סרטון זה מדגים פרוטוקול להעשרת תאי אפיתל תימיים (TECs) עם שיפוע צפיפות לבידוד FACS. הוא גם מראה את השימוש בפפטידים EAK16-II/EAKIIH6 כדי לקדם את היווצרות הצבירה של TEC. המיקרו-סביבות של הידרוג'ל EAK16-II/EAKIIH6 מספקות את התצורה התלת-ממדית הדרושה לשמירה על ההישרדות והתפקוד של ה-TEC.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
קידום Aggregation 3-D של תאי אפיתל הרתי המטוהר FACS עם EAK 16-II / EAKIIH6 עצמית להרכבת הידרוג'ל
במאמר זה
סיכום
תקציר
התפתחות בלוטת התימוס, הקשורה להזדקנות או עלבונות פתולוגיים, גורמת לירידה בתפוקה של תאי T בוגרים. שחזור התפקוד של בלוטת התימוס הכושלת הוא חיוני לשמירה על תגובה חיסונית נרכשת יעילה בתיווך תאי T כנגד פתוגנים פולשים. עם זאת, התחדשות התימוס והחייאתו התגלו כמאתגרים, בעיקר בשל הקשיים בשחזור המיקרו-סביבה התלת-ממדית הייחודית של הסטרומה התימית שהיא קריטית להישרדות ולתפקוד של תאי אפיתל תימוס (TECs). פיתחנו מערכת הידרוג'ל חדשה לקידום היווצרותם של אגרגטים TEC, המבוססת על תכונת ההרכבה העצמית של האוליגופפטידים האמפיפיליים EAK16-II והאנלוגי ההיסטידיניל שלו EAKIIH6. TECs הועשרו מתאים תימיים מבודדים עם שיפוע צפיפות, מוינו במיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטי (FACS), וסומנו בנוגדנים של מולקולת הידבקות תאים אנטי-אפיתל (EpCAM) שעוגנו, יחד עם אנטי-His IgGs, על קומפלקסי מתאם החלבון A/G. היווצרות אגרגטים של תאים קודמה על ידי דגירה של TECs עם אוליגופפטידים EAKIIH6 ו-EAK16-II, ולאחר מכן על ידי הגדלת הריכוז היוני של המדיום כדי להתחיל ג'לציה. אגרגטים של TEC המוטבעים בהידרוג'ל EAK יכולים לקדם ביעילות את התפתחותם של תאי T פונקציונליים in vivo כאשר הם מושתלים בעכברים עירומים אתימיים.
מבוא
התימוס הוא איבר הלימפה הראשי אחראי לייצור אוכלוסייה מגוונת של תאי הפתוגן-reactive, עצמי סובלני T כי הוא חיוני לתפקוד של מערכת החיסון הנרכשת. זהו איבר דינמי שבו thymocytes פיתוח, עלה ממח העצם כפי ובתאים הלימפוציטים, נודדים דרך מטריקס תלת מימדי דמוי ספוג (3-D) של stroma הרתי, לעבור השושלת-מפרט והבחנה, ובסופו של דבר להגר כפי בוגרת T-תאי. הצלחתו של תהליך מתוכנת היטב זה תלוי במידה רבה על הצטלבות בין thymocytes נודדות לתאי האפיתל מגורים הרתי (Tecs), האוכלוסייה השלטת של stroma הרתי החיוניים לקביעתם ולקיומם של שלמות במיקרו-סביבה של התימוס.
בהתבסס על המיקום האנטומי שלה....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל בעלי החיים המשמשים בניסויים שוכנו במתקן החיה במכון מחקר אלגני-זינגר תחת הפרוטוקול נבדק ואושר על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדיים השתמש המכון לחקר זינגר רשת בריאות אלגני / אלגני.
1. לעכל את התימוס עם Collagenase
- בלוטות התימוס קציר.
- להרדים 3-5 שבועות בן עכברים C57BL6 / J בתוך הפחמן הדו-חמצני (CO 2) תא למסוק בלוטות התימוס. בפירוט, מניחים את העכברים בתא תחת אינדוקציה
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כדי לבחון את האפקטיביות של השימוש בפרוטוקול ההפרדה שיפוע צפיפות להעשיר את תאי סטרומה CD45-, תאים שנקטפו משני הממשק ואת כדורי הלימפוציטים זירז הוכתמו אנטי CD45 ונוגדנים אנטי EpCAM. שני 1 אנטי Ulex Europaeus agglutinin (UEA1) ונוגדנים נגד MHC Class II נכללו גם קוקטייל מכתים להמשיך לזהות את תת cTEC ו Mtec. כפי שניתן לראות בתרשים 1, הצלחנו להשיג שגרתי קרוב ל 15-20 פעמים העשרה של Tecs.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בעוד Tecs הם האוכלוסייה השלטת של stroma הרתי ולשחק תפקידים חיוניים עבור המבנה והתפקוד של בלוטות התימוס, הם מהווים רק 0.1-0.5% של cellularity הרתי הכולל. הם גם תאי שברירי כמו באחוזים גבוהים של מוות של תאים הם נצפו לעתים בעקבות עיכול collagenase, כלומר, הטיפול לנתק Tecs מן מטריקס (ECM). הנדירות שלהם (~ 200,000 לכל התימוס עכבר) והשברירי, היו זו משימה מאתגרת לבודד Tecs. הניצול האחרון של collagenase הנקי במיוחד בבידוד TEC הגדיל באופן משמעותי את מספרם של תאי חיים בעקבות העיכול .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין ניגוד אינטרסים.
תודות
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקים R21 AI113000 (WSM) ו R01 AI123392 (YF).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>TEC בידוד | |||
| 70% אתנול | Decon Laboratories | 2701 (1 ליטר) | אתנול 200 הוכחה, מספריים לניתוח מים נטולי יונים |
| , ישר | Fine Science Tools, Inc. | 91460-11 | |
| מלקחיים של Graefe, ישר | Fine Science Tools, Inc. | 11053-10 | |
| מלקחיים של Graefe, | Fine Science Tools, Inc. | 11052-10 | |
| תמיסת | 1x PBS, 0.1% BSA, 2 mM EDTA | ||
| 1x PBS (תמיסת מלח חוצצת פוספט) | Gibco | 10010-023 | |
| BSA (אלבומין בסרום בקר) | Sigma | A1470-100G | |
| EDTA (חומצה אתילנדיאמינטטראצטית) | Invitrogen | 15575-038 | |
| תמיסת | 9 מ"ל RPMI-1640, 0.025 מ"ג/מ"ל Liberase TM ציון מחקר, 10 מ"מ HEPES, 0.2 מ"ג/מ"ל DNaseI | ||
| RPMI-1640 | Gibco | 11879-020 | |
| Liberase TM Research Grade | Roche | 05 401 127 001 | המכונה "קולגנאז מטוהר" |
| 1 M HEPES | Lonza | 17-737E | |
| Dnase I | Roche | 10 104 159 001 | |
| 50 צינור צנטריפוגה מ"ל | קורנינג | 430290 | |
| 60 צלחת תרבית רקמות מ"מ | פלקון | 353002 | |
| 1/2 מזרק אינסולין cc U-100 28 1/2 ג'י | בקטון דיקינסון | 329461 | |
| 5 מ"ל פוליסטירן צינור תחתון עגול | פלקון | 352058 | |
| 5 מ"ל צינור זכוכית | פישר הלת' | 13-678-27E | השתמש לשטיפת שברי התימוס. שברי תימוס נוטים להיצמד לקיר בעזרת צנרת פלסטיק. |
| מסובב צינור MACSmix | Miltenyi | 130-090-753 | |
| 100 ומיקרו; מסננת תאים m | Falcon | 352360 | |
| מדיום שיפוע צפיפות: OptiPrep | Axis-Shield | ||
| <מיון תאים חזק> | |||
| 5 מ"ל פוליפרופילן צינור תחתון עגול | Falcon | 352063 | |
| נגד עכבר CD16/CD32 (FC Block) | BD Biosciences | 553142 | להשתמש כלא מדולל, 2 ומיקרו; l לכל דגימה |
| נגד עכבר CD45-PercpCy5.5 | eBioscience | 45-0451-80 | השתמש ב 1:150, 10 ומיקרו; l לכל דגימה |
| נגד עכבר CD326 (EpCAM)-PE | eBioscience | 12-5791-82 | השתמש ב-1:100, 10 ומיקרו; l לכל דגימה |
| BD Influx | BD Biosciences | ||
| FlowJo | |||
| EAK ג'ל הרכבה | |||
| אנטי-היס-תג | AnaSpec | 29673 | "אנטי-היס-תג IgG" |
| מטוהר נגד עכבר CD326 (EpCAM) | BioLegend | 118202 | "אנטי-EpCAM IgG" |
| חלבון רקומביננטי A/G | פירס ביוטכנולוגיה | ||
| 1.5 ml Safe-Lock Tubes, Biopur, Sterile | Fisher Healthcare | 05-402-24B | המכונה "1.5 צינור מיקרוצנטריפוגה מ"ל " |
| 96 בארות, צלחת תרבית רקמות, תחתית עגולה עם מכסה אידוי נמוך | BD Falcon | 353917 | |
| פלטפורמת נדנדה: מיקסר Nutator מס' 1105 | BD Clay Adams | ||
| 10% סוכרוז | Sigma | S0389 | הכן עם מים מזוקקים סטריליים |
| EAK16-II (AcNH-AEAEAKAEAEAKAK-CONH2) | American Peptide Company& נ.ב.פ; | מסונתז בהתאמה אישית, 10 מ"ג/מ"ל | |
| EAKIIH6 (AcNH-AEAEAKAEAEAKAKHHHHHH-CONH2) | חברת הפפטידים האמריקאית | מסונתז בהתאמה אישית, 7.5 מ"ג/מ"ל | |
| בינוני | , 10% FBS, 1% עט/סטרפטוק, 1% L-גלוטמין, 1% NEAA, 5 מ"מ HEPES, 50 ומיקרו; M 2-מרקפטואתנול | ||
| RPMI-1640 | ג'יבקו | 11879-020 | |
| FBS (סרום בקר עוברי) | Atlanta Biologicals | S11150 | מושבת בחום לפני השימוש |
| עט/סטרפטוקוקוס | גיבקו | 15140-122 | |
| L-גלוטמין 200 מ"מ (100x) | גיבקו | 25030-081 | |
| NEAA (חומצת אמינו לא חיונית) 100x | גיבקו | 11140-050 | |
| 1 M HEPES | BioWhittaker | 17-737E | |
| 2-Mercaptoethanol (100x) | Millipore | ES-007-E | |
| שייקר פלטפורמה: רקדנית הבטן | Stovall Life Sciences Inc. | דגם: USBDbo |
מקורות
- Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus. Nature. 362, 70-73 (1993).
- Fan, Y., et al. Thymus-specific deletion of insuli....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
