Introduction
胸腺は、獲得免疫系の機能に必須である病原体反応、自己寛容T細胞の多様な集団の生成を担う主要なリンパ器官です。それは、胸腺細胞の開発、リンパ球前駆細胞として骨髄から移住動的な器官である、胸腺間質のスポンジ状の三次元（3-D）マトリックスを通って移動し、系統仕様と分化を起こし、最終的にのように移住します成熟T細胞。このよくプログラムされたプロセスの成功は、移行胸腺細胞や住宅胸腺上皮細胞（TECを）、胸腺微小環境の整合性を確立し、維持するために必須である胸腺間質の優勢な集団間のクロストークに大きく依存します。
その解剖学的位置とユニークな機能に基づいて、TECのは、2つのサブセットに分けることができます。皮質でのTEC responある（cTECs）1,2- T細胞（正の選択）を制限し、自己MHC（主要組織適合遺伝子複合体）を選択するためのsible、および自己反応性T細胞を除去するために不可欠である髄質（mTECs）中のTEC（負の選択）。多くの要因（ 例えば 、老化、感染症、放射線照射、薬物治療）は妥協適応免疫が得られ、胸腺上皮に不可逆的な損傷を引き起こす可能性があります。多くの試みにもかかわらず、胸腺機能を回復することは、胸腺微小環境を再現する難しさに挑戦してきました。 2次元環境で培養のTECが急激胸腺形成3,4のための重要な遺伝子の発現を減少させる一方、特に、胸腺三次元（3-D）の構成は、のTECの生存および機能に重要です。
EAK16-II（AEAEKAKAEAEAKAK）およびそのC末端histidinylatedアナログEAKIIH6（AEAEKAKAEAEAKAKHHHHHH）は低分子量であり、脱イオンWATEに可溶性である両親媒性オリゴペプチドRが、20mMのNaClを（ヒト体液中の正常な塩濃度は、154 mMで）より高いイオン強度に曝されたとき、β原線維を形成するためにゲル化を受けます。この環境応答性は、3D構造を形成するように多目的なビルディングブロックを作ります。複合タンパク質薬物および他の生体分子を固定するためのアダプタとして機能することができる（：EAKII-H6上のHisタグは、ドッキング機構を、これにより抗HisのIgG / Fc結合組換えタンパク質A / G（PA / GはαH6）提供します例えばヒドロゲル複合5-8に、抗体）。
我々は以前に、ヒドロゲルに固定蛍光標識されたIgG分子は、最大13日間9のための注入部位に保持することができることを実証しました。 αH6時更に、抗CD4 IgGを用いて固定PA / GアダプタがEAK16-II / EAKIIH6（EAK）ヒドロゲルに添加し、CD4 + T細胞を特異的に10を捕捉しました。同様の技術を使用して、我々は最近のTEC Cの3-Dの凝集を実証しています（：PA / G：αEpCAMαH6）TEC-特定の抗EpCAM抗体を運ぶアダプター複合体とEAKハイドロゲルに昇格するウルド。ヌードマウスの腎臓カプセル下に移植した場合、EAKハイドロゲルに埋め込 まれたTECクラスタが効果的に生体内11,12に機能的なT細胞の開発を支援することができます。
ここでは、迅速かつ効果的に蛍光活性化細胞選別（FACS）でのTECを浄化し、EAKハイドロゲルシステムと3次元TEC凝集体を生成するために、我々の方法を示します。
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Protocol
実験で使用した全ての動物は、アレゲニー健康ネットワーク/アレゲニーシンガー研究所の施設内動物管理使用委員会によって審査および承認されたプロトコルの下でアレゲニー・シンガー研究所の動物施設に収容しました。
1.コラゲナーゼで胸腺を消化
- 収穫胸腺。
- 胸腺を収穫するために、二酸化炭素（CO 2）チャンバー内で3-5週齢のC57BL6 / Jマウスを安楽死させます。具体的には、3〜5分間、CO 2の誘導の下でチャンバー内にマウスを置き、心臓や呼吸停止を検証することによって、死亡を確認。
- その裏に死体を置き、70％エタノールで体を濡らします。皮膚を通してその腹部に鋭い、ストレート解剖ハサミで小さな水平切開を行います。それは裏返しされるように両端（頭部と脚）の皮膚を引きます。
- すぐ下に解剖ハサミで水平カットを作ります最低リブとは、横振動板をカット。ピンセットで剣状突起を持ち、両側にまで進んリブの真ん中を切りました。胸腺がはっきり見えるように肋骨/胸骨を引き上げます。
注：胸腺、心臓の上に直接位置する2葉からなり、白色半透明色のものです。 - 湾曲した鉗子を使用して、静かに（材料のリストを参照してください）洗浄液中の結合組織および転送のオフ胸腺ローブをスクープし、引き出します。
- 9mLのRPMI-1640（ロズウェルパーク記念研究所培地-1640）、0.025 mg / mlで精製されたコラゲナーゼ、10mMのHEPES [4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸]、および0.2 mg / mlで混合することにより、消化液を調製50ml遠心管中のDNase I。使用するまで37℃の水浴中で消化溶液を保管してください。
注：準備消化溶液の量は、1 5ミリリットルポリスチレン丸で一緒にインキュベートすることができる最大5つの成体マウスの胸腺、のために十分です下部チューブ。 - 5〜6ミリリットルRPMI-1640を含む60ミリメートルの組織培養皿に胸腺を転送します。
- リンパ球が流出できるように小片（約1mm 3の正方形）に28 Gインスリン注射針で胸腺を解剖。
- ガラスパスツールピペットでペトリ皿であるRPMI-1640と胸腺の作品をすすぎます。皿を傾け、胸腺断片が底に沈殿してみましょう。ゆっくり吸引し、ガラスピペットを用いて、RPMI-1640上清を捨てます。解決策はあまり不透明になるまで、ガラスピペットを用いて4-5回5〜6ミリリットルRPMI-1640でこのすすぎ工程を繰り返します。
注：胸腺断片は、胸腺組織の過剰な損失をもたらす、プラスチックに固執する傾向があるので、ガラスピペットは、この段階で推奨されています。残りの手順については、プラスチック製のピペットを使用しています。 - ステップ1.5で説明したように最後のすすぎの後、上清を捨てます。 3ミリリットルの消化溶液を追加し、5ミリリットル丸底Pに胸腺片とソリューションを転送olystyreneチューブ。
- チューブ回転にチューブを置き、12回転の回転速度で6分間37℃でインキュベートします。
- インキュベーション後、胸腺断片は、重力によって、チューブの底に沈殿してみましょう。パスツールピペットを用いて上清を回収し、洗浄溶液10mlと50mlの遠心管に移します。 5分間、300×gで遠心分離し、上清を捨て、10mlの洗浄溶液で細胞を懸濁します。氷の上に保管してください。
- 繰り返しは、5ミリリットル丸底ポリスチレンチューブに胸腺断片に二回1.6から1.8を繰り返します。同じ50ミリリットルチューブに上清をプール。
注：遠心分離は、第2および第3の洗浄のための必要はありません。 - 50mlの遠心管にチューブ、転送中の任意の残りのフラグメントを打破するために、最終的な消化の後、アップピペットと2ミリリットルのプラスチック血清学的ピペットを用いてダウン。
- 5分間、300×gで遠心分離50ミリリットルチューブ、上清を吸引、洗浄ブフェの10ミリリットルで再懸濁100μmのセルストレーナーを通してrおよびフィルタ。氷の上に保管してください。
不連続密度勾配でのTECの2濃縮
- 2.4ミリリットルの密度勾配培地（水中のイオジキサノールのw / vの60％）と9.6ミリリットル洗浄溶液を混合することにより、21％密度勾配溶液を調製します。
- 2.5ミリリットル洗浄緩衝液中で5分間再懸濁し、300×gでステップ1.11から50ミリリットルコレクションチューブに解離した胸腺細胞を遠心します。
- 細胞懸濁液に20ミリリットルRPMI-1640培地を追加します。
- 電子ピペッターで10ミリリットル血清学的ピペットで21％密度勾配液の12ミリリットルを記入してください。細胞を含有する50mLの遠心チューブの底に血清学的ピペットの先端を配置し、重力を介してチューブの底に排出するための密度勾配溶液を可能にします。
- 穏やかに異なる密度の二層を生成終了するピペットからの密度勾配溶液を排出。
- 600×gでFOで遠心分離スイングバケットローター中で、室温で20分rは。最も遅いレベルでの減速度を設定します。
- 新しい50ミリリットルチューブにトップ層との界面を転送します。
注：のTECのほとんどは界面に保持されます。リンパ球は、遠心分離後、チューブの底に沈殿します。これらの細胞は、他の目的に使用する場合、3回20mLの洗浄溶液でペレットを洗浄。洗浄緩衝液10ml中に細胞を再懸濁。 - 4℃で6分間、400×gでステップ2.6および遠心機でチューブに40ミリリットルに洗浄液を追加します。ピペットで上清を、吸引を削除します。
- ステップ2.7で説明したように洗浄し、吸引2回繰り返します。
- 洗浄液の2ミリリットル中に再懸濁し、血球計数器で細胞をカウント。
FACS 3.分離のTEC
- 洗浄液や転送に1×10 6細胞/ 100μlの濃度でステップ2.9から細胞を調整します（フローソーターの指示により推奨されるように、ポリプロピレン、ポリスチレン、）5ミリリットル丸底チューブに細胞。
- 1×10 6個の細胞当たり2μlの抗Fc受容体のIgGを添加し、4℃で10分間インキュベートします。
- （：150希釈、サンプルあたり10μlの1）および抗EpCAM（1：100希釈、サンプルあたり10μl）を抗体および以上4℃で20分間インキュベート抗CD45を追加します。
- 4℃で6分間、400×gで2ミリリットルの洗浄液と遠心で細胞を洗浄します。ピペットで上清を吸引除去します。
- 1ml中の細胞1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）に再懸濁します。
- 100μmのストレーナーを通して濾過。
- 仕分け機器に細胞を適用します。その後、側方散乱光（SSC）/前方散乱光（FSC）パネル（死細胞）、13をソートするためCD45-のEpCAM +のために選択された集団にゲート上の最小のセルを除くリンパ球とTEC人口を選択します。
4. GTEC / EAK骨材のeneration
注：試薬調製と層状フードの下で混合セルを伴う手順を実行します。
- 滅菌1.5ミリリットルマイクロチューブ中の抗HisタグIgGの4μlの、抗EpCAM IgGの8μlのとPA / Gの2.6μLを混合することにより、PA / Gアダプター複合体を準備し、そして室温で5分間インキュベートします。
- 洗浄溶液、およびピペット低蒸発、96ウェル丸底組織培養プレートの1ウェルに100μlの5×10 4細胞/ mlにステップ3.7からソートのTECを調整します。細胞に14.6μlのPA / Gアダプター複合体を追加します。 4℃で20分間ロッキングプラットフォーム上でプレートを置きます。
- 200μlの洗浄液で1回洗浄。 6分間400×gでプレートを遠心。マイクロピペットで上清を捨てます。
- 200μlの10％スクロース溶液で1回洗浄します。 6分間400×gで遠心分離します。マイクロピペットで上清を捨てます。
- 30μlの10％s内の細胞を再懸濁しウェルあたりショ糖ソリューションterile。
- EAKIIH610μlの（7.5ミリグラム/ ml）を加え、室温で5分間インキュベートします。
- TEC混合物にEAK16-II（10mg / ml）の20μlのを追加します。
- ゲル化を開始するために、システムへの完全培地100μlを加えます。室温で15〜20分間プラットフォームシェーカー上でプレートを置きます。
- 37℃のインキュベーターでプレートを置き、5％CO 2。 2-4時間後、完全培地の別の100μlのを追加します。
- 使用時まで一日おきに培地交換。
- 吸引除去し、表面からの培地100μlのマイクロピペットを用いてゲルを乱すことなく、ゆっくりとでは、ウェルの壁にピペットチップを配置することによって、予め温めた培地100μlを追加します。
TEC / EAK骨材の5キャラクタリゼーション
- in vivoでの TEC / EAK凝集体の機能を調べるために、無胸腺ヌードの腎臓被膜下O / N培養と移植後のTEC / EAKヒドロゲルを収集以前に記載された手順11,14を用いて、マウス、。
- 4-6週間は、抗CD4、-CD8のカクテルで-CD45を移植し、汚れを投稿ヌードマウスからEDTA含有採血管に50〜100μlの血液サンプルを採取することにより末梢におけるT細胞の発生を監視します、および-CD3 12は抗体。
- 単一細胞解析ソフトウェア12を使用して、フローサイトメトリー（FCM）で末梢血白血球におけるTリンパ球の割合を分析します。
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Representative Results
CD45-間質細胞を濃縮するために密度勾配分離プロトコルを使用しての有効性を調べるために、インタフェースと沈殿リンパ球ペレットの両方から採取した細胞を、抗CD45及び抗EpCAM抗体で染色しました。抗ULEX Europaeusアグルチニン1（UEA1）および抗MHCクラスII抗体の両方がさらにCTECとMTECサブセットを識別するために、染色カクテルに含まれていました。 図1に示すように 、我々が日常のTECの15〜20倍濃縮の近くに達成することができました。
EAKヒドロゲル中のTECの凝集を調べるために、のTECは遍在膜結合、赤色蛍光tdTomato分子を発現する、4週齢B6.ROSA MT /ミリグラムマウスから単離しました。上記のように調製TEC凝集体は、（ インビトロで 2日間培養し、共焦点顕微鏡下で検査しました
密度勾配溶液で富化のTECの 図1 のフローサイトメトリー分析細胞を、TEC母集団（CD45-のEpCAM +）を区別するために、抗CD45及び抗EpCAM抗体で染色しました。左パネル：酵素消化後の胸腺細胞を、密度勾配手順の前に。中央のパネル：トップ層中の細胞および密度勾配溶液を用いて分離した後のインタフェース。右のパネル：密度勾配溶液を用いて分離した後ペレット化した細胞（リンパ球ペレット） この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 
図2。
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Discussion
TECは、胸腺間質の優勢な集団であると胸腺の構造と機能のために重要な役割を果たしているが、それらは、総胸腺細胞充実の約0.1から0.5パーセントを表します。彼らはまた、細胞死の高いパーセンテージは時折すなわち 、治療は、細胞外マトリックス（ECM）からのTECを解離するために、コラゲナーゼ消化後に観察されている脆弱な細胞です。その希少性（マウス胸腺あたり200,000）および脆弱性は、それのTECを分離するためにやりがいのある仕事ました。 TECの分離における高度に精製されたコラゲナーゼの最近の使用率が大幅に酵素消化15-19以下の生きた細胞の数を増加しています。
抗体を大量に細胞表面標識およびFACSによって収集される必要があるイベントの過剰な数のために必要とされるが、TECの非常に小さな数は、それらの分析および分離のための主要な課題です。抗体コンジュゲートしながらD磁気ビーズ技術は、CD45 +胸腺細胞を枯渇させるために使用することができ、それらの大量長期的には、それが経済的に法外なレンダリングします。我々は効果的に単純な、1ステップ密度勾配遠心分離でのTECを15-20回を豊かにすることができました。イオジキサノール密度勾配媒体の等浸透施設には、それらの形状、サイズと密度20-22に基づいて細胞を分離することができます。のTECの純度および収率を用いる密度勾配媒体の割合によって影響を受けることに留意すべきです。密度勾配媒体の低い割合は、（18-20％のv / v）の界面でのTECの高い純度が、より低い収率をもたらします。より高いイオジキサノール濃度（22％のv / v）を用いた場合は対照的に、胸腺細胞のより大きな量のTECのより低い割合で回収することができます。イオジキサノール濃度は、実験の目的に基づいて調整されるべきです。 TECの純度が大きく密度勾配溶液の有用性と改善されるが、それはshoulトップ層との界面から採取した細胞はまだCD45 +細胞（ 図1）の比較的高い割合を含んでいることを強調してdが。この余分な手順は、細胞のいくつかの損失を引き起こし、より多くの時間を必要とするかもしれないので、唯一のTECの集団は、この実験のように必要とされる場合、細胞選別は、極めて重要です。
内臓を裏打ちする単一または複数の層に配置された上皮細胞のほとんどとは違って、TECのは、彼らの生存および機能のために必須である胸腺間質、3-Dの設定で構成されています。 PA / G：αEpCAMアダプター複合体の自己集合EAKヒドロゲル系は、三分子αH6によって媒介される3次元TEC凝集体の形成を促進します。注目すべきは、EAK16-II / EAKIIH6オリゴペプチドの微調整の濃度及び比率により、ヒドロゲルの多孔率および密度は、栄養分の流れおよび胸腺細胞の移行を可能にするように調整することができます。確かに、関数AL個のT細胞を、TEC / EAK複合材料を移植無胸腺ヌードマウスに作成しました。
このEAKヒドロゲルシステムにおける欠点は、この現在のプロトコルを用いて、特定の細胞組成物は、指定された領域に局在化することができないことです。物理的な環境では胸腺は、TECの特定のタイプが存在する二つの異なる区画、髄質における皮質でcTECsとmTECsから構成されています。私たちのシステムは、ここで説明すると、cTECsとmTECs両方がEpCAMを、一般的な上皮マーカーで標識されています。したがって、形成されたヒドロゲル中の凝集体のTECの両方のサブタイプを含むと推測されます。 cTECsとmTECsが共通の両能性のTEC前駆細胞から派生しているが、T細胞の発達における役割は明らかに独特です。皮質は、未成熟胸腺前駆細胞が入る胸腺内の最初の領域であり、正の選択は、場所23を取ります。その後、選択したセルはワットを通じて、延髄領域に移動し、mTECsとの対話しますHICH自己反応性細胞は、ネガティブ選択24によって除去されます。また、遺伝子の25％が示差cTECsとmTECs 25の間に発現されることが実証されています。これらの知見は、T細胞の発達の効果を高めるためにTECサブセットの凝集を促進することの重要性を強調する。 1つの可能なアプローチは、このようなcTECsのための抗サイトケラチン8、およびmTECsための抗サイトケラチン5などcTECsまたはmTECsのいずれかに特異的な表面分子を、標的とする異なる抗体を使用することです。
将来の臨床応用の観点から、生分解性ヒドロゲル中に埋め込まれたTECクラスターは、このような高齢者に適応免疫系を若返らせるなど、様々な医学的状態、のために重要であり得る適応免疫系を調節するなどの注射可能な「ミニ胸腺単位を「機能可能性があります、または固形臓器移植におけるドナー特異的寛容を誘導します。
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Acknowledgments
この作品は、国立衛生研究所によって部分的にサポートされていたR21 AI113000（WSM）とR01 AI123392（YF）を付与します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TEC Isolation | |||
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2701(1 Gallon) | Ethanol 200 Proof, deionized water |
| Dissecting scissors, straight | Fine Science Tools, Inc. | 91460-11 | |
| Graefe forceps, straight | Fine Science Tools, Inc. | 11053-10 | |
| Graefe forceps, curved | Fine Science Tools, Inc. | 11052-10 | |
| Washing solution | 1x PBS, 0.1% BSA, 2 mM EDTA | ||
| 1x PBS (Phosphate buffered saline) | Gibco | 10010-023 | |
| BSA (Bovine serum albumin) | Sigma | A1470-100G | |
| EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | Invitrogen | 15575-038 | |
| Digestion solution | 9 ml RPMI-1640, 0.025 mg/ml Liberase TM Research grade, 10 mM HEPES, 0.2 mg/ml DNaseI | ||
| RPMI-1640 | Gibco | 11879-020 | |
| Liberase TM Research Grade | Roche | 05 401 127 001 | referred as "purified collagenase" |
| 1 M HEPES | Lonza | 17-737E | |
| Dnase I | Roche | 10 104 159 001 | |
| 50 ml Centrifuge tube | Corning | 430290 | |
| 60 mm tissue culture dish | Falcon | 353002 | |
| 1/2 cc U-100 Insulin syringe 28 1/2 G | Becton Dickinson | 329461 | |
| 5 ml Polystyrene round-bottom tube | Falcon | 352058 | |
| 5 ml glass pipet | Fisher Healthcare | 13-678-27E | Use for rinsing the thymic fragments. Thymic fragments tend to stick to the wall with plastic pipets. |
| MACSmix tube rotator | Miltenyi | 130-090-753 | |
| 100 µm Cell strainer | Falcon | 352360 | |
| Density gradient medium: OptiPrep | Axis-Shield | ||
| Cell Sorting | |||
| 5 ml Polypropylene round-bottom tube | Falcon | 352063 | |
| Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | Use as undiluted, 2 µl per sample |
| Anti-mouse CD45-PercpCy5.5 | eBioscience | 45-0451-80 | Use at 1:150, 10 µl per sample |
| Anti-mouse CD326 (EpCAM)-PE | eBioscience | 12-5791-82 | Use at 1:100, 10 µl per sample |
| BD Influx | BD Biosciences | ||
| Single cell analysis software | FlowJo | ||
| EAK Gel Assembly | |||
| Anti-His-Tag | AnaSpec | 29673 | "anti-His-Tag IgG" |
| Purified anti-mouse CD326 (EpCAM) | BioLegend | 118202 | "anti-EpCAM IgG" |
| Recombinant protein A/G | Pierce Biotechnology | ||
| 1.5 ml Safe-Lock Tubes, Biopur, Sterile | Fisher Healthcare | 05-402-24B | referred as "1.5 ml microcentrifuge tube" |
| 96-well, Tissue culture plate, Round-bottom with low evaporation lid | BD Falcon | 353917 | |
| Rocking platform: Nutator Mixer no.1105 | BD Clay Adams | ||
| 10% sucrose | Sigma | S0389 | Prepare with sterile distilled water |
| EAK16-II (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAK-CONH2) | American Peptide Company | custom synthesized, 10 mg/ml | |
| EAKIIH6 (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAKHHHHHH-CONH2) | American Peptide Company | custom synthesized, 7.5 mg/ml | |
| Complete medium | RPMI-1640, 10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% L-glutamine, 1% NEAA, 5 mM HEPES, 50 µM 2-Mercaptoethanol | ||
| RPMI-1640 | Gibco | 11879-020 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Atlanta Biologicals | S11150 | Heat inactivated before use |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| NEAA (non-essential amino acid) 100x | Gibco | 11140-050 | |
| 1 M HEPES | BioWhittaker | 17-737E | |
| 2-Mercaptoethanol (100x) | Millipore | ES-007-E | |
| Platform shaker: The Belly Dancer | Stovall Life Sciences Inc. | model: USBDbo |
References
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