Introduction
흉선이 획득 면역계의 기능에 필수적인 병원체 반응성 자기 저항성 T 세포의 다양한 집단의 생성을 담당 차 림프 기관이다. 그것은 흉선 기질의 스폰지 상 3 차원 (3-D) 매트릭스를 통해 이주 현상 흉선 세포는 림프구 전구 세포와 골수 이민 동적 인 기관이다 계통 명세서 및 분화를 거쳐, 최종적으로 이주 성숙한 T 세포. 이 아니라 프로그래밍 프로세스의 성공은 주로 이주 흉선 및 신청 흉선 상피 세포 (TEC는) 설정 및 흉선 미세 환경의 무결성을 유지하기위한 필수적인 가슴샘 기질의 주된 집단 간의 크로스 토크에 따라 다르다.
그 해부학 적 위치 및 고유 함수에 기초하여, TEC는 두 개의 서브 세트들로 분할 될 수있다 : 피질의 열팽창 계수의 차이이다 respon (cTECs)자기 MHC (주요 조직 적합성 복합체)을 선택하기위한 sible은 T 세포 (긍정적 인 선택) 및 자기 반응성 T 세포 (음 선택) 1, 2를 제거하기위한 필수적인 수질의 열팽창 계수의 차이 (mTECs)을 제한. 많은 요인 (예를 들어, 노화, 감염, 방사선 조사, 약물 치료) 손상된 적응 면역의 결과로, 흉선 상피 세포에 돌이킬 수없는 손상을 일으킬 수 있습니다. 수많은 시도에도 불구하고, 흉선 기능을 복원하기 때문에 흉선 미세 환경을 재현하는 어려움에 도전하고있다. 2 차원 환경에서 배양 TEC는 빠르게 thymopoiesis 3,4에 중요한 유전자의 발현이 감소하는 반면 특히 흉선 3 차원 (3-D)의 구성은, 열팽창 계수의 차이의 생존과 기능에 중요하다.
EAK16-II (AEAEKAKAEAEAKAK)과 C 말단 histidinylated 아날로그 EAKIIH6 (AEAEKAKAEAEAKAKHHHHHH)은 저 분자량, 탈 물 공급에 가용성 인 양친 매성 올리고 펩타이드이다20 mM의 염화나트륨 (인간 체액 정상 염 농도 154 mM)을보다 높은 이온 강도에 노출되었을 때 R, β-브릴을 형성 겔화하지만 겪는다. 이 환경에 응답 특성은 3 차원 구조를 형성하기 위해 그들에게 다목적 빌딩 블록을 만든다. 단지 단백질 약물과 다른 생체 분자를 고정 할 수있는 어댑터 역할을 할 수 있습니다 (: EAKII-H6에 그의 태그는 도킹 메커니즘을하는 항 그의 IgG를 / 된 Fc 결합 재조합 단백질 A / G (PA / G는 αH6) 제공 예를 들어 하이드로 겔 합성 5-8 항체).
우리는 이전에 하이드로 겔에 고정 형광 표지의 IgG 분자 최대 십삼일 9 주사 부위에 유지 될 수 있음을 증명하고있다. αH6 때 또한 : 안티 - CD4 IgG를 함께 고정 PA / G 어댑터가 EAK16-II / EAKIIH6 (EAK) 하이드로 겔에 첨가하고, CD4 + T 세포는 특별히 (10)를 체포했다. 유사한 기술을 사용하여, 최근 입증하는 TEC는 (C)의 3-D 통합(: PA / G : αEpCAM αH6) TEC-특정 안티는 EpCAM 항체를 운반하는 어댑터 단지와 EAK 하이드로 겔에 승진 울드. 누드 마우스의 신장 캡슐 밑에 이식하면 EAK 히드로 겔에 포함 된 TEC 클러스터 효과적으로 생체 내에서 기능적 11,12 T 세포의 발달을 지원할 수있다.
여기서 우리는 신속하고 효과적으로 형광 - 활성화 된 세포 (FACS)를 정렬과 열팽창 계수의 차이를 정화하고 EAK 하이드로 젤 시스템과 3 차원 TEC 응집체를 생성하기 위해 방법을 도시한다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
실험에 사용 된 모든 동물은 앨 건강 네트워크 / 앨 가수 연구소의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 검토 및 승인 프로토콜에서 앨-가수 연구소에서 동물 시설에 수용되었다.
1. 콜라게나로 흉선 소화
- 수확 흉선 분비.
- 흉선을 수확 3-5 주령 C57BL6 / J의 이산화탄소에 마우스 (CO 2) 챔버를 안락사. 구체적으로, 3 ~ 5 분 동안 CO 2 유도에서 챔버에 마우스를 배치하고 심장 또는 호흡 정지를 확인하여 죽음을 확인합니다.
- 그 뒷면에있는 시체를 놓고 70 % 에탄올로 몸을 젖은. 피부를 통해 자사의 복부에 날카로운 직선 해부 가위로 작은 수평 절개를합니다. 이 밖에 내부에 켜져 있도록 양쪽 끝 (머리와 다리)에 피부를 당겨.
- 해부 가위 바로 아래에 수평 절단합니다가장 낮은 리브와 옆으로 다이어프램을 잘라. 겸자와 칼 모양의 과정을 잡고 양쪽에 최대 진행 리브의 중간을 잘라. 흉선은 명확하게 볼 수 있도록 갈비 / 흉골을 당깁니다.
참고 : 흉선은 직접 심장의 상단에 놓여 두 엽으로 구성되어 있으며 흰색 반투명 색이다. - 부드럽게 특종 및 결합 조직 및 세척 용액에 전송 오프 흉선 로브를 당겨, 곡선 집게를 사용하여 (물질의 목록 참조).
- 9 ml로 RPMI-1640 (로스웰 파크 메모리얼 연구소 매체-1640) 0.025 ㎎ / ㎖ 정제 된 콜라겐, 10 mM의 HEPES [4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산, 0.2 ㎎ / ㎖을 혼합하여 소화 용액을 준비 50 ㎖의 원심 분리기 튜브의 DNase I. 사용할 때까지 37 ° C의 물을 욕조에서 소화 용액을 유지합니다.
참고 제조 소화 용액의 양이 하나 5 ㎖ 폴리스틸렌 원형 - 함께 배양 할 수 최대 5 성인 마우스 thymi, 충분바닥 튜브. - 5-6 ml의 RPMI-1640을 함유 한 60mm의 조직 배양 접시에 흉선 전송.
- 림프구가 유출 할 수있는 작은 조각으로 28 G 인슐린 주사기 바늘 (약 1mm 3 사각형)과 흉선을 해부하다.
- 유리 파스퇴르 피펫으로 배양 접시에 RPMI-1640과 흉선 조각을 씻어. 접시를 기울여과 흉선 조각이 바닥에 정착 할 수 있습니다. 천천히 대기음과 유리 피펫을 사용하여 RPMI-1640 상층 액을 버린다. 이 솔루션은 덜 불투명 때까지 유리 피펫으로 4-5 회 5-6 ml의 RPMI-1640이 세척 단계를 반복합니다.
참고 : 유리 피펫은이 단계에서 권장, 흉선 조각이 흉선 조직의 과도한 손실이 발생, 플라스틱에 집착하는 경향이 있기 때문이다. 절차의 나머지, 플라스틱 피펫을 사용합니다. - 단계 1.5에 기재된 바와 같이 최종 헹굼 후, 상층 액을 제거한다. 3 ㎖ 소화 솔루션을 추가하고 5 ㎖의 둥근 바닥 페이지로 흉선 조각과 솔루션을 전송olystyrene 튜브.
- 튜브의 회전에 튜브를 넣고 12 rpm의 회전 속도로 6 분 동안 37 ℃에서 배양한다.
- 배양 후, 흉선 단편은 중력에 의해 상기 튜브의 하단에 정착하자. 파스퇴르 피펫으로 상층 액을 수집하고 세척 용액 10 ㎖로 50 ml의 원심 분리기 튜브로 전송할 수 있습니다. 5 분 동안 300 XG에서 원심 분리하고, 상청액을 버리고, 10 mL의 세척 용액으로 세포를 재현 탁. 얼음에 보관하십시오.
- 반복 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브 5 ml의에서 흉선 조각에 두 번 1.6-1.8 단계를 반복합니다. 같은 50 ML 튜브에 뜨는 수영장.
주 : 원심 번째 및 세 번째 세척 필요는 없다. - 50 ㎖의 원심 분리기 튜브에 튜브 및 전송에 남아있는 조각을 무너 뜨리는 최종 소화 한 후, 최대 피펫 2 ml의 플라스틱 혈청 학적 피펫 아래.
- 원심 분리기에서 5 분 동안 300 XG에서 50 ㎖ 튜브 세척 buffe 10ml에 뜨는, 재현 탁 대기음100 μm의 셀 스트레이너를 통해 연구 및 필터. 얼음에 보관하십시오.
불연속 밀도 기울기와 TEC는 2. 심화
- 2.4 mL의 밀도 구배 배지 (물 iodixanol의 V / w 60 %) 및 9.6 mL의 세척 용액을 혼합하여 21 % 밀도 구배 용액을 제조 하였다.
- 2.5 ml의 세척 버퍼에 5 분,에 resuspend 300 XG에 단계 1.11에서 50 ㎖ 수집 관에서 해리 흉선 세포를 원심 분리기.
- 세포 현탁액에 20 ml의 RPMI-1640 배지를 추가합니다.
- 전자 피펫으로 10 ㎖의 혈청 학적 피펫에서 21 % 밀도 구배 용액 12 ml를 채 웁니다. 50 mL의 원심 분리 튜브 함유 세포 하단의 혈청 피펫의 선단을 배치하고, 밀도 구배 용액이 중력을 통해 상기 튜브의 하단에 배수 할 수있다.
- 부드럽게 밀도가 다른 두 층을 생성 완료 피펫에서 밀도 구배 용액을 배출.
- 600 XG FO에서 원심 분리기R 스윙 버킷 로터에서 실온에서 20 분. 가장 느린 수준에서 감속 속도를 설정합니다.
- 새로운 50 ㎖ 튜브에 상단 층과의 계면을 전송.
참고 : 열팽창 계수의 차이의 대부분은 인터페이스에 유지됩니다. 림프구는 원심 분리 후 튜브의 바닥에 침전됩니다. 이들 세포는 다른 용도로 사용되는 경우, 3 회 20 ㎖ 세척 용액 펠렛을 헹군다. 세척 완충액 10ml에 세포를 재현 탁. - 4 ° C에서 6 분 동안 400 XG에 단계 2.6 및 원심 분리기 튜브에 40 ml의 세척 솔루션을 추가 할 수 있습니다. 피펫으로 상층 액, 흡인를 제거합니다.
- 단계 2.7에 기재된 바와 같이 세척하고, 흡인 2 회 더 반복한다.
- 세척 용액 2 ㎖에 재현 탁하고는 혈구 세포 계산.
FACS 3. 분리의 열팽창 계수의 차이
- 세정액 및 전송로 1 × 106 세포 / 100 ㎕의 농도로 290 단계에서 세포를 조절(유동 분류기의 지침에서 권장하는 폴리 프로필렌 또는 폴리스티렌) 5 ㎖의 둥근 바닥 튜브에 세포.
- 1 × 6 셀 당 2 μL 방지 Fc 수용체 IgG를 추가하고 10 분 동안 4 ° C에서 품어.
- (150 희석, 샘플 당 10 μl의 1) 및 안티는 EpCAM 항 CD45 추가 (1 : 100 희석, 샘플 당 10 μL) 항체 이상 20 분 동안 4 ° C에서 품어.
- 4 ° C에서 6 분 동안 400 XG에 2 ml의 세척 용액을 원심 분리로 세포를 씻으십시오. 피펫으로 뜨는을 대기음.
- 1 ㎖의 1X 인산 완충 생리 식염수 (PBS)으로 세포를 재현 탁.
- 100 μm의 스트레이너를 통해 필터링합니다.
- 정렬 악기의 셀을 적용합니다. 사이드 산란광 (SSC) / 전방 산란 광 (FSC) 패널 (죽은 세포), (13)을 정렬 CD45-는 EpCAM +의 선택 인구에 다음 게이트에서 가장 작은 세포를 제외한 림프구와 TEC 인구를 선택합니다.
4. GTEC / EAK 집계의 eneration
참고 : 시약 준비 및 층류 후드 혼합 셀을 포함하는 단계를 수행합니다.
- 멸균 된 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 안티 그의 태그 IgG를 4 μL, 안티는 EpCAM IgG의 8 μL 및 PA / G 2.6 μL를 혼합하여 PA / G 어댑터 착물을 준비하고, 5 분 동안 RT에서 배양한다.
- 세척 용액 및 피펫 낮은 증발, 96 웰 둥근 바닥 조직 배양 플레이트 잘 하나에 100 μL와 5 × 4 세포 / ml로 단계 3.7에서 분류 열팽창 계수의 차이를 조정합니다. 세포에 14.6 μl의 PA / G 어댑터 단지를 추가합니다. 4 ℃에서 20 분 동안 흔들 플랫폼에서 접시를 놓습니다.
- 200 ㎕를 세척 용액으로 한 번 씻으십시오. 6 분 동안 400 XG에 접시를 원심 분리기. 마이크로 피펫으로 상층 액을 버린다.
- 200 ㎕의 10 % 자당 용액으로 한 번 씻으십시오. 6 분 동안 400 XG에 원심 분리기. 마이크로 피펫으로 상층 액을 버린다.
- 30 μl의 10 %의에서 재현 탁 세포물론 당 terile 자당 솔루션입니다.
- EAKIIH6 10 μL (7.5 ㎎ / ㎖)를 첨가하고, 실온에서 5 분 동안 품어.
- 가 TEC 혼합물에 EAK16-II의 20 μL (10 ㎎ / ㎖)를 추가합니다.
- 겔화을 시작하는 시스템에 완전 배지 100 μl를 추가합니다. 실온에서 15 ~ 20 분 동안 플랫폼 통에 접시를 놓습니다.
- 37 ° C에서 인큐베이터에있는 접시를 놓고 5 % CO 2. 2-4 시간 후, 전체 매체의 다른 100 μl를 추가합니다.
- 사용할 때까지 매일 매체를 변경합니다.
- 대기음 마이크로 피펫을 사용하여 조심스럽게 웰의 벽에 피펫 팁을 배치하여 예열 배지 100 ㎕를 추가 겔을주지 않고 표면으로부터 배지 100 ㎕.
가 TEC / EAK 집계 5. 특성
- 생체 내에서 TEC / EAK 집계의 기능을 조사하기 위해, 무 흉선 누드의 신장 캡슐에서 O / N 문화와 이식 후 TEC / EAK 하이드로 겔을 수집마우스, 이전 절차 11,14 설명 사용.
- 4~6주 안티 CD4의 칵테일 이식 얼룩을 게시 누드 마우스 -CD8, -CD45에서 EDTA를 함유 혈관으로 50 ~ 100 ㎕의 혈액 샘플을 채취하여 주변의 T 세포의 발달을 모니터링 및 -CD3 (12)는 항체.
- 단일 세포 분석 소프트웨어 (12)를 사용하여 유동 세포 계측법으로 말초 혈액 백혈구 (FCM)에 T 림프구의 백분율을 분석한다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CD45- 간질 세포를 풍부하게하는 밀도 구배 분리 프로토콜을 사용의 효과를 조사하기 위해, 인터페이스 석출 림프구 펠렛 모두에서 수확 한 세포를 항 CD45, 항는 EpCAM 항체로 염색 하였다. 두 방지 Ulex Europaeus 응집소 1 (UEA1) 및 안티 MHC 클래스 II 항체는 더 CTEC 및 mTEC 하위 집합을 식별하기 위해 염색 칵테일에 포함되었다. 도 1에 도시 된 바와 같이, 우리는 일상적 TEC는 15-20 배 농축 가까이 달성 할 수 있었다.
EAK 하이드로 겔의 열팽창 계수의 차이의 집계를 검사하려면, 열팽창 계수의 차이는 보편적으로 막 바인딩, 적색 형광 tdTomato 분자를 표현하는 4 주 이전 B6.ROSA 만 T / MG 마우스에서 분리 하였다. 전술 한 바와 같이 제조 TEC 집합체, (시험 관내에서 이틀 동안 배양하고, 공 초점 현미경 검사 
TEC는도 1의 유세포 분석은 밀도 구배 용액 풍부. 세포 TEC 인구 (CD45-는 EpCAM +)를 구별하는 항 CD45, 항는 EpCAM 항체로 염색 하였다. 왼쪽 패널 : 효소 분해 후 흉선 세포 밀도 구배 절차 전에. 중간 패널 : 상부층 세포와 밀도 구배 용액을 분리 한 후 인터페이스. 오른쪽 패널 :. 밀도 구배 용액을 분리 한 후 펠렛 세포 (림프구 펠렛) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 
그림 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
열팽창 계수의 차이가 흉선 기질의 주된 인구이며 흉선 샘의 구조와 기능에 필수적인 역할을하지만, 이들은 총 흉선 세포 수의 약 0.1 ~ 0.5 %를 차지한다. 그들은 또한 세포 사멸의 높은 비율이 때때로 즉, 치료는 세포 외 기질 (ECM)의 열팽창 계수의 차이를 해리, 콜라게나 제 소화 다음 관찰 깨지기 세포이다. 그들의 희귀 (~ 20 만 마우스의 흉선 당)과 취약성은 그것을 열팽창 계수의 차이를 분리하는 어려운 작업을했다. TEC 분리 고도로 정제 된 콜라겐 최근의 활용은 크게 효소 소화 15-19 다음 생균의 수를 증가하고있다.
항체 다량 세포 표면 라벨링 및 이벤트에 필요한 과도 번호 FACS에 의해 수집 될 필요가있다 그러나 열팽창 계수의 차이를 매우 작은 숫자들이 분석 및 분리를위한 중요한 과제로 남아. 항체 복합체 동안D 자기 비드 기술은 CD45 + 흉선 세포를 고갈하는 데 사용할 수 있습니다, 그들의 큰 수량이 장기적으로는 경제적으로 금지 렌더링합니다. 우리는 효과적으로 간단한 한 단계 밀도 기울기 원심 분리와 열팽창 계수의 차이를 15 ~ 20 시간을 풍요롭게 할 수 있었다. iodixanol 밀도 구배 매질의 삼투압 속성들은 모양, 크기 및 밀도를 20 ~ 22에 기초하여 세포의 분리를 허용한다. 열팽창 계수의 차이의 순도 및 수율은 사용되는 밀도 구배 배지의 비율에 의해 영향을받는 것을 주목해야한다. 밀도 구배 매질의 낮은 비율 (18~20% V를 / V) 인터페이스에서의 TEC는 고순도이지만 낮은 수율을 초래한다. 반대로, 높은 경우 iodixanol 농도 (22 % V / V)를 사용하고, 흉선 세포의 큰 열팽창 계수의 차이가 양의 낮은 비율로 회수 할 수있다. iodixanol의 농도는 실험의 목적에 기초하여 조정되어야한다. TEC는 순도가 크게 밀도 구배 용액의 유용성이 개선되고 있지만, 그것은 shoul상부 층과의 계면에서 수집 한 세포 정지 (도 1) CD45 + 세포의 비교적 높은 비율을 포함하는 것이 강조 될 거라고. 이러한 추가 과정은 세포의 일부가 손실 될 더 많은 시간을 필요로 수 있지만, 이에 만 TEC 인구가이 실험에서와 같이 요구되는 경우, 셀 정렬은 중요 할 것이다.
본능적 장기 안감 단일 또는 다중 층으로 배열 된 상피 세포의 대부분과는 달리, TEC는 그들의 생존 및 기능에 필수적인 흉선 간질, 3-D 구성에서 구성되어있다. PA / G : αEpCAM 어댑터 착체 자기 조립 EAK 하이드로 젤 시스템 트라이 αH6 분자에 의해 매개되는 3 차원 TEC 응집체의 형성을 용이하게한다. 참고로하여 농도와 EAK16-II / EAKIIH6 올리고, 기공률 및 하이드로 겔의 농도의 비를 미세 조정하는 영양소의 유동 및 흉선 세포의 이동을 허용하도록 조정될 수있다. 사실, functiona리터의 T 세포는 TEC / EAK 복합 이식 무 흉선 누드 마우스에서 발생했다.
이 EAK 하이드로 젤 시스템에서의 단점은 이러한 현재의 프로토콜과 함께, 특정 셀 조성물가 지정된 영역에 국부적 수 없다는 것이다. 물리적 환경에서 흉선은 TEC는 특정 유형의가 상주하는 두 가지 구획, 수질의 피질에서 cTECs 및 mTECs로 구성되어 있습니다. 우리의 시스템은 여기에 설명과 함께, cTECs 및 mTECs 모두는 EpCAM, 일반 상피 마커로 표시되어 있습니다. 그러므로, 형성된 겔의 응집체 TEC는 두 아형을 포함하는 것으로 추측된다. cTECs 및 mTECs 일반적인 bipotent의 TEC 전구 세포에서 유래하지만, T 세포의 개발에 자신의 역할을 명확하게 특징이다. 외피는 흉선 미성숙 전구 세포 입력 흉선에서 상기 제 1 영역이고, 양의 선택은 장소 (23) 걸린다. 그런 다음 선택한 셀은 w를 통해 수질 영역으로 이동하고 mTECs와 상호 작용HICH 자기 반응성 세포는 음의 선택 (24)에 의해 제거된다. 또한, 유전자의 25 % 차등 cTECs mTECs과 25 사이에 표현되어 설명되었다. 이러한 연구 결과는 T 세포의 발전 효율을 높이기 위해 TEC 서브셋의 응집을 촉진의 중요성을 강조한다. 한 가지 가능한 방법은 cTECs 안티 사이토 케라틴 8 및 mTECs 안티 사이토 케라틴 5로 cTECs 또는 mTECs 중 특정 표면 분자를 대상으로 서로 다른 항체를 사용하는 것입니다.
미래의 임상 적용의 관점에서, 생분해 성 하이드로 겔에 내장 된 TEC 클러스터는 세 개인의 적응 면역계 젊어 같은 다양한 질환에 대해 중요 할 수있는 적응 면역 시스템을 조절하기 위해 주사 "미니 흉선 단위"기능 수도 또는 고형 기관 이식 공여자의 특정 내성을 유도.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
이 작품은 R21 AI113000 (WSM)와 R01 AI123392 (YF)는 국립 보건원 (National Institutes of Health)에 의해 부분적으로 부여 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TEC Isolation | |||
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2701(1 Gallon) | Ethanol 200 Proof, deionized water |
| Dissecting scissors, straight | Fine Science Tools, Inc. | 91460-11 | |
| Graefe forceps, straight | Fine Science Tools, Inc. | 11053-10 | |
| Graefe forceps, curved | Fine Science Tools, Inc. | 11052-10 | |
| Washing solution | 1x PBS, 0.1% BSA, 2 mM EDTA | ||
| 1x PBS (Phosphate buffered saline) | Gibco | 10010-023 | |
| BSA (Bovine serum albumin) | Sigma | A1470-100G | |
| EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | Invitrogen | 15575-038 | |
| Digestion solution | 9 ml RPMI-1640, 0.025 mg/ml Liberase TM Research grade, 10 mM HEPES, 0.2 mg/ml DNaseI | ||
| RPMI-1640 | Gibco | 11879-020 | |
| Liberase TM Research Grade | Roche | 05 401 127 001 | referred as "purified collagenase" |
| 1 M HEPES | Lonza | 17-737E | |
| Dnase I | Roche | 10 104 159 001 | |
| 50 ml Centrifuge tube | Corning | 430290 | |
| 60 mm tissue culture dish | Falcon | 353002 | |
| 1/2 cc U-100 Insulin syringe 28 1/2 G | Becton Dickinson | 329461 | |
| 5 ml Polystyrene round-bottom tube | Falcon | 352058 | |
| 5 ml glass pipet | Fisher Healthcare | 13-678-27E | Use for rinsing the thymic fragments. Thymic fragments tend to stick to the wall with plastic pipets. |
| MACSmix tube rotator | Miltenyi | 130-090-753 | |
| 100 µm Cell strainer | Falcon | 352360 | |
| Density gradient medium: OptiPrep | Axis-Shield | ||
| Cell Sorting | |||
| 5 ml Polypropylene round-bottom tube | Falcon | 352063 | |
| Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | Use as undiluted, 2 µl per sample |
| Anti-mouse CD45-PercpCy5.5 | eBioscience | 45-0451-80 | Use at 1:150, 10 µl per sample |
| Anti-mouse CD326 (EpCAM)-PE | eBioscience | 12-5791-82 | Use at 1:100, 10 µl per sample |
| BD Influx | BD Biosciences | ||
| Single cell analysis software | FlowJo | ||
| EAK Gel Assembly | |||
| Anti-His-Tag | AnaSpec | 29673 | "anti-His-Tag IgG" |
| Purified anti-mouse CD326 (EpCAM) | BioLegend | 118202 | "anti-EpCAM IgG" |
| Recombinant protein A/G | Pierce Biotechnology | ||
| 1.5 ml Safe-Lock Tubes, Biopur, Sterile | Fisher Healthcare | 05-402-24B | referred as "1.5 ml microcentrifuge tube" |
| 96-well, Tissue culture plate, Round-bottom with low evaporation lid | BD Falcon | 353917 | |
| Rocking platform: Nutator Mixer no.1105 | BD Clay Adams | ||
| 10% sucrose | Sigma | S0389 | Prepare with sterile distilled water |
| EAK16-II (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAK-CONH2) | American Peptide Company | custom synthesized, 10 mg/ml | |
| EAKIIH6 (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAKHHHHHH-CONH2) | American Peptide Company | custom synthesized, 7.5 mg/ml | |
| Complete medium | RPMI-1640, 10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% L-glutamine, 1% NEAA, 5 mM HEPES, 50 µM 2-Mercaptoethanol | ||
| RPMI-1640 | Gibco | 11879-020 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Atlanta Biologicals | S11150 | Heat inactivated before use |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| NEAA (non-essential amino acid) 100x | Gibco | 11140-050 | |
| 1 M HEPES | BioWhittaker | 17-737E | |
| 2-Mercaptoethanol (100x) | Millipore | ES-007-E | |
| Platform shaker: The Belly Dancer | Stovall Life Sciences Inc. | model: USBDbo |
References
- Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus. Nature. 362, 70-73 (1993).
- Fan, Y., et al. Thymus-specific deletion of insulin induces autoimmune diabetes. The EMBO J. 28, 2812-2824 (2009).
- Mohtashami, M., Zuniga-Pflucker, J. C. Three-dimensional architecture of the thymus is required to maintain delta-like expression necessary for inducing T cell development. J Immunol. 176, 730-734 (2006).
- Pinto, S., et al. An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression. J Immunol. 190, 1085-1093 (2013).
- Fung, S. Y., Yang, H., Chen, P. Formation of colloidal suspension of hydrophobic compounds with an amphiphilic self-assembling peptide. Colloids Surf B Biointerfaces. 55, 200-211 (2007).
- Jun, S., et al. Self-assembly of the ionic peptide EAK16: the effect of charge distributions on self-assembly. Biophys J. 87, 1249-1259 (2004).
- Saunders, M. J., et al. Engineering fluorogen activating proteins into self-assembling materials. Bioconjug Chem. 24, 803-810 (2013).
- Zhang, S., Holmes, T., Lockshin, C., Rich, A. Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane. Proc of the Natl Acad Sci U S A. 90, 3334-3338 (1993).
- Wen, Y., et al. Coassembly of amphiphilic peptide EAK16-II with histidinylated analogues and implications for functionalization of beta-sheet fibrils in vivo. Biomaterials. 35, 5196-5205 (2014).
- Zheng, Y., et al. A peptide-based material platform for displaying antibodies to engage T cells. Biomaterials. 32, 249-257 (2011).
- Tajima, A., et al. Bioengineering mini functional thymic units with EAK16-II/EAKIIH6 self-assembling hydrogel. Clin Immunol. 160, 82-89 (2015).
- Fan, Y., et al. Bioengineering Thymus Organoids to Restore Thymic Function and Induce Donor-Specific Immune Tolerance to Allografts. Mol Ther. 23, 1262-1277 (2015).
- Fan, Y., et al. Thymus-specific deletion of insulin induces autoimmune diabetes. The EMBO J. 28, 2812-2824 (2009).
- Fan, Y., et al. Compromised central tolerance of ICA69 induces multiple organ autoimmunity. J Autoimmun. 53, 10-25 (2014).
- Palumbo, M. O., Levi, D., Chentoufi, A. A., Polychronakos, C. Isolation and characterization of proinsulin-producing medullary thymic epithelial cell clones. Diabetes. 55, 2595-2601 (2006).
- Williams, K. M., et al. Single cell analysis of complex thymus stromal cell populations: rapid thymic epithelia preparation characterizes radiation injury. Clin Transl Sci. 2, 279-285 (2009).
- McLelland, B. T., Gravano, D., Castillo, J., Montoy, S., Manilay, J. O. Enhanced isolation of adult thymic epithelial cell subsets for multiparameter flow cytometry and gene expression analysis. J Immunol Methods. 367, 85-94 (2011).
- Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. J Immunol methods. 385, 23-34 (2012).
- Xing, Y., Hogquist, K. A. Isolation, identification, and purification of murine thymic epithelial cells. J Vis Exp. , e51780 (2014).
- Graham, J. M. Separation of monocytes from whole human blood. ScientificWorldJournal. 2, 1540-1543 (2002).
- Li, X., Donowitz, M. Fractionation of subcellular membrane vesicles of epithelial and nonepithelial cells by OptiPrep density gradient ultracentrifugation. Methods Mol Biol. 440, 97-110 (2008).
- Mita, A., et al. Purification method using iodixanol (OptiPrep)-based density gradient significantly reduces cytokine chemokine production from human islet preparations, leading to prolonged beta-cell survival during pretransplantation culture. Transplant Proc. 41, 314-315 (2009).
- Anderson, G., Takahama, Y. Thymic epithelial cells: working class heroes for T cell development and repertoire selection. Trends Immunol. 33, 256-263 (2012).
- Kyewski, B., Klein, L. A central role for central tolerance. Annu Rev Immunol. 24, 571-606 (2006).
- St-Pierre, C., et al. Transcriptome sequencing of neonatal thymic epithelial cells. Sci Rep. 3, 1860 (2013).
