Questo video dimostra un protocollo per arricchire le cellule epiteliali timiche (TEC) con gradiente di densità per l'isolamento FACS. Mostra anche l'uso di peptidi EAK16-II/EAKIIH6 per promuovere la formazione di aggregati TEC. I microambienti dell'idrogel EAK16-II/EAKIIH6 forniscono la configurazione 3D necessaria per mantenere la sopravvivenza e la funzione dei TEC.
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Articolo metodologico
La promozione 3-D di aggregazione delle cellule FACS purificata timica epiteliali con EAK 16-II / EAKIIH6 autoassemblanti idrogel
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'involuzione del timo, associata all'invecchiamento o a insulti patologici, provoca una diminuzione della produzione di cellule T mature. Il ripristino della funzione di un timo difettoso è fondamentale per mantenere un'efficace risposta immunitaria acquisita mediata dalle cellule T contro i patogeni invasori. Tuttavia, la rigenerazione e la rivitalizzazione del timo si sono rivelate impegnative, in gran parte a causa delle difficoltà di riprodurre l'esclusivo microambiente 3D dello stroma timico che è fondamentale per la sopravvivenza e la funzione delle cellule epiteliali timiche (TEC). Abbiamo sviluppato un nuovo sistema di idrogel per promuovere la formazione di aggregati TEC, basato sulla proprietà autoassemblante degli oligopeptidi anfifilici EAK16-II e del suo analogo istidinilato EAKIIH6. Le TEC sono state arricchite da cellule timiche isolate con gradiente di densità, selezionate con smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) e marcate con anticorpi anti-molecola di adesione cellulare epiteliale (EpCAM) che sono stati ancorati, insieme a IgG anti-Hi, sui complessi adattatori della proteina A/G. La formazione di aggregati cellulari è stata promossa incubando i TEC con oligopeptidi EAKIIH6 e EAK16-II, e quindi aumentando la concentrazione ionica del mezzo per avviare la gelificazione. Gli aggregati TEC incorporati nell'idrogel di EAK possono promuovere efficacemente lo sviluppo di cellule T funzionali in vivo quando trapiantati nei topi nudi atimici.
Introduzione
Il timo è l'organo linfoide primaria responsabile per la generazione di una popolazione eterogenea di cellule T auto-tolerant patogeno-reattivo che è essenziale per la funzione del sistema immunitario acquisito. Si tratta di un organo dinamico dove timociti di sviluppo, immigrarono dal midollo osseo come cellule linfociti progenitrici, migrano attraverso il tridimensionale (3-D) a matrice spugnosa dello stroma timico, sottoposti lineage-specifiche e differenziazione, e infine emigrare maturo T-cellule. Il successo di questo processo ben programmato dipende in gran parte sul cross-talk tra i timociti migrazione e le cellule epiteliali del timo residenziali (TEC), ....
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Protocollo
Tutti gli animali utilizzati negli esperimenti sono stati alloggiati nella struttura animali a Allegheny-Singer Research Institute nell'ambito del protocollo esaminato e approvato dal Comitato di Cura e uso istituzionale animali del / Allegheny Singer Research Institute Allegheny Health Network.
1. digerire il timo con collagenasi
- Harvest timo.
- Euthanize 3-5 settimane di età topi C57BL6 / J in anidride carbonica (CO 2) da camera per raccogliere timo. Nel dettaglio, mettere i topi nella camera sotto di CO 2 di induzione per 3-5 minuti e confermare la morte verificando arresto cardiaco o respira....
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Risultati
Per esaminare l'efficacia di utilizzare il protocollo di separazione gradiente di densità per arricchire le cellule stromali CD45-, cellule raccolte sia l'interfaccia e il pellet di linfociti precipitati sono state colorate con anti-CD45 e anti-EpCAM. Entrambi anti-Ulex Europaeus Agglutinin 1 (UEA1) e anticorpi anti-MHC di classe II sono stati inclusi anche nel cocktail colorazione per identificare ulteriormente i sottoinsiemi CTEC e MTEC. Come mostrato in Figura 1, siam.......
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Discussione
Mentre TEC sono la popolazione predominante dello stroma del timo e svolgono ruoli essenziali per la struttura e la funzione del timo, essi rappresentano solo circa il 0,1-0,5% della cellularità timica totale. Sono anche cellule fragili come alte percentuali di morte cellulare sono occasionalmente osservati dopo digestione collagenasi, cioè, il trattamento dissociare TEC dalla matrice extracellulare (ECM). La loro rarità (~ 200.000 al timo del mouse) e la fragilità reso un compito impegnativo per isolare TEC. I.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato in parte dal National Institutes of Health concede R21 AI113000 (WSM) e R01 AI123392 (YF).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| TEC Isolation | |||
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2701 (1 gallone) | Ethanol 200 Proof, acqua deionizzata |
| Forbici da dissezione, dritto | Fine Science Tools, Inc. | 91460-11 | |
| Pinze Graefe, diritte | Fine Science Tools, Inc. | 11053-10 | |
| Pinza Graefe, curva | Fine Science Tools, Inc. | 11052-10 | |
| Soluzione di lavaggio | 1x PBS, 0,1% BSA, 2 mM EDTA | ||
| 1x PBS (soluzione salina tamponata con fosfato) | Gibco | 10010-023 | |
| BSA (albumina sierica bovina) | Sigma | A1470-100G | |
| EDTA (acido etilendiamminotetraacetico) | Invitrogen | 15575-038 | |
| Soluzione | 9 ml RPMI-1640, 0,025 mg/ml Liberase TM Grado di ricerca, 10 mM HEPES, 0,2 mg/ml DNaseI | ||
| RPMI-1640 | Gibco | 11879-020 | |
| Liberase TM Research Grade | Roche | 05 401 127 001 | indicato come "collagenasi purificata" |
| 1 M HEPES | Lonza | 17-737E | |
| Dnase I | Roche | 10 104 159 001 | |
| 50 ml Provetta da centrifuga | Corning | 430290 | |
| 60 piatto per coltura tissutale in mm | Falcon | 353002 | |
| 1/2 cc U-100 Siringa da insulina 28 1/2 G | Becton Dickinson | 329461 | |
| 5 ml Tubo in polistirene a fondo tondo | Falcon | 352058 | |
| 5 ml pipetta in vetro | Fisher Healthcare | 13-678-27E | Utilizzare per il risciacquo dei frammenti di timo. I frammenti di timo tendono ad attaccarsi al muro con pipette di plastica. |
| Rotatore per provette MACSmix | Miltenyi | 130-090-753 | |
| 100 µ m Filtro cellulare | Falcon | 352360 | |
| Gradiente di densità medio: OptiPrep | Axis-Shield | ||
| Cell Sorting | |||
| 5 ml Tubo a fondo tondo | in polipropilene Falcon | 352063 | |
| Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | Utilizzare come non diluito, 2 µ l per campione |
| Anti-topo CD45-PercpCy5.5 | eBioscience | 45-0451-80 | Utilizzare a 1:150, 10 µ l per campione |
| Anti-topo CD326 (EpCAM)-PE | eBioscience | 12-5791-82 | Utilizzare a 1:100, 10 µ l per campione |
| BD Influx | BD Biosciences Software per | ||
| singole cellule | FlowJo | ||
| EAK Gel Assembly | |||
| Anti-His-Tag | AnaSpec | 29673 | "anti-His-Tag IgG" |
| Purificato anti-topo CD326 (EpCAM) | BioLegend | 118202 | "anti-EpCAM IgG" |
| Proteina ricombinante A/G | Pierce Biotechnology | ||
| 1.5 ml Provette Safe-Lock, Biopur, sterili | Fisher Healthcare | 05-402-24B | indicato come "1.5 provetta per microcentrifuga ml" |
| 96-well, Piastra per coltura tissutale, Fondo rotondo con coperchio a bassa evaporazione | BD Falcon | 353917 | |
| Piattaforma oscillante: Nutator Mixer no.1105 | BD Clay Adams | ||
| 10% saccarosio | Sigma | S0389 | Preparare con acqua distillata sterile |
| EAK16-II (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAK-CONH2) | American Peptide Company& nbsp; | sintetizzato su misura, 10 mg/ml | |
| EAKIIH6 (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAKHHHHHHH-CONH2) | American Peptide Company | sintetizzato su misura, 7,5 mg/ml | |
| Terreno | RPMI-1640, 10% FBS, 1% Pen/Streptococco, 1% L-glutammina, 1% NEAA, 5 mM HEPES, 50 µ M 2-Mercaptoetanolo | ||
| RPMI-1640 | Gibco | 11879-020 | |
| FBS (Siero fetale bovino) | Atlanta Biologicals | S11150 | Calore inattivato prima dell'uso |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| L-glutammina 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| NEAA (aminoacido non essenziale) 100x | Gibco | 11140-050 | |
| 1 M HEPES | BioWhittaker | 17-737E | |
| 2-Mercaptoetanolo (100x) | Millipore | ES-007-E | |
| Agitatore a piattaforma: La danzatrice del ventre | Stovall Life Sciences Inc. | modello: USBDbo |
Riferimenti
- Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus. Nature. 362, 70-73 (1993).
- Fan, Y., et al. Thymus-specific deletion of insuli....
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Ristampe e permessi
