Introduction
Il timo è l'organo linfoide primaria responsabile per la generazione di una popolazione eterogenea di cellule T auto-tolerant patogeno-reattivo che è essenziale per la funzione del sistema immunitario acquisito. Si tratta di un organo dinamico dove timociti di sviluppo, immigrarono dal midollo osseo come cellule linfociti progenitrici, migrano attraverso il tridimensionale (3-D) a matrice spugnosa dello stroma timico, sottoposti lineage-specifiche e differenziazione, e infine emigrare maturo T-cellule. Il successo di questo processo ben programmato dipende in gran parte sul cross-talk tra i timociti migrazione e le cellule epiteliali del timo residenziali (TEC), la popolazione predominante dello stroma timica che sono essenziali per stabilire e mantenere l'integrità del microambiente del timo.
Sulla base della loro posizione anatomica e funzione unica, TEC può essere suddiviso in due sottoinsiemi: TEC nella corteccia (CTEC) che sono responbile per la selezione di auto-MHC (complesso maggiore di istocompatibilità) limitato cellule T (selezione positiva), e le TEC nella midollare (mTECs) che sono essenziali per eliminare le cellule T autoreattive (selezione negativa) 1,2. Molti fattori (ad esempio, l'invecchiamento, infezioni, irradiazione, droga trattamenti) possono causare danni irreversibili per l'epitelio timico, con conseguente compromissione immunità adattativa. Nonostante i numerosi tentativi, ripristinando la funzione timica è stata difficile a causa della difficoltà di riprodurre il microambiente timico. In particolare, timica tridimensionale (3-D) configurazione è fondamentale per la sopravvivenza e la funzione del TEC, mentre TEC coltivate in un ambiente 2-D diminuire rapidamente l'espressione di geni critici per timopoiesi 3,4.
EAK16-II (AEAEKAKAEAEAKAK) e il suo C-terminale analogico histidinylated EAKIIH6 (AEAEKAKAEAEAKAKHHHHHH) sono a basso peso molecolare, oligopeptidi anfifilici che sono solubili in tardo deionizzatar, ma sottoposto gelificazione per formare beta fibrille quando esposto a forza ionica superiore a 20 mM NaCl (concentrazione salina normale in fluido corporeo umano è 154 mM). La struttura, situata reattivo ambientali li rende mattoni versatili per formare strutture in 3D. Il His-tag su EAKII-H6 fornisce un meccanismo di aggancio, con la quale gli anti-His IgG / Fc-legame proteina ricombinante A / G (αH6: pA / G) complessi possono servire come un adattatore per ancorare farmaci proteici e altre biomolecole ( ad esempio, anticorpi) sul idrogel composita 5-8.
Abbiamo precedentemente dimostrato che le molecole fluorescenti marcato IgG ancorate sul idrogel possono essere conservati al sito di iniezione per un massimo di 13 giorni 9. Inoltre, quando i αH6: adattatori pA / G ancorate con l'anti-CD4 IgG sono stati aggiunti al idrogel EAK16-II / EAKIIH6 (EAK), cellule T CD4 + sono stati specificamente catturati 10. Usando una tecnica simile, abbiamo recentemente dimostrato che il 3-D aggregazione di TEC could essere promosso in EAK idrogel con complessi di adattamento che trasportano gli anticorpi anti-EpCAM specifici-TEC (αH6: PA / G: αEpCAM). Quando trapiantato sotto le capsule reni di topi nudi, i grappoli TEC incorporato in EAK idrogel possono supportare efficacemente lo sviluppo di cellule T funzionali in vivo 11,12.
Qui illustriamo il nostro metodo di rapido ed efficace purificare TEC con l'ordinamento delle cellule di fluorescenza-attivato (FACS) e generare aggregati TEC 3-D con il sistema EAK idrogel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutti gli animali utilizzati negli esperimenti sono stati alloggiati nella struttura animali a Allegheny-Singer Research Institute nell'ambito del protocollo esaminato e approvato dal Comitato di Cura e uso istituzionale animali del / Allegheny Singer Research Institute Allegheny Health Network.
1. digerire il timo con collagenasi
- Harvest timo.
- Euthanize 3-5 settimane di età topi C57BL6 / J in anidride carbonica (CO 2) da camera per raccogliere timo. Nel dettaglio, mettere i topi nella camera sotto di CO 2 di induzione per 3-5 minuti e confermare la morte verificando arresto cardiaco o respiratorio.
- Posare la carcassa sul dorso e bagnare il corpo con il 70% di etanolo. Fai una piccola incisione orizzontale con un forte, forbici dissezione dritto sul suo addome attraverso la pelle. Tirare la pelle su entrambe le estremità (testa e gambe) in modo che venga rovesciato.
- Fare un taglio orizzontale con le forbici dissezione appena sottola costola più bassa e tagliare attraverso il diaframma lateralmente. Tenere il processo xifoideo con una pinza e tagliare la metà delle costole che procedono su entrambi i lati. Tirare il costole / sterno in modo che il timo è chiaramente visibile.
Nota: Thymus si trova direttamente sopra il cuore, costituito da 2 lobi ed è di colore bianco traslucido. - Utilizzando una pinza curva, paletta delicatamente e tirare i lobi del timo fuori del tessuto connettivo e il trasferimento in soluzione di lavaggio (vedi elenco dei materiali).
- Preparare la soluzione di digestione miscelando 9 ml RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute medio-1640), 0,025 mg / ml di collagenasi purificato, 10 mM HEPES [4- (2-idrossietil) -1-acido piperazineethanesulfonic], e 0,2 mg / ml DNase I in una provetta da centrifuga da 50 ml. Conservare la soluzione di digestione nel 37 ° C bagnomaria fino al momento dell'uso.
Nota: La quantità della soluzione di digestione preparata è sufficiente per un massimo di cinque adulti thymi mouse, che può essere incubato in un unico 5 ml polistirene round-tubo inferiore. - Trasferire il timo ad un piatto di coltura di tessuti 60 millimetri contenente 5-6 ml RPMI-1640.
- Sezionare il timo con 28 g di insulina siringa in piccoli pezzi (circa 1 mm 3 quadrato) per lasciare che i linfociti defluire.
- Sciacquare i pezzi del timo con RPMI-1640 che è nella capsula di Petri con vetro pipetta Pasteur. Inclinare il piatto e lasciare che i frammenti timici depositano sul fondo. Lentamente aspirare e scartare il surnatante RPMI-1640 con una pipetta di vetro. Ripetere questo passaggio risciacquo con 5-6 ml di RPMI-1640 per 4-5 volte con pipetta di vetro fino a quando la soluzione è meno opaco.
Nota: pipette di vetro sono raccomandati in questa fase, dal momento che i frammenti timici tendono ad attaccarsi alla plastica, con conseguente perdita eccessiva di tessuto del timo. Per il resto della procedura, utilizzare pipette di plastica. - Dopo il risciacquo finale, scartare il surnatante come descritto al punto 1.5. Aggiungere la soluzione di digestione 3 ml e trasferire i pezzi timo e la soluzione in un 5 ml a fondo rotondo ptubo olystyrene.
- Posizionare il tubo su un rotatore tubo e incubare a 37 ° C per 6 minuti ad una velocità di rotazione di 12 rpm.
- Dopo l'incubazione, lasciare che i frammenti timici depositano sul fondo della provetta per gravità. Raccogliere il surnatante con la pipetta Pasteur e trasferire in una provetta da centrifuga da 50 ml con 10 ml di soluzione di lavaggio. Centrifugare a 300 xg per 5 minuti, scartare il surnatante e risospendere le cellule in soluzione di lavaggio 10 ml. Tenere in ghiaccio.
- Ripetere i passaggi 1,6-1,8 per due volte sui frammenti timici in 5 ml di tubo in polistirene a fondo rotondo. In comune il surnatante nello stesso tubo da 50 ml.
Nota: centrifugazione non è necessario che il secondo e il terzo lavaggio. - Dopo la digestione finale, pipettare su e giù con una pipetta sierologica 2 ml di plastica per abbattere eventuali frammenti residui nel tubo e trasferimento in provetta da centrifuga da 50 ml.
- Centrifugare la provetta 50 ml a 300 xg per 5 min, aspirare il surnatante, risospendere in 10 ml di lavaggio buffeR e filtro attraverso 100 micron colino cella. Tenere in ghiaccio.
2. Arricchimento della TEC con discontinuo gradiente di densità
- Preparare 21% soluzione gradiente di densità miscelando 2,4 ml densità media pendenza (60% w / v di iodixanolo in acqua) e 9,6 ml di soluzione di lavaggio.
- Centrifugare le cellule del timo dissociate in tubo da 50 ml di raccolta dal punto 1.11 a 300 xg per 5 minuti e risospendere in tampone di 2,5 ml di lavaggio.
- Aggiungere mezzo 20 ml RPMI-1640 alla sospensione cellulare.
- Riempire 12 ml di soluzione di gradiente di densità del 21% in un 10 ml pipetta sierologica con una pipetta elettronica. Posizionare la punta della pipetta sierologica al fondo dei 50 ml cellule provetta da centrifuga contenenti, e lasciare che la soluzione gradiente di densità per drenare il fondo della provetta per gravità.
- espellere delicatamente la soluzione gradiente di densità della pipetta per terminare generare i due strati di diversa densità.
- Centrifugare a 600 xg for 20 min a temperatura ambiente in un rotore oscillante secchio. Impostare la velocità di decelerazione al livello più lento.
- Trasferire lo strato superiore e l'interfaccia per un nuovo tubo 50 ml.
Nota: La maggior parte dei TEC vengono mantenuti nell'interfaccia. Linfociti precipitano al fondo della provetta dopo centrifugazione. Se queste cellule devono essere utilizzati per altri scopi, lavare il pellet con 20 ml di soluzione di lavaggio per tre volte. Risospendere le cellule in 10 ml di tampone di lavaggio. - Aggiungere la soluzione di lavaggio fino a 40 ml al tubo nella fase 2.6 e centrifugare a 400 xg per 6 minuti a 4 ° C. Per rimuovere il surnatante, aspirare con una pipetta.
- Ripetere il lavaggio e l'aspirazione altre 2 volte come descritto al punto 2.7.
- Risospendere in 2 ml di soluzione di lavaggio e contare le cellule con un emocitometro.
3. TEC isolamento con FACS
- Regolare cellule dal punto 2.9 alla concentrazione di 1x10 6 cellule / 100 microlitri con soluzione di lavaggio e trasferimentole cellule in una provetta da 5 ml a fondo rotondo (polipropilene o polistirolo, come raccomandato dalle istruzioni del sorter flusso).
- Aggiungere 2 microlitri anti-recettore Fc IgG a 1x10 6 cellule e incubare a 4 ° C per 10 min.
- Aggiungere anti-CD45 (1: 150 diluizione, 10 microlitri per campione) e anti-EpCAM (diluizione 1: 100, 10 microlitri per campione) anticorpi e incubare a 4 ° C per più di 20 min.
- Lavare le cellule con soluzione di lavaggio 2 ml e centrifugare a 400 xg per 6 minuti a 4 ° C. Aspirare il surnatante con una pipetta.
- Risospendere le cellule in 1 ml 1x tampone fosfato salino (PBS).
- Filtrare 100 micron colino.
- Applicare le cellule allo strumento di smistamento. Selezionare il linfocita e la popolazione TEC escludendo le più piccole celle luce laterale-dispersa (SSC) / luce avanti dispersa (FSC) del pannello (cellule morte), poi cancello sulla popolazione selezionata per CD45- EpCAM + 13 per l'ordinamento.
4. Generation di TEC / EAK Aggregati
Nota: eseguire la preparazione e passaggi che coinvolgono cellule mescolare sotto il cofano laminare reagente.
- Preparare pA / G complessi adattatore mescolando 4 ml di anti-His-tag IgG, 8 ml di anti-IgG EpCAM e 2,6 ml di pA / G in una sterile 1,5 ml provetta, e incubare a temperatura ambiente per 5 min.
- Regolare le TEC ordinati dal punto 3.7 a 5x10 4 cellule / ml con soluzione di lavaggio, e pipetta 100 ml ad un pozzetto di una evaporazione basso, a 96 pozzetti a fondo tondo piastra di coltura tissutale. Aggiungere 14,6 microlitri complessi adattatore pA / G per le cellule. Porre la piastra su una piattaforma oscillante per 20 minuti a 4 ° C.
- Lavare una volta con 200 ml soluzione di lavaggio. Centrifugare la piastra a 400 g per 6 min. Eliminare il surnatante con una micropipetta.
- Risciacquare una volta con soluzione di saccarosio 200 microlitri 10%. Centrifugare a 400 g per 6 min. Eliminare il surnatante con una micropipetta.
- Risospendere le cellule in 30 ml 10% ssoluzione di saccarosio terile per pozzetto.
- Aggiungere 10 ml di EAKIIH6 (7,5 mg / ml) e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere 20 ml di EAK16-II (10 mg / ml) alla miscela TEC.
- Aggiungere 100 ml di terreno completo al sistema di avviare gelificazione. Posizionare la piastra su un agitatore piattaforma per 15-20 minuti a temperatura ambiente.
- Porre la piastra in incubatore a 37 ° C e 5% CO 2. Dopo 2-4 ore, aggiungere altri 100 ml di terreno completo.
- Cambiare medio a giorni alterni fino al momento dell'uso.
- Aspirare 100 microlitri del mezzo dalla superficie senza disturbare il gel utilizzando una micropipetta e aggiungere delicatamente 100 pl di mezzo pre-riscaldato posizionando la punta della pipetta alla parete del pozzo.
5. Caratterizzazione dei TEC / EAK Aggregati
- Per esaminare la funzione degli aggregati TEC / EAK in vivo, raccogliere la TEC / EAK idrogel dopo O / N e la cultura del trapianto sotto la capsula renale di un nudo atimicimouse, utilizzando in precedenza procedura descritta 11,14.
- Monitorare lo sviluppo delle cellule T nella periferia raccogliendo campioni di sangue 50-100 microlitri nel tubo di raccolta del sangue EDTA contenenti da topi nudi 4-6 settimane dopo il trapianto e macchia con un cocktail di anti-CD4, -CD8, -CD45 e -CD3 anticorpi 12.
- Analizzare le percentuali di linfociti T nei leucociti del sangue periferico con citometria di flusso (FCM), utilizzando un'unica cella software di analisi 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Per esaminare l'efficacia di utilizzare il protocollo di separazione gradiente di densità per arricchire le cellule stromali CD45-, cellule raccolte sia l'interfaccia e il pellet di linfociti precipitati sono state colorate con anti-CD45 e anti-EpCAM. Entrambi anti-Ulex Europaeus Agglutinin 1 (UEA1) e anticorpi anti-MHC di classe II sono stati inclusi anche nel cocktail colorazione per identificare ulteriormente i sottoinsiemi CTEC e MTEC. Come mostrato in Figura 1, siamo riusciti a realizzare routine vicino a 15-20 volte arricchimento del TEC.
Per esaminare l'aggregazione dei TEC in idrogel EAK, TEC sono stati isolati da 4 settimane i topi vecchi B6.ROSA mt / MG, che esprimono ubiquitariamente i di membrana, rosso molecole tdTomato fluorescenti. Aggregati TEC, preparato come sopra descritto, sono state coltivate per due giorni in vitro ed esaminate al microscopio confocale ( 
Figura 1. Flusso analisi di citometria di TEC arricchito con la soluzione di gradiente di densità. Le cellule sono state colorate con anti-CD45 e anti-EpCAM distinguere TEC popolazione (CD45- EpCAM +). pannelli a sinistra: le cellule del timo dopo la digestione enzimatica, prima della procedura di gradiente di densità. pannelli centrali: cellule dello strato superiore e l'interfaccia dopo la separazione con la soluzione gradiente di densità. Pannelli a destra:. Cellule pellet (linfociti pellet) dopo la separazione con la soluzione di gradiente di densità Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. 
Figura 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mentre TEC sono la popolazione predominante dello stroma del timo e svolgono ruoli essenziali per la struttura e la funzione del timo, essi rappresentano solo circa il 0,1-0,5% della cellularità timica totale. Sono anche cellule fragili come alte percentuali di morte cellulare sono occasionalmente osservati dopo digestione collagenasi, cioè, il trattamento dissociare TEC dalla matrice extracellulare (ECM). La loro rarità (~ 200.000 al timo del mouse) e la fragilità reso un compito impegnativo per isolare TEC. Il recente utilizzo di collagenasi altamente purificata in isolamento TEC hanno notevolmente aumentato il numero di cellule vive dopo la digestione enzimatica 15-19.
Tuttavia, il numero molto piccolo di TEC rimane una sfida importante per la loro analisi e l'isolamento, come sono necessarie grandi quantità di anticorpi per l'etichettatura superficie cellulare e un numero eccessivo di eventi devono essere raccolte da FACS. Mentre anticorpo-coniugatod tecnologia branello magnetico può essere utilizzato per esaurire CD45 + timociti, la grande quantità rende economicamente proibitiva nel lungo periodo. Siamo stati in grado di arricchire in modo efficace TEC 15-20 volte con un semplice, un passo densità centrifugazione in gradiente. La struttura iso-osmotica del mezzo iodixanolo gradiente di densità permette la separazione di cellule in base alle loro forme, dimensioni e densità 20-22. Va notato che la purezza e resa del TEC sono influenzati dalla percentuale del mezzo gradiente di densità utilizzato. Bassa percentuale del mezzo gradiente di densità (18-20% v / v) si tradurrà in maggiore purezza del TEC nell'interfaccia ma resa inferiore. Al contrario, quando la concentrazione iodixanolo superiore (22% v / v) viene utilizzato, maggiore quantità di cellule del timo può essere raccolto con bassa percentuale di TEC. La concentrazione di iodixanolo deve essere regolata in base allo scopo dell'esperimento. Mentre la purezza del TEC è ampiamente migliorata con l'utilità della soluzione gradiente di densità, Should sottolineare che le cellule raccolte dallo strato superiore e l'interfaccia contengono ancora relativamente elevata frazione di cellule CD45 + (Figura 1). Pertanto, quando soltanto la popolazione TEC è richiesto come in questo esperimento, separazione delle cellule sarà fondamentale, anche se questa procedura supplementare può causare una perdita di cellule e richiede più tempo.
Diversamente dalla maggior parte delle cellule epiteliali disposte in un unico o più strati che rivestono gli organi viscerali, TEC sono organizzati in configurazione 3-D nello stroma timo, che è essenziale per la loro sopravvivenza e la funzionalità. Il sistema EAK idrogel di auto-assemblaggio facilita la formazione di aggregati 3-D TEC che sono mediati dal αH6 tri-molecolare: PA / G: complessi adattatore αEpCAM. Di nota, affinando le concentrazioni e rapporti di EAK16-II / EAKIIH6 oligopeptidi, la porosità e la densità del idrogel può essere regolata per consentire il flusso di nutrienti e la migrazione dei timociti. Infatti, functionaL T-cellule sono stati generati in topi nudi atimici trapiantati con i compositi TEC / EAK.
Lo svantaggio di questo sistema idrogel EAK è che con questo protocollo attuale, la composizione cella specifica non può essere localizzato in una zona apposita. In un ambiente fisico un timo è costituito da due compartimenti distinti, in cui tipi specifici di TEC risiedono, CTEC nella corteccia e mTECs in midollare. Con il nostro sistema qui descritto, sia CTEC e mTECs sono etichettati con EpCAM, un marker epiteliale generale. Pertanto si è ipotizzato che gli aggregati in idrogel formato include sia sottotipi di TEC. Anche se CTEC e mTECs derivano dalla comune bipotente progenitori TEC, il loro ruolo nello sviluppo delle cellule T sono chiaramente distintivo. Cortex è la prima regione nel timo, dove le cellule progenitrici immature timiche entrano, e la selezione positiva avviene 23. Quindi le cellule selezionate spostano nella regione midollare e interagiscono con mTECs, attraverso which le cellule autoreattive sono eliminati dalla selezione negativa 24. Inoltre, è stato dimostrato che il 25% dei geni differenzialmente espressi tra CTEC e mTECs 25. Questi risultati sottolineano l'importanza di promuovere l'aggregazione di sottoinsiemi TEC per aumentare l'efficacia dello sviluppo delle cellule T. Un possibile approccio è quello di utilizzare diversi anticorpi mirati molecole di superficie specifici a uno o CTEC mTECs, come anti-citocheratina 8 per CTEC, e anti-citocheratina 5 per mTECs.
Dal punto di vista di una futura applicazione clinica, i grappoli TEC incorporati nel idrogel biodegradabili potrebbero funzionare come iniettabili "unità timo mini" di modulare il sistema immunitario adattativo che potrebbe essere importante per varie condizioni mediche, come ringiovanire il sistema immunitario adattativo in soggetti di età compresa tra , o indurre tolleranza specifica-donatori nel trapianto di organo solido.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato in parte dal National Institutes of Health concede R21 AI113000 (WSM) e R01 AI123392 (YF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TEC Isolation | |||
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2701(1 Gallon) | Ethanol 200 Proof, deionized water |
| Dissecting scissors, straight | Fine Science Tools, Inc. | 91460-11 | |
| Graefe forceps, straight | Fine Science Tools, Inc. | 11053-10 | |
| Graefe forceps, curved | Fine Science Tools, Inc. | 11052-10 | |
| Washing solution | 1x PBS, 0.1% BSA, 2 mM EDTA | ||
| 1x PBS (Phosphate buffered saline) | Gibco | 10010-023 | |
| BSA (Bovine serum albumin) | Sigma | A1470-100G | |
| EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | Invitrogen | 15575-038 | |
| Digestion solution | 9 ml RPMI-1640, 0.025 mg/ml Liberase TM Research grade, 10 mM HEPES, 0.2 mg/ml DNaseI | ||
| RPMI-1640 | Gibco | 11879-020 | |
| Liberase TM Research Grade | Roche | 05 401 127 001 | referred as "purified collagenase" |
| 1 M HEPES | Lonza | 17-737E | |
| Dnase I | Roche | 10 104 159 001 | |
| 50 ml Centrifuge tube | Corning | 430290 | |
| 60 mm tissue culture dish | Falcon | 353002 | |
| 1/2 cc U-100 Insulin syringe 28 1/2 G | Becton Dickinson | 329461 | |
| 5 ml Polystyrene round-bottom tube | Falcon | 352058 | |
| 5 ml glass pipet | Fisher Healthcare | 13-678-27E | Use for rinsing the thymic fragments. Thymic fragments tend to stick to the wall with plastic pipets. |
| MACSmix tube rotator | Miltenyi | 130-090-753 | |
| 100 µm Cell strainer | Falcon | 352360 | |
| Density gradient medium: OptiPrep | Axis-Shield | ||
| Cell Sorting | |||
| 5 ml Polypropylene round-bottom tube | Falcon | 352063 | |
| Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | Use as undiluted, 2 µl per sample |
| Anti-mouse CD45-PercpCy5.5 | eBioscience | 45-0451-80 | Use at 1:150, 10 µl per sample |
| Anti-mouse CD326 (EpCAM)-PE | eBioscience | 12-5791-82 | Use at 1:100, 10 µl per sample |
| BD Influx | BD Biosciences | ||
| Single cell analysis software | FlowJo | ||
| EAK Gel Assembly | |||
| Anti-His-Tag | AnaSpec | 29673 | "anti-His-Tag IgG" |
| Purified anti-mouse CD326 (EpCAM) | BioLegend | 118202 | "anti-EpCAM IgG" |
| Recombinant protein A/G | Pierce Biotechnology | ||
| 1.5 ml Safe-Lock Tubes, Biopur, Sterile | Fisher Healthcare | 05-402-24B | referred as "1.5 ml microcentrifuge tube" |
| 96-well, Tissue culture plate, Round-bottom with low evaporation lid | BD Falcon | 353917 | |
| Rocking platform: Nutator Mixer no.1105 | BD Clay Adams | ||
| 10% sucrose | Sigma | S0389 | Prepare with sterile distilled water |
| EAK16-II (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAK-CONH2) | American Peptide Company | custom synthesized, 10 mg/ml | |
| EAKIIH6 (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAKHHHHHH-CONH2) | American Peptide Company | custom synthesized, 7.5 mg/ml | |
| Complete medium | RPMI-1640, 10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% L-glutamine, 1% NEAA, 5 mM HEPES, 50 µM 2-Mercaptoethanol | ||
| RPMI-1640 | Gibco | 11879-020 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Atlanta Biologicals | S11150 | Heat inactivated before use |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| NEAA (non-essential amino acid) 100x | Gibco | 11140-050 | |
| 1 M HEPES | BioWhittaker | 17-737E | |
| 2-Mercaptoethanol (100x) | Millipore | ES-007-E | |
| Platform shaker: The Belly Dancer | Stovall Life Sciences Inc. | model: USBDbo |
References
- Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus. Nature. 362, 70-73 (1993).
- Fan, Y., et al. Thymus-specific deletion of insulin induces autoimmune diabetes. The EMBO J. 28, 2812-2824 (2009).
- Mohtashami, M., Zuniga-Pflucker, J. C. Three-dimensional architecture of the thymus is required to maintain delta-like expression necessary for inducing T cell development. J Immunol. 176, 730-734 (2006).
- Pinto, S., et al. An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression. J Immunol. 190, 1085-1093 (2013).
- Fung, S. Y., Yang, H., Chen, P. Formation of colloidal suspension of hydrophobic compounds with an amphiphilic self-assembling peptide. Colloids Surf B Biointerfaces. 55, 200-211 (2007).
- Jun, S., et al. Self-assembly of the ionic peptide EAK16: the effect of charge distributions on self-assembly. Biophys J. 87, 1249-1259 (2004).
- Saunders, M. J., et al. Engineering fluorogen activating proteins into self-assembling materials. Bioconjug Chem. 24, 803-810 (2013).
- Zhang, S., Holmes, T., Lockshin, C., Rich, A. Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane. Proc of the Natl Acad Sci U S A. 90, 3334-3338 (1993).
- Wen, Y., et al. Coassembly of amphiphilic peptide EAK16-II with histidinylated analogues and implications for functionalization of beta-sheet fibrils in vivo. Biomaterials. 35, 5196-5205 (2014).
- Zheng, Y., et al. A peptide-based material platform for displaying antibodies to engage T cells. Biomaterials. 32, 249-257 (2011).
- Tajima, A., et al. Bioengineering mini functional thymic units with EAK16-II/EAKIIH6 self-assembling hydrogel. Clin Immunol. 160, 82-89 (2015).
- Fan, Y., et al. Bioengineering Thymus Organoids to Restore Thymic Function and Induce Donor-Specific Immune Tolerance to Allografts. Mol Ther. 23, 1262-1277 (2015).
- Fan, Y., et al. Thymus-specific deletion of insulin induces autoimmune diabetes. The EMBO J. 28, 2812-2824 (2009).
- Fan, Y., et al. Compromised central tolerance of ICA69 induces multiple organ autoimmunity. J Autoimmun. 53, 10-25 (2014).
- Palumbo, M. O., Levi, D., Chentoufi, A. A., Polychronakos, C. Isolation and characterization of proinsulin-producing medullary thymic epithelial cell clones. Diabetes. 55, 2595-2601 (2006).
- Williams, K. M., et al. Single cell analysis of complex thymus stromal cell populations: rapid thymic epithelia preparation characterizes radiation injury. Clin Transl Sci. 2, 279-285 (2009).
- McLelland, B. T., Gravano, D., Castillo, J., Montoy, S., Manilay, J. O. Enhanced isolation of adult thymic epithelial cell subsets for multiparameter flow cytometry and gene expression analysis. J Immunol Methods. 367, 85-94 (2011).
- Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. J Immunol methods. 385, 23-34 (2012).
- Xing, Y., Hogquist, K. A. Isolation, identification, and purification of murine thymic epithelial cells. J Vis Exp. , e51780 (2014).
- Graham, J. M. Separation of monocytes from whole human blood. ScientificWorldJournal. 2, 1540-1543 (2002).
- Li, X., Donowitz, M. Fractionation of subcellular membrane vesicles of epithelial and nonepithelial cells by OptiPrep density gradient ultracentrifugation. Methods Mol Biol. 440, 97-110 (2008).
- Mita, A., et al. Purification method using iodixanol (OptiPrep)-based density gradient significantly reduces cytokine chemokine production from human islet preparations, leading to prolonged beta-cell survival during pretransplantation culture. Transplant Proc. 41, 314-315 (2009).
- Anderson, G., Takahama, Y. Thymic epithelial cells: working class heroes for T cell development and repertoire selection. Trends Immunol. 33, 256-263 (2012).
- Kyewski, B., Klein, L. A central role for central tolerance. Annu Rev Immunol. 24, 571-606 (2006).
- St-Pierre, C., et al. Transcriptome sequencing of neonatal thymic epithelial cells. Sci Rep. 3, 1860 (2013).
