканирование эмбриона в различных каналах возбуждения и получить г-стека изображение.
   Примечание: В гороховой тли тканей, уменьшить толщину каждого оптического участка до 1,5 мкм или менее.

Representative Results

В этом исследовании, мы провели целый монтажа иммуноокрашивания на эмбрионах бесполого гороха тлей (Рис. 1А) Эти женщины производят потомство партеногенетически и viviparously. Эти женщины эмбрионы развиваются в течение яичных палат яичников канальцев (овариол) (рис 1B и 2A Рисунок). Перед микроскопии, рассеченные овариол являются окрашивания цели; Однако разделение яиц камер требуется для наблюдения эмбрионов под микроскопом (Фигура 2В - D).

Повышение проницаемости ткани

Протеиназа К (PK) лечение является стандартным подходом для повышения проницаемости тканей, но и для эмбрионов некоторых модельных организмов, такие как Caenorhabditis Элеганс (нематод), дрозофилы (золы), и Danio rerio (данио) -за шаг является необязательным. В гороховой тли, требование для лечения PK является этап зависит от: для germaria и эмбрионов до гаструляции до (этапы 0-7), лечение ПК может быть опущен; но для эмбрионов под расширением germband (стадия 11), или в более поздних стадиях этот шаг рекомендуется. Например, во время середине сигналов эмбриогенеза были обнаружены в едва эмбрионов без лечения PK (фиг.3А - C). В отличие от этого, интенсивность сигнала была значительно повышена в эмбрионах, подвергнутых ПК пищеварения (фиг.3А '- C', A "- С").

Снижение фона окрашивания

Высокий уровень эндогенной пероксидазы (POD) активности был идентифицирован в эмбриональных тканях тлей. Для подавления активности фермента, эмбрионы параформальдегид фиксированной инкубировали в присутствии HYDrogen пероксид _(H 2 O _2), общая реагент для окисления POD. Наши результаты показали, что _H 2 O ₂ лечение не подавить активность эндогенного POD эффективно в поздней стадии эмбрионов (рис 4А, Д). В отличие от этого, фоновое окрашивание было в значительной степени снижена в эмбрионах, подвергнутых метанола инкубации (фиг.4В, C, E, F). Перед применением первичного антитела эмбрионов были заблокированы в растворе, содержащем БСА и NGS, как описано в стандартных протоколах для окрашивания антител. Однако остаточное фоновое окрашивание в эмбрионах тли был обнаружен (3А '- C'). Эта проблема была решена после замены NGS / BSA с блокирующим реагентом, подаваемого с помощью набора DIG буфера для маркировки экспериментов, таких как гибридизация (Фигура 3А "- С"). Таким образом, мы заключаем, что пост-фиксация с метанолом и инкубации с DIG-Bблокирующий реагент оба важно для снижения фонового окрашивания в эмбрионах тлей.

Лечение ПК и DIG-Б блокировка реагент требуется не только для эффективного обнаружения сигнала с помощью хромогенные но также флуоресцентные подходы. Актина окрашивание фаллоидином или окрашивание на метанол чувствительных эпитопом, однако, не работает в эмбрионах подвергают предварительной фиксации метанолом, которые могут разрушить нативную форму актина или антител. Соответственно, это лечение следует избегать при выполнении флуоресценции иммунное окрашивание. Помимо устранения стадий обработки метанол иммунофлюоресценции позволяет мульти-маркировки эксперименты у эмбрионов тлей. Использование конфокальной микроскопии, например, тля гороховая Vasa1 белок (ApVas1) в половых клетках, альфа-тубулина микротрубочек, в F-актина в микрофиламентов, и ДНК в ядрах может быть одновременно обозначены и визуализировали (5А, В). По сравнению с CHROmogenic метод (5В), конфокальной секционирования флуоресцентно меченных образцов обеспечивает лучшее разрешение локализованных сигналов, таких как ApVas1 в зародышевой плазмы и cellularizing зародышевых клеток в эмбрионы ранней тли (5С ", D - D"). Принятие условий для маркировки зародышевые клетки, описанные выше, белок Engrailed / внесенный в сегментах, проходящей зародышевой полосы также окрашивали антителами 4D9 (рис 6). Это показывает, что наш протокол для иммуноокрашивание, в том числе хромогенными и люминесцентных методов-может эффективно применяться для сигнализации обнаружения как в зародышевой линии и соматическими клеточных линий в тлей.

Рисунок 1. партеногенетические живородящие гороха тли. (А) Первый возрастной стадии нимфы появляются из бесполого живородящих взрослой женщины. (В 12. Яйцевая трубка содержит гермарии в наконечнике (стрелки), 1-2 ооцитов, и 5-7 эмбриональные камер. Гут и конского обычно связаны с расчлененными яичников. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2. Иллюстрация стратегий для монтажа эмбрионов тли на разных стадиях развития. (А) Схема эмбрионального развития в яйцевая трубка расчлененный от партеногенетической живородящих взрослой женщины. Краткое оогенез (germarial этап и этапы 0-2) следует эмбриогенеза (стадии 3-20). План эмбриогенеза: F ormation из-синцитиальный бластодермы (этапы 3-5); бластуляции (этапы 6-7); гаструляции (стадии 8-10); удлинение зародыша группы (этапы 11-14); katatrepsis (этапы 15); Сообщение katatrepsis и зародыш группа отвода (этапы 16-17); органогенез (этапы 18-20). Ключи цвета в нижней части рисунка. (В, В ') гермарии и этапы 0-10 эмбрионов. Нет покровное мост не требуется. (С, С ') Этапы 11-18 эмбрионов. Покровное мост не требуется. (D, D ') Этапы 19-20 эмбрионов. Двойные покровного мосты требуется. Подвижной эмбрионов, сдвинув покровное можете создавать различные углы наблюдения. Размеры: 22 покровные х 22 мм в (б), 18 х 18 мм в (С) и (D). Толщина покровных: 0,13 до 0,16 мм. Эмбриональные постановка последовал Miura и др ¹² Сокращения: G:. Гермарии; ул: стадия..com / файлы / ftp_upload / 53883 / 53883fig2large.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

. Рисунок 3. протеиназы К лечения и сравнение реагентов с различными блокирующими эффекты Передняя яичных камер слева; все точки зрения бокового исключением эмбрионов, показанных на (B ", C ', C"), которые спинной. Эмбрионы все окрашивали ApVas1 антитела (разведение 1: 500) и сигналы ApVas1 разработаны в 10-20 сек. Наконечники указывают расположение половых клеток. (А - С) эмбрионов без лечения протеиназы К (PK). Сигналы ApVas1 в зародышевых клетках едва обнаруживается. (А '- С', А "- С") Сравнение фоне окрашивания в эмбрионов блокарунец с NGS и BSA (A '- C') и коммерческой блокировки реагента в DIG Wash и блок Набор буфера (DIG-B) (A "- C"). Предпосылки значительно снижается в эмбрионах, показанных на (A "- C"). Аббревиатура: B: бактерии. Масштабные бары:. 100 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4.. Минимизация фон окрашивание метанол переднего эмбрионов слева; все взгляды спинной. Эмбрионы обрабатывали PK для увеличения проницаемости антитела. Наконечники указывают расположение половых клеток. (А, В, D, Е) Сравнение обработокс перекисью водорода (H _{2 O 2)} и метанола. Эмбрионы окрашивают только с вторичным антителом. _H 2 O ₂ лечение (0,3% вес / объем, 10 мин): высокий уровень фона (А, D); Лечение метанол (100%, 60 мин): низкий фоновый (В, Е). (C, F) окрашивание первичного антитела на эмбрионах, обработанных метанолом. Условия обработки метанолом идентичны тем, которые используются для эмбрионов, показанных на (В, Е). ApVas1 антитела преимущественно этикетки эмбриональных зародышевых клеток. Масштабные бары:. 100 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5. Иммунофлуоресценции окрашивание на ранних эмбрионов. (A, C - D) и 1: 500 в (B). (А) Окрашивание сигналы, которые включают в себя ApVas1, альфа-тубулина, F-актин, и ядерную ДНК, обнаруженных с помощью четырех каналов с различными длинами волн. Цвет клавиши сигналов показаны в нижней части рисунка. (B), ДВС-синдром образ хромогенным результате для сравнения. ApVas1 обогащается в гермарии то время как интенсивность контраст задней локализации ApVas1 (стрелки) в стадии 3-эмбриона не ясно, как показано на (C, C '). (С, С ') Обогащение сигналов ApVas1 в яйце задней. Сигналы, локализованные в задней области яйцевой камеры (стрелки) усиливаются изображения укладки. Потому что сигналы F-актина и тубулина альфа-частично маскировать ApVas1 в задней (С), изображение получают путем однократного направлены сканирования показана на (C '). (D - D '') конфокальной секционирование ApVas1 локализуется в задней области этап-4 эмбриона. Изображения, показанные в (D) и (D ') будут ApVas1 обнаружен в поверхностных и центральных координационных плоскостей, соответственно. (Д ") является Объединенная образ всех разделов из одного эмбриона как (D) и (D ') Сокращения: как: астра; FC, фолликулярных клеток; ВОУ, перспективного яйцеклетки; SP:. Шпинделя; ТС, трофических шнуров. Масштабные бары:. 10 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 6. Иммуноокрашивание эмбриональных сегментов.Наружные яичных камер слева. PK-лечение эмбрионы окрашивали моноклональных антител 4D9 против Engrailed / внесенный, которые выражаются в эмбриональных сегментов. Цвет клавиши сигналов показаны в нижней части рисунка. (А, А ') Иммунофлуоресценции окрашивание на стадии эмбриона 13-. (А), конфокальной изображения сложены из образов Engrailed / внесенный, альфа-тубулина, F-актин, и окрашивания ядерных ДНК. (А ') конфокальный изображение, показывающее окрашивание только Engrailed / внесенный. Без вмешательства сигналов от других каналов, сигналы лучше отображается. (B, C) ​​хромогенный окрашивание на эмбрионах на стадии 13 и 17, соответственно развития. (Б) Стадия-13 эмбрионов. (С) Стадия-17 эмбрионов. От этапа 13 до 17 лет, растущее число сегментов в животе помечены 4D9. (D) Отрицательный контроль (-Ctrl) пятноING только с вторичным антителом сопряжено с Alexa Fluor 633. Почти нет Иммуноокрашивание сигналы не обнаружены на яйцевая трубка без первичного антитела. Тем не менее, аутофлюоресценция бактерий (пунктирная линия) в пределах стадии 7 и 13 яичных камер обнаружены на длине волны возбуждения 488 нм. Сокращения: A: брюшной полости; B: бактерии; Н: глава; Т: грудная клетка. Масштабные бары:. 100 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

Мы определили оптимальные условия решающее значение для успешного иммуноокрашивания в гороховой тли А. Pisum, появляющаяся модельный организм для геномных исследований и развития ^3,15. Оптимизированные условия для увеличения проницаемости тканей и уменьшения окрашивания усиливается фоновый интенсивность и специфичность сигналов. Они отличаются от стандартных протоколов для иммуноокрашивания в других моделях животных в шагах для создания пор в клеточных мембранах и блокирование неспецифической связывания антитела.

Для иммунного окрашивания и в гибридизация, протеиназы К (PK) пищеварение один из общих подходов для повышения проницаемости тканей ^16-19. В антитела окрашивания тли тканей, наши результаты показывают, что: (1) ПК пищеварения значительно улучшена иммунным окрашиванием сигналы в партеногенетическими живородящим эмбрионов в течение зародышевой расширения диапазона (этапы 11-14) (3В '', C ''), хотяслабые сигналы были еще видны в эмбрионах, лишенных PK лечения (рис 3В, С); и (2) ПК пищеварение было обязательным для эмбрионов katatrepsis дальнейшей стадии (15-20) (рис 4C, F и 6С). Для бесполого живородящих эмбрионов до katatrepsis, объем яиц камер вряд ли причиной проблемы проникновения, так успешно иммуноокрашивание на ранних сексуальных яйцекладущие эмбрионов, проживающих в отложенных яиц-которые почти эквивалентны по размеру наиболее зрелой бесполого яиц chamber- не требует PK пищеварение ^20. Таким образом, удлиняя и складные ростка группы (стадии от 11 до 14) в ограниченном пространстве бесполым яиц камер может помешать вход антителом, и это ПК, который позволяет проникновению антител путем создания пор в клеточных мембранах между застрявшие эмбриональные структуры. В отличие от прямой линии расширение ростка полосы в сексуальных яиц может объяснить, почему он даже в окрашенныхотсутствие PK. Удаление желточная конверте / хориона также можете сделать сексуальные яйценосные эмбрионы более доступным для антител. Для эмбрионов после katatrepsis (стадии от 16 до 20), лечение ПК имеет важное значение для обеих бесполого и полового морф, потому что эмбрионы толщиной cuticled ¹⁹ (рис 4C, F и 6С).

Тем не менее, предложенный условием PK пищеварения (1 мкг / мл в течение 10 мин) требует дополнительной регулировки, если целостность эмбриональных структур или интенсивность сигналов не является удовлетворительным. В основном это вызвано PK деятельности, которые могут варьироваться от партии к партии. Например, если эмбриональные ткани повреждены после PK пищеварения, концентрация ПК может быть уменьшен до 0,5 мкг / мл. Аналогичным образом, если интенсивность сигнала слабый, расширение инкубации 15-20 мин, таким образом, рекомендуется. Наиболее зрелые эмбрионы (стадия 20), подвергнутые длительному PK инкубации до 20 мин при 1,0 мкг / мл концентрации, Хоувер, как правило, отображать слабые сигналы, предполагая, что ПК пищеварение еще неполным. Длительное пищеварения может улучшить окрашивание сигналы, но не является обязательным, особенно когда паттерны экспрессии обнаруженные на стадии 18 эмбрионов, аналогичны в стадии 20 эмбрионов. По сравнению с эмбрионами на стадии 20 развития, этап 18 эмбрионов с аналогичным морфологии еще с меньшим количеством тела кутикулы в целом может дать сильный интенсивность сигнала.

При разработке сигнала, фоновое окрашивание может быть повышен по активности эндогенных энзимов, которые могут перекрестно реагируют с субстратами. В эмбрионов гороховой тли, активность эндогенной щелочной фосфатазы (AP) и пероксидазы (POD), оба из которых являются общими конъюгаты антител для переваривания сигнала субстраты, обнаружено не было. Активной гидролазы эндогенного AP может быть эффективно подавлено во всем эмбриогенеза по левамизол (данные не показаны). Тем не менее, лечение эмбрионов с 0,3-0,6% hydrogан перекиси (H _{2 O 2)} может только устранить эндогенного POD деятельность до katatrepsis, но не было достаточно для пожилых эмбрионов (рис 4А, Д). Метанол инкубации, альтернативным подходом к денатурации эндогенных белков, было показано, чтобы быть эффективным в тлей ²¹ (фиг.4В, E). В отличие от _H 2 O _2, который повреждает тля ткани во время длительной инкубации 30 мин или более, метанол не переварить или деформироваться эмбрионов на любой стадии развития (рис 4C, F). Следовательно, метанол является лучшей альтернативой для подавления эндогенного POD деятельность в эмбрионах тлей. Если остаточное фоновое окрашивание обнаружено, что обычно происходит на зрелых зародышей с утолщенной слой кутикулы, O / N инкубации в метаноле при 4 ° С-по нашему опыту, может дополнительно уменьшить эндогенную POD активность.

Остаточный фоновое окрашивание было обнаружено вЭмбрионы блокировали сывороточных белков, такие как нормальный осла сыворотки (NDS), нормальной козьей сыворотки (NGS), бычий сывороточный альбумин (BSA), или их смесей ¹³ (фиг 3A'-C '). Принятие коммерчески поставляемый блокирующий реагент, используемый для в гибридизация, напротив, оставшаяся фон во иммунным окрашиванием может быть значительно устранены ^{5 (Фигура} 3А '' - C ''). Хотя ингредиенты блокирующего реагента являются собственностью, он скорее всего содержит не-сывороточных белков, которые могут блокировать неспецифические эпитопов гороховой тли белков. Блокирующий реагент также работал намного лучше, чем сывороток животных в персиковой тли Myzus persicae. Точно так же, в М persicae ПК пищеварение и метанол Инкубационный привело в удовлетворительном проникновения антител и уменьшения фона -. По аналогии с улучшенными достигнутых результатов в А. Pisum (данные не показаны). Мы ожидаем, что условия optimizред для увеличения проницаемости тканей и уменьшения фона, используется ли хромогенную окрашивание или флуоресценции, будут применяться ко многим другим видам тлей.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% hydrogen perxidase (H2O2)	Sigma-Aldrich	18304	For bleaching endogenous peroxidase of embryos.
4’6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542	For labeling the double-strand DNA. TOXIC. Wear gloves, dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure
4D9 anti-engrailed/invected mouse monoclonal antibody	Developmental studies hybridoma bank	AB_528224	For labeling the developing segments of embryo.
ApVas1 rabbit polyclonal antibody	Our laboratory	N/A	For labeling the aphid germline specific Vas1 protein in embryos. This antibody was made by our laboratory.
Austerlitz Insect pins	ENTOMORAVIA	N/A	For seperating each egg chambers from an ovariole. Size 000, BLACK ENAMELLED.
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	9048-46-8	For blocking the non-specific binding of antibodies.
Camera connted to compound microscope	Canon	EOS 5D	For photographing of aphid embryos.
Colorimetric 8 cell tray	Kartell Labware	357	For developing the staining signal of aphid embryos. Diameter 95 x 57 mm, cell depth 2 mm.
Compound microscope with DIC optics	Leica Microsystems	DMR	For photographing of aphid embryo mounted on the slides.
DIG Wash and Block Buffer Set	Sigma-Aldrich (Roche)	11585762001	For blocking the non-specific binding of antibodies. We diluted the 10x Blocking solution into 1x as blocking reagent.
Forceps	Ideal-tek	N/A	For dissection of ovaries from aphids. Manufacturer part No 5: 5 SA.
Glass dropper	N/A	N/A	For transfering ovaries of aphids from the splot plate to tubes. 150 mm of total length and 5 3/4" of tip length.
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	For clearing of aphid embryos and mounting.
Glycine	Bioshop	N/A	For blocking the enzyme activity of proteinase K (PK).
Goat anti-mouse IgG conjugated Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11017	For detection of primary antibody from mouse.
Goat anti-rabbit IgG conjugated Alexa Fluor 633	Invitrogen	A21072	For detection of primary antibody from rabbit.
Intelli mixer	ELMI laboratory equipment	RM-2M	For improving the thorughly reaction of reagents with ovaries.
Laser-scanning confocal microscopy	Leica Microsystems	SP5	For photographing of aphid embryo mounted on the slides with florecent tag.
methanol	Burdick and Jackson	AH2304	For bleaching endogenous peroxidase of embryos.
Microscope slides	Thermo scientific	10143560	For mounting of embryos. SUPERFROST ground edges, ca./env. 76 x 26 mm.
Microscope Cover glasses	Marienfeld	0101030	For mounting embryos on the slides. Size 18 x 18 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
Microscope Cover glasses	Marienfeld	0101050	For mounting embryos on the slides. Size 22 x 22 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
mouse monoclonal anti-alphaTubulin antibody (DM1A)	Santa Cruz Biotechnology	sc-32293	For labeling the distrbution of alpha-tubulin of cells.
Nail polish	N/A	N/A	For sealing the coverslips on the slides.
Normal goat serum (NGS)	Sigma-Aldrich	G9023	For blocking the non-specific binding of antibodies.
Paraformaldehyde (PFA)	VWR	MK262159	For fixation of aphid ovaries.
Phalloidin-TRITC	Sigma-Aldrich	P1951	For labeling the distrbution of F-actin on embryos.
Phosphate-buffered saline (PBS)	N/A	N/A	As isotonic solution for aphid ovaries.
Plastic dropper	N/A	N/A	For transfering ovaries of aphids from tube to cell tray. Size 3 ml.
Proteinase K	Merck	124678	For creating pores (punching) on the cell membrane and facilitating the access of antibodies.
Pyrex spot plate	N/A	N/A	For dissection and color reactions of aphid ovaries under microscopy. Each cavity with diameter 22 mm and  depth 7 mm.
SIGMAFAST 3,3’-diaminobenzidine (DAB) tablets	Sigma-Aldrich	D4168	For developing of substrated signals. Also called DAB peroxidase substrate tablet set.
Stereo microscope	Leica Microsystems	EZ4	For dissection and observation of aphid ovaries.
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	T8787	For creating pores (punching) on the cell membrane.
VECTASHIELD Elite ABC Kit (Rabbit IgG)	Vector laboratories	PK-6101	For enhancement of the signal. Including of biotinylated goat anti-rabbit IgG secondary antibody, A and B reagents.
VECTASHIELD mounting medium	Vector laboratories	H1000	For clearing of aphid embryos and mounting.