Introduction
Thymus er det primære lymfoide organ er ansvarlig for genereringen av en mangfoldig populasjon av patogen-reaktive, selv-tolerant T-celler som er avgjørende for funksjonen av ervervet immunsystemet. Det er en dynamisk organ hvor utviklings thymocytter, innvandret fra benmargen som lymfocytt progenitorceller, migrerer gjennom det svampliknende tredimensjonale (3-D) matrise av thymus-stroma, gjennomgår avstamning-spesifikasjonen og differensiering, og til slutt migrere så modne T-celler. Suksessen til dette godt programmert prosessen avhenger i stor grad av krysstale mellom de trekkende thymocytter og bolig thymus epitelceller (Tecs), den dominerende befolkningen i thymus stroma som er avgjørende for å etablere og opprettholde integriteten av thymus mikromiljøet.
Basert på deres anatomiske plassering og unik funksjon, kan Tecs deles inn i to undergrupper: den Tecs i cortex (cTECs) som er ansvarslig for valg av selv-MHC (major histocompatibility komplekse) begrensede T-celler (positiv seleksjon), og Tecs i medulla (mTECs) som er vesentlig for å eliminere autoreaktive T-celler (negativ seleksjon) 1,2. Mange faktorer (for eksempel aldring, infeksjon, bestråling, narkotika behandlinger) kan føre til irreversible skader på thymus epitel, noe som resulterer i nedsatt adaptiv immunitet. Til tross for mange forsøk, gjenopprette thymus-funksjonen har vært utfordrende på grunn av problemer med å reprodusere thymus mikromiljøet. Spesielt, er tymisk tre-dimensjonal (3-D) konfigurasjon kritisk for overlevelse og funksjon av Tecs, mens Tecs dyrket i en 2-D miljø hurtig redusere ekspresjonen av gener som kritiske for thymopoiesis 3,4.
EAK16-II (AEAEKAKAEAEAKAK) og dets C-terminale histidinylated analog EAKIIH6 (AEAEKAKAEAEAKAKHHHHHH) er lav molekylvekt, amfifile oligopeptider som er løselige i deionisert water, men gjennomgår gelering for dannelse av p-fibriller når de utsettes for ionestyrke høyere enn 20 mM NaCl (normal saltkonsentrasjon i human kroppsvæske er 154 mM). Dette miljø responsive egenskapen gjør dem allsidige byggesteiner for å danne 3D-strukturer. Den His-tag på EAKII-H6 gir en docking mekanisme, der anti-Hans IgG / Fc-bindende rekombinant protein A / G (αH6: PA / G) komplekser kan tjene som en adapter for å forankre protein narkotika og andre biomolekyler ( for eksempel antistoffer) på hydrogelen kompositt 5-8.
Vi har tidligere demonstrert at fluorescensmerkede IgG-molekyler er forankret på hydrogelen kan beholdes ved injeksjonsstedet i opp til 13 dager 9. Videre, når de αH6: pA / G adaptere forankret med anti-CD4-IgG ble tilsatt til EAK16-II / EAKIIH6 (EAK) hydrogel, CD4 + T-celler ble bestemt tatt 10. Ved hjelp av tilsvarende teknikk, har vi nylig vist at 3-D aggregering av Tecs cOuld bli fremmet i EAK hydrogel med adapter komplekser bærer TEC-spesifikk anti-EpCAM antistoffer (αH6: PA / G: αEpCAM). Når transplantert under nyre kapsler av nakne mus, kan TEC klynger innebygd i EAK hydrogel effektivt støtte utviklingen av funksjonelle T-celler in vivo 11,12.
Her viser vi vår metode for å raskt og effektivt rense Tecs med fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) og generere 3D-TEC aggregater med EAK hydrogel system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr som brukes i forsøkene ble plassert i dyret anlegget på Allegheny-Singer Research Institute under protokollen gjennomgått og godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité Allegheny helsenett / Allegheny Singer Research Institute.
1. fordøye Thymus med Collage
- Slakte thymus kjertler.
- Avlive 3-5 uker gamle C57BL6 / J-mus i en karbondioksid (CO 2) kammer å høste thymus kjertler. I detalj, plasserer musene i kammeret etter CO 2 induksjons for 3-5 min og bekrefte dødsfallet ved å verifisere hjerte- eller respirasjonsstans.
- Lå slakteskrotten på ryggen og fukte legemet med 70% etanol. Lag en liten horisontal snitt med en skarp, rette disseksjonssaksen på buken gjennom huden. Trekk huden på begge ender (hode og ben), slik at det blir vrengt.
- Lag en horisontal kutt med dissekere saks like underden laveste ribben og skjære gjennom membranen sidelengs. Hold xiphoid prosessen med en pinsett og kuttet på midten av ribbene som utgår på begge sider. Trekk opp ribbe / brystbenet, slik at thymus er klart synlig.
Merk: Thymus ligger direkte på toppen av hjertet, består av 2 lapper og er av en hvit gjennomskinnelig farge. - Ved hjelp av en buet pinsett, forsiktig scoop og trekke thymus lapper ut av bindevev og overføring i vaskeløsning (se liste over materialer).
- Fremstille fordøyelse oppløsning ved blanding av 9 ml RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute medium 1640), 0.025 mg / ml renset kollagenase, 10 mM HEPES [4- (2-hydroksyetyl) -1-piperazinetansulfonsyre], og 0,2 mg / ml DNase i i et 50 ml sentrifugerør. Hold fordøyelse oppløsning i 37 ° C vannbad inntil bruk.
Merk: Mengden av fordøyelsen løsning forberedt er tilstrekkelig for opp til fem voksne mus thymus, som kan inkuberes sammen i en 5 ml polystyren runde-bunn tube. - Overfør thymus til en 60 mm vevskulturskål inneholdende 5-6 ml RPMI-1640.
- Dissekere thymus med 28 G insulin sprøytespissen i små biter (ca 1 mm 3 kvadrat) til å la lymfocyttene strømme ut.
- Skyll thymus stykker med RPMI-1640 som er i petriskål med glass Pasteur pipette. Vipp fatet og la thymus fragmenter bosette til bunnen. Sakte aspirer og kast RPMI-1640 supernatant ved hjelp av et glass pipette. Gjenta dette rensetrinnet med 5-6 ml RPMI-1640 for 4-5 ganger med glass pipette inntil oppløsningen er mindre ugjennomsiktig.
Merk: Glass pipetter anbefales på dette trinnet, siden thymus fragmenter tendens til å holde seg til plast, noe som resulterer i store tap av thymus vev. For resten av prosedyren, bruke plast pipetter. - Etter siste skylling, kast supernatanten som beskrevet i trinn 1.5. Tilsett 3 ml fordøyelse oppløsning og overfører de thymus stykker og oppløsningen inn i en 5 ml rundbunnet polystyrene tube.
- Plasser røret på en tube rotator og inkuber ved 37 ° C i 6 min ved en rotasjonshastighet på 12 rpm.
- Etter inkubering la thymus-fragmentene faller til bunnen av røret ved hjelp av tyngdekraft. Samle supernatanten med Pasteur-pipette og overføres til et 50 ml sentrifugerør med 10 ml vaskeløsning. Sentrifuger ved 300 xg i 5 minutter, kaste supernatanten og resuspender cellene i 10 ml vaskeløsning. Hold på is.
- Gjenta trinn 1,6-1,8 to ganger på thymus fragmenter i de 5 ml rundbunnet polystyren tube. Pool supernatanten i samme 50 ml tube.
Merk: Sentrifugering er ikke nødvendig for den andre og den tredje vask. - Etter den siste fordøyelse, pipetter opp og ned med 2 ml plast serologisk pipette for å bryte ned eventuelle gjenværende fragmenter i røret og overføring til 50 ml sentrifugerør.
- Sentrifuger 50 ml rør ved 300 xg i 5 minutter, aspirer supernatanten, resuspender i 10 ml vaske buffer og filter gjennom 100 mikrometer celle sil. Hold på is.
2. Anriking av Tecs med Discontinuous tettshetsgradient
- Fremstille 21% densitetsgradient oppløsning ved å blande 2,4 ml tettshetsgradient medium (60% vekt / volum av iodixanol i vann) og 9,6 ml vaskeløsning.
- Sentrifuger dissosierte thymus-celler i 50 ml oppsamlingsrøret fra trinn 1,11 ved 300 xg i 5 minutter og resuspendert i 2,5 ml vaskebuffer.
- Tilsett 20 ml RPMI-1640 medium til cellesuspensjonen.
- Fyll 12 ml 21% tettshetsgradient oppløsning i en 10 ml serologisk pipette med en elektronisk pipette. Plassere spissen av serologisk pipette i bunnen av de 50 ml sentrifugerør inneholdende celler, og at den densitetsgradient løsning å renne ned i bunnen av røret via tyngdekraften.
- Forsiktig utvise den densitetsgradient oppløsning fra pipette for å avslutte genererende de to lag med forskjellig tetthet.
- Sentrifuger ved 600 xg for 20 minutter ved romtemperatur i en svingende spannrotor-. Sett retardasjonshastighet på den laveste nivå.
- Overfør det øverste laget og grenseflaten til et nytt 50 ml tube.
Merk: De fleste av de Tecs beholdes i grensesnittet. Lymfocytter vil utfelles til bunnen av røret etter sentrifugering. Hvis disse celler skal brukes til andre formål, skyll pelleten med 20 ml vaskeløsning for tre ganger. Resuspender cellene i 10 ml vaskebuffer. - Legg vaskeløsning opp til 40 ml i røret i trinn 2.6 og sentrifuger ved 400 xg i 6 min ved 4 ° C. For å fjerne supernatanten, aspirer med en pipette.
- Gjenta vaskingen og aspirasjon 2 flere ganger som beskrevet i trinn 2.7.
- Resuspender i 2 ml vaskeløsning og telle cellene med et hemocytometer.
3. Isolering Tecs med FACS
- Juster celler fra trinn 2,9 ved en konsentrasjon på 1x10 6 celler / 100 ul med vaskeløsning og overførecellene til en 5 ml rundbunnet rør (polypropylen eller polystyren, som anbefalt av instruksjoner fra flyt sorter).
- Tilsett 2 mL anti-Fc-reseptor-IgG pr 1x10 6 celler og inkuber ved 4 ° C i 10 min.
- Legg til anti-CD45 (1: 150 fortynning, 10 ul per prøve) og anti-EpCAM (1: 100 fortynning, 10 ul per prøve) antistoffer og inkuber ved 4 ° C i mer enn 20 min.
- Vask cellene med 2 ml vaskeløsning og sentrifuger ved 400 xg i 6 min ved 4 ° C. Aspirer supernatanten med en pipette.
- Resuspender cellene i 1 ml 1 x fosfatbufret saltvann (PBS).
- Filtrer gjennom 100 mikrometer sil.
- Påfør cellene til sortering instrument. Velg lymfocytt og TEC befolkningen unntatt de minste cellene på side spredt lys (SSC) / forover-spredt lys (FSC) panel (døde celler), deretter gate på den valgte befolkningen for CD45- EpCAM + for sortering 13.
4. Generation av TEC / EAK Aggregater
Merk: Utfør reagensklargjøring og trinn som involverer celle blande under laminær panseret.
- Forbered pA / G adapter komplekser ved blanding av 4 mL av anti-His-merke IgG, 8 ul av anti-EpCAM IgG og 2,6 ul av pA / G i et sterilt 1,5 ml mikrosentrifugerør, og inkuber ved romtemperatur i 5 min.
- Juster de sorterte Tecs fra trinn 3,7 til 5x10 celler / ml 4 med vaskeoppløsning, og 100 ul pipette til en brønn av en lav fordamping, 96-brønners rundbunnet vevskulturplate. Legg 14.6 mL pA / G adapterkomplekser til cellene. Plassere platen på en risteplattform i 20 min ved 4 ° C.
- Vask en gang med 200 mL vaskeløsning. Sentrifuger plate ved 400 x g i 6 min. Kast supernatanten med en mikropipette.
- Vask en gang med 200 mL 10% sukrose løsning. Sentrifuger ved 400 xg for 6 min. Kast supernatanten med en mikropipette.
- Resuspender cellene i 30 mL 10% sterile sukrose løsning per brønn.
- Tilsett 10 ul EAKIIH6 (7,5 mg / ml) og inkuber i 5 minutter ved romtemperatur.
- Tilsett 20 ul EAK16-II (10 mg / ml) til den TEC blandingen.
- Tilsett 100 ul av fullstendig medium til systemet for å initiere gelering. Plassere platen på en plattform risteapparat i 15-20 minutter ved romtemperatur.
- Sett platen i inkubatoren ved 37 ° C og 5% CO2. Etter 2-4 timer, legger ytterligere 100 mL av komplett medium.
- Endre medium annenhver dag inntil bruk.
- Sug av 100 ul av mediet fra overflaten uten å forstyrre den under anvendelse av en mikropipette og tilsett 100 ul av forvarmet medium ved å plassere pipettespissen til veggen i brønnen.
5. Karakterisering av TEC / EAK Aggregater
- For å undersøke funksjonen av TEC / EAK-aggregater in vivo, samler den TEC / EAK hydrogel etter O / N kultur og transplantasjon under nyrekapselen på en atymiske naknemus, brukte tidligere beskrevet prosedyre 11,14.
- Overvåke utviklingen av T-celler i periferien ved å høste 50-100 ul blodprøver inn i EDTA-holdige blodprøverøret fra hårløse mus 4-6 uker etter transplantasjonen og flekken med en cocktail av anti-CD4, -CD8, -CD45 og -CD3 antistoffer 12.
- Analyser prosentandelene av T-lymfocytter i de perifere blodleukocytter med strømningscytometri (FCM), ved hjelp av enkeltcelleanalyse-programvare 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å undersøke effekten av å bruke densitetsgradient separasjons protokollen for å berike CD45- stromale celler, ble celler høstet fra både grenseflaten og de utfelte lymfocytt-pellets farget med anti-CD45 og anti-EpCAM-antistoffer. Både anti-Ulex europaeus agglutinin 1 (UEA1) og anti-MHC klasse II-antistoffer ble også inkludert i fargings cocktail for å ytterligere identifisere de cTEC og Mtec undergrupper. Som vist i figur 1, var vi i stand til rutinemessig å oppnå nær 15-20 ganger anrikning av Tecs.
For å undersøke aggregering av Tecs i EAK-hydrogel, ble Tecs isolert fra fire-ukers gamle B6.ROSA mT / mg mus, som ubiquitously uttrykker membranbundne, røde fluorescerende tdTomato molekyler. TEC aggregater, fremstilt som beskrevet ovenfor, ble dyrket i to dager in vitro og undersøkt under et mikroskop konfokal ( 
Figur 1. Strømningscytometrisk analyse av Tecs anriket med den densitetsgradient løsning. Celler ble farget med anti-CD45 og anti-EpCAM-antistoffer for å skille TEC populasjon (CD45- EpCAM +). Venstre paneler: thymus celler etter enzym fordøyelsen, før tettshetsgradient prosedyren. Midterste panelene: Celler i topplaget og grensesnittet etter separasjon med densitetsgradient løsning. Høyre paneler:. Pelleterte celler (lymfocytter pellets) etter separasjon med tettshetsgradient løsning Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 
Figur 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mens Tecs er den dominerende befolkningen i thymus stroma og spille viktige roller for struktur og funksjon av thymus kjertler, de representerer bare ca 0,1-0,5% av den totale thymus cellularity. De er også skjøre celler som høye prosentandeler av celledød blir av og til observert følgende kollagenase fordøyelse, dvs. til behandling dissosiere Tecs fra den ekstracellulære matriks (ECM). Deres sjeldenhet (~ 200 000 per mus thymus) og skjørhet gjort det en utfordrende oppgave å isolere Tecs. Den nylige utnyttelse av høyt renset kollagenase i TEC isolasjon har betydelig økt antall levende celler etter den enzymatiske fordøyelsen 15-19.
Imidlertid forblir meget lite antall Tecs en stor utfordring for sin analyse og isolasjon, som store mengder av antistoffer er nødvendig for celleoverflate-merking og store antall av hendelser må hentes ved hjelp av FACS. Mens antistoff-konjugatd magnetiske kuler teknologi kan brukes til å utarme CD45 + thymocytter, gjengir deres store mengder det økonomisk uoverkommelige i det lange løp. Vi var i stand til å effektivt berike Tecs 15-20 ganger med en enkel, ett skritt densitetsgradientsentrifugering. Iso-osmotisk egenskap av iodixanol densitetsgradient medium tillater separering av celler basert på deres former, størrelser og densiteter 20-22. Det skal bemerkes at renheten og utbyttet av Tecs påvirkes av den prosentandel av densitetsgradienten medium som brukes. Lavere prosentandel av den tettshetsgradient medium (18-20% v / v) vil resultere i høyere renhet av Tecs i grenseflaten, men lavere utbytte. I motsetning til dette, når høyere iodixanol konsentrasjon (22% v / v) brukes, kan større kvantum av thymus-celler samles med lavere prosentandel av Tecs. Konsentrasjonen av iodixanol bør justeres basert på hensikten med forsøket. Selv om renheten av Tecs er i stor grad forbedret med anvendeligheten av densitetsgradienten løsning, det should understrekes at de innsamlede fra topplaget, og grensesnittet cellene fremdeles inneholde en relativt høy andel av CD45 + celler (figur 1). Derfor, når bare den TEC befolkning er nødvendig som i dette eksperimentet, vil cellesortering være avgjørende, selv om dette ekstra fremgangsmåten kan føre til noe tap av celler og krever mer tid.
I motsetning til de fleste av de epiteliale celler som er arrangert i en enkelt eller flere lag langs de innvendige organer, er Tecs organisert i 3-D konfigurasjon i thymus stroma, noe som er vesentlig for deres overlevelse og funksjon. Den selvsammen EAK hydrogel system letter dannelsen av 3-D TEC aggregater som er mediert av tri-molekylær αH6: PA / G: αEpCAM adapter komplekser. Av notatet, ved å finjustere de konsentrasjoner og forhold av den EAK16-II / EAKIIH6 oligopeptider, porøsiteten og tettheten av hydrogelen kan justeres for å tillate strømmen av næringsstoffer og migrering av thymocyttene. Faktisk, funksjonellel T-celler ble generert i atymiske hårløse mus transplantert med TEC / EAK kompositter.
Ulempen i dette EAK-hydrogel system er at med denne aktuelle protokoll, bestemt celle blandingen kan ikke være lokalisert til et bestemt område. I en fysisk miljø et thymus består av to adskilte avdelinger, i hvilke bestemte typer Tecs bor, cTECs i cortex og mTECs i medulla. Med vårt system er beskrevet her, er begge cTECs og mTECs merket med EpCAM, en generell epitel markør. Derfor er det spekulert i at aggregatene i dannet hydrogel omfatter både undergrupper av Tecs. Selv cTECs og mTECs stammer fra vanlig bipotent TEC stamfedre, deres roller i utviklingen av T-celler er klart karakteristiske. Cortex er den første regionen i thymus hvor umodne thymus stamceller gå inn og positiv seleksjon foregår 23. Da de valgte cellene flytte inn i medullary regionen og samhandle med mTECs, gjennom wjør de selvreaktive celler elimineres ved negativ seleksjon 24. Videre har det blitt vist at 25% av genene blir uttrykt forskjellig mellom cTECs og mTECs 25. Disse funnene understreker betydningen av å fremme aggregering av TEC undergrupper for å øke effekten av T-celle utvikling. En mulig tilnærming er å bruke forskjellige antistoffer rettet mot overflatemolekyler som er spesifikke for enten cTECs eller mTECs, slik som anti-cytokeratin 8 for cTECs, og anti-cytokeratin 5 for mTECs.
Fra perspektivet til fremtidig klinisk anvendelse, kan det hende at TEC klynger innleiret i den bionedbrytbare hydrogel fungere som injiserbare "mini thymus enheter" for å modulere den adaptive immunsystem som kan være viktig for ulike medisinske tilstander, slik som foryngende det adaptive immunsystemet hos eldre individer , eller indusering av donor-spesifikk toleranse i organtransplantasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet delvis av National Institutes of Health gir R21 AI113000 (WSM) og R01 AI123392 (YF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TEC Isolation | |||
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2701(1 Gallon) | Ethanol 200 Proof, deionized water |
| Dissecting scissors, straight | Fine Science Tools, Inc. | 91460-11 | |
| Graefe forceps, straight | Fine Science Tools, Inc. | 11053-10 | |
| Graefe forceps, curved | Fine Science Tools, Inc. | 11052-10 | |
| Washing solution | 1x PBS, 0.1% BSA, 2 mM EDTA | ||
| 1x PBS (Phosphate buffered saline) | Gibco | 10010-023 | |
| BSA (Bovine serum albumin) | Sigma | A1470-100G | |
| EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | Invitrogen | 15575-038 | |
| Digestion solution | 9 ml RPMI-1640, 0.025 mg/ml Liberase TM Research grade, 10 mM HEPES, 0.2 mg/ml DNaseI | ||
| RPMI-1640 | Gibco | 11879-020 | |
| Liberase TM Research Grade | Roche | 05 401 127 001 | referred as "purified collagenase" |
| 1 M HEPES | Lonza | 17-737E | |
| Dnase I | Roche | 10 104 159 001 | |
| 50 ml Centrifuge tube | Corning | 430290 | |
| 60 mm tissue culture dish | Falcon | 353002 | |
| 1/2 cc U-100 Insulin syringe 28 1/2 G | Becton Dickinson | 329461 | |
| 5 ml Polystyrene round-bottom tube | Falcon | 352058 | |
| 5 ml glass pipet | Fisher Healthcare | 13-678-27E | Use for rinsing the thymic fragments. Thymic fragments tend to stick to the wall with plastic pipets. |
| MACSmix tube rotator | Miltenyi | 130-090-753 | |
| 100 µm Cell strainer | Falcon | 352360 | |
| Density gradient medium: OptiPrep | Axis-Shield | ||
| Cell Sorting | |||
| 5 ml Polypropylene round-bottom tube | Falcon | 352063 | |
| Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | Use as undiluted, 2 µl per sample |
| Anti-mouse CD45-PercpCy5.5 | eBioscience | 45-0451-80 | Use at 1:150, 10 µl per sample |
| Anti-mouse CD326 (EpCAM)-PE | eBioscience | 12-5791-82 | Use at 1:100, 10 µl per sample |
| BD Influx | BD Biosciences | ||
| Single cell analysis software | FlowJo | ||
| EAK Gel Assembly | |||
| Anti-His-Tag | AnaSpec | 29673 | "anti-His-Tag IgG" |
| Purified anti-mouse CD326 (EpCAM) | BioLegend | 118202 | "anti-EpCAM IgG" |
| Recombinant protein A/G | Pierce Biotechnology | ||
| 1.5 ml Safe-Lock Tubes, Biopur, Sterile | Fisher Healthcare | 05-402-24B | referred as "1.5 ml microcentrifuge tube" |
| 96-well, Tissue culture plate, Round-bottom with low evaporation lid | BD Falcon | 353917 | |
| Rocking platform: Nutator Mixer no.1105 | BD Clay Adams | ||
| 10% sucrose | Sigma | S0389 | Prepare with sterile distilled water |
| EAK16-II (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAK-CONH2) | American Peptide Company | custom synthesized, 10 mg/ml | |
| EAKIIH6 (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAKHHHHHH-CONH2) | American Peptide Company | custom synthesized, 7.5 mg/ml | |
| Complete medium | RPMI-1640, 10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% L-glutamine, 1% NEAA, 5 mM HEPES, 50 µM 2-Mercaptoethanol | ||
| RPMI-1640 | Gibco | 11879-020 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Atlanta Biologicals | S11150 | Heat inactivated before use |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| NEAA (non-essential amino acid) 100x | Gibco | 11140-050 | |
| 1 M HEPES | BioWhittaker | 17-737E | |
| 2-Mercaptoethanol (100x) | Millipore | ES-007-E | |
| Platform shaker: The Belly Dancer | Stovall Life Sciences Inc. | model: USBDbo |
References
- Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus. Nature. 362, 70-73 (1993).
- Fan, Y., et al. Thymus-specific deletion of insulin induces autoimmune diabetes. The EMBO J. 28, 2812-2824 (2009).
- Mohtashami, M., Zuniga-Pflucker, J. C. Three-dimensional architecture of the thymus is required to maintain delta-like expression necessary for inducing T cell development. J Immunol. 176, 730-734 (2006).
- Pinto, S., et al. An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression. J Immunol. 190, 1085-1093 (2013).
- Fung, S. Y., Yang, H., Chen, P. Formation of colloidal suspension of hydrophobic compounds with an amphiphilic self-assembling peptide. Colloids Surf B Biointerfaces. 55, 200-211 (2007).
- Jun, S., et al. Self-assembly of the ionic peptide EAK16: the effect of charge distributions on self-assembly. Biophys J. 87, 1249-1259 (2004).
- Saunders, M. J., et al. Engineering fluorogen activating proteins into self-assembling materials. Bioconjug Chem. 24, 803-810 (2013).
- Zhang, S., Holmes, T., Lockshin, C., Rich, A. Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane. Proc of the Natl Acad Sci U S A. 90, 3334-3338 (1993).
- Wen, Y., et al. Coassembly of amphiphilic peptide EAK16-II with histidinylated analogues and implications for functionalization of beta-sheet fibrils in vivo. Biomaterials. 35, 5196-5205 (2014).
- Zheng, Y., et al. A peptide-based material platform for displaying antibodies to engage T cells. Biomaterials. 32, 249-257 (2011).
- Tajima, A., et al. Bioengineering mini functional thymic units with EAK16-II/EAKIIH6 self-assembling hydrogel. Clin Immunol. 160, 82-89 (2015).
- Fan, Y., et al. Bioengineering Thymus Organoids to Restore Thymic Function and Induce Donor-Specific Immune Tolerance to Allografts. Mol Ther. 23, 1262-1277 (2015).
- Fan, Y., et al. Thymus-specific deletion of insulin induces autoimmune diabetes. The EMBO J. 28, 2812-2824 (2009).
- Fan, Y., et al. Compromised central tolerance of ICA69 induces multiple organ autoimmunity. J Autoimmun. 53, 10-25 (2014).
- Palumbo, M. O., Levi, D., Chentoufi, A. A., Polychronakos, C. Isolation and characterization of proinsulin-producing medullary thymic epithelial cell clones. Diabetes. 55, 2595-2601 (2006).
- Williams, K. M., et al. Single cell analysis of complex thymus stromal cell populations: rapid thymic epithelia preparation characterizes radiation injury. Clin Transl Sci. 2, 279-285 (2009).
- McLelland, B. T., Gravano, D., Castillo, J., Montoy, S., Manilay, J. O. Enhanced isolation of adult thymic epithelial cell subsets for multiparameter flow cytometry and gene expression analysis. J Immunol Methods. 367, 85-94 (2011).
- Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. J Immunol methods. 385, 23-34 (2012).
- Xing, Y., Hogquist, K. A. Isolation, identification, and purification of murine thymic epithelial cells. J Vis Exp. , e51780 (2014).
- Graham, J. M. Separation of monocytes from whole human blood. ScientificWorldJournal. 2, 1540-1543 (2002).
- Li, X., Donowitz, M. Fractionation of subcellular membrane vesicles of epithelial and nonepithelial cells by OptiPrep density gradient ultracentrifugation. Methods Mol Biol. 440, 97-110 (2008).
- Mita, A., et al. Purification method using iodixanol (OptiPrep)-based density gradient significantly reduces cytokine chemokine production from human islet preparations, leading to prolonged beta-cell survival during pretransplantation culture. Transplant Proc. 41, 314-315 (2009).
- Anderson, G., Takahama, Y. Thymic epithelial cells: working class heroes for T cell development and repertoire selection. Trends Immunol. 33, 256-263 (2012).
- Kyewski, B., Klein, L. A central role for central tolerance. Annu Rev Immunol. 24, 571-606 (2006).
- St-Pierre, C., et al. Transcriptome sequencing of neonatal thymic epithelial cells. Sci Rep. 3, 1860 (2013).
