Introduction
Тимус является первичным лимфоидной органом, ответственным за генерацию различных слоев населения патоген-реактивная, уверенных терпимы Т-клеток, имеет важное значение для функции приобретенной иммунной системы. Это динамичный орган, в котором развивающиеся тимоциты, иммигрировал из костного мозга в качестве клеток-лимфоцитов-предшественников, мигрируют через губчатую трехмерные (3-D) матрицы тимуса стромы, подвергаются LINEAGE-спецификации и дифференциации, и в конечном счете эмигрировать в зрелых Т-клеток. Успех этого хорошо запрограммированный процесс во многом зависит от перекрестных помех между мигрирующими тимоцитов и жилых тимуса эпителиальных клеток (ТИК), преобладающей популяции вилочковой стромы, которые имеют важное значение для установления и поддержания целостности вилочковой микросреды.
На основе их анатомического расположения и уникальной функции, ТЭМ можно разделить на два подмножества: ТИКи в коре (cTECs), которые являются responность за выбор собственного MHC (главный комплекс гистосовместимости) ограничено Т-клетки (положительный выбор), а ТИК в мозговом веществе (mTECs), которые необходимы для устранения аутореактивных Т-клеток (негативный отбор) 1,2. Многие факторы (например, старение, инфекции, облучение, лекарственное лечение) может вызвать необратимые повреждения тимуса эпителия, что приводит к скомпрометированных адаптивного иммунитета. Несмотря на многочисленные попытки, восстановление функции тимуса была сложной задачей из-за трудностей, чтобы воспроизвести тимуса микросреду. Следует отметить, что вилочковой трехмерные (3-D) , конфигурация имеет решающее значение для выживания и функции ТЭМ, тогда как ТЭМ культивируют в среде 2-D быстро уменьшают экспрессию генов , критических для тимопоэз 3,4.
EAK16-II (AEAEKAKAEAEAKAK) и С-концевой histidinylated аналог EAKIIH6 (AEAEKAKAEAEAKAKHHHHHH) имеют низкий молекулярный вес, амфифильные олигопептиды, которые растворяются в деионизованной водоснаг, но подвергаются гелеобразование с образованием бета-фибриллы при воздействии ионной силы выше, чем 20 мМ NaCl (нормальной концентрации соли в жидкости тела человека составляет 154 мм). Это свойство отзывчивым окружающей среды делает их универсальными строительными блоками для формирования 3D-структур. His-метки на EAKII-H6 обеспечивает стыковочный механизм, с помощью которого противопехотные Его IgGs / Fc-связывающий рекомбинантный белок A / G (αH6: пА / G) комплексы могут служить в качестве адаптера для закрепления белковых лекарственных средств и других биомолекул ( например, антитела) на гидрогеля композита 5-8.
Ранее мы показали , что флуоресцентные меченных молекул IgG , базирующуюся на гидрогеля может удерживаться в месте инъекции в течение до 13 дней 9. Кроме того, когда αH6: пА / G адаптеры с прикрепленные анти-CD4 IgG , были добавлены к EAK16 II / EAKIIH6 (ЕАК) гидрогеля, CD4 + Т - клетки были специально захваченный 10. Используя подобную технику, мы недавно показали, что 3-D агрегация TECS Cульд быть повышен в ЕАК гидрогеля с адаптером комплексов, несущих ПЭС-специфических анти-EpCAM антител (αH6: Pa / G: αEpCAM). Когда пересаживают под почки капсулы голых мышей, КТР кластеры , встроенные в ЕАК гидрогеля может эффективно поддерживать развитие функциональных Т - клеток в естественных условиях 11,12.
Здесь мы проиллюстрируем наш метод, чтобы быстро и эффективно очищают ТИК с сортировкой флуоресцентно активированных клеток (FACS) и генерировать 3-D TEC агрегаты с системой EAK гидрогеля.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все животные, используемые в экспериментах, были размещены в виварии в научно-исследовательском институте Allegheny-Зингера в соответствии с протоколом были рассмотрены и одобрены Institutional животных по уходу и использованию комитета / Allegheny научно-исследовательского института Allegheny Network Health певцу.
1. Переваривание тимусе коллагеназой
- Урожай вилочковой железы.
- Эвтаназии 3-5-недельных мышей C57BL6 / J в двуокиси углерода (СО 2) камеры для сбора вилочковой железы. Более подробно, поместить мышей в камере под СО 2 индукции в течение 3-5 мин и подтвердить смерть путем проверки сердца или дыхания.
- Положите тушу на спине и намочить тело с 70% -ным этанолом. Сделайте небольшой горизонтальный разрез с острыми, прямыми Препарационные ножницами на его животе через кожу. Потяните кожу на обоих концах (головы и ног), так что она вывернута наизнанку.
- Сделайте горизонтальный разрез с рассекает ножницами только подсамое низкое ребро и разрезают через диафрагму в сторону. Держа мечевидного отростка с пинцетом и вырезать середину ребер, идущих с обеих сторон. Подтяните ребра / грудину так, что тимус четко виден.
Примечание: Тимус расположен непосредственно на вершине сердца, состоит из 2-х лепестков и белого полупрозрачного цвета. - С помощью изогнутых щипцов, осторожно выкопать и вытащить тимуса лепестка от соединительной ткани и передачи в моющем растворе (см перечень материалов).
- Готовят пищеварение раствора путем смешивания 9 мл среды RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute среднего 1640), 0,025 мг / мл очищенного коллагеназа, 10 мМ HEPES [4- (2-гидроксиэтил) -1-пиперазинэтансульфонова кислота], и 0,2 мг / мл ДНКазы I в центрифужную пробирку на 50 мл. Хранить раствор Пищеварение в 37 ° С на водяной бане до использования.
Примечание: Количество варочным раствором, приготовленным достаточно для пяти взрослых thymi мыши, который можно инкубировать в одном 5 мл полистирола круглодоннуюнижняя труба. - Передача тимус до 60 мм ткани блюдо культуры, содержащей 5-6 мл RPMI-1640.
- Рассеките тимус с 28 G иглой шприца инсулина на мелкие кусочки (около 1 мм 3 кв) , чтобы позволить лимфоциты вытечь.
- Промыть вилочковой части с RPMI-1640, который находится в чашке Петри со стеклянной пипетки Пастера. Наклоните блюдо и пусть тимуса фрагменты оседают на дно. Медленно аспирация и отбросить RPMI-1640 супернатанта с помощью стеклянной пипетки. Повторите этот шаг, промывая 5-6 мл среды RPMI-1640, в 4-5 раз со стеклянной пипеткой до тех пор, пока раствор не станет менее прозрачным.
Примечание: Стеклянные пипетки рекомендуется на этом этапе, так как фрагменты тимуса имеют тенденцию придерживаться пластика, что приводит к чрезмерной потере тканей тимуса. Для остальной части процедуры, использование пластиковых пипеток. - После окончательной промывки, отбросить супернатант, как описано на стадии 1.5. Добавить раствор 3 мл переваривания и переносят кусочки тимуса и раствора в 5 мл с круглым дном рolystyrene трубки.
- Поместите пробирку на ротатор трубки и инкубировать при 37 ° С в течение 6 мин при скорости вращения 12 оборотов в минуту.
- После инкубации, пусть вилочковой фрагменты оседают на дно трубки под действием силы тяжести. Собирают супернатант с пипеткой Пастера и переносят в 50 мл центрифужную пробирку с 10 мл промывочного раствора. Центрифуга при 300 мкг в течение 5 мин, отбросить супернатант и клетки вновь суспендируют в растворе 10 мл промывки. Держите на льду.
- Повторите шаги 1.6-1.8 дважды на тимуса фрагментов в 5 мл с круглым дном полистирола трубки. Бассейн супернатант в том же 50 мл трубки.
Примечание: Центрифугирование не является необходимым для второй и третьей промывки. - После окончательного переваривания, пипеткой вверх и вниз с 2 мл пластиковой серологической пипетки, чтобы сломать оставшиеся фрагменты в трубке и передачи в центрифужную пробирку на 50 мл.
- Центрифуга 50 мл трубки при 300 мкг в течение 5 мин, аспирата супернатант, ресуспендируют в 10 мл промывочного Buffeг и фильтр через мкм клеточный фильтр 100. Держите на льду.
2. Обогащение ТЭМ с разрывным градиентом плотности
- Готовят 21% раствор градиента плотности путем смешивания 2,4 мл в градиенте плотности среды (60% вес / об иодиксанола в воде) и 9,6 мл промывочного раствора.
- Центрифуга диссоциированных клеток тимуса в трубке 50 мл сбора с шагом 1.11 при 300 мкг в течение 5 мин и ресуспендируют в 2,5 мл буфера для промывки.
- Добавьте 20 мл среды RPMI-1640 к клеточной суспензии.
- Заполните 12 мл 21% -ного раствора градиента плотности в 10 мл серологической пипеткой с электронным дозаторов. Поместите кончик серологической пипеткой в нижней части 50-мл центрифужные пробирки, содержащие клетки, и чтобы раствор градиента плотности стечь на дно трубки под действием силы тяжести.
- Аккуратно выталкивать раствор градиента плотности с пипеткой, чтобы закончить генерации двух слоев различной плотности.
- Центрифуга при 600 мкг Foг 20 мин при комнатной температуре в качающийся-роторе. Установите скорость торможения на уровне самого медленного.
- Перенести верхний слой и интерфейс к новой 50 мл пробирку.
Примечание: Большинство ТЭМ сохраняются в интерфейсе. Лимфоциты будет выпадать в осадок на дно пробирки после центрифугирования. Если эти клетки должны быть использованы для других целей, промыть осадок с помощью 20 мл промывочного раствора в течение трех раз. Ресуспендируют клеток в 10 мл буфера для промывки. - Добавьте промывочный раствор до 40 мл в пробирку на шаге 2.6 и центрифуге при 400 мкг в течение 6 мин при температуре 4 ° С. Для того, чтобы удалить супернатант, аспирация с пипеткой.
- Повторите промывание и аспирация еще 2 раза, как описано в шаге 2.7.
- Ресуспендируют в 2 мл промывочного раствора и подсчета клеток с помощью гемоцитометра.
3. Разделительные ТЭМ с FACS
- Отрегулировать клетки от шага 2,9 при концентрации 1х10 6 клеток / 100 мкл промывочного раствора и передачиклетки в 5 мл с круглым дном трубы (полипропилен или полистирол, в соответствии с рекомендациями инструкции сортировщика потока).
- Добавьте 2 мкл анти-Fc IgG рецептора на 1х10 6 клеток и инкубируют при 4 ° С в течение 10 мин.
- Добавить анти-CD45 (1: 150 разбавление, 10 мкл на образце) и анти-EpCAM (разведение 1: 100, 10 мкл на образце) антител и инкубируют при 4 ° С в течение более 20 мин.
- Промывают клетки с промывочного раствора 2 мл и центрифугируют при 400 х г в течение 6 мин при температуре 4 ° С. Аспирируйте супернатант с пипеткой.
- Ресуспендируют клеток в 1 мл 1х фосфатно-солевым буферным раствором (PBS).
- Фильтруют через сито 100 мкм.
- Применение клеток в сортировочный инструмента. Выберите лимфоцит и TEC население за исключением самых маленьких клеток на стороне рассеянного света (SSC) / вперед рассеянного света (FSC) панели (мертвые клетки), а затем ворота на выбранной популяции для CD45- EpCAM + для сортировки 13.
4. Generation ТЭМ / EAK Совокупностей
Примечание: Выполните приготовления реагентов и действия, связанные с смесительной камере под ламинарным укрытием.
- Готовят пА / G адаптер комплексов путем смешивания 4 мкл анти-His-меткой IgG, 8 мкл анти-EpCAM IgG и 2,6 мкл пА / G в стерильном 1,5 мл микроцентрифужных трубки, и инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Отрегулировать отсортированные ТИК с шага 3,7 до 5x10 4 клеток / мл с промывочным раствором, и пипетку 100 мкл в одну лунку низкой испарительной 96-луночного круглым дном планшета для культуры ткани. Добавить 14,6 мкл адаптера комплексов пА / G к клеткам. Поместите пластину на качающейся платформе в течение 20 мин при температуре 4 ° С.
- Промывают один раз 200 мкл промывочного раствора. Центрифуга пластины при 400 х г в течение 6 мин. Удалите супернатант с помощью микропипетки.
- Промывают один раз 200 мкл 10% раствора сахарозы. Центрифуга при 400 мкг в течение 6 мин. Удалите супернатант с помощью микропипетки.
- Ресуспендируют клеток в 30 мкл 10% сterile раствор сахарозы на лунку.
- Добавьте 10 мкл EAKIIH6 (7,5 мг / мл) и инкубируют в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Добавьте 20 мкл EAK16-II (10 мг / мл) к смеси TEC.
- Добавьте 100 мкл полной среды в системе, чтобы инициировать гелеобразование. Поместите пластину на платформе шейкере в течение 15-20 мин при комнатной температуре.
- Поместите пластину в инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% СО 2. Через 2-4 часа, добавить еще 100 мкл полной среды.
- Измените среда каждый день до использования.
- Отберите 100 мкл среды с поверхности без нарушения гель с использованием микропипетки и осторожно добавляют 100 мкл подогретого среды, помещая кончик пипетки к стенке скважины.
5. Характеристика ТИК / EAK Совокупностей
- Чтобы проверить функцию TEC / EAK агрегатов в естественных условиях, собрать TEC / EAK гидрогель после O / N культуры и пересадки под почечную капсулу бестимусных обнаженноймыши, используя ранее описанную процедуру 11,14.
- Контроль за развитие Т-клеток на периферии путем сбора 50-100 мкл пробы крови в ЭДТА-содержащие пробирки для сбора крови из голых мышей через 4-6 недель после трансплантации и пятна с коктейлем анти-CD4, -CD8, -CD45 и -CD3 антитела 12.
- Проанализировать процент Т-лимфоцитов в периферической крови лейкоцитов с проточной цитометрии (FCM), с помощью программного обеспечения для анализа одноклеточ- 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для изучения эффективности использования протокола градиента плотности разделения для обогащения стромальных клеток CD45-, клетки, полученные как из интерфейса и осажденных лимфоцитах гранул окрашивали анти-CD45 и анти-EpCAM антител. Оба анти-Улекс Europaeus Agglutinin 1 (UEA1) и антитела анти-МНС класса II, также были включены в окрашивании коктейль для дальнейшей идентификации подмножества CTEC и Mtec. Как показано на рисунке 1, мы смогли достичь обычно близко к 15-20 раз обогащения ТЭМ.
Для изучения агрегации ТЭМ в ЕАК гидрогеля, ТЭМ были изолированы от 4-недельных мышей B6.ROSA мТл / Мg, который Повсеместно выражают мембраносвязанные, красные флуоресцентные молекулы tdTomato. TEC агрегаты, полученные , как описано выше, культивируют в течение двух дней в пробирке и исследовали под конфокальной микроскопии ( 
Рисунок 1. Цитометрический анализ ТЭМ обогащенный раствор с градиентом плотности. Клетки окрашивали анти-CD45 и анти-EpCAM антител отличить TEC популяцию (CD45- EpCAM , +). Левая панель: тимуса клетки после ферментативного расщепления, до процедуры градиента плотности. Средние панели: клетки в верхнем слое и интерфейс после разделения с раствором с градиентом плотности. Правая панель:. Осажденные клетки (лимфоцит пеллетах) после разделения с раствором с градиентом плотности Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. 
Фигура 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В то время как ТЭМ являются преобладающими популяция вилочковой стромы и играют существенную роль для структуры и функции тимуса желез, они составляют лишь около 0,1-0,5% от общего тимуса клеточности. Они также являются хрупкими клетки , как высокий процент гибели клеток изредка наблюдаются следующие коллагеназы, то есть лечение , чтобы диссоциировать из ТИК внеклеточного матрикса (ЕСМ). Их редкость (~ 200 000 за тимуса мыши) и хрупкость сделал это сложная задача, чтобы изолировать ТИК. Недавнее использование высокой степени очистки коллагеназы в изоляции TEC значительно увеличилось число живых клеток после ферментативного переваривания 15-19 лет.
Тем не менее, очень небольшое количество ТЭМ остается серьезной проблемой для их анализа и изоляции, так как большое количество антител, которые необходимы для клеточной поверхности маркировки, а также чрезмерное количество событий должны быть собраны FACS. В то время как антитело-конъюгатd технологии магнитного шарика может быть использована для истощить CD45 + тимоцитов, их большое количество делает его экономически запретительными в долгосрочной перспективе. Мы смогли эффективно обогатить TECS 15-20 раз с простой, один шаг плотности центрифугирования в градиенте. Изо-осмотического свойство иодиксанол градиента плотности среды позволяет разделение клеток в зависимости от их форм, размеров и плотности 20-22. Следует отметить, что чистота и выход ТЭМ влияет на процент градиента плотности среды, используемой. Более низкий процент градиента плотности среды (18-20% об / об), приведет к более высокой чистоте ТЭМ в интерфейсе, но более низким выходом. В противоположность этому, при более высокой концентрации йодиксанол (22% об / об), то большее количество клеток тимуса может быть собрана с более низким процентом ТЭМ. Концентрация иодиксанол должна быть отрегулирована на основании целей эксперимента. В то время как чистота ТЭМ в значительной степени улучшается с полезностью в градиенте плотности раствора, его зачиститьd следует подчеркнуть , что клетки , собранные из верхнего слоя , а интерфейс по- прежнему содержат относительно высокую долю CD45 + клеток (рис 1). Поэтому, когда только население ТЕС требуется, как в этом эксперименте, сортировки клеток будет иметь решающее значение, хотя эта дополнительная процедура может привести к некоторой потере клеток и требует больше времени.
В отличие от большинства эпителиальных клеток, расположенных в один или несколько слоев, выравнивающих внутренних органов, ТЭМ организованы в конфигурации 3-D в вилочковой стромы, которая необходима для их выживания и функции. Самоорганизующиеся системы ЕАК гидрогеля способствует формированию 3-D TEC агрегатов, которые опосредованных тримарана молекулярной αH6: пА / G: αEpCAM адаптер комплексов. Следует отметить, что с помощью тонкой настройки концентраций и соотношений EAK16-II / EAKIIH6 олигопептидов, пористость и плотность гидрогель можно регулировать, чтобы обеспечить поступление питательных веществ и миграцию тимоцитов. Действительно, functionaл Т-клетки были получены у бестимусных голых мышей, пересаженных с TEC / EAK композитов.
Недостаток в этой системе гидрогеля ЕАК является то, что с этим текущего протокола, видовой состав клеток не может быть локализован в определенной зоне. В физической среде тимус состоит из двух отдельных отсеков, в которых определенные типы ТЭМ проживают, cTECs в коре и mTECs в мозговом веществе. С помощью нашей системы описана здесь, как cTECs и mTECs помечены EpCAM, общий эпителиальной маркер. Поэтому он предположил, что агрегаты в сформированном гидрогель включает в себя как подтипы ТЭМ. Хотя cTECs и mTECs вытекают из общих бипотентными TEC клеток-предшественников, их роли в развитии Т-клеток, явно своеобразна. Cortex является первым регионом в тимусе , куда входят незрелые клетки - предшественники тимуса, а положительный отбор происходит 23. Затем выбранные клетки перемещаются в костномозговой области и взаимодействовать с mTECs, через шHICH самореактивного клетки уничтожаются путем негативной селекции 24. Кроме того, было показано , что 25% генов дифференциально экспрессируются между cTECs и mTECs 25. Эти данные подчеркивают важность содействия агрегации ПЭС подмножеств для повышения эффективности развития Т-клеток. Один из возможных подходов заключается в использовании различных антител, направленные поверхностные молекулы, специфичные для каждой cTECs или mTECs, такие как анти-цитокератином 8 для cTECs и анти-цитокератином 5 для mTECs.
С точки зрения будущего клинического применения, КТР кластеры, внедренные в биоразлагаемого гидрогеля мог бы функционировать как инъекционные "мини тимуса единицы" модулировать иммунную систему адаптивной, которая может иметь важное значение для различных заболеваний, таких как омолаживающий адаптивную иммунную систему у пожилых индивидуумов , или побуждение доноров-специфической толерантности в твердой трансплантации органов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была частично поддержана Национальным институтом здравоохранения грантов R21 AI113000 (WSM) и R01 AI123392 (YF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TEC Isolation | |||
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2701(1 Gallon) | Ethanol 200 Proof, deionized water |
| Dissecting scissors, straight | Fine Science Tools, Inc. | 91460-11 | |
| Graefe forceps, straight | Fine Science Tools, Inc. | 11053-10 | |
| Graefe forceps, curved | Fine Science Tools, Inc. | 11052-10 | |
| Washing solution | 1x PBS, 0.1% BSA, 2 mM EDTA | ||
| 1x PBS (Phosphate buffered saline) | Gibco | 10010-023 | |
| BSA (Bovine serum albumin) | Sigma | A1470-100G | |
| EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | Invitrogen | 15575-038 | |
| Digestion solution | 9 ml RPMI-1640, 0.025 mg/ml Liberase TM Research grade, 10 mM HEPES, 0.2 mg/ml DNaseI | ||
| RPMI-1640 | Gibco | 11879-020 | |
| Liberase TM Research Grade | Roche | 05 401 127 001 | referred as "purified collagenase" |
| 1 M HEPES | Lonza | 17-737E | |
| Dnase I | Roche | 10 104 159 001 | |
| 50 ml Centrifuge tube | Corning | 430290 | |
| 60 mm tissue culture dish | Falcon | 353002 | |
| 1/2 cc U-100 Insulin syringe 28 1/2 G | Becton Dickinson | 329461 | |
| 5 ml Polystyrene round-bottom tube | Falcon | 352058 | |
| 5 ml glass pipet | Fisher Healthcare | 13-678-27E | Use for rinsing the thymic fragments. Thymic fragments tend to stick to the wall with plastic pipets. |
| MACSmix tube rotator | Miltenyi | 130-090-753 | |
| 100 µm Cell strainer | Falcon | 352360 | |
| Density gradient medium: OptiPrep | Axis-Shield | ||
| Cell Sorting | |||
| 5 ml Polypropylene round-bottom tube | Falcon | 352063 | |
| Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | Use as undiluted, 2 µl per sample |
| Anti-mouse CD45-PercpCy5.5 | eBioscience | 45-0451-80 | Use at 1:150, 10 µl per sample |
| Anti-mouse CD326 (EpCAM)-PE | eBioscience | 12-5791-82 | Use at 1:100, 10 µl per sample |
| BD Influx | BD Biosciences | ||
| Single cell analysis software | FlowJo | ||
| EAK Gel Assembly | |||
| Anti-His-Tag | AnaSpec | 29673 | "anti-His-Tag IgG" |
| Purified anti-mouse CD326 (EpCAM) | BioLegend | 118202 | "anti-EpCAM IgG" |
| Recombinant protein A/G | Pierce Biotechnology | ||
| 1.5 ml Safe-Lock Tubes, Biopur, Sterile | Fisher Healthcare | 05-402-24B | referred as "1.5 ml microcentrifuge tube" |
| 96-well, Tissue culture plate, Round-bottom with low evaporation lid | BD Falcon | 353917 | |
| Rocking platform: Nutator Mixer no.1105 | BD Clay Adams | ||
| 10% sucrose | Sigma | S0389 | Prepare with sterile distilled water |
| EAK16-II (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAK-CONH2) | American Peptide Company | custom synthesized, 10 mg/ml | |
| EAKIIH6 (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAKHHHHHH-CONH2) | American Peptide Company | custom synthesized, 7.5 mg/ml | |
| Complete medium | RPMI-1640, 10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% L-glutamine, 1% NEAA, 5 mM HEPES, 50 µM 2-Mercaptoethanol | ||
| RPMI-1640 | Gibco | 11879-020 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Atlanta Biologicals | S11150 | Heat inactivated before use |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| NEAA (non-essential amino acid) 100x | Gibco | 11140-050 | |
| 1 M HEPES | BioWhittaker | 17-737E | |
| 2-Mercaptoethanol (100x) | Millipore | ES-007-E | |
| Platform shaker: The Belly Dancer | Stovall Life Sciences Inc. | model: USBDbo |
References
- Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus. Nature. 362, 70-73 (1993).
- Fan, Y., et al. Thymus-specific deletion of insulin induces autoimmune diabetes. The EMBO J. 28, 2812-2824 (2009).
- Mohtashami, M., Zuniga-Pflucker, J. C. Three-dimensional architecture of the thymus is required to maintain delta-like expression necessary for inducing T cell development. J Immunol. 176, 730-734 (2006).
- Pinto, S., et al. An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression. J Immunol. 190, 1085-1093 (2013).
- Fung, S. Y., Yang, H., Chen, P. Formation of colloidal suspension of hydrophobic compounds with an amphiphilic self-assembling peptide. Colloids Surf B Biointerfaces. 55, 200-211 (2007).
- Jun, S., et al. Self-assembly of the ionic peptide EAK16: the effect of charge distributions on self-assembly. Biophys J. 87, 1249-1259 (2004).
- Saunders, M. J., et al. Engineering fluorogen activating proteins into self-assembling materials. Bioconjug Chem. 24, 803-810 (2013).
- Zhang, S., Holmes, T., Lockshin, C., Rich, A. Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane. Proc of the Natl Acad Sci U S A. 90, 3334-3338 (1993).
- Wen, Y., et al. Coassembly of amphiphilic peptide EAK16-II with histidinylated analogues and implications for functionalization of beta-sheet fibrils in vivo. Biomaterials. 35, 5196-5205 (2014).
- Zheng, Y., et al. A peptide-based material platform for displaying antibodies to engage T cells. Biomaterials. 32, 249-257 (2011).
- Tajima, A., et al. Bioengineering mini functional thymic units with EAK16-II/EAKIIH6 self-assembling hydrogel. Clin Immunol. 160, 82-89 (2015).
- Fan, Y., et al. Bioengineering Thymus Organoids to Restore Thymic Function and Induce Donor-Specific Immune Tolerance to Allografts. Mol Ther. 23, 1262-1277 (2015).
- Fan, Y., et al. Thymus-specific deletion of insulin induces autoimmune diabetes. The EMBO J. 28, 2812-2824 (2009).
- Fan, Y., et al. Compromised central tolerance of ICA69 induces multiple organ autoimmunity. J Autoimmun. 53, 10-25 (2014).
- Palumbo, M. O., Levi, D., Chentoufi, A. A., Polychronakos, C. Isolation and characterization of proinsulin-producing medullary thymic epithelial cell clones. Diabetes. 55, 2595-2601 (2006).
- Williams, K. M., et al. Single cell analysis of complex thymus stromal cell populations: rapid thymic epithelia preparation characterizes radiation injury. Clin Transl Sci. 2, 279-285 (2009).
- McLelland, B. T., Gravano, D., Castillo, J., Montoy, S., Manilay, J. O. Enhanced isolation of adult thymic epithelial cell subsets for multiparameter flow cytometry and gene expression analysis. J Immunol Methods. 367, 85-94 (2011).
- Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. J Immunol methods. 385, 23-34 (2012).
- Xing, Y., Hogquist, K. A. Isolation, identification, and purification of murine thymic epithelial cells. J Vis Exp. , e51780 (2014).
- Graham, J. M. Separation of monocytes from whole human blood. ScientificWorldJournal. 2, 1540-1543 (2002).
- Li, X., Donowitz, M. Fractionation of subcellular membrane vesicles of epithelial and nonepithelial cells by OptiPrep density gradient ultracentrifugation. Methods Mol Biol. 440, 97-110 (2008).
- Mita, A., et al. Purification method using iodixanol (OptiPrep)-based density gradient significantly reduces cytokine chemokine production from human islet preparations, leading to prolonged beta-cell survival during pretransplantation culture. Transplant Proc. 41, 314-315 (2009).
- Anderson, G., Takahama, Y. Thymic epithelial cells: working class heroes for T cell development and repertoire selection. Trends Immunol. 33, 256-263 (2012).
- Kyewski, B., Klein, L. A central role for central tolerance. Annu Rev Immunol. 24, 571-606 (2006).
- St-Pierre, C., et al. Transcriptome sequencing of neonatal thymic epithelial cells. Sci Rep. 3, 1860 (2013).
