Introduction
De thymus is de belangrijkste lymfoïde orgaan verantwoordelijk voor het genereren van een gediversificeerde populatie van pathogeen-reactieve, zelfverdraagzaam T-cellen die essentieel is voor de functie van het verworven immuunsysteem. Het is een dynamisch orgaan waarin ontwikkelingslanden thymocyten immigreerden uit het beenmerg als lymfocyten progenitorcellen, migreren door het sponsachtig driedimensionale (3-D) matrix van de thymus stroma ondergaan lijn-specificatie en differentiatie, en uiteindelijk emigratie als rijpe T-cellen. Het succes van deze goed geprogrammeerde proces hangt grotendeels af van de overspraak tussen de migrerende thymocyten en de residentiële thymus epitheelcellen (TEC), de overheersende bevolking van de thymus stroma die essentieel zijn voor het opzetten en onderhouden van de integriteit van de thymus micromilieu zijn.
Op basis van hun anatomische locatie en unieke functie, kan TEC worden verdeeld in twee subgroepen: de TEC in de cortex (cTECs) die verantwoorde-woordelijk voor het selecteren eigen MHC (major histocompatibility complex) beperkte T-cellen (positieve selectie), en de TEC in de medulla (mTECs) die essentieel zijn voor het elimineren van autoreactieve T-cellen (negatieve selectie) 1,2 zijn. Vele factoren (bijvoorbeeld, veroudering, infectie, bestraling, behandeling met geneesmiddelen) kan onomkeerbare schade veroorzaken aan de thymus epitheel, wat resulteert in een verminderde adaptieve immuniteit. Ondanks talrijke pogingen, herstel van de thymus functie uitdagend omdat het moeilijk om de thymus micro reproduceren. Met name thymus driedimensionale (3-D) configuratie is kritisch voor de overleving en functie van TEC, terwijl TEC gekweekt in een 2-D omgeving snel de expressie van genen essentieel voor thymopoiesis 3,4 te verlagen.
EAK16-II (AEAEKAKAEAEAKAK) en de C-terminale histidinylated analoge EAKIIH6 (AEAEKAKAEAEAKAKHHHHHH) zijn laagmoleculaire amfifiele oligopeptiden die oplosbaar zijn in gedeïoniseerd water, maar ondergaan gelering β-fibrillen bij blootstelling aan ionsterkte lager dan 20 mM NaCl (normale zoutconcentratie in menselijk lichaamsvloeistof 154 mM). Deze reagerende eigenschap milieu maakt ze veelzijdig bouwstenen om 3D-structuren te vormen. Het His-tag on EAKII-H6 heeft een docking mechanisme, waarbij de anti-His IgG / Fc-bindend recombinant eiwit A / G (αH6: pA / G) complexen kunnen als een adapter om eiwit drugs en andere biomoleculen te verankeren te dienen ( bijvoorbeeld antilichamen) aan de hydrogel composiet 5-8.
We hebben eerder aangetoond dat fluorescent-gelabelde IgG-moleculen verankerd op de hydrogel op de injectieplaats gedurende maximaal 13 dagen 9 kan worden gehandhaafd. Wanneer verder de αH6: pA / G adapters verankerd met anti-CD4 IgG's werden toegevoegd aan de EAK16-II / EAKIIH6 (EAK) hydrogel, CD4 + T-cellen werden specifiek vastgelegd 10. Met vergelijkbare techniek, hebben we onlangs aangetoond dat 3-D aggregatie van TEC could worden bevorderd EAK hydrogel met adapter complexen dragen TEC-specifieke anti-EpCAM antilichamen (αH6: pA / G: αEpCAM). Wanneer getransplanteerde nier onder de capsules van naakt muizen, kan de TEC clusters ingebed in EAK hydrogel effectief te ondersteunen de ontwikkeling van functionele T-cellen in vivo 11,12.
Hier illustreren we onze methode om snel en effectief te zuiveren TEC's met fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) en het genereren van 3-D-TEC aggregaten met het EAK hydrogel systeem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle gebruikt in de experimenten dieren werden ondergebracht in het dier faciliteit in Allegheny-Singer Research Institute in het kader van het protocol beoordeeld en goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Allegheny Health Network / Allegheny Singer Research Institute.
1. verteren de Thymus met collagenase
- Harvest thymus klieren.
- Euthanize 3-5 weken oude C57BL6 / J-muizen in een koolstofdioxide (CO2) kamer naar thymusklier oogsten. In detail, plaatst de muizen in de kamer onder CO 2 inductie voor de 3-5 minuten en bevestig de dood door te controleren of hart- of ademstilstand.
- Lag het karkas op zijn rug en bevochtig het lichaam met 70% ethanol. Maak een kleine horizontale incisie met een scherpe, rechte ontleden schaar op haar buik door de huid. Trek de huid aan beide uiteinden (hoofd en benen) zodat het binnenstebuiten gekeerd.
- Maak een horizontale snede met het ontleden van een schaar net onderde laagste rib en dwars door het middenrif zijwaarts. Houd de processus xiphoideus met een pincet en snijd het midden van de ribben verloopt aan beide zijden. Trek de ribben / borstbeen zodat de thymus duidelijk zichtbaar.
Opmerking: Thymus ligt direct op het hart bestaat uit 2 lobben en is een witte doorschijnende kleur. - Met behulp van een gebogen pincet voorzichtig schep en trek de thymus lobben off van het bindweefsel en de overdracht in wasoplossing (zie lijst van materialen).
- Bereid ontsluitingsoplossing door mengen 9 ml RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute medium-1640), 0,025 mg / ml gezuiverd collagenase, 10 mM HEPES [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur] en 0,2 mg / ml DNase I in een 50 ml centrifugebuis. Houd de vertering oplossing 37 ° C waterbad tot gebruik.
Opmerking: De hoeveelheid ontsluitingsoplossing bereid is voldoende voor vijf volwassen muis thymi, die samen in een 5 ml polystyreen rond- kunnen worden geïncubeerdbottom buis. - Breng de thymus een 60 mm weefselkweekplaat met 5-6 ml RPMI-1640.
- Ontleden de thymus met 28 G insulinespuit naald in kleine stukjes (ongeveer 1 mm 3 vierkant) te laten de lymfocyten stromen.
- Spoel de thymus stukken met RPMI-1640 dat in de petrischaal met glazen Pasteur pipet. Kantel het gerecht en laat de thymus fragmenten naar de bodem. Langzaam zuigen en gooi de RPMI-1640 supernatant met behulp van een glazen pipet. Herhaal deze spoelstap met 5-6 ml RPMI-1640 voor 4-5 keer met glazen pipet totdat de oplossing minder opaak.
Opmerking: Glas pipetten aanbevolen bij deze stap, aangezien thymus fragmenten meestal bij kunststof, waardoor overmatig verlies van thymus weefsel. Voor de rest van de procedure, gebruik maken van plastic pipetten. - Na de laatste spoeling, gooi het supernatant zoals beschreven in stap 1.5. Voeg 3 ml verteringsoplossing en breng de thymus stukken en de oplossing in een 5 ml rondbodem polystyrene buis.
- De buis wordt op een buis rotator en incubeer bij 37 ° C gedurende 6 minuten bij een rotatiesnelheid van 12 rpm.
- Na incubatie liet de thymus fragmenten naar de bodem van de buis door de zwaartekracht. Verzamel de bovenstaande vloeistof met Pasteur pipet overgebracht in een 50 ml centrifugebuis met 10 ml wasoplossing. Centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten, verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 10 ml wasoplossing. Houd op het ijs.
- Herhaal stappen 1.6-1.8 tweemaal op de thymus fragmenten in 5 ml ronde bodem polystyreen buis. Verzamel de supernatant op dezelfde 50 ml buis.
Opmerking: Centrifugeren is niet noodzakelijk voor de tweede en derde maal. - Na de laatste digestie pipet op en neer met 2 ml plastic serologische pipet resterende fragmenten in de buis en overdracht af te breken tot de 50 ml centrifugebuis.
- Centrifugeer de 50 ml buis bij 300 g gedurende 5 minuten, zuig de supernatant, resuspendeer in 10 ml wassen Buffer en filter door middel van 100 micrometer cel zeef. Houd op het ijs.
2. Verrijking van TEC's met discontinue dichtheidsgradiënt
- Bereid 21% dichtheidsgradiënt oplossing door het mengen van 2,4 ml dichtheidsgradiënt medium (60% w / v iodixanol in water) en 9,6 ml wasoplossing.
- Centrifugeer de gedissocieerde cellen in de thymus verzameling 50 ml buis uit stap 1,11 bij 300 xg gedurende 5 minuten en resuspendeer in 2,5 ml wasbuffer.
- Voeg 20 ml RPMI-1640 medium aan de celsuspensie.
- Vul 12 ml 21% dichtheidsgradiënt oplossing in een 10 ml serologische pipet met een elektronische pipet. Plaats het uiteinde van de serologische pipet op de bodem van de 50 ml centrifugebuis bevattende cellen, en laat de dichtheidsgradiënt oplossing kan afvloeien naar de bodem van de buis via zwaartekracht.
- Voorzichtig verdrijven de dichtheidsgradiënt oplossing uit de pipet te eindigen genereren van de twee lagen van verschillende dichtheden.
- Centrifugeer bij 600 xg for 20 min bij kamertemperatuur in een swingende-bucket rotor. Stel de vertraging snelheid de langzaamste niveau.
- Breng de bovenste laag en de interface naar een nieuwe 50 ml buis.
Opmerking: De meeste van de TEC's blijven in de interface. Lymfocyten precipiteren op de bodem van de buis na centrifugeren. Wanneer deze cellen worden gebruikt voor andere doeleinden, spoel de pellet met 20 ml wasoplossing driemaal. Resuspendeer de cellen in 10 ml wasbuffer. - Voeg wasoplossing tot 40 ml aan de buis in stap 2,6 en centrifugeer bij 400 xg gedurende 6 min bij 4 ° C. Om de bovenstaande vloeistof, aspireren met een pipet verwijderen.
- Herhaal het wassen en aspiratie meer 2 keer zoals beschreven in stap 2.7.
- Resuspendeer in 2 ml wasoplossing en tel de cellen met een hemocytometer.
3. Isoleren TEC's met FACS
- Pas cellen van stap 2,9 bij een concentratie van 1x10 6 cellen / 100 pl wasoplossing met en overdrachtde cellen een 5 ml rondbodem buis (polypropeen of polystyreen, zoals aanbevolen door de instructies van de stroming sorter).
- Voeg 2 ul anti-Fc receptor IgG per 1x10 6 cellen en incuberen bij 4 ° C gedurende 10 minuten.
- Add anti-CD45 (1: 150 verdunning, 10 ul per monster) en anti-EpCAM (1: 100 verdunning, 10 ul per monster) antilichamen en incuberen bij 4 ° C gedurende meer dan 20 minuten.
- Was de cellen met 2 ml wasoplossing en centrifugeer bij 400 xg gedurende 6 min bij 4 ° C. Zuig het supernatant met een pipet.
- Resuspendeer de cellen in 1 ml 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Filteren door middel van 100 urn zeef.
- Breng de cellen aan de sorteerinrichting instrument. Selecteer de lymfocyt en TEC bevolking met uitzondering van de kleinste cellen op zijdelings verstrooid licht (SSC) / forward-verstrooid licht (FSC) paneel (dode cellen), dan poort aan de geselecteerde populatie van CD45- EpCAM + voor het sorteren 13.
4. GENERATIE van TEC / EAK Aggregaten
Opmerking: Voer reagens voorbereiding en stappen waarbij cel mengen onder de laminaire kap.
- Bereid pA / G adapter complexen door mengen van 4 ui van anti-His-tag IgG, 8 pl anti-EpCAM IgG en 2,6 pl pA / G in een steriele 1,5 ml microcentrifugebuis en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- Pas de gesorteerde TEC uit stap 3,7 tot 5x10 4 cellen / ml met het wassen oplossing en pipet 100 ul één putje van een laag door verdamping, 96 putjes met ronde bodem weefselkweek plaat. Voeg 14,6 ul pA / G adapter complexen aan de cellen. Plaats de plaat op een schudapparaat gedurende 20 minuten bij 4 ° C.
- Was eenmaal met 200 pi wasoplossing. Centrifugeer de plaat bij 400 g gedurende 6 minuten. Verwijder het supernatant met een micropipet.
- Was eenmaal met 200 ui 10% sucrose-oplossing. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 6 min. Verwijder het supernatant met een micropipet.
- Resuspendeer cellen in 30 ui 10% sterile sucrose oplossing per well.
- Voeg 10 ul van EAKIIH6 (7,5 mg / ml) en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 20 ul van EAK16-II (10 mg / ml) aan het mengsel TEC.
- Voeg 100 ul volledig medium om het systeem te starten gelering. Plaats de plaat op een platform schudmachine gedurende 15-20 minuten bij kamertemperatuur.
- Plaats de plaat in de incubator bij 37 ° C en 5% CO2. Na 2-4 uur, voeg nog eens 100 ul volledig medium.
- Wijzig medium om de andere dag tot gebruik.
- Verzamelbak 100 ui van het medium van het oppervlak zonder de gel te storen met een micropipet en voorzichtig 100 ul voorverwarmde medium toevoegen door het plaatsen van de pipetpunt aan de wand van de put.
5. Analyse van de TEC / EAK Aggregaten
- Om de functie van de TEC / EAK aggregaten in vivo onderzoeken, verzamel de TEC / EAK hydrogel na O / N kweek en transplantatie onder de nier capsule van een athymische naaktmuis, met behulp van eerder beschreven procedure 11,14.
- Bewaken van de ontwikkeling van T-cellen in de periferie door het oogsten van 50-100 pl bloedmonsters in de EDTA bevattende bloedafnamebuis van naakt muizen 4-6 weken na transplantatie en vlek met een cocktail van anti-CD4, -CD8, -CD45 en -CD3 antilichamen 12.
- Analyseer het percentage T-lymfocyten in het perifere bloed leukocyten met flowcytometrie (FCM), waarbij een enkelvoudige cel analysesoftware 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de effectiviteit van het gebruik van de dichtheidsgradiënt scheidingsprotocol de CD45- stromale cellen verrijken onderzoeken werden cellen geoogst uit zowel de interface en het neergeslagen lymfocyt korrels gekleurd met anti-CD45 en anti-EpCAM antilichamen. Zowel anti-Ulex Europaeus agglutinine 1 (UEA1) en anti-MHC Klasse II antilichamen werden ook opgenomen in de kleuring cocktail de CTEC en Mtec subsets verdere omschrijving. Zoals getoond in figuur 1, konden we routinematig bijna in 15-20 keer verrijking van de TEC.
Tot de som van de TEC in de EAK hydrogel onderzoeken werden TEC geïsoleerd uit 4 weken oude B6.ROSA mT / mG muizen, die alom de membraangebonden, fluorescerende tdTomato moleculen tot expressie. TEC aggregaten, bereid zoals hierboven beschreven, werden gedurende twee dagen in vitro onderzocht onder een confocale microscoop ( 
Figuur 1. Flow cytometrische analyse van TEC verrijkt met de dichtheidsgradiënt oplossing. Cellen werden gekleurd met anti-CD45 en anti-EpCAM antilichamen tegen TEC populatie (CD45- EpCAM +) onderscheiden. Links panelen: thymus cellen na enzymdigestie, voordat de dichtheidsgradiënt procedure. Tussenruiten: Cellen in de toplaag en de interface na afscheiding van de dichtheidsgradiënt oplossing. Rechts panelen:. Gepelleteerd cellen (lymfocyten pellet) na scheiding met de dichtheidsgradiënt oplossing Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 
Figuur 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Terwijl TEC de overheersende populatie van de thymus stroma en spelen een essentiële rol voor de structuur en functie van de thymus, zij slechts ongeveer 0,1-0,5% van de totale thymus cellulariteit. Ze zijn ook kwetsbaar cellen zo hoog percentage celdood worden soms waargenomen na digereren door collagenase, dat wil zeggen, de behandeling TEC van de extracellulaire matrix (ECM) dissociëren. Hun zeldzaamheid (~ 200.000 per muis thymus) en kwetsbaarheid maakte het een uitdagende taak om TEC te isoleren. De recente gebruik van sterk gezuiverd collagenase in TEC isolatie zijn aanzienlijk toegenomen het aantal levende cellen na de enzymatische afbraak 15-19.
De zeer klein aantal TEC blijft een belangrijke uitdaging voor de analyse en isolatie, als grote hoeveelheden antilichamen zijn nodig voor celoppervlak labeling en overmatige aantallen gebeurtenissen kunnen worden opgehaald door FACS. Terwijl antilichaam-conjugaatd magnetische bead-technologie kan worden gebruikt om CD45 + thymocyten afbreken, hun grote hoeveelheid maakt het economisch prohibitief op de lange termijn. We waren in staat om effectief te verrijken TEC 15-20 keer met een eenvoudige, een stap dichtheidsgradiënt centrifugatie. Het iso-osmotische eigendom van de iodixanol dichtheidsgradiënt medium maakt de scheiding van cellen op basis van hun vormen, maten en dichtheden 20-22. Opgemerkt wordt dat de zuiverheid en opbrengst van TECs worden beïnvloed door het percentage van de dichtheidsgradiënt te bewaren. Lager percentage van de dichtheidsgradiënt medium (18-20% v / v) leiden tot hogere zuiverheid van TEC in de interface, maar lagere opbrengst. Wanneer daarentegen hogere iodixanol concentratie (22% v / v) gebruikt wordt, kunnen grotere hoeveelheid thymus cellen worden verzameld lager percentage TEC. De concentratie van iodixanol worden aangepast aan het doel van het experiment. Hoewel de zuiverheid van TEC grotendeels verbeterd met het nut van dichtheidsgradiënt oplossing het should gewezen dat de vanuit de toplaag en de interface cellen bevatten nog steeds een relatief hoge fractie CD45 + cellen (Figuur 1). Daarom, wanneer alleen de TEC bevolking vereist zoals in experiment celsortering zijn cruciaal, hoewel dit extra procedure enig verlies van cellen kan veroorzaken en vereist meer tijd.
In tegenstelling tot de meeste epitheelcellen die in een enkele of meerdere lagen langs de viscerale organen, worden TEC georganiseerd in 3-D-configuratie in de thymus stroma, wat essentieel is voor de levensvatbaarheid en functie. De zelfassemblerende EAK hydrogel systeem vergemakkelijkt de vorming van 3-D TEC aggregaten die worden gemedieerd door het tri-moleculaire αH6: pA / G: αEpCAM adapter complexen. We merken van het verfijnen van de concentraties en verhoudingen van de EAK16-II / EAKIIH6 oligopeptiden, de porositeit en de dichtheid van het hydrogel kan worden aangepast om de stroom van voedingsstoffen en de migratie van thymocyten mogelijk. Inderdaad, functionaliteitenl T-cellen werden gegenereerd in athymische naakt muizen getransplanteerd met de TEC / EAK composieten.
Het nadeel van deze EAK hydrogel systeem is dat met de huidige protocol specifieke celsamenstelling kan niet worden gelokaliseerd op een beperkt gebied. In een fysieke omgeving een thymus bestaat uit twee verschillende compartimenten, waarbij specifieke soorten TEC bevinden, cTECs in de cortex en medulla mTECs in. Met ons systeem hier beschreven, zowel cTECs en mTECs zijn gelabeld met EpCAM, een algemene epitheliale marker. Daarom wordt gespeculeerd dat de aggregaten in de gevormde hydrogel zowel subtypes van TEC. Hoewel cTECs en mTECs ontlenen gemeenschappelijke bipotent TEC stamcellen hun rol in de ontwikkeling van T-cellen zijn duidelijk te onderscheiden. Cortex is de eerste regio in de thymus, waar de onrijpe thymus voorlopercellen in te voeren, en de positieve selectie plaatsvindt 23. Dan gaan de geselecteerde cellen in het medullaire regio en interageren met mTECs door which de zelf-reactieve cellen worden geëlimineerd door negatieve selectie 24. Bovendien is aangetoond dat 25% van de genen differentiële expressie tussen cTECs en mTECs 25. Deze resultaten onderstrepen het belang om aggregatie van TEC subsets om de werkzaamheid van T cel ontwikkeling. Een mogelijke benadering is om verschillende antilichamen gericht oppervlak moleculen specifiek voor ofwel cTECs of mTECs, zoals anti-cytokeratine 8 voor cTECs en anti-cytokeratine 5 voor mTECs gebruiken.
Vanuit het perspectief van toekomstige klinische toepassing, kan het TEC clusters ingebed in de biologisch afbreekbare hydrogel functioneren als injecteerbare "mini thymus eenheden" naar het adaptieve immuunsysteem die belangrijk zijn voor diverse medische aandoeningen, zoals verjonging van het adaptieve immuunsysteem personen van zou kunnen moduleren of het induceren van donor-specifieke tolerantie in vaste orgaantransplantatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund in het kader van de National Institutes of Health subsidies R21 AI113000 (WSM) en R01 AI123392 (YF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TEC Isolation | |||
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2701(1 Gallon) | Ethanol 200 Proof, deionized water |
| Dissecting scissors, straight | Fine Science Tools, Inc. | 91460-11 | |
| Graefe forceps, straight | Fine Science Tools, Inc. | 11053-10 | |
| Graefe forceps, curved | Fine Science Tools, Inc. | 11052-10 | |
| Washing solution | 1x PBS, 0.1% BSA, 2 mM EDTA | ||
| 1x PBS (Phosphate buffered saline) | Gibco | 10010-023 | |
| BSA (Bovine serum albumin) | Sigma | A1470-100G | |
| EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | Invitrogen | 15575-038 | |
| Digestion solution | 9 ml RPMI-1640, 0.025 mg/ml Liberase TM Research grade, 10 mM HEPES, 0.2 mg/ml DNaseI | ||
| RPMI-1640 | Gibco | 11879-020 | |
| Liberase TM Research Grade | Roche | 05 401 127 001 | referred as "purified collagenase" |
| 1 M HEPES | Lonza | 17-737E | |
| Dnase I | Roche | 10 104 159 001 | |
| 50 ml Centrifuge tube | Corning | 430290 | |
| 60 mm tissue culture dish | Falcon | 353002 | |
| 1/2 cc U-100 Insulin syringe 28 1/2 G | Becton Dickinson | 329461 | |
| 5 ml Polystyrene round-bottom tube | Falcon | 352058 | |
| 5 ml glass pipet | Fisher Healthcare | 13-678-27E | Use for rinsing the thymic fragments. Thymic fragments tend to stick to the wall with plastic pipets. |
| MACSmix tube rotator | Miltenyi | 130-090-753 | |
| 100 µm Cell strainer | Falcon | 352360 | |
| Density gradient medium: OptiPrep | Axis-Shield | ||
| Cell Sorting | |||
| 5 ml Polypropylene round-bottom tube | Falcon | 352063 | |
| Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | Use as undiluted, 2 µl per sample |
| Anti-mouse CD45-PercpCy5.5 | eBioscience | 45-0451-80 | Use at 1:150, 10 µl per sample |
| Anti-mouse CD326 (EpCAM)-PE | eBioscience | 12-5791-82 | Use at 1:100, 10 µl per sample |
| BD Influx | BD Biosciences | ||
| Single cell analysis software | FlowJo | ||
| EAK Gel Assembly | |||
| Anti-His-Tag | AnaSpec | 29673 | "anti-His-Tag IgG" |
| Purified anti-mouse CD326 (EpCAM) | BioLegend | 118202 | "anti-EpCAM IgG" |
| Recombinant protein A/G | Pierce Biotechnology | ||
| 1.5 ml Safe-Lock Tubes, Biopur, Sterile | Fisher Healthcare | 05-402-24B | referred as "1.5 ml microcentrifuge tube" |
| 96-well, Tissue culture plate, Round-bottom with low evaporation lid | BD Falcon | 353917 | |
| Rocking platform: Nutator Mixer no.1105 | BD Clay Adams | ||
| 10% sucrose | Sigma | S0389 | Prepare with sterile distilled water |
| EAK16-II (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAK-CONH2) | American Peptide Company | custom synthesized, 10 mg/ml | |
| EAKIIH6 (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAKHHHHHH-CONH2) | American Peptide Company | custom synthesized, 7.5 mg/ml | |
| Complete medium | RPMI-1640, 10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% L-glutamine, 1% NEAA, 5 mM HEPES, 50 µM 2-Mercaptoethanol | ||
| RPMI-1640 | Gibco | 11879-020 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Atlanta Biologicals | S11150 | Heat inactivated before use |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| NEAA (non-essential amino acid) 100x | Gibco | 11140-050 | |
| 1 M HEPES | BioWhittaker | 17-737E | |
| 2-Mercaptoethanol (100x) | Millipore | ES-007-E | |
| Platform shaker: The Belly Dancer | Stovall Life Sciences Inc. | model: USBDbo |
References
- Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus. Nature. 362, 70-73 (1993).
- Fan, Y., et al. Thymus-specific deletion of insulin induces autoimmune diabetes. The EMBO J. 28, 2812-2824 (2009).
- Mohtashami, M., Zuniga-Pflucker, J. C. Three-dimensional architecture of the thymus is required to maintain delta-like expression necessary for inducing T cell development. J Immunol. 176, 730-734 (2006).
- Pinto, S., et al. An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression. J Immunol. 190, 1085-1093 (2013).
- Fung, S. Y., Yang, H., Chen, P. Formation of colloidal suspension of hydrophobic compounds with an amphiphilic self-assembling peptide. Colloids Surf B Biointerfaces. 55, 200-211 (2007).
- Jun, S., et al. Self-assembly of the ionic peptide EAK16: the effect of charge distributions on self-assembly. Biophys J. 87, 1249-1259 (2004).
- Saunders, M. J., et al. Engineering fluorogen activating proteins into self-assembling materials. Bioconjug Chem. 24, 803-810 (2013).
- Zhang, S., Holmes, T., Lockshin, C., Rich, A. Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane. Proc of the Natl Acad Sci U S A. 90, 3334-3338 (1993).
- Wen, Y., et al. Coassembly of amphiphilic peptide EAK16-II with histidinylated analogues and implications for functionalization of beta-sheet fibrils in vivo. Biomaterials. 35, 5196-5205 (2014).
- Zheng, Y., et al. A peptide-based material platform for displaying antibodies to engage T cells. Biomaterials. 32, 249-257 (2011).
- Tajima, A., et al. Bioengineering mini functional thymic units with EAK16-II/EAKIIH6 self-assembling hydrogel. Clin Immunol. 160, 82-89 (2015).
- Fan, Y., et al. Bioengineering Thymus Organoids to Restore Thymic Function and Induce Donor-Specific Immune Tolerance to Allografts. Mol Ther. 23, 1262-1277 (2015).
- Fan, Y., et al. Thymus-specific deletion of insulin induces autoimmune diabetes. The EMBO J. 28, 2812-2824 (2009).
- Fan, Y., et al. Compromised central tolerance of ICA69 induces multiple organ autoimmunity. J Autoimmun. 53, 10-25 (2014).
- Palumbo, M. O., Levi, D., Chentoufi, A. A., Polychronakos, C. Isolation and characterization of proinsulin-producing medullary thymic epithelial cell clones. Diabetes. 55, 2595-2601 (2006).
- Williams, K. M., et al. Single cell analysis of complex thymus stromal cell populations: rapid thymic epithelia preparation characterizes radiation injury. Clin Transl Sci. 2, 279-285 (2009).
- McLelland, B. T., Gravano, D., Castillo, J., Montoy, S., Manilay, J. O. Enhanced isolation of adult thymic epithelial cell subsets for multiparameter flow cytometry and gene expression analysis. J Immunol Methods. 367, 85-94 (2011).
- Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. J Immunol methods. 385, 23-34 (2012).
- Xing, Y., Hogquist, K. A. Isolation, identification, and purification of murine thymic epithelial cells. J Vis Exp. , e51780 (2014).
- Graham, J. M. Separation of monocytes from whole human blood. ScientificWorldJournal. 2, 1540-1543 (2002).
- Li, X., Donowitz, M. Fractionation of subcellular membrane vesicles of epithelial and nonepithelial cells by OptiPrep density gradient ultracentrifugation. Methods Mol Biol. 440, 97-110 (2008).
- Mita, A., et al. Purification method using iodixanol (OptiPrep)-based density gradient significantly reduces cytokine chemokine production from human islet preparations, leading to prolonged beta-cell survival during pretransplantation culture. Transplant Proc. 41, 314-315 (2009).
- Anderson, G., Takahama, Y. Thymic epithelial cells: working class heroes for T cell development and repertoire selection. Trends Immunol. 33, 256-263 (2012).
- Kyewski, B., Klein, L. A central role for central tolerance. Annu Rev Immunol. 24, 571-606 (2006).
- St-Pierre, C., et al. Transcriptome sequencing of neonatal thymic epithelial cells. Sci Rep. 3, 1860 (2013).
