Introduction
الغدة الصعترية هي الجهاز الليمفاوي الرئيسية المسؤولة عن توليد مجموعة متنوعة من السكان من الخلايا T-متسامح الذاتي الممرض رد الفعل التي لا غنى عنها لوظيفة نظام المناعة المكتسبة. وإنما هي جهاز ديناميكي حيث thymocytes النامية، هاجر من نخاع العظام والخلايا اللمفاوية السلف، الهجرة من خلال ثلاثي الأبعاد (3-D) مصفوفة تشبه الاسفنج للسدى الغدة الصعترية، والخضوع النسب المطابقة للمواصفات والتمايز، والهجرة في نهاية المطاف كما ناضجة الخلايا التائية. نجاح هذه العملية مبرمجة بشكل جيد يعتمد إلى حد كبير على الحديث المتبادل بين وthymocytes المهاجرة والخلايا الظهارية السكنية الغدة الصعترية (TECS)، فإن عدد سكان السائد للسدى الغدة الصعترية التي هي ضرورية لإنشاء والحفاظ على سلامة المكروية الغدة الصعترية.
واستنادا إلى موقعها التشريحي وظيفة فريدة من نوعها، TECS يمكن تقسيمها إلى مجموعتين فرعيتين: وTECS في القشرة (cTECs) التي هي responsible لاختيار-MHC النفس (كبير مجمع التوافق النسيجي) يقتصر خلايا تي (اختيار إيجابية)، وTECS في النخاع (mTECs) التي هي ضرورية للقضاء على autoreactive خلايا تي (اختيار السلبية) 1،2. العديد من العوامل (على سبيل المثال، والشيخوخة، والعدوى، أشعة، علاج المخدرات) يمكن أن يسبب الأضرار التي لا رجعة فيها لظهارة الغدة الصعترية، مما أدى إلى حصانة التكيفية للخطر. وعلى الرغم من المحاولات العديدة، لم استعادة وظيفة الغدة الصعترية صعبة نظرا لصعوبة إعادة إنشاء المكروية الغدة الصعترية. والجدير بالذكر أن الغدة الصعترية ثلاثي الأبعاد (3-D) التكوين أمر بالغ الأهمية لبقاء وظيفة TECS، في حين TECS مثقف في بيئة 2-D تقلل بسرعة التعبير عن الجينات الهامة لthymopoiesis 3،4.
EAK16-II (AEAEKAKAEAEAKAK) و C-محطة نظائره histidinylated EAKIIH6 (AEAEKAKAEAEAKAKHHHHHH) ومنخفضة الوزن الجزيئي، oligopeptides محبة للجهتين القابلة للذوبان في توفير المياه منزوع الأيوناتص، ولكن الخضوع دبق من تشكيل الألياف بيتا عندما تتعرض لقوة الأيونية أعلى من 20 ملي كلوريد الصوديوم (ملح الطعام العادي تركيز في السوائل في الجسم البشري هو 154 ملم). هذا العقار استجابة البيئية يجعلها اللبنات تنوعا لتشكيل هياكل 3D. وصاحب العلامة على EAKII-H6 توفر آلية لرسو السفن، التي معاداة صاحب الجماعات الحكومية الدولية / FC-ملزمة المؤتلف بروتين A / G (αH6: السلطة الفلسطينية / G) يمكن المجمعات بمثابة محول لترسيخ المخدرات البروتين والجزيئات الحيوية الأخرى ( على سبيل المثال، والأجسام المضادة) على مركب هيدروجيل 5-8.
لقد أثبتنا سابقا أن جزيئات مفتش الفلورسنت المسمى ترسو على هيدروجيل يمكن الاحتفاظ بها في مكان الحقن لمدة تصل إلى 13 أيام 9. وعلاوة على ذلك، عندما αH6: تم إضافة محولات السلطة الفلسطينية / G الراسية مع مكافحة CD4 الجماعات الحكومية الدولية هيدروجيل EAK16-II / EAKIIH6 (EAK)، تم القبض على خلايا CD4 + T تحديدا 10. باستخدام تقنية مشابهة، لقد أثبتنا مؤخرا أن 3-D تجميع TECS جولد تعزيزه في EAK هيدروجيل مع المجمعات محول تحمل-TEC محدد أضداد EpCAM (αH6: السلطة الفلسطينية / G: αEpCAM). عندما زرعها تحت كبسولات الكلى من الفئران عارية، ويمكن للمجموعات TEC جزءا لا يتجزأ من هيدروجيل EAK تدعم بشكل فعال في تطوير خلايا T وظيفية في الجسم الحي 11،12.
نحن هنا توضيح لدينا وسيلة لتنقية بسرعة وفعالية TECS مع الفرز مضان تنشيط الخلايا (FACS) وتوليد 3-D المجاميع TEC مع نظام EAK هيدروجيل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وتم إيواء جميع الحيوانات المستخدمة في التجارب في منشأة الحيوان في معهد بحوث ألغني-المغني تحت مراجعتها والموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي لل/ معهد بحوث المغني أليغني شبكة الصحة أليغني البروتوكول.
1. هضم الغدة الصعترية مع كولاجيناز
- حصاد الغدد الغدة الصعترية.
- الموت ببطء الفئران القديمة أسابيع 3-5 C57BL6 / J في ثاني أكسيد الكربون (CO 2) غرفة لجني الغدد الصعترية. في التفاصيل، وضع الفئران في الغرفة تحت CO 2 تحريض لمدة 3-5 دقيقة وتأكيد وفاة خلال التحقق من السكتة القلبية أو الجهاز التنفسي.
- وضع الجثة على ظهرها والرطب الجسم مع الايثانول 70٪. جعل شق أفقي صغير مع حادة، ومقص تشريح التوالي على البطن من خلال الجلد. سحب الجلد على طرفي (الرأس والساقين) بحيث يتم تشغيله الداخل الى الخارج.
- اجراء خفض الأفقي مع مقص تشريح فقط تحتأدنى ضلع وقطع طريق الحجاب الحاجز جانبية. عقد عملية الخنجري مع ملقط وقطع منتصف الأضلاع المضي على كلا الجانبين. سحب ما يصل الأضلاع / القص بحيث الغدة الصعترية واضحة للعيان.
ملاحظة: الغدة الصعترية تقع مباشرة على الجزء العلوي من القلب، تتكون من 2 فصوص وهي ذات لون شفاف أبيض. - باستخدام ملقط المنحنية، حلج القطن بلطف وسحب فصوص الغدة الصعترية الخروج من النسيج الضام، ونقل في حل غسل (انظر قائمة من المواد).
- يعد حل الهضم عن طريق خلط 9 مل RPMI-1640 (روزويل معهد الحديقة التذكارية المتوسطة 1640)، 0.025 ملغ / مل كولاجيناز النقاء، 10 ملي HEPES [4- (2-هيدروكسي) حامض -1-piperazineethanesulfonic]، و 0.2 ملغ / مل الدناز أنا في أنبوب الطرد المركزي 50 مل. حافظ على حل الهضم في 37 ° C حمام الماء حتى الاستخدام.
ملاحظة: مقدار من الحل الهضم إعداد كافية لالتوتة الماوس ما يصل إلى خمسة الكبار، والتي يمكن المحتضنة معا في واحد 5 مل البوليسترين المستديرةأنبوب أسفل. - نقل الغدة الصعترية إلى 60 مم طبق زراعة الأنسجة التي تحتوي على 5-6 مل RPMI-1640.
- تشريح الغدة الصعترية مع 28 G حقنة الانسولين إبرة إلى قطع صغيرة (حوالي 1 ملم 3 مربع) للسماح للالخلايا الليمفاوية تتدفق.
- شطف القطع الغدة الصعترية مع RPMI-1640 التي هي في طبق بتري مع الزجاج ماصة باستير. إمالة الطبق والسماح للشظايا الغدة الصعترية تترسب في القاع. ببطء ونضح وتجاهل طاف RPMI-1640 باستخدام ماصة الزجاج. كرر هذه الخطوة الشطف مع 5-6 مل RPMI-1640 لمدة 4-5 مرات مع ماصة الزجاج حتى الحل هو أقل مبهمة.
ملاحظة: ينصح الماصات الزجاجية في هذه الخطوة، لأن شظايا الغدة الصعترية تميل إلى التمسك البلاستيك، مما أدى إلى خسائر فادحة في أنسجة الغدة الصعترية. بالنسبة لبقية الإجراء، استخدام الماصات البلاستيكية. - بعد شطف النهائي، تجاهل طاف كما هو موضح في الخطوة 1.5. إضافة 3 مل من محلول الهضم ونقل القطع الغدة الصعترية والحل في 5 مل جولة القاع صأنبوب olystyrene.
- وضع أنبوب على محور دوار أنبوب واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 6 دقائق في سرعة دوران 12 دورة في الدقيقة.
- بعد مرور فترة الحضانة، والسماح للشظايا الغدة الصعترية تترسب في قاع الأنبوب عن طريق الجاذبية. جمع طاف مع ماصة باستير ونقل في أنبوب 50 مل الطرد المركزي مع 10 مل من محلول الغسيل. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق، تجاهل وطاف resuspend الخلايا في محلول الغسيل 10 مل. الحفاظ على الجليد.
- كرر الخطوات من 1،6-1،8 مرتين على أجزاء الغدة الصعترية في 5 مل أنبوب البوليسترين جولة القاع. تجمع طاف في نفس أنبوب 50 مل.
ملاحظة: الطرد المركزي ليست ضرورية للمرة الثانية وغسل الثالث. - بعد الهضم النهائي، الماصة صعودا وهبوطا مع ماصة المصلية 2 مل من البلاستيك لكسر أي شظايا المتبقية في الأنبوب، ونقل إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل.
- أجهزة الطرد المركزي في أنبوب 50 مل بسعر 300 x ج لمدة 5 دقائق، ونضح طاف، resuspend في 10 مل من غسل العازلهص ومرشح من خلال 100 مصفاة ميكرومتر الخلية. الحفاظ على الجليد.
2. إثراء TECS مع التدرج الكثافة متقطع
- إعداد 21٪ من محلول كثافة التدرج عن طريق خلط 2.4 مل كثافة متوسطة الانحدار (60٪ ث / ت من iodixanol في الماء) و 9.6 مل من محلول الغسيل.
- الطرد المركزي الخلايا الغدة الصعترية فصلها في أنبوب 50 مل مجموعة من الخطوة 1.11 في 300 x ج لمدة 5 دقائق و resuspend العازلة في 2.5 مل الغسيل.
- إضافة المتوسطة 20 مل RPMI-1640 لتعليق الخلية.
- ملء 12 مل من 21٪ محلول التدرج الكثافة في 10 مل الماصة المصلية مع pipettor الإلكترونية. وضع غيض من الماصة المصلية في الجزء السفلي من 50 مل خلايا أنبوب الطرد المركزي التي تحتوي على، والسماح للحل كثافة التدرج لاستنزاف إلى أسفل الأنبوب عبر الجاذبية.
- طرد بلطف الحل كثافة التدرج من الماصة لإنهاء توليد طبقتين من كثافات مختلفة.
- أجهزة الطرد المركزي في 600 x ج فوص 20 دقيقة في RT في الدوار يتأرجح دلو. تعيين معدل التباطؤ في أبطأ مستوى.
- نقل الطبقة العليا واجهة لأنبوب 50 مل الجديد.
ملاحظة: يتم الاحتفاظ معظم TECS في الواجهة. والخلايا الليمفاوية يعجل إلى أسفل الأنبوب بعد الطرد المركزي. إذا هذه الخلايا لاستخدامها لأغراض أخرى، وشطف بيليه مع 20 مل من محلول الغسيل ثلاث مرات. resuspend الخلايا في 10 مل من غسل العازلة. - إضافة محلول الغسيل إلى 40 مل إلى أنبوب في الخطوة 2.6 وأجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 6 دقائق في 4 درجات مئوية. لإزالة طاف، نضح مع الماصة.
- تكرار غسل والطموح 2 مرات أكثر كما هو موضح في الخطوة 2.7.
- resuspend في 2 مل من محلول الغسيل وتعول الخلايا مع عدادة الكريات.
3. TECS عزل مع نظام مراقبة الأصول الميدانية
- ضبط الخلايا من الخطوة 2.9 في تركيز الخلايا 1x10 6/100 ميكرولتر مع الحل غسل ونقلالخلايا إلى 5 مل أنبوب جولة القاع (البولي بروبلين أو البوليسترين، على النحو الموصى به من قبل تعليمات فارز التدفق).
- إضافة 2 ميكرولتر مكافحة التيسير مستقبلات مفتش في الخلايا 1x10 6 واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
- إضافة مكافحة CD45 (1: 150 التخفيف، 10 ميكرولتر لكل عينة) ومكافحة EpCAM (1: 100 التخفيف، 10 ميكرولتر لكل عينة) الأجسام المضادة واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة أكثر من 20 دقيقة.
- غسل الخلايا بمحلول غسيل 2 مل وأجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 6 دقائق في 4 درجات مئوية. نضح طاف مع ماصة.
- Resuspend الخلايا في 1 مل 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
- تصفية من خلال 100 مصفاة ميكرون.
- تطبيق الخلايا إلى أداة الفرز. حدد الخلايا اللمفاوية والسكان TEC باستثناء أصغر الخلايا على ضوء متناثرة الجانب (SSC) / الضوء المتناثرة إلى الأمام (FSC) لوحة (الخلايا الميتة)، ثم بوابة على السكان تم اختيارها لCD45- EpCAM + لفرز 13.
4. Generation من TEC / EAK المجاميع
ملاحظة: إجراء إعداد كاشف والخطوات التي تنطوي على خلية خلط تحت غطاء محرك السيارة الصفحي.
- إعداد المجمعات محول السلطة الفلسطينية / G عن طريق خلط 4 ميكرولتر من مكافحة صاحب العلامة مفتش، 8 ميكرولتر من مكافحة EpCAM مفتش و 2.6 ميكرولتر من السلطة الفلسطينية / G في العقيمة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge، واحتضانها في RT لمدة 5 دقائق.
- ضبط TECS مرتبة من الخطوة 3.7 إلى 5X10 4 خلية / مل مع حل الغسيل، والماصة 100 ميكرولتر من بئر واحدة من التبخر منخفض، 96-جيدا جولة القاع لوحة زراعة الأنسجة. إضافة 14.6 المجمعات محول السلطة الفلسطينية / G ميكرولتر إلى الخلايا. وضع لوحة على منصة هزاز لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- يغسل مرة واحدة مع 200 حل غسل ميكرولتر. أجهزة الطرد المركزي لوحة في 400 x ج لمدة 6 دقائق. تجاهل طاف مع micropipette.
- يغسل مرة واحدة مع محلول السكروز 200 ميكرولتر 10٪. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 6 دقائق. تجاهل طاف مع micropipette.
- Resuspend الخلايا في 30 ميكرولتر 10٪ الصورةمحلول السكروز terile لكل بئر.
- إضافة 10 ميكرولتر من EAKIIH6 (7.5 ملغ / مل)، واحتضان لمدة 5 دقائق على RT.
- إضافة 20 ميكرولتر من EAK16-II (10 ملغ / مل) إلى الخليط TEC.
- إضافة 100 ميكرولتر من المتوسط كاملة لنظام لبدء دبق. وضع لوحة على شاكر منصة لمدة 15-20 دقيقة في RT.
- وضع لوحة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. بعد 2-4 ساعة، إضافة 100 ميكرولتر آخر من المتوسط كاملة.
- تغيير المتوسط كل يوم حتى الاستخدام.
- نضح 100 ميكرولتر من المتوسط من على سطح الأرض دون إزعاج جل باستخدام micropipette وإضافة بلطف 100 ميكرولتر من المتوسط قبل تحسنت عن طريق وضع طرف ماصة لجدار البئر.
5. توصيف TEC / EAK المجاميع
- لدراسة وظيفة المجاميع TEC / EAK في الجسم الحي، وجمع TEC / EAK هيدروجيل بعد O / N الثقافة وزرع تحت كبسولة الكلى من عارية athymicالماوس، وذلك باستخدام وصفه سابقا إجراء 11،14.
- مراقبة تطور خلايا T في محيط من حصاد 50-100 عينات الدم ميكرولتر في أنبوب جمع الدم التي تحتوي على EDTA من الفئران عارية 4-6 أسابيع بعد زرع وصمة عار مع مزيج من مكافحة CD4، -CD8، -CD45 و-CD3 الأجسام المضادة 12.
- تحليل نسب الخلايا اللمفاوية التائية في الكريات البيض في الدم الطرفية مع التدفق الخلوي (FCM)، وذلك باستخدام خلية واحدة تحليل البرامج 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لدراسة فعالية استخدام كثافة بروتوكول الفصل الانحدار إلى إثراء خلايا انسجة CD45-، تم صبغ الخلايا التي تحصد من كل من واجهة والكريات اللمفاوية عجلت مع anti-CD45 وأضداد EpCAM. كلا، الجولق مكافحة Europaeus الملزن 1 (UEA1) والأجسام المضادة لمكافحة MHC الدرجة الثانية أدرجت أيضا في كوكتيل تلطيخ لمزيد من التعرف على مجموعات فرعية CTEC وMTEC. كما هو مبين في الشكل رقم 1، كنا قادرين على تحقيق روتيني بالقرب من 15-20 مرة إثراء TECS.
للنظر في تجميع للTECS في هيدروجيل EAK، تم عزل TECS من 4 أسابيع الفئران B6.ROSA طن متري / ملغ القديمة، التي تعبر عن بتواجد مطلق ووالأحمر جزيئات tdTomato الفلورسنت بغشاء. وكانت المجاميع المجلس التنفيذي الانتقالي، الذي أعد كما هو موضح أعلاه، مثقف لمدة يومين في المختبر وفحصها تحت المجهر متحد البؤر ( 
الشكل 1. تحليل تدفق cytometric من TECS المخصب مع الحل التدرج الكثافة. كانت ملطخة الخلايا مع anti-CD45 وأضداد EpCAM للتمييز بين السكان TEC (CD45- EpCAM +). لوحات اليسار: خلايا الغدة الصعترية بعد الهضم انزيم، وذلك قبل إجراء التدرج الكثافة. لوحات الوسطى: خلايا في الطبقة العليا وواجهة بعد الانفصال مع الحل التدرج الكثافة. لوحات اليمين: خلايا مكعبات (اللمفاويات بيليه) بعد الانفصال مع الحل كثافة التدرج الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. 
الرقم 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في حين TECS هي السكان السائد للسدى الغدة الصعترية وتلعب أدوارا أساسية للهيكل وظيفة من وظائف الغدد الغدة الصعترية، أنهم لا يمثلون سوى حوالي 0.1-0.5٪ من إجمالي الخلوية الغدة الصعترية. بل هي أيضا الخلايا الهشة كما هي لاحظت ارتفاع نسبة موت الخلايا في بعض الأحيان بعد الهضم كولاجيناز، أي معالجة لفصل TECS من المصفوفة خارج الخلية (ECM). ندرتها (~ 200000 في الغدة الصعترية الماوس)، وهشاشة جعلت من مهمة صعبة لعزل TECS. استخدام الأخير من كولاجيناز العالية النقاء في عزلة TEC زادت بشكل ملحوظ في أعداد الخلايا الحية بعد الهضم الأنزيمي 15-19.
ومع ذلك، لا يزال عدد قليل جدا من TECS تحديا كبيرا للتحليل والعزلة، وهناك حاجة إلى كميات كبيرة من الأجسام المضادة لوضع العلامات سطح الخلية وتحتاج إلى جمعها من قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية أعداد زائدة من الأحداث. بينما الأجسام المضادة المترافقةد التكنولوجيا حبة المغناطيسي يمكن استخدامها لاستنزاف CD45 + thymocytes، كميتها كبيرة تجعل من المتعذر اقتصاديا على المدى الطويل. كنا قادرين على إثراء فعال TECS 15-20 مرات مع بسيطة، والكثافة خطوة واحدة الطرد المركزي التدرج. الخاصية-ايزو الاسموزي من المتوسط iodixanol التدرج الكثافة تسمح للفصل الخلايا استنادا على الأشكال والأحجام والكثافة 20-22. وتجدر الإشارة إلى أن الطهارة والعائد من TECS تتأثر نسبة متوسطة الكثافة التدرج المستخدمة. نسبة أقل من المتوسط الكثافة التدرج (18-20٪ ت / ت) سوف يؤدي إلى نقاء أعلى من TECS في واجهة ولكن انخفاض العائد. في المقابل، عندما تركيز أعلى iodixanol (22٪ ت / ت) يتم استخدام كمية أكبر من خلايا الغدة الصعترية يمكن جمعها مع نسبة أقل من TECS. ينبغي تعديل تركيز iodixanol على أساس الغرض من التجربة. في حين تم تحسين نقاء TECS إلى حد كبير مع فائدة حل التدرج الكثافة، وشولد ينبغي التأكيد على أن الخلايا التي تم جمعها من الطبقة العليا واجهة لا تزال تحتوي على نسبة عالية نسبيا من CD45 + الخلايا (الشكل 1). لذلك، عندما يكون مطلوبا فقط السكان TEC كما هو الحال في هذه التجربة، سوف فرز الخلايا ستكون حاسمة، على الرغم من أن هذا الإجراء الزائد قد يسبب فقدان بعض الخلايا ويتطلب المزيد من الوقت.
وخلافا لمعظم الخلايا الظهارية مرتبة في طبقات واحد أو عدة بطانة الأجهزة الحشوية، ويتم تنظيم TECS في التكوين 3-D في سدى الغدة الصعترية، وهو أمر ضروري لبقائها وظيفة. النظام EAK هيدروجيل الذاتي تجميع يسهل تشكيل 3-D المجاميع TEC التي يتم بوساطة αH6 ثلاثي الجزيئي: السلطة الفلسطينية / G: مجمعات محول αEpCAM. وتجدر الإشارة، من خلال صقل تركيز ونسب EAK16-II / EAKIIH6 oligopeptides، المسامية والكثافة من هيدروجيل يمكن تعديلها للسماح بتدفق المواد الغذائية وهجرة thymocytes. في الواقع، functionaتم إنشاؤها ل T-الخلايا في الفئران عارية athymic المزروعة مع المركبة TEC / EAK.
العيب في هذا النظام هيدروجيل EAK هو أنه مع هذا البروتوكول الحالي، وتكوين خلية معينة لا يمكن أن تكون مترجمة إلى منطقة محددة. في بيئة مادية وتتألف الغدة الصعترية من قسمين متميزين، في أي نوع من أنواع محددة من TECS يقيمون، cTECs في القشرة وmTECs في النخاع. مع نظامنا وصف هنا، وصفت كلا cTECs وmTECs مع EpCAM، علامة الظهارية العامة. ولذلك تردد أن مجاميع هيدروجيل شكلت تضم كلا من أنواع فرعية من TECS. على الرغم من أن cTECs وmTECs تستمد من الأسلاف TEC bipotent شيوعا، دورهم في تطوير خلايا تي هي مميزة بوضوح. القشرة هي المنطقة الأولى في الغدة الصعترية حيث تدخل الخلايا الاولية الغدة الصعترية غير ناضجة، واختيار إيجابية تجري 23. ثم الخلايا المحددة تتحرك في المنطقة النخاعية وتتفاعل مع mTECs، من خلال ثهيك يتم التخلص من الخلايا ذاتية التفاعل عن طريق الانتقاء السلبية (24). وعلاوة على ذلك، فقد ثبت أن 25٪ من الجينات يتم التعبير عن تفاضلي بين cTECs وmTECs 25. تؤكد هذه النتائج على أهمية تعزيز تجميع مجموعات فرعية TEC لزيادة فعالية التنمية الخلايا التائية. نهج واحد ممكن هو استخدام الأجسام المضادة مختلفة تستهدف جزيئات سطح محددة إما cTECs أو mTECs، مثل مكافحة cytokeratin 8 لcTECs، ومكافحة cytokeratin 5 لmTECs.
من منظور التطبيق السريري في المستقبل، ومجموعات TEC جزءا لا يتجزأ من هيدروجيل القابلة للتحلل قد تعمل "وحدات الصعترية مصغرة"، كما عن طريق الحقن لتعديل نظام المناعة التكيفية التي قد تكون مهمة لمختلف الحالات المرضية، مثل تجديد الجهاز المناعي التكيفي لدى الأفراد الذين تتراوح أعمارهم بين ، أو حمل التسامح مع الجهات المانحة محددة في زرع الأعضاء الصلبة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل في جزء من المعاهد الوطنية للصحة منح R21 AI113000 (ساموا) وR01 AI123392 (YF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TEC Isolation | |||
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2701(1 Gallon) | Ethanol 200 Proof, deionized water |
| Dissecting scissors, straight | Fine Science Tools, Inc. | 91460-11 | |
| Graefe forceps, straight | Fine Science Tools, Inc. | 11053-10 | |
| Graefe forceps, curved | Fine Science Tools, Inc. | 11052-10 | |
| Washing solution | 1x PBS, 0.1% BSA, 2 mM EDTA | ||
| 1x PBS (Phosphate buffered saline) | Gibco | 10010-023 | |
| BSA (Bovine serum albumin) | Sigma | A1470-100G | |
| EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | Invitrogen | 15575-038 | |
| Digestion solution | 9 ml RPMI-1640, 0.025 mg/ml Liberase TM Research grade, 10 mM HEPES, 0.2 mg/ml DNaseI | ||
| RPMI-1640 | Gibco | 11879-020 | |
| Liberase TM Research Grade | Roche | 05 401 127 001 | referred as "purified collagenase" |
| 1 M HEPES | Lonza | 17-737E | |
| Dnase I | Roche | 10 104 159 001 | |
| 50 ml Centrifuge tube | Corning | 430290 | |
| 60 mm tissue culture dish | Falcon | 353002 | |
| 1/2 cc U-100 Insulin syringe 28 1/2 G | Becton Dickinson | 329461 | |
| 5 ml Polystyrene round-bottom tube | Falcon | 352058 | |
| 5 ml glass pipet | Fisher Healthcare | 13-678-27E | Use for rinsing the thymic fragments. Thymic fragments tend to stick to the wall with plastic pipets. |
| MACSmix tube rotator | Miltenyi | 130-090-753 | |
| 100 µm Cell strainer | Falcon | 352360 | |
| Density gradient medium: OptiPrep | Axis-Shield | ||
| Cell Sorting | |||
| 5 ml Polypropylene round-bottom tube | Falcon | 352063 | |
| Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | Use as undiluted, 2 µl per sample |
| Anti-mouse CD45-PercpCy5.5 | eBioscience | 45-0451-80 | Use at 1:150, 10 µl per sample |
| Anti-mouse CD326 (EpCAM)-PE | eBioscience | 12-5791-82 | Use at 1:100, 10 µl per sample |
| BD Influx | BD Biosciences | ||
| Single cell analysis software | FlowJo | ||
| EAK Gel Assembly | |||
| Anti-His-Tag | AnaSpec | 29673 | "anti-His-Tag IgG" |
| Purified anti-mouse CD326 (EpCAM) | BioLegend | 118202 | "anti-EpCAM IgG" |
| Recombinant protein A/G | Pierce Biotechnology | ||
| 1.5 ml Safe-Lock Tubes, Biopur, Sterile | Fisher Healthcare | 05-402-24B | referred as "1.5 ml microcentrifuge tube" |
| 96-well, Tissue culture plate, Round-bottom with low evaporation lid | BD Falcon | 353917 | |
| Rocking platform: Nutator Mixer no.1105 | BD Clay Adams | ||
| 10% sucrose | Sigma | S0389 | Prepare with sterile distilled water |
| EAK16-II (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAK-CONH2) | American Peptide Company | custom synthesized, 10 mg/ml | |
| EAKIIH6 (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAKHHHHHH-CONH2) | American Peptide Company | custom synthesized, 7.5 mg/ml | |
| Complete medium | RPMI-1640, 10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% L-glutamine, 1% NEAA, 5 mM HEPES, 50 µM 2-Mercaptoethanol | ||
| RPMI-1640 | Gibco | 11879-020 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Atlanta Biologicals | S11150 | Heat inactivated before use |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| NEAA (non-essential amino acid) 100x | Gibco | 11140-050 | |
| 1 M HEPES | BioWhittaker | 17-737E | |
| 2-Mercaptoethanol (100x) | Millipore | ES-007-E | |
| Platform shaker: The Belly Dancer | Stovall Life Sciences Inc. | model: USBDbo |
References
- Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus. Nature. 362, 70-73 (1993).
- Fan, Y., et al. Thymus-specific deletion of insulin induces autoimmune diabetes. The EMBO J. 28, 2812-2824 (2009).
- Mohtashami, M., Zuniga-Pflucker, J. C. Three-dimensional architecture of the thymus is required to maintain delta-like expression necessary for inducing T cell development. J Immunol. 176, 730-734 (2006).
- Pinto, S., et al. An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression. J Immunol. 190, 1085-1093 (2013).
- Fung, S. Y., Yang, H., Chen, P. Formation of colloidal suspension of hydrophobic compounds with an amphiphilic self-assembling peptide. Colloids Surf B Biointerfaces. 55, 200-211 (2007).
- Jun, S., et al. Self-assembly of the ionic peptide EAK16: the effect of charge distributions on self-assembly. Biophys J. 87, 1249-1259 (2004).
- Saunders, M. J., et al. Engineering fluorogen activating proteins into self-assembling materials. Bioconjug Chem. 24, 803-810 (2013).
- Zhang, S., Holmes, T., Lockshin, C., Rich, A. Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane. Proc of the Natl Acad Sci U S A. 90, 3334-3338 (1993).
- Wen, Y., et al. Coassembly of amphiphilic peptide EAK16-II with histidinylated analogues and implications for functionalization of beta-sheet fibrils in vivo. Biomaterials. 35, 5196-5205 (2014).
- Zheng, Y., et al. A peptide-based material platform for displaying antibodies to engage T cells. Biomaterials. 32, 249-257 (2011).
- Tajima, A., et al. Bioengineering mini functional thymic units with EAK16-II/EAKIIH6 self-assembling hydrogel. Clin Immunol. 160, 82-89 (2015).
- Fan, Y., et al. Bioengineering Thymus Organoids to Restore Thymic Function and Induce Donor-Specific Immune Tolerance to Allografts. Mol Ther. 23, 1262-1277 (2015).
- Fan, Y., et al. Thymus-specific deletion of insulin induces autoimmune diabetes. The EMBO J. 28, 2812-2824 (2009).
- Fan, Y., et al. Compromised central tolerance of ICA69 induces multiple organ autoimmunity. J Autoimmun. 53, 10-25 (2014).
- Palumbo, M. O., Levi, D., Chentoufi, A. A., Polychronakos, C. Isolation and characterization of proinsulin-producing medullary thymic epithelial cell clones. Diabetes. 55, 2595-2601 (2006).
- Williams, K. M., et al. Single cell analysis of complex thymus stromal cell populations: rapid thymic epithelia preparation characterizes radiation injury. Clin Transl Sci. 2, 279-285 (2009).
- McLelland, B. T., Gravano, D., Castillo, J., Montoy, S., Manilay, J. O. Enhanced isolation of adult thymic epithelial cell subsets for multiparameter flow cytometry and gene expression analysis. J Immunol Methods. 367, 85-94 (2011).
- Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. J Immunol methods. 385, 23-34 (2012).
- Xing, Y., Hogquist, K. A. Isolation, identification, and purification of murine thymic epithelial cells. J Vis Exp. , e51780 (2014).
- Graham, J. M. Separation of monocytes from whole human blood. ScientificWorldJournal. 2, 1540-1543 (2002).
- Li, X., Donowitz, M. Fractionation of subcellular membrane vesicles of epithelial and nonepithelial cells by OptiPrep density gradient ultracentrifugation. Methods Mol Biol. 440, 97-110 (2008).
- Mita, A., et al. Purification method using iodixanol (OptiPrep)-based density gradient significantly reduces cytokine chemokine production from human islet preparations, leading to prolonged beta-cell survival during pretransplantation culture. Transplant Proc. 41, 314-315 (2009).
- Anderson, G., Takahama, Y. Thymic epithelial cells: working class heroes for T cell development and repertoire selection. Trends Immunol. 33, 256-263 (2012).
- Kyewski, B., Klein, L. A central role for central tolerance. Annu Rev Immunol. 24, 571-606 (2006).
- St-Pierre, C., et al. Transcriptome sequencing of neonatal thymic epithelial cells. Sci Rep. 3, 1860 (2013).
