Introduction
התימוס הוא איבר הלימפה הראשי אחראי לייצור אוכלוסייה מגוונת של תאי הפתוגן-reactive, עצמי סובלני T כי הוא חיוני לתפקוד של מערכת החיסון הנרכשת. זהו איבר דינמי שבו thymocytes פיתוח, עלה ממח העצם כפי ובתאים הלימפוציטים, נודדים דרך מטריקס תלת מימדי דמוי ספוג (3-D) של stroma הרתי, לעבור השושלת-מפרט והבחנה, ובסופו של דבר להגר כפי בוגרת T-תאי. הצלחתו של תהליך מתוכנת היטב זה תלוי במידה רבה על הצטלבות בין thymocytes נודדות לתאי האפיתל מגורים הרתי (Tecs), האוכלוסייה השלטת של stroma הרתי החיוניים לקביעתם ולקיומם של שלמות במיקרו-סביבה של התימוס.
בהתבסס על המיקום האנטומי שלהם פונקציה ייחודית, Tecs ניתן לחלק לשתי קבוצות משנה: הטקאנים בקליפה (cTECs) כי הם responsible לבחירה עצמי MHC (מורכבי histocompatibility גדולים) מוגבל מתאי T (סלקציה חיובית), ואת Tecs ב הלשד (mTECs) כי הם חיוניים עבור ביטול אוטוריאקטיבים תאי T (סלקציה שלילית) 1,2. גורמים רבים (למשל, הזדקנות, זיהום, קרינה, התרופה טיפולים) יכול לגרום נזק בלתי הפיך האפיתל הרתי, וכתוצאה מכך חסינות אדפטיבית נפגעת. למרות ניסיונות רבים, משחזר את תפקוד הרתי כבר מאתגר בשל הקושי לשחזר את המיקרו-סביבה הרתי. יש לציין, הרתי תלת ממדי (3-D) תצורה היא קריטית להישרדות והתפקוד של Tecs, ואילו Tecs תורבת בסביבת 2-D במהירות להקטין את הביטוי של גנים קריטיים עבור 3,4 thymopoiesis.
EAK16-II (AEAEKAKAEAEAKAK) ו אנלוגי histidinylated C- מסוף שלה EAKIIH6 (AEAEKAKAEAEAKAKHHHHHH) הם משקל מולקולרי נמוך, oligopeptides amphiphilic כי הם מסיסים שתייה ללא יוניםr, אבל לעבור gelation ליצירת β-הסיבים כאשר הם נחשפים כוח יוניים גבוה מ -20 מ"מ NaCl (ריכוז מלח רגיל בנוזל הגוף האנושי הוא 154 מ"מ). נכס תגובה הסביבה זה גורם להם להיות אבני הבניין צדדי כדי ליצור מבנים 3D. The-התג שלו על EAKII-H6 מספק מנגנון עגינה, שבאמצעותו IgGs אנטי שלו / Fc מחייב חלבון רקומביננטי / G (αH6: PA / G) מתחמים יכולים לשמש מתאם לעגן תרופות חלבון ביומולקולות אחר ( למשל, נוגדנים) על מרוכבים הידרוג'ל 5-8.
אנחנו הוכחנו בעבר כי מולקולות ניאון שכותרתו IgG מעוגנות על הידרוג'ל ניתן להיעזר באזור הזריקה עד 13 ימים 9. יתר על כן, כאשר αH6: מתאמי הרשות / G מעוגן עם IgGs אנטי CD4 נוספו EAK16-II / EAKIIH6 (EAK) הידרוג'ל, תאי CD4 + T נתפסו במיוחד 10. באמצעות טכניקה דומה, אנחנו הוכחנו לאחרונה כי צבירת 3-D של ג Tecsולד יקודם הידרוג'ל EAK עם מתחמי מתאם נושאת נוגדנים אנטי EpCAM TEC-ספציפי (αH6: PA / G: αEpCAM). כאשר מושתלים מתחת קפסולות הכליות של עכברים בעירום, אשכולות TEC מוטבעים הידרוג'ל EAK יכולים לתמוך בפיתוח יעיל של תאי T התפקודיים in vivo 11,12.
כאן אנו מדגימים את השיטה שלנו לטהר Tecs במהירות וביעילות עם תא המופעל הקרינה מיון (FACS) וליצור 3-D אגרגטים TEC עם מערכת הידרוג'ל EAK.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל בעלי החיים המשמשים בניסויים שוכנו במתקן החיה במכון מחקר אלגני-זינגר תחת הפרוטוקול נבדק ואושר על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדיים השתמש המכון לחקר זינגר רשת בריאות אלגני / אלגני.
1. לעכל את התימוס עם Collagenase
- בלוטות התימוס קציר.
- להרדים 3-5 שבועות בן עכברים C57BL6 / J בתוך הפחמן הדו-חמצני (CO 2) תא למסוק בלוטות התימוס. בפירוט, מניחים את העכברים בתא תחת אינדוקציה 2 CO 3-5 דקות ולאשר למוות על ידי אימות דום לב או נשימה.
- הנח את הפגר על גבו להרטיב את הגוף עם אתנול 70%. לעשות חתך אופקי קטן עם מספרי לנתח חד, ישר על הבטן שלה דרך העור. משוך את העור משני הקצוות (ראש ורגליים), כך הוא גם הפוך לחלוטין.
- ביצוע חתך אופקי עם המספריים לנתח רק תחתהצלע הנמוכה ביותר לחתוך דרך הסרעפת לצדדים. החזק את תהליך xiphoid עם מלקחיים ולחתוך באמצע הצלעות שתמשיך עד משני הצדדים. משוך כלפי מעלה את הצלעות / עצם החזה כך התימוס נראה בבירור.
הערה: קורנית שוכנת ישירות על החלק העליון של הלב, מורכבת מ -2 אונות והוא בצבע לבן שקוף. - בעזרת מלקחיים מעוקלים, בעדינות לגרוף ולמשוך אונות התימוס ההנחה של רקמות חיבור העביר בתמיסת כביסה (ראה רשימה של חומרים).
- הכן פתרון העיכול על ידי ערבוב 9 מ"ל RPMI-1640 (מכון ממוריאל פארק רוזוול בינוני-1640), 0.025 מ"ג / collagenase מטוהרים מ"ל, 10 HEPES מ"מ [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic חומצה], ו -0.2 מ"ג / מ"ל DNase אני בתוך שפופרת 50 צנטריפוגות מ"ל. שמור את הפתרון העיכול ב -37 מעלות צלזיוס המים באמבטיה עד השימוש.
הערה: סכום פתרון העיכול המוכן מספיק thymi עכבר עד חמישה מבוגרים, אשר יכול להיות מודגרות יחד עגול קלקר אחד 5 מיליליטרצינור תחתון. - מעבירים את התימוס לצלחת בתרבית רקמה 60 מ"מ המכיל 5-6 מ"ל RPMI-1640.
- לנתח את בלוטת התימוס עם 28 G אינסולין מזרק מחט לחתיכות קטנות (ריבוע 1 מ"מ 3 על) כדי לאפשר לזרום החוצה לימפוציטים.
- שוטפים את חתיכות הרתי עם RPMI-1640 כי הוא בצלחת פטרי עם פיפטה זכוכית פסטר. הטה את הצלחת ולתת שברי הרתי ליישב לתחתית. לאט לשאוב וזורקים supernatant RPMI-1640 באמצעות פיפטה מזכוכית. חזור על שלב שטיפה זה עם 5-6 מ"ל RPMI-1640 עבור 4-5 פעמים עם פיפטה זכוכית עד הפתרון הוא פחות אטום.
הערה: טפטפות זכוכית מומלץ בשלב זה, שכן שברי הרתי נוטים לדבוק פלסטיק, וכתוצאה מכך אובדן מוגזם של רקמות הרתי. עבור שאר ההליך, להשתמש טפטפות פלסטיק. - לאחר השטיפה הסופית, לבטל את supernatant כמתואר בשלב 1.5. הוסף פתרון העיכול 3 מ"ל ולהעביר את חתיכות התימוס והפתרון לתוך 5 מ"ל p מסביב לתחתיתצינור olystyrene.
- מניחים את הצינור על הכתף צינור לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 6 דקות במהירות סיבוב של 12 סל"ד.
- לאחר דגירה, לתת את שברי הרתי ליישב לתחתית של התחתית על ידי כוח הכבידה. אסוף את supernatant עם פיפטה פסטר ולהעביר לתוך צינור צנטריפוגה 50 מ"ל עם 10 מ"ל של תמיסת שטיפה. צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות, לבטל את supernatant ו resuspend התאים בתמיסה לשטיפת 10 מ"ל. שמור על הקרח.
- חזור על שלבים 1.6-1.8 פעמיים על שברי הרתי ב -5 מ"ל מסביב לתחתית צינור קלקר. לרכז את supernatant בצינור אותו 50 מ"ל.
הערה: צנטריפוגה אין צורך השני לשטוף השלישי. - לאחר העיכול הסופי, pipet למעלה ולמטה עם 2 מיליליטר פיפטה סרולוגיות פלסטיק לשבור כל שברים שנותרו בצינור והעברת צינור צנטריפוגות 50 המ"ל.
- צנטריפוגה שפופרת 50 מ"ל ב 300 XG במשך 5 דקות, לשאוב supernatant, resuspend ב 10 מ"ל של שטיפת buffer ולסנן דרך 100 מיקרומטר תא מסנן. שמור על הקרח.
2. העשרה של Tecs עם שיפוע צפיפות רציף
- הכן פתרון שיפוע צפיפות 21% על ידי ערבוב 2.4 מ"ל בינוני שיפוע צפיפות (60% w / v של iodixanol במים) פתרון הכביסה 9.6 מ"ל.
- צנטריפוגה התאים הרתי ניתק בצינור 50 מ"ל אוסף משלב 1.11 ב XG 300 במשך 5 דקות ו resuspend במאגר כביסה 2.5 מ"ל.
- הוסף 20 מ"ל בינוני RPMI-1640 על השעיית התא.
- מלאו 12 מ"ל של תמיסת שיפוע צפיפות 21% בתוך pipet סרולוגיות 10 מ"ל עם פיפטור אלקטרוני. מניחים את קצה pipet סרולוגיות בתחתית הצינור צנטריפוגה 50 מ"ל תאים המכילים, ולאפשר הפתרון שיפוע צפיפות לנקז אל החלק התחתון של הצינור באמצעות כוח הכבידה.
- בעדינות לגרש פתרון שיפוע צפיפות מ pipet לסיים שהניב שתי השכבות של צפיפויות שונות.
- צנטריפוגה ב 600 XG FOr 20 דקות ב RT ב הרוטור מתנדנד-דלי. הגדר את קצב ההאטה ברמה האיטית ביותר.
- מעבירים את השכבה העליונה ואת ממשק לצינור חדש 50 מ"ל.
הערה: רוב Tecs נשמרים בממשק. לימפוציטים יהיה להאיץ לתחתית הצינור לאחר צנטריפוגה. אם תאים אלה ישמשו למטרות אחרות, יש לשטוף את הגלולה עם פתרון כביסה 20 מיליליטר במשך שלוש פעמים. Resuspend התאים 10 מ"ל של חיץ הכביסה. - הוסף פתרון כביסה עד 40 מ"ל אל הצינור בשלב 2.6 ו צנטריפוגות ב 400 XG במשך 6 דקות ב 4 ° C. כדי להסיר את supernatant, לשאוב עם pipet.
- חזור על הכביסה פי 2 השאיפה כמתואר בשלב 2.7.
- Resuspend ב 2 מ"ל של תמיסת שטיפה לספור את התאים עם hemocytometer.
3. Tecs בידוד עם FACS
- התאם התאים משלב 2.9 בריכוז של 1x10 6 תאים / 100 μl עם פתרון כביסה והעברתהתאים לצינור 5 מ"ל מסביב לתחתית (פוליפרופילן או קלקר, כפי שהומלץ על ידי ההנחיות של סדרן זרימה).
- מוסיפים 2 IgG הקולטן אנטי Fc μl לכל 1x10 6 תאים דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
- תוספת CD45 אנטי (דילול 1: 150, 10 μl לדגימה) ואנטי-EpCAM (1: 100 דילול, 10 μl לדגימה) נוגדני דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך יותר מ -20 דקות.
- שוטפים את התאים עם פתרון צנטריפוגות כביסה 2 מ"ל ב 400 XG במשך 6 דקות ב 4 ° C. לשאוב supernatant עם טפטפת.
- Resuspend התאים שנאגרו מלוחים פוספט 1x 1 מ"ל (PBS).
- סינון דרך מסננת 100 מיקרומטר.
- החל את התאים למכשיר מיון. בחר את הלימפוציטים ואוכלוסיית TEC למעט התאים הקטנים ביותר על אור המפוזר בצד (SSC) / אור-מפוזר קדימה פנל (FSC) (תאים מתים), אז שער על האוכלוסייה שנבחרה CD45- EpCAM + למיון 13.
4. Generation של TEC / EAK אגרגטים
הערה: יש לבצע הכנה מגיב וצעדים מעורבים תא ערבוב מתחת למכסה המנוע למינרית.
- הכן מתחמי מתאם PA / G על ידי ערבוב 4 μl של IgG אנטי-שלו-תג, 8 μl של IgG אנטי EpCAM ו -2.6 μl של הרשות / G בתוך שפופרת microcentrifuge סטרילי 1.5 מ"ל, ו לדגור על RT במשך 5 דקות.
- התאם את Tecs מסודרים משלב 3.7 ל 5x10 4 תאים / מ"ל עם פתרון כביסה, ו pipet 100 μl כדי אחד טוב של אויר נמוך, 96-גם צלחת בתרבית רקמה מסביב לתחתית. להוסיף 14.6 מתחמי מתאם PA / G μl אל התאים. מניח את הצלחת על פלטפורמת נדנדה במשך 20 דקות ב 4 °.
- שטפי פעם עם 200 פתרון הכביסה μl. צנטריפוגה את הצלחת ב 400 XG במשך 6 דקות. בטל supernatant עם micropipette.
- שטפי פעם עם תמיסת סוכרוז 200 μl 10%. צנטריפוגה ב 400 XG במשך 6 דקות. בטל supernatant עם micropipette.
- תאים Resuspend ב 30 μl 10% sתמיסת סוכרוז terile לכל טוב.
- הוסף 10 μl של EAKIIH6 (7.5 מ"ג / מ"ל) ו דגירה במשך 5 דקות ב RT.
- הוסף 20 μl של EAK16-II (10 מ"ג / מ"ל) לתערובת TEC.
- הוספת 100 μl של מדיום מלא למערכת ליזום gelation. מניחים את הצלחת על שייקר פלטפורמה 15-20 דקות ב RT.
- מניח את הצלחת בחממה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. לאחר 2-4 שעות, להוסיף עוד 100 μl של בינוני מלא.
- שנה בינונית בכל יום אחר עד השימוש.
- לשאוב 100 μl של המדיום מפני השטח מבלי להפריע את הג'ל באמצעות micropipette בעדינות להוסיף 100 μl של מדיום מראש חימם ידי הצבת קצה פיפטה אל הקיר של הבאר.
אפיון 5. של אגרגטים TEC / EAK
- כדי לבחון את הפונקציה של אגרגטים TEC / EAK in vivo, לאסוף את TEC / הידרוג'ל EAK לאחר O / N תרבות השתלת תחת הקפסולה כליות של athymic בעירוםעכבר, באמצעות שתואר לעיל הליך 11,14.
- לפקח על התפתחות תאי T בפריפריה על ידי קצירת 50-100 דגימות דם μl לתוך צינור איסוף דם המכיל EDTA מן העכברים בעירום 4-6 שבועות לפרסם השתלה ואת כתם עם קוקטייל של CD4 אנטי, -CD8, -CD45 , ו -CD3 נוגדנים 12.
- לנתח את האחוזים של לימפוציטים מסוג T ב לויקוציטים דם היקפיים עם cytometry זרימה (FCM), באמצעות תוכנת ניתוח תא בודד 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי לבחון את האפקטיביות של השימוש בפרוטוקול ההפרדה שיפוע צפיפות להעשיר את תאי סטרומה CD45-, תאים שנקטפו משני הממשק ואת כדורי הלימפוציטים זירז הוכתמו אנטי CD45 ונוגדנים אנטי EpCAM. שני 1 אנטי Ulex Europaeus agglutinin (UEA1) ונוגדנים נגד MHC Class II נכללו גם קוקטייל מכתים להמשיך לזהות את תת cTEC ו Mtec. כפי שניתן לראות בתרשים 1, הצלחנו להשיג שגרתי קרוב ל 15-20 פעמים העשרה של Tecs.
כדי לבחון את ההצטברות של Tecs הידרוג EAK, Tecs בודד מעכברים בן 4 שבועות B6.ROSA MT / מיליגאוס, אשר בכל מקום בגוף להביע את הקרום נכנס, מולקולות tdTomato ניאון אדומות. אגרגטים TEC, מוכן כמתואר לעיל, היו בתרבית למשך יומיים במבחנה ובחן תחת מיקרוסקופ confocal ( 
איור 1. ניתוח תזרים cytometric של Tecs מועשר פתרון שיפוע צפיפות. תאים הוכתמו-CD45 אנטי ונוגדנים אנטי EpCAM להבחין אוכלוסיית TEC (CD45- EpCAM +). לוחות שמאל: תאים הרתי לאחר עיכול אנזים, לפני הליך שיפוע צפיפות. לוחות תיכון: תאים בשכבה העליונה ואת הממשק לאחר הפרדה עם שיפוע פתרון צפיפות. לוחות מימין:. תאי pelleted (גלולה לימפוציטים) לאחר פרידה עם שיפוע פתרון צפיפות אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. 
איור 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בעוד Tecs הם האוכלוסייה השלטת של stroma הרתי ולשחק תפקידים חיוניים עבור המבנה והתפקוד של בלוטות התימוס, הם מהווים רק 0.1-0.5% של cellularity הרתי הכולל. הם גם תאי שברירי כמו באחוזים גבוהים של מוות של תאים הם נצפו לעתים בעקבות עיכול collagenase, כלומר, הטיפול לנתק Tecs מן מטריקס (ECM). הנדירות שלהם (~ 200,000 לכל התימוס עכבר) והשברירי, היו זו משימה מאתגרת לבודד Tecs. הניצול האחרון של collagenase הנקי במיוחד בבידוד TEC הגדיל באופן משמעותי את מספרם של תאי חיים בעקבות העיכול אנזימטי 15-19.
עם זאת, המספר קטן מאוד של Tecs עדיין מהווה אתגר מרכזי לניתוח והבידוד שלהם, כמו כמויות גדולות של נוגדנים יש צורך תיוג פני תא ומספרים מוגזמים של אירועים צריכים להיות שנאספו על ידי FACS. בעוד-המצומד נוגדןטכנולוגיה החרוזה ד מגנטית ניתן להשתמש כדי לרוקן thymocytes CD45 +, הכמות הגדולה שלהם הופכת את העניין לבלתי אפשרי מבחינה כלכלית בטווח הארוך. הצלחנו להעשיר Tecs ביעילות 15-20 פעמים עם צנטריפוגה שיפוע פשוט, צפיפות צעד אחד. הנכס האוסמוטי-iso של מדיום שיפוע צפיפות iodixanol מאפשר הפרדת תאים בהתבסס על צורתם, גדל בצפיפות 20-22. יצוין כי טוהר התשואה של Tecs מושפע אחוז מדיום שיפוע צפיפות בשימוש. שיעור נמוך יותר של מדיום שיפוע צפיפות (v 18-20% / v) יגרום טוהר גבוה של Tecs בממשק אבל תשואה נמוכה. לעומת זאת, כאשר ריכוז iodixanol גבוה יותר (22% v / v) משמש, כמות גדולה יותר של תאים הרתי ניתן לאסוף עם שיעור נמוך יותר של Tecs. ריכוז iodixanol צריך להיות מותאם המבוסס על מטרת הניסוי. בעוד טוהר Tecs משתפר במידה רבה עם השירות של פתרון שיפוע צפיפות, זה שאולd להדגיש כי התאים שנאספו השכבה העליונה ואת הממשק עדיין מכילים שיעור גבוה יחסי של CD45 + תאים (איור 1). לכן, כאשר רק אוכלוסיית TEC נדרשת בניסוי הזה, מיון תא יהיה מכריע, למרות הליך נוסף זה עלול לגרום לאובדן של תאים דורש יותר זמן.
בשונה מרוב תאי אפיתל מסודרים שכבות בודדות או מרובות רירית האיברים הקרביים, Tecs מאורגנים בתצורת 3-D ב stroma התימוס, שהוא חיוני להישרדות ותפקודם. מערכת הידרוג'ל EAK הרכבה העצמית מקלה על ההיווצרות של אגרגטים TEC 3-D, כי הם מתווכים על ידי αH6 תלת-מולקולרי: PA / G: מתחמי מתאם αEpCAM. מן הראוי לציין כי, על ידי כיוון עדין הריכוזים ויחסים של EAK16-II / EAKIIH6 oligopeptides, בנקבוביות ובצפיפות של הידרוג'ל יכול להיות מותאם כדי לאפשר את זרימת החומרים המזינים ואת נדידת thymocytes. ואכן, functional-תאי T נוצרו בעכברים בעירום athymic המושתלים עם מרוכבים TEC / EAK.
החסרון במערכת הידרוג'ל EAK זה הוא כי עם פרוטוקול נוכחי, רכב תאים ספציפי לא יכול להיות מקומי לאזור מיועד. בסביבה גופנית התימוס מורכב משני תאים נפרדים, שבהם סוגים מסוימים של Tecs מתגוררים, cTECs בקליפה ו mTECs ב לשד. באמצעות המערכת שלנו המתואר כאן, הן cTECs ו mTECs מסומנים עם EpCAM, סמן אפיתל בכלל. לכן ישנה סברה כי אגרגטים הידרוג נוצר כוללת שתי תת הקבוצות של Tecs. למרות cTECs ו mTECs נובעות אבות TEC bipotent משותף, תפקידם בפיתוח תאי T הם ייחודיים בבירור. Cortex הוא האזור הראשון התימוס שבו ובתאים הרתי בשלה להיכנס, ואת הבחירה החיובית מתרחשת 23. ואז התאים שנבחרו לעבור לאזור מדולרי ולתקשר עם mTECs, דרך which התאים-reactive העצמית בוטלו על ידי סלקציה שלילית 24. יתר על כן, הוכח כי 25% מהגנים מתבטאים באופן דיפרנציאלי בין cTECs ו mTECs 25. ממצאים אלו מדגישים את החשיבות של קידום צבירה של תת TEC להגדיל את היעילות של פיתוח תאי T. גישה אפשרית אחת היא להשתמש נוגדנים שונים מיקוד מולקולות משטח ספציפי או cTECs או mTECs, כגון 8-cytokeratin אנטי עבור cTECs, ואנטי-cytokeratin 5 עבור mTECs.
מנקודת המבט של יישומים קליניים בעתיד, אשכולות TEC מוטבעים הידרוג'ל המתכלה עשויים לתפקד בזריקות "יחידות התימוס מיניות" כדי לווסת את מערכת אדפטיבית חיסונית שעלולה להיות חשוב עבור מצבים רפואיים שונים, כגון התחדשות המערכת החיסונית אדפטיבית אצל אנשים בגילים , או גרימת סובלנות ספציפי התורם בהשתלות איברים מוצקים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקים R21 AI113000 (WSM) ו R01 AI123392 (YF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TEC Isolation | |||
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2701(1 Gallon) | Ethanol 200 Proof, deionized water |
| Dissecting scissors, straight | Fine Science Tools, Inc. | 91460-11 | |
| Graefe forceps, straight | Fine Science Tools, Inc. | 11053-10 | |
| Graefe forceps, curved | Fine Science Tools, Inc. | 11052-10 | |
| Washing solution | 1x PBS, 0.1% BSA, 2 mM EDTA | ||
| 1x PBS (Phosphate buffered saline) | Gibco | 10010-023 | |
| BSA (Bovine serum albumin) | Sigma | A1470-100G | |
| EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | Invitrogen | 15575-038 | |
| Digestion solution | 9 ml RPMI-1640, 0.025 mg/ml Liberase TM Research grade, 10 mM HEPES, 0.2 mg/ml DNaseI | ||
| RPMI-1640 | Gibco | 11879-020 | |
| Liberase TM Research Grade | Roche | 05 401 127 001 | referred as "purified collagenase" |
| 1 M HEPES | Lonza | 17-737E | |
| Dnase I | Roche | 10 104 159 001 | |
| 50 ml Centrifuge tube | Corning | 430290 | |
| 60 mm tissue culture dish | Falcon | 353002 | |
| 1/2 cc U-100 Insulin syringe 28 1/2 G | Becton Dickinson | 329461 | |
| 5 ml Polystyrene round-bottom tube | Falcon | 352058 | |
| 5 ml glass pipet | Fisher Healthcare | 13-678-27E | Use for rinsing the thymic fragments. Thymic fragments tend to stick to the wall with plastic pipets. |
| MACSmix tube rotator | Miltenyi | 130-090-753 | |
| 100 µm Cell strainer | Falcon | 352360 | |
| Density gradient medium: OptiPrep | Axis-Shield | ||
| Cell Sorting | |||
| 5 ml Polypropylene round-bottom tube | Falcon | 352063 | |
| Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | Use as undiluted, 2 µl per sample |
| Anti-mouse CD45-PercpCy5.5 | eBioscience | 45-0451-80 | Use at 1:150, 10 µl per sample |
| Anti-mouse CD326 (EpCAM)-PE | eBioscience | 12-5791-82 | Use at 1:100, 10 µl per sample |
| BD Influx | BD Biosciences | ||
| Single cell analysis software | FlowJo | ||
| EAK Gel Assembly | |||
| Anti-His-Tag | AnaSpec | 29673 | "anti-His-Tag IgG" |
| Purified anti-mouse CD326 (EpCAM) | BioLegend | 118202 | "anti-EpCAM IgG" |
| Recombinant protein A/G | Pierce Biotechnology | ||
| 1.5 ml Safe-Lock Tubes, Biopur, Sterile | Fisher Healthcare | 05-402-24B | referred as "1.5 ml microcentrifuge tube" |
| 96-well, Tissue culture plate, Round-bottom with low evaporation lid | BD Falcon | 353917 | |
| Rocking platform: Nutator Mixer no.1105 | BD Clay Adams | ||
| 10% sucrose | Sigma | S0389 | Prepare with sterile distilled water |
| EAK16-II (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAK-CONH2) | American Peptide Company | custom synthesized, 10 mg/ml | |
| EAKIIH6 (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAKHHHHHH-CONH2) | American Peptide Company | custom synthesized, 7.5 mg/ml | |
| Complete medium | RPMI-1640, 10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% L-glutamine, 1% NEAA, 5 mM HEPES, 50 µM 2-Mercaptoethanol | ||
| RPMI-1640 | Gibco | 11879-020 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Atlanta Biologicals | S11150 | Heat inactivated before use |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| NEAA (non-essential amino acid) 100x | Gibco | 11140-050 | |
| 1 M HEPES | BioWhittaker | 17-737E | |
| 2-Mercaptoethanol (100x) | Millipore | ES-007-E | |
| Platform shaker: The Belly Dancer | Stovall Life Sciences Inc. | model: USBDbo |
References
- Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus. Nature. 362, 70-73 (1993).
- Fan, Y., et al. Thymus-specific deletion of insulin induces autoimmune diabetes. The EMBO J. 28, 2812-2824 (2009).
- Mohtashami, M., Zuniga-Pflucker, J. C. Three-dimensional architecture of the thymus is required to maintain delta-like expression necessary for inducing T cell development. J Immunol. 176, 730-734 (2006).
- Pinto, S., et al. An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression. J Immunol. 190, 1085-1093 (2013).
- Fung, S. Y., Yang, H., Chen, P. Formation of colloidal suspension of hydrophobic compounds with an amphiphilic self-assembling peptide. Colloids Surf B Biointerfaces. 55, 200-211 (2007).
- Jun, S., et al. Self-assembly of the ionic peptide EAK16: the effect of charge distributions on self-assembly. Biophys J. 87, 1249-1259 (2004).
- Saunders, M. J., et al. Engineering fluorogen activating proteins into self-assembling materials. Bioconjug Chem. 24, 803-810 (2013).
- Zhang, S., Holmes, T., Lockshin, C., Rich, A. Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane. Proc of the Natl Acad Sci U S A. 90, 3334-3338 (1993).
- Wen, Y., et al. Coassembly of amphiphilic peptide EAK16-II with histidinylated analogues and implications for functionalization of beta-sheet fibrils in vivo. Biomaterials. 35, 5196-5205 (2014).
- Zheng, Y., et al. A peptide-based material platform for displaying antibodies to engage T cells. Biomaterials. 32, 249-257 (2011).
- Tajima, A., et al. Bioengineering mini functional thymic units with EAK16-II/EAKIIH6 self-assembling hydrogel. Clin Immunol. 160, 82-89 (2015).
- Fan, Y., et al. Bioengineering Thymus Organoids to Restore Thymic Function and Induce Donor-Specific Immune Tolerance to Allografts. Mol Ther. 23, 1262-1277 (2015).
- Fan, Y., et al. Thymus-specific deletion of insulin induces autoimmune diabetes. The EMBO J. 28, 2812-2824 (2009).
- Fan, Y., et al. Compromised central tolerance of ICA69 induces multiple organ autoimmunity. J Autoimmun. 53, 10-25 (2014).
- Palumbo, M. O., Levi, D., Chentoufi, A. A., Polychronakos, C. Isolation and characterization of proinsulin-producing medullary thymic epithelial cell clones. Diabetes. 55, 2595-2601 (2006).
- Williams, K. M., et al. Single cell analysis of complex thymus stromal cell populations: rapid thymic epithelia preparation characterizes radiation injury. Clin Transl Sci. 2, 279-285 (2009).
- McLelland, B. T., Gravano, D., Castillo, J., Montoy, S., Manilay, J. O. Enhanced isolation of adult thymic epithelial cell subsets for multiparameter flow cytometry and gene expression analysis. J Immunol Methods. 367, 85-94 (2011).
- Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. J Immunol methods. 385, 23-34 (2012).
- Xing, Y., Hogquist, K. A. Isolation, identification, and purification of murine thymic epithelial cells. J Vis Exp. , e51780 (2014).
- Graham, J. M. Separation of monocytes from whole human blood. ScientificWorldJournal. 2, 1540-1543 (2002).
- Li, X., Donowitz, M. Fractionation of subcellular membrane vesicles of epithelial and nonepithelial cells by OptiPrep density gradient ultracentrifugation. Methods Mol Biol. 440, 97-110 (2008).
- Mita, A., et al. Purification method using iodixanol (OptiPrep)-based density gradient significantly reduces cytokine chemokine production from human islet preparations, leading to prolonged beta-cell survival during pretransplantation culture. Transplant Proc. 41, 314-315 (2009).
- Anderson, G., Takahama, Y. Thymic epithelial cells: working class heroes for T cell development and repertoire selection. Trends Immunol. 33, 256-263 (2012).
- Kyewski, B., Klein, L. A central role for central tolerance. Annu Rev Immunol. 24, 571-606 (2006).
- St-Pierre, C., et al. Transcriptome sequencing of neonatal thymic epithelial cells. Sci Rep. 3, 1860 (2013).
