Identificação de condições críticas para Immunostaining no Pea Aphid Embriões: Aumento Tissue permeabilidade e diminuir a coloração de fundo

Abstract

O Acyrthosiphon pisum ervilha pulgão, com um genoma seqüenciado e abundante plasticidade fenotípica, tornou-se um modelo emergente para estudos genômicos e de desenvolvimento. Como outros pulgões, A. Pisum propagar rapidamente via reprodução vivípara parthenogenetic, onde os embriões se desenvolvem dentro de câmaras de ovo em uma forma de linha de montagem na ovaríolo. Anteriormente nós estabelecemos uma plataforma robusta de todo-mount hibridização in situ permitindo a detecção da expressão de mRNA nos embriões de afídeos. Para analisar a expressão de proteínas, no entanto, os protocolos estabelecidos para a imunocoloração os ovarioles de pulgões assexuadas vivíparos não produziu resultados satisfatórios. Aqui nós relatamos condições otimizadas para aumentar a permeabilidade dos tecidos e diminuição da coloração de fundo, sendo que ambos foram problemas ao aplicar abordagens estabelecidas. Optimizações incluem: (1) incubação de proteinase K (1 ug / ml, 10 min), o qual foi encontrado f essencialou a penetração de anticorpos em embriões de médio e em estágio final de pulgões; (2) a substituição de albumina sérica de soro de cabra / bovina normal com um reagente de bloqueio fornecido por um digoxigenina (DIG) -based conjunto de tampões e (3) aplicação de metanol em vez de peróxido de hidrogénio (H _{2 O 2)} para o branqueamento da peroxidase endógena; que reduziu significativamente a coloração de fundo nos tecidos de afídeos. Estas condições críticas optimizadas para imunocoloração permitirá a detecção eficaz de produtos de genes em embriões de A. Pisum e outros pulgões.

Introduction

Pulgões são insetos hemípteros com pequenos (1-10 mm) corpos macios. Eles se alimentam de plantas sugando a seiva floema com mouthparts piercing. Além disso, eles contam com uma bactéria endosymbiotic obrigatório, Buchnera aphidicola, para sintetizar aminoácidos essenciais que são deficientes na dieta seiva floema. Pulgões tem uma história de vida complexo que inclui reprodução vivípara parthenogenetic durante a primavera eo verão fotoperíodo longo dia e reprodução ovípara sexual desencadeada por fotoperíodos de curto-dia durante o qual eles estabelecem um número limitado de ovos overwintering ^1,2. Na Primavera esses ovos eclodem para produzir a primeira geração de todo-fêmea pulgões (fundatrices), na sequência de muitas rodadas de reprodução parthenogenetic até o outono. A partenogênese cíclico em pulgões, onde fases sexuada e assexuada, alternam no ciclo de vida anual, tem sido considerada como um ^1,2 novidade evolucionária. Nos pulgões vivíparos partenogenéticas, Embriogênese ocorre dentro de câmaras de ovos dos túbulos ovarianos (ovaríolos). Em contrapartida, os embriões ovíparos sexuais desenvolver nos ovos fertilizados. Além de plasticidade reprodutiva, os pulgões podem exibir transgeracional polifenismo asa: em resposta a sinais de superlotação e ameaças de predadores, as fêmeas assexuadas unwinged pode vivíparos produzir descendentes voado para a migração de longa distância. Publicação da sequência do genoma do pulgão da ervilha pisum Acyrthosiphon -a primeira sequência de genoma para uma basal inseto-hemimetabolous permite uma maior exploração da plasticidade reprodutiva, asa polifenismo, e outros recursos, incluindo interações inseto-planta, vetorização viral e simbiose em pulgões em um molecular ³ base.

Além do genoma sequenciado, ferramentas para caracterizar expressão e função do gene são necessários para promover o afídeo da ervilha como um organismo modelo ⁴ madura. Nós descrevemos protocolos robustos de todo-mount 5-7. Interferência de RNA (RNAi), através de injecção de ARN de cadeia dupla e de alimentação foi usado para silenciamento de genes em ninfas de afídeos e adultos, mas condições estáveis ​​para o gene knockdown nos embriões não foram ainda relatados ^8-10. A imunocoloração, uma abordagem baseada em anticorpo que se pode detectar a expressão de proteínas em amostras antes e depois de ARNi knockdown, foi realizada em embriões de ervilha ^11-13 afídeos. No entanto, o aumento da permeabilidade do tecido e a eliminação de coloração de fundo é ainda insatisfatória utilizando protocolos convencionais para a imunocoloração nas embriões vivíparos assexuadas de ervilha pulgão. Por exemplo, verificou-se que a penetração do anticorpo aos tecidos diminuiu em embriões gastrulating (fases 8-10) e que os embriões com brotos dos membros morfologicamente identificáveis ​​(etapas 13-14) eram pouco permeável ao anticorpo. Além disso, a coloração de fundo foi visualizado no viviparo assexuadaUS embriões de afídeos de ervilha coradas utilizando o anticorpo contra o marcador da linha germinativa dos vasos, bem como contra a proteína que Engrailed / Invected expressa nos segmentos embrionárias ^12,13. Na verdade, a coloração de fundo foi ainda claramente visível em embriões corados com o anticorpo secundário sozinho.

A fim de aumentar a permeabilidade, sem danificar a integridade dos tecidos de afídeos, cuidadosamente titulada a concentração de proteinase K e determinaram as condições óptimas para a digestão de tecidos de embriões de afídeos. A fim de evitar coloração não específica na ervilha pulgão, temos procurado por compostos que poderia bloquear eficazmente os embriões e suprimir a actividade endógena de peroxidase (POD), uma enzima utilizada para amplificar os sinais durante a imunocoloração. Um reagente de bloqueio proporcionada por uma digoxigenina (DIG) -based conjunto tampão, em vez do soro de cabra normal utilizado tradicionalmente (NGS) / albumina do soro bovino (BSA), reduziu significativamente a coloração de fundo. Além disso, o metanol foi encontrado para inhimordeu a actividade POD endógena mais eficaz do que o peróxido de hidrogénio (H _{2 O 2).} Os detalhes a respeito dessas condições específicas de afídeos para immunostaining sobre os embriões serão descritos nas seções a seguir.

Protocol

1. Cultura de pulgões

NOTA:. A cepa laboratorial da parthenogenetic viviparous ervilha pulgão A pisum foram originalmente coletadas no centro de Taiwan e tem sido criados em plantas hospedeiras (a sativum jardim ervilha Pisum ou fava Vicia faba) sob longo dia fotoperíodo para mais de 300 gerações (uma geração: ~ 10 dias).

1. Germinação de sementes
   1. Mergulhe as sementes de plantas hospedeiras em água corrente por 3-5 dias em temperatura ambiente. Reabastecer com água fresca, uma vez por dia.
      NOTA: Como alternativa, colocando sementes de plantas hospedeiras em linha reta em solo úmido pode induzir a germinação também.
   2. Crescer 10 sementes germinam em uma panela pequena (9 cm de diâmetro x 7 cm de altura) com solo na câmara de crescimento sob fotoperíodo de 16 horas de luz / 8 h escuro, a 20 ° C.
   3. Cerca de 10 dias após o crescimento começa, transferir pulgões sobre as plantas cuja altura é de mais de 8 cm.
2. Transferência de pulgões Mantenha cada vaso de plantas dentro de um copo de vidro de 1 L, transferir 8 pulgões adultos em plantas usando um pincel, e, em seguida, selar o copo com uma tampa permeável ao ar, como malha gaze para evitar a fuga dos pulgões.
3. Incubar pulgões em uma câmara de crescimento sob fotoperíodo de 16 horas de luz / 8 h escuro, a 20 ° C. Regue cada vaso de plantas uma vez por dia.
4. Para obter a próxima geração de pulgões, reiterar passos 1.1.3-1.2.2 dez dias após a transferência pulgão primário.

2. Dissecção e Fixação de Ovários

1. Recentemente preparar 4% de paraformaldeído (PFA) em solução salina tamponada 1x com fosfato (PBS) como o tampão de fixação.
2. Encha um poço de uma placa de ponto com PFA (cerca de 500 mL), colocar a placa sob um microscópio estéreo com pequeno aumento, e submergir um pulgão adulto dentro da PFA para dissecção.
3. Dissecar ovários, segurando a cabeça e abdômen com um conjunto de pinças, cortando abrir o dorsalcutícula do abdómen, e arrastando os ovários de distância a partir da cavidade abdominal.
4. Fix três pares de ovários em um tubo de 1,5 ml contendo 1 ml de PFA à TA durante 20 min.
5. Decantar tampão de fixação com uma pipeta de transferência (de vidro ou descartável) e, em seguida, lavar ovários com 0,2% de Triton X-100 em PBS 1x (PBST) 3 vezes durante 10 minutos cada. Leve agitação num misturador / rotador (ângulo de rotação: 60 ° (F60) / velocidade de rotação: 8 RPM) é recomendado tanto para a fixação e lavagem.

3. O tratamento com proteinase K (PK) para aumentar a permeabilidade dos tecidos embrionários

NOTA: tratamento PK é aplicada a embriões de extensão banda germe em diante (estágio 11 de desenvolvimento). Para os embriões jovens, este passo é opcional.

1. Serialmente diluir a solução mãe de PK (10 mg / ml) com 1x PBS para a concentração de trabalho de 1 ug / ml.
2. Incubar ovários com 1 ug / mL de PK (cerca de 500 mL) durante 10 minutos com agitação suave.
3. Decantar PK solutiem seguida, lavar e os ovários com 700 ul de glicina (2 mg / ml) 3 vezes durante 5 minutos cada.
4. Lavar ovários com PBST 0,2% duas vezes durante 10 minutos cada.
5. Fix ovários novamente com tampão de fixação durante 15 min à temperatura ambiente com agitação suave.
6. Elimine o sobrenadante e lava-se com 0,2% ovários PBST duas vezes durante 10 minutos cada.

4. Metanol Incubação para suprimir a peroxidase endógena (POD) atividade

NOTA: O metanol incubação não é aplicada aos embriões sujeitos a phalloidin de coloração ou epítopos de anticorpos que são metanol sensível.

1. Desidratar ovários em série com diferentes percentagens de metanol em PBST 0,2% (v / v: 1: 3, 1: 1, 3: 1) através da incubação de ovários em cada concentração da solução de metanol durante 10 min com agitação suave.
2. Desidratar ovários com 100% de metanol durante 1 hora à TA com agitação suave.
   NOTA: Resultados satisfatórios de coloração pode ser ainda obtido a partir de tecidos de pulgões que foram armazenados em 100% de metanol a -20 &# 176; C, durante um mês.
3. Seriadamente reidratar ovários com diferentes percentagens de metanol em PBST 0,2% (v / v: 3: 1, 1: 1, 1: 3) através da incubação de ovários em cada concentração da solução de metanol durante 10 min com agitação suave.

5. Coloração de anticorpos

1. Diluir a solução 10x de bloqueio do conjunto tampão à base de DIG (DIG-B) para 1x.
   NOTA: A solução de bloqueio 1x DIG-B é mais eficaz para a redução da coloração de fundo de reagente padrão de bloqueio composto por 5% (v / v) de soro de cabra normal (NGS) e 0,5% (v / v) de albumina de soro bovino (BSA ) em 0,2% de PBST.
2. Incubar os ovários com a solução 1x DIG-B bloqueio durante 2,5 a 4 horas à temperatura ambiente ou O / N a 4 ° C com agitação suave.
   NOTA: Para três pares de ovários em um tubo de 1,5 ml, 200 ul é o volume mínimo para o bloqueio por amostra e coloração com anticorpo.
3. Decantar o sobrenadante e substituir com solução de bloqueio 1x DIG-B fresco contendo o anticorpo primário em diluti apropriadoem proporção. Manchar os ovários durante 4 horas à temperatura ambiente ou O / N a 4 ° C com agitação suave.
   NOTA: Para o experimento descrito aqui, use as seguintes diluições ideais de anticorpos primários: (1) ApVas1 anticorpos: 1: 500 para a coloração cromogénico, 1:50 para imunofluorescência; (2) anticorpo anti-tubulina α: 1: 500; (3) o anticorpo monoclonal 4D9: 01:25.
4. Lavar ovários com 0,2% PBST 4 vezes durante 15 minutos cada.
5. Incubar ovários com solução de bloqueio 1x DIG-B durante 1 hora à TA com agitação suave.
6. Decantar o sobrenadante e substituir com frescos solução de bloqueio DIG-B 1x contendo anticorpo secundário em razão de diluição apropriado. Manchar os ovários durante 4 horas à temperatura ambiente ou O / N a 4 ° C com agitação suave.
   1. Use as seguintes razões de diluição de anticorpos secundários: (1) Para a coloração de imunofluorescência: 1: 500 para Alexa Fluor 633 IgG de cabra anti-coelho ou de cabra Alexa Fluor 488 anti-IgG de ratinho; (2) Para a coloração cromogénico: 1: 200 de IgG de cabra biotinilada anti-coelho.
      NOTA: O anticorpo secundário biotinilado é aplicada para interagir com o complexo avidina-biotina (ABC) na (cromogénica) a detecção baseada em substrato, através do qual os sinais são amplificados significativamente coloração.
   2. Para imunofluorescência, realizar coloração no escuro, porque o anticorpo secundário é sensível à luz.
7. Lavar anticorpo secundário com 0,2% PBST 4 vezes durante 10 minutos cada.

6. Nuclear e F-actina Coloração

NOTA: Isto só é aplicada por imunofluorescência.

1. Mancha ovários com 0,2% PBST contendo DAPI (2 ng / ul) e faloidina-TRITC (100 nM) durante 2 horas à temperatura ambiente no escuro.
2. Lavar ovários com 0,2% PBST 4 vezes durante 10 minutos cada.
3. Incubar ovários com o meio de montagem O / N a 4 ° C com agitação suave.

7. Desenvolvimento de sinal

NOTA: Isto só é aplicada para a coloração cromogênico.

1. Preparação de 100 ul dereagente de avidina-biotina (ABC) para reforçar os sinais através da adição de 1 ml de reagente A (avidina) em 98 ul de 0,2% de PBST, misturando cuidadosamente através de pipetagem suave, e adicionando 1 ml de reagente B (biotina conjugado com peroxidase de rábano ), seguido de mistura imediata. Incubar a mistura durante 30 min à temperatura ambiente com agitação suave.
2. Incubar ovários (incluindo as câmaras de ovo dissociados) na mistura de reagentes A e B durante 30 min à temperatura ambiente com agitação suave.
3. Lavar a mistura de reagentes A e B com 0,2% de PBST 4 vezes durante 10 minutos cada.
4. Transferir ovários submersas em PBST a um poço na placa de ponto com um conta-gotas de plástico.
5. Preparar a solução de substrato de 3,3'-diaminobenzidina (DAB): dissolver um comprimido DAB mais outra contendo peróxido de hidrogénio ureia em 1 ml de _ddH2O através de vórtice vigoroso durante 1 min.
   NOTA: DAB, um substrato precipitante de peroxidase, é um cromogénio popular para immunostaining. Ela produz uma brprecipitado insolúvel próprio e depois de ter sido oxidado pelo peroxidase. Os sinais fracos podem ser melhorados pela adição de cloreto de níquel para a solução de substrato (concentração final de 0,05-0,08%).
6. Remover a solução de PBST remanescente no poço e voltar a encher com 100 uL da solução de substrato DAB para o desenvolvimento do sinal.
7. Monitorar a intensidade de sinais sob um microscópio estéreo em baixa ampliação.
8. Pare reacções removendo a solução DAB, seguido de reenchimento com 1x PBS imediatamente. Repita a lavagem duas vezes.
9. Transferir ovários de volta para o tubo de 1,5 ml e, em seguida, lava-se com 1x PBS ou PBST duas vezes durante 15 minutos cada.
10. Incubar ovários em um meio à base de glicerol de montagem (70% de glicerol) O / N a 4 ° C com agitação suave.

8. Montagem do Aphid Embriões

NOTA: A espessura de embriões de afídeos varia entre fases de desenvolvimento. Estratégias de montagem são, portanto, modificado para atender precoces (germaria e encena 0-10), meio (estágios11-18), e tardios embriões (etapas 19-20), que são mostrados na Figura 2B - D. Estadiamento embrionário seguido Miura et ^al 12.

1. Transferir ovários junto com meio de montagem para a bandeja de celular com um conta-gotas plástico e observar amostras sob um microscópio estéreo em baixa ampliação.
2. Corte os cálices associados ao oviduto lateral usando os pinos de insetos e, em seguida, transferir uma ovaríolo isolado para um copo vazio bem com um conta-gotas. Faça-se o volume final de 50-100 ul usando meio de montagem.
3. Transferir uma ovaríolo para o slide com um conta-gotas de vidro e depois dissecá câmaras de ovo usando os pinos de insetos.
   NOTA: Para os embriões com mais de 6 fase de desenvolvimento, sugere a separação de câmaras de ovos; para germaria e as duas primeiras câmaras de ovos com menos de fase 6, a separação é opcional.
4. Mudaria de uma câmara de ovo dissecado para uma lâmina limpa usando um conta-gotas de vidro.
5. Coloque uma lamela (tamanho: 22 x 22mm) ao longo dos germaria dissecados ou câmaras de ovos (contendo embriões em estágios de desenvolvimento 1-10) lentamente para evitar bolhas.
   1. Câmaras de Mount ovo (contendo embriões em estágios do desenvolvimento 11-18) em um slide com a ponte lamela unilateral e colocar outra lamela (tamanho: 18 x 18 mm) no topo da amostra.
   2. Câmaras de Mount ovo (contendo embriões com idade superior a 19 etapa do desenvolvimento) em um slide com ponte dupla face lamela e colocar outra lamela (tamanho: 18 x 18 mm) no topo da amostra.
6. Encha o espaço sob o topo lamela com meios de montagem para evitar a secagem da amostra.
7. Ligeiramente role o embrião deslizando a lamela para obter a orientação certa para observação.
8. Selar em torno da borda de lamelas (incluindo as lamelas ponte) com unha polonês.

9. Análise de Imagem

1. Fotografia contraste de interferência diferencial (DIC) imagens de toda montagem embriões com um compouND microscópio equipado com DIC óptica e uma lente objectiva seco (10X, 20X, 40X) ligado a uma câmara. Instale o software para transferência de imagens entre a câmera eo computador usando as instruções do fabricante.
2. Adquirir projeções dos embriões fluorescente etiquetado com uma varredura a laser confocal microscópio ^14. Siga as instruções do fabricante para fotografar, z-empilhamento, e projetando 3D com software de imagem.
   1. Vire o slide de cabeça para baixo, encontrar a amostra montada com objetivo de 10X, e circundar a área da amostra com uma caneta com base oleada bem.
      NOTA: Isso faz com identificação da amostra mais fácil quando procurá-lo através de objectivos de um microscópio confocal.
   2. Adicionar uma gota de óleo na parte superior da área de lamela cujo lado oposto é rotulado como descrito no ponto 9.2.1.
3. Encontre o plano focal em 40X objetivo de imersão em óleo, em seguida, mudar para um objetivo de imersão em óleo 63X. Mova manualmente o controle de foco fino e fazerwn para capturar o melhor plano focal.
   NOTA: Para observar detalhes estruturais da germaria e embriões, sugerimos o uso 40X objetivos ou aqueles com maior ampliação.
4. Digitalizar o embrião em diferentes canais de excitação e obter uma imagem de z-stack.
   NOTA: Para tecidos de afídeos de ervilha, reduzir a espessura de cada secção óptica até 1,5 m ou menos.

Representative Results

Neste estudo, realizamos todo mount-immunostaining em embriões de afídeos de ervilha assexuados (Figura 1A). Estas fêmeas produzir descendentes partenogeneticamente e vivíparos. Estes embriões femininos se desenvolvem em câmaras de ovo dos túbulos do ovário (ovarioles) (Figura 1B e Figura 2A). Antes de microscopia, os ovaríolos dissecados são os alvos de coloração; No entanto, a separação de câmaras de ovo é necessário para a observação dos embriões sob um microscópio (Figura 2B - D).

Aumento da permeabilidade dos tecidos

Proteinase K (PK) de tratamento é uma abordagem padrão para aumentar a permeabilidade do tecido, mas para embriões de alguns organismos-modelo tais como Caenorhabditis elegans (nematóides), Drosophila melanogaster (mosca) e Danio rerio, (peixe-zebra) -este etapa é opcional. No ervilha pulgão, a necessidade de tratamento com PK é dependente da fase: de germaria e embriões antes da gastrulação (etapas 0-7), tratamento com PK pode ser omitida; mas para os embriões com menos de extensão germband (fase 11) ou em estágios mais avançados essa etapa é altamente recomendada. Por exemplo, durante a embriogénese sinais de idade foram apenas detectados em embriões sem tratamento com PK (Figura 3A - C). Pelo contrário, a intensidade do sinal foi significativamente aumentada em embriões sujeito a digestão com PK (Figura 3A '- C', A "- C").

A redução da coloração de fundo

Um nível elevado de actividade da peroxidase endógena (POD) foi identificada em tecidos embrionários de pulgões. Para suprimir esta actividade enzimática, os embriões foram fixados em paraformaldeído incubadas na presença de HYDrogen peróxido (H _{2 O 2),} um reagente comum para a oxidação de POD. Os nossos resultados mostraram que o H _{2 O 2} tratamento não suprimir a actividade endógena de POD eficazmente nos embriões de fase final (Figura 4A, D). Em contraste, a coloração de fundo foi largamente reduzida em embriões sujeitos a metanol incubação (Figura 4B, C, E, F). Antes da aplicação dos anticorpos primários embriões foram bloqueadas em solução contendo NGS e BSA, como descrito em protocolos convencionais para coloração de anticorpos. No entanto, a coloração de fundo residual nos embriões de afídeos foi detectada (Figura 3A '- C'). Este problema foi resolvido depois de substituir NGS / BSA com o reagente de bloqueio fornecido por um conjunto de tampão para as experiências DIG-rotulagem, tais como hibridação in situ (Figura 3A "- C"). Nós, portanto, concluir que a pós-fixação com metanol e incubação com o DIG-Breagente de bloqueio são essenciais para reduzir a coloração de fundo nos embriões de afídeos.

Tratamento com PK e o reagente de bloqueio DIG-B são necessários não só para a detecção de sinal eficaz usando os dois métodos cromogénicos, mas também fluorescentes. A actina com faloidina coloração ou coloração para epitopo sensível ao metanol, no entanto, não funciona em embriões submetida a um pré-fixação com metanol, o que pode destruir a forma nativa da actina ou anticorpos. Por conseguinte, este tratamento deve ser evitado ao realizar fluorescência imunocoloração. Além de eliminar as etapas de tratamento metanol imunofluorescência permite experimentos multi-rotulagem nos embriões de afídeos. Usando a microscopia confocal, por exemplo, proteína de ervilha pulgão Vasa1 (ApVas1) em células germinativas, α-tubulina em microtúbulos, F-actina em microfilamentos, e ADN em núcleos poderia ser visualizado simultaneamente e marcado (Figura 5A, C). Em comparação com o crométodo mogenic (Figura 5B), confocal seccionamento amostras de fluorescente etiquetado oferece melhor resolução de sinais localizada tal como ApVas1 nos germoplasma e cellularizing células germinativas em embriões de afídeos precoce (Figura 5C ', D - D "). Adotando as condições de rotulagem células germinais acima descritos, a proteína Engrailed / Invected em segmentos da banda germinal que se estende também foi corado com o anticorpo 4D9 (Figura 6). Isto mostra que o nosso protocolo para-imunocoloração incluindo cromogénicos e fluorescentes métodos pode ser efectivamente aplicado a um sinal de detecção em ambas linhagens de linha germinal e células somáticas em afídeos.

Figura 1. partenogenética afídeos de ervilha vivíparos. (A) A primeira-instar ninfa emergente de um adulto do sexo feminino viviparous assexuada. (B 12 estirpes. Um ovaríolo contém um germário na ponta (setas), 1-2 e 5-7 oócitos, câmaras embrionárias. Gut e cauda são normalmente associados com os ovários dissecados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Ilustração de estratégias para a montagem de embriões de afídeos em diferentes fases de desenvolvimento. (A) Esquema de desenvolvimento embrionário no ovaríolo dissecados a partir de uma fêmea adulta partenogenético vivíparos. Breve oogenesis (estágio germarial e estágios 0-2) é seguido por embriogênese (etapas 3-20). Esboço de embriogênese: f ormação de sincicial blastoderm (estágios 3-5); blastulação (estágios 6-7); gastrulação fases (8-10); alongamento da banda germe fases (11-14); katatrepsis (encena 15); pós katatrepsis e germe banda de retração (estágios 16-17); organogênese (estágios 18-20). Chaves de cor estão na parte inferior da figura. (B, B ') germário e encena 0-10 embriões. Nenhuma ponte lamela é necessária. (C, C ') Fases 11-18 embriões. Uma ponte lamela é necessária. (D, D ') Fases 19-20 embriões. Pontes lamela duplas são obrigatórios. Rolando os embriões deslizando a lamela pode criar diferentes ângulos de observação. Tamanhos de lamelas: 22 x 22 mm em (B), 18 x 18 mm em (C) e (D). A espessura das lamelas: 0,13 a 0,16 mm. Estadiamento embrionário seguido Miura et ^al 12 Abreviaturas: g:. Germário; st: palco..com / files / ftp_upload / 53883 / "target =" _ blank 53883fig2large.jpg "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

. Figura 3. o tratamento com proteinase K e comparação dos reagentes com diferentes efeitos de bloqueio anterior, câmaras de ovo é para a esquerda; todas as vistas lateral, excepto embriões são mostrados em (B ", C", C "), que são dorsal. Os embriões são coradas utilizando anticorpo ApVas1 (diluição 1: 500) e sinais de ApVas1 são desenvolvidos dentro de 10-20 segundos. As setas indicam a localização de células germinativas. (A - C) Os embriões sem tratamento de proteinase K (PK). Sinais ApVas1 em células germinativas são mal detectada. (A '- C', A "- C") Comparação de coloração de fundo em bloco embriõesked com NGS e BSA (A '- C') e do reagente de bloqueio comercial na DIG Wash e Block Buffer de Jogo (DIG-B) (A "- C"). O fundo é significativamente reduzida em embriões mostrados em (A "- C"). Abreviatura: b: bactérias. Barras de escala:. 100 mm Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

. Figura 4. Minimizando coloração de fundo com metanol anterior de embriões é para a esquerda; todos os pontos de vista são dorsal. Os embriões são tratadas com PK para aumentar a permeabilidade de anticorpo. As setas indicam a localização de células germinativas. (A, B, D, E) Comparação de tratamentoscom peróxido de hidrogénio (H _{2 O 2)} e metanol. Embriões só são corados com anticorpo secundário. H _{2 O 2} de tratamento (0,3% w / v, 10 min): elevada interferência de fundo (A, D); tratamento metanol (100%, 60 min): baixo fundo (B, E). (C, F) de coloração de anticorpo primário em embriões tratados com metanol. Condições de tratamento metanol são idênticos aos utilizados para os embriões mostrados em (B, E). O anticorpo ApVas1 preferencialmente rotula as células germinativas embrionárias. Barras de escala:. 100 mm Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5. Imunofluorescência coloração em embriões precoces. (A, C - D) e 1: 500 em (B). (A), sinais de coloração, que incluem ApVas1, α-tubulina, F-actina, e DNA nuclear, são detectados por meio de quatro canais com diferentes comprimentos de onda. Teclas de cor dos sinais que são mostradas na parte inferior da figura. (B) Imagem de DIC resultado cromogénico para comparação. ApVas1 é enriquecido dentro do germário Considerando que a intensidade do contraste de posterior localização de ApVas1 (setas) no embrião fase-3 não é tão clara como a mostrada em (C, C '). (C, C ') Enriquecimento de sinais em ApVas1 posterior ovo. Os sinais localizados na região posterior da câmara do ovo (pontas de seta) são reforçadas por imagem de empilhamento. Dado que os sinais de F-actina e α-tubulina parcialmente mascarar os de ApVas1 na região posterior (C), uma imagem produzida por um único varrimento canalizada é mostrado em (C '). (D - D '') de corte confocal de ApVas1 localizada na região posterior da fase-4 embrião. As imagens mostradas em (D) e (D ') são ApVas1 detectado em superfície e planos focais centrais, respectivamente. (D ") é a imagem mesclada de todas as seções do mesmo embrião como (D) e (D ') Abreviaturas: como: aster; fc, células do folículo; poc, oócito prospectivo; sp:. Eixo; tc, cabos tróficos. Barras de escala:. 10 m Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6. A imunocoloração em segmentos embrionárias. Umterior das câmaras de ovo é para a esquerda. Embriões tratados com PK estão manchadas com o anticorpo monoclonal 4D9 contra Engrailed / Invected, que são expressos em segmentos embrionárias. Teclas de cor dos sinais que são mostradas na parte inferior da figura. (A, A ') imunofluorescência em um estágio embrionário-13. (A), uma imagem confocal empilhados a partir de imagens de Engrailed / Invected, α-tubulina, actina F, e colorações nucleares de ADN. (A?) Uma imagem confocal mostrando a coloração de apenas Engrailed / Invected. Sem a interferência de sinais de outros canais, os sinais são mais bem visualizada. (B, C) ​​Chromogenic coloração em embriões em estágios 13 e 17 de desenvolvimento, respectivamente. (B) Fase-13 embrião. (C) Fase-17 embrião. De 13 a 17 estágios, o número crescente de segmentos no abdômen são rotulados por 4D9. (D) Controle negativo (-Ctrl) manchaing apenas com anticorpo secundário conjugado com Alexa Fluor 633. Quase não há sinais de positividade são detectados em ovaríolo sem anticorpo primário. No entanto, autofluorescência de bactérias (linha traço) no estágio 7 e 13 de câmaras de ovos são detectados no comprimento de onda de excitação 488 nm. Abreviaturas: A: abdômen; b: bactérias; H: cabeça; T: tórax. Barras de escala:. 100 mm Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Identificamos condições óptimas críticas para immunostaining sucesso no pulgão da ervilha A. Pisum, um organismo modelo emergente para estudos genômicos e de desenvolvimento ^3,15. Condições otimizadas para aumentar a permeabilidade dos tecidos e reduzindo a coloração de fundo aumentou a intensidade e especificidade dos sinais. Eles diferem de protocolos padrão para a imunocoloração, em outros modelos animais nos passos para a criação de poros em membranas celulares e anticorpo bloqueador a ligação não específica.

Para imunocoloração e hibridação in situ, proteinase K (PK) a digestão é uma das abordagens para o aumento da permeabilidade comuns tecido ^16-19. Na coloração com anticorpos de tecidos de afídeos, nossos resultados mostraram que: (1) digestão PK melhorada significativamente sinais de imunocoloração nos embriões vivíparos partenogenéticas durante a extensão da banda germinal (etapas 11-14) (Figura 3B '', C ''), emborasinais fracos ainda eram visíveis em embriões desprovidas de tratamento PK (Figura 3B, C); e (2) a digestão PK era obrigatória para os embriões de katatrepsis em diante (estágios 15-20) (Figura 4C, F e Figura 6C). Para os embriões antes vivíparos assexuadas katatrepsis, o volume das câmaras de ovo é improvável que a causa do problema de penetração por causa imunocoloração sucesso em embriões iniciais ovíparas sexuais residentes nos ovos-definidas que são quase equivalentes em tamanho para o mais maduro chamber- ovo assexuada não requer a digestão PK ^20. Portanto, o alongamento e a dobragem da banda germinal (Fases 11 a 14) no espaço limitado das câmaras de ovo assexuadas podem impedir a entrada de anticorpo, e é PK que permite a penetração do anticorpo através da criação de poros em membranas celulares entre o estruturas embrionárias atoladas. Em contrapartida, a extensão da linha reta da banda germe nos ovos sexuais podem explicar por que ele está manchado mesmo ema ausência de PK. A remoção do envelope vitelline / chorion também pode fazer embriões ovíparos sexuais mais acessível ao anticorpo. Para os embriões após katatrepsis (estádios 16 a 20), o tratamento PK é essencial para ambos os morfos sexuada e assexuada, porque os embriões são grossos cuticled ¹⁹ (Figura 4C, F e Figura 6C).

No entanto, a condição sugerido para a digestão de PK (1 ug / ml durante 10 min) deve ser ajustado se a integridade das estruturas embrionárias ou a intensidade dos sinais não é satisfatória. Isto é provocado principalmente pela actividade de PK que pode variar de lote para lote. Por exemplo, se os tecidos embrionários ficar danificado depois de digestão PK, concentração de PK pode ser reduzida para 0,5 ug / ml. Da mesma forma, se a intensidade do sinal é fraco, a extensão da incubação de 15-20 min é, portanto, recomendada. Os embriões mais maduras (fase 20), submetido a incubação a PK prolongou-se até 20 min a 1,0 ug / ml de concentração, However, geralmente exibem sinais fracos, sugerindo que a digestão PK é ainda incompleta. Digestão prolongada pode aumentar os sinais de coloração mas é opcional, especialmente quando os padrões de expressão detectados na fase de 18 embriões são semelhantes aos do estágio 20 embriões. Em comparação com embriões na fase 20 do desenvolvimento, os embriões de fase de 18 e com a morfologia análoga ainda com menor quantidade de cutícula corpo geralmente pode produzir intensidade de sinal mais forte.

Durante o desenvolvimento de sinal, a coloração de fundo pode ser elevado pela actividade de enzimas endógenos que podem reagir de forma cruzada com os substratos. Nos embriões de ervilha de afídeos, a actividade de fosfatase endógena do alcalina (AP) e de peroxidase (POD), ambos os quais são conjugados de anticorpos comuns para digerir substratos de sinal, foi detectado. Actividade da hidrolase do AP endógena podia ser eficazmente suprimida em toda a embriogénese por levamisol (dados não mostrados). No entanto, o tratamento de embriões com 0,3-0,6% hydrogen peróxido (H _{2 O 2)} só poderia eliminar a actividade endógena POD antes katatrepsis mas não foi suficiente para embriões mais velhos (Figura 4A, D). Metanol incubação, uma abordagem alternativa para a desnaturação de proteínas endógenas, foi demonstrado ser eficaz nas pulgões ²¹ (Figura 4B, E). Ao contrário de H _{2 O 2,} que danifica pulgão tecidos durante a incubação prolongada de 30 minutos ou mais, o metanol não digerir ou deformar-se os embriões durante qualquer fase do desenvolvimento (Figura 4C, F). Consequentemente, o metanol é uma alternativa melhor para suprimir a atividade POD endógeno em embriões de afídeos. Se o fundo de coloração residual é detectado, o que normalmente ocorre para os embriões maduros com uma camada mais espessa de cutícula, S / N de incubação em metanol a 4 ° C, de acordo com a nossa experiência, pode reduzir ainda mais a actividade endógena POD.

Fundo de coloração residual foi detectada emembriões bloqueadas com proteínas do soro, tais como soro normal de burro (NDS), soro de cabra normal (NGS), albumina de soro bovino (BSA), ou suas misturas ¹³ (Figura 3A'-C '). A adopção de um reagente de bloqueio fornecido comercialmente utilizados para hibridação in situ, por outro lado, o fundo restante durante a imunocoloração poderia ser significativamente eliminadas ⁵ (Figura 3A '' - C ''). Embora os ingredientes do reagente de bloqueio são proprietários, que provavelmente contém proteínas não-soro que podem bloquear epitopos não específicos de proteínas de ervilha de afídeos. O reagente de bloqueio também funcionou muito melhor do que soros animais no pulgão Myzus persicae verde. Do mesmo modo, no M digestão persicae PK e metanol incubação resultou na penetração satisfatória anticorpo e a redução de fundo. - Semelhante aos resultados melhorados alcançados em A. pisum (dados não mostrados). Prevemos que as condições optimized para o aumento da permeabilidade dos tecidos e reduzindo fundo, se alguém usa coloração cromogénico ou fluorescência, será aplicada a muitas outras espécies de afídeos.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% hydrogen perxidase (H2O2)	Sigma-Aldrich	18304	For bleaching endogenous peroxidase of embryos.
4’6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542	For labeling the double-strand DNA. TOXIC. Wear gloves, dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure
4D9 anti-engrailed/invected mouse monoclonal antibody	Developmental studies hybridoma bank	AB_528224	For labeling the developing segments of embryo.
ApVas1 rabbit polyclonal antibody	Our laboratory	N/A	For labeling the aphid germline specific Vas1 protein in embryos. This antibody was made by our laboratory.
Austerlitz Insect pins	ENTOMORAVIA	N/A	For seperating each egg chambers from an ovariole. Size 000, BLACK ENAMELLED.
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	9048-46-8	For blocking the non-specific binding of antibodies.
Camera connted to compound microscope	Canon	EOS 5D	For photographing of aphid embryos.
Colorimetric 8 cell tray	Kartell Labware	357	For developing the staining signal of aphid embryos. Diameter 95 x 57 mm, cell depth 2 mm.
Compound microscope with DIC optics	Leica Microsystems	DMR	For photographing of aphid embryo mounted on the slides.
DIG Wash and Block Buffer Set	Sigma-Aldrich (Roche)	11585762001	For blocking the non-specific binding of antibodies. We diluted the 10x Blocking solution into 1x as blocking reagent.
Forceps	Ideal-tek	N/A	For dissection of ovaries from aphids. Manufacturer part No 5: 5 SA.
Glass dropper	N/A	N/A	For transfering ovaries of aphids from the splot plate to tubes. 150 mm of total length and 5 3/4" of tip length.
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	For clearing of aphid embryos and mounting.
Glycine	Bioshop	N/A	For blocking the enzyme activity of proteinase K (PK).
Goat anti-mouse IgG conjugated Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11017	For detection of primary antibody from mouse.
Goat anti-rabbit IgG conjugated Alexa Fluor 633	Invitrogen	A21072	For detection of primary antibody from rabbit.
Intelli mixer	ELMI laboratory equipment	RM-2M	For improving the thorughly reaction of reagents with ovaries.
Laser-scanning confocal microscopy	Leica Microsystems	SP5	For photographing of aphid embryo mounted on the slides with florecent tag.
methanol	Burdick and Jackson	AH2304	For bleaching endogenous peroxidase of embryos.
Microscope slides	Thermo scientific	10143560	For mounting of embryos. SUPERFROST ground edges, ca./env. 76 x 26 mm.
Microscope Cover glasses	Marienfeld	0101030	For mounting embryos on the slides. Size 18 x 18 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
Microscope Cover glasses	Marienfeld	0101050	For mounting embryos on the slides. Size 22 x 22 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
mouse monoclonal anti-alphaTubulin antibody (DM1A)	Santa Cruz Biotechnology	sc-32293	For labeling the distrbution of alpha-tubulin of cells.
Nail polish	N/A	N/A	For sealing the coverslips on the slides.
Normal goat serum (NGS)	Sigma-Aldrich	G9023	For blocking the non-specific binding of antibodies.
Paraformaldehyde (PFA)	VWR	MK262159	For fixation of aphid ovaries.
Phalloidin-TRITC	Sigma-Aldrich	P1951	For labeling the distrbution of F-actin on embryos.
Phosphate-buffered saline (PBS)	N/A	N/A	As isotonic solution for aphid ovaries.
Plastic dropper	N/A	N/A	For transfering ovaries of aphids from tube to cell tray. Size 3 ml.
Proteinase K	Merck	124678	For creating pores (punching) on the cell membrane and facilitating the access of antibodies.
Pyrex spot plate	N/A	N/A	For dissection and color reactions of aphid ovaries under microscopy. Each cavity with diameter 22 mm and  depth 7 mm.
SIGMAFAST 3,3’-diaminobenzidine (DAB) tablets	Sigma-Aldrich	D4168	For developing of substrated signals. Also called DAB peroxidase substrate tablet set.
Stereo microscope	Leica Microsystems	EZ4	For dissection and observation of aphid ovaries.
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	T8787	For creating pores (punching) on the cell membrane.
VECTASHIELD Elite ABC Kit (Rabbit IgG)	Vector laboratories	PK-6101	For enhancement of the signal. Including of biotinylated goat anti-rabbit IgG secondary antibody, A and B reagents.
VECTASHIELD mounting medium	Vector laboratories	H1000	For clearing of aphid embryos and mounting.