Introduction
Der Thymus ist die primäre lymphoiden Organ für die Erzeugung einer vielfältigen Population von pathogen-reaktives, selbst tolerant T-Zellen, die für die Funktion des erworbenen Immunsystems wesentlich ist. Es ist ein dynamisches Organ, in dem die Entwicklung Thymozyten aus dem Knochenmark als Lymphozyten-Vorläuferzellen immigrierte, wandern durch die schwammartige dreidimensionale (3-D) Matrix des Thymus-Stroma, durchlaufen abstammungs Spezifizierung und Differenzierung, und schließlich auswandern als reifen T-Zellen. Der Erfolg dieses gut programmiert Verfahren hängt weitgehend von der Kreuzkopplung zwischen den wandernden Thymozyten und den Wohn Thymus-Epithelzellen (TECs), die vorherrschende Bevölkerung des Thymus-Stroma, die für die Einrichtung und Aufrechterhaltung der Integrität des Thymus Mikroumgebung wesentlich sind.
Auf der Grundlage ihrer anatomischen Lage und einzigartige Funktion kann TECs in zwei Untergruppen unterteilt werden: die TECs in der Hirnrinde (CTEC), die Verant sindwortlich Selbst MHC (Major Histocompatibility Complex) beschränkt T-Zellen (positive Auswahl) und die TECs in der Medulla (mTEZ) , die zur Eliminierung autoreaktiver T-Zellen wesentlich sind (negative Selektion) 1,2 für die Auswahl. Viele Faktoren (zB Alterung, Infektion, Bestrahlung, medikamentöse Behandlungen) können irreversible Schäden an der Thymus - Epithel führen, in kompromittierten adaptive Immunität führt. Trotz zahlreicher Versuche hat die Thymusfunktion Wiederherstellung herausfordernd aufgrund der Schwierigkeit, den Thymus-Mikroumgebung zu reproduzieren. Bemerkenswerterweise ist thymic dreidimensionale (3-D) -Konfiguration entscheidend für das Überleben und die Funktion von TECs, während TECs kultiviert in einem 2-D - Umgebung schnell die Expression von Genen kritisch für Thymopoese 3,4 verringern.
EAK16-II (AEAEKAKAEAEAKAK) und dessen C-terminale histidinylated analogen EAKIIH6 (AEAEKAKAEAEAKAKHHHHHH) sind niedermolekulare, amphiphile Oligopeptide, die in deionisiertem gegen Ende der löslichenr, sondern gehen Gelieren β-Fibrillen zu bilden, wenn sie Ionenstärke von mehr als 20 mM NaCl (normale Salzkonzentration in der menschlichen Körperflüssigkeit beträgt 154 mM) ausgesetzt. Diese Umwelt reagierende Eigenschaft macht sie vielseitige Bausteine 3D-Strukturen zu bilden. Das His-Tag auf EAKII-H6 ein Andockmechanismus, durch welche die anti-His IgGs / Fc-bindenden rekombinantes Protein A / G (αH6: pA / G) -Komplexen als Adapter dienen können Proteinwirkstoffen und anderen Biomolekülen zu verankern ( zB Antikörper) auf dem Hydrogelverbundstoff 5-8.
Wir haben zuvor gezeigt , daß 9 bis zu 13 Tage an der Injektionsstelle fluoreszenzmarkierte IgG - Moleküle auf dem Hydrogel verankert können beibehalten werden. Wenn ferner die αH6: pA / G Adapter verankert mit anti-CD4 IgGs an das Hydrogel EAK16-II / EAKIIH6 (EAK) hinzugefügt wurden, wurden CD4 + T - Zellen spezifisch 10 eingefangen. Unter Verwendung ähnlicher Technik haben wir vor kurzem gezeigt, dass 3-D-Aggregation von TECs c(: PA / G: αEpCAM αH6) Ould mit Adapter Komplexe tragen TEC-spezifische anti-EpCAM-Antikörper in EAK Hydrogel gefördert werden. Wenn unterhalb der Nierenkapseln von nackten Mäusen transplantiert, können die TEC - Cluster in EAK Hydrogel eingebettet effektiv die Entwicklung von funktionellen T - Zellen in vivo 11,12 unterstützen.
Hier veranschaulichen wir unser Verfahren, um schnell und effektiv reinigen TECs mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) und Erzeugen 3-D TEC Aggregate mit dem EAK Hydrogelsystem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle Tiere in den Experimenten verwendet wurden in der Tierhaltung bei Allegheny-Singer Research Institute im Rahmen des Protokolls überprüft und genehmigt von der Institutional Animal Care und Use Committee des Allegheny Health Network / Allegheny Singer Research Institute untergebracht.
1. Verdauen des Thymus mit Kollagenase
- Ernte Thymusdrüse.
- Euthanize 3-5 Wochen alte C57BL6 / J - Mäusen in einem Kohlendioxid (CO 2) Kammer Thymusdrüse zu ernten. Im Einzelnen stellen die Mäuse in der Kammer unter CO 2 Induktion für 3-5 min und Tod bestätigen durch Herz- oder Atemstillstand zu überprüfen.
- Legen Sie die Karkasse auf den Rücken und nass, den Körper mit 70% Ethanol. Machen Sie einen kleinen horizontalen Schnitt mit einem scharfen, geraden Präparierscheren auf seinem Bauch durch die Haut. Ziehen Sie die Haut an beiden Enden (Kopf und Beine), so dass es von innen nach außen gedreht wird.
- Machen Sie einen horizontalen Schnitt mit den Dissektionsscheren knappdie niedrigste Rippe und seitlich durch die Membran geschnitten. Halten Sie die Xiphoidbasis mit einer Pinzette und schneiden Sie die Mitte der Rippen auf beiden Seiten ausgehend nach oben. Ziehen Sie die Rippen / Brustbein nach oben, so dass der Thymus deutlich sichtbar ist.
Hinweis: Thymus direkt auf der Oberseite des Herzens liegt, besteht aus zwei Lappen und einer weißen durchscheinenden Farbe. - Unter Verwendung einer gebogenen Pinzette vorsichtig schöpfen und die Thymus Lappen weg von dem Bindegewebe und den Transfer in Waschlösung ziehen (siehe Materialliste).
- Vorbereitung Aufschlußlösung durch Mischen von 9 ml RPMI-1640 (Rpmi-1640), 0,025 mg / ml gereinigter Kollagenase, 10 mM HEPES [4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure] und 0,2 mg / ml DNase I in einem 50 ml Zentrifugenröhrchen. Halten Sie die Aufschlusslösung in 37 ° C warmen Wasserbad bis zur Verwendung.
Anmerkung: Die Menge der Aufschlußlösung ausreichend vorbereitet ist für bis zu fünf erwachsenen Maus Thymi, die zusammen Polystyrol rund- in einem 5 ml inkubiert werden können,Unterrohr. - Übertragen Sie die Thymusdrüse zu einer 60 mm-Gewebekulturschale mit 5-6 ml RPMI-1640.
- Präparieren Sie die Thymusdrüse mit 28 G Insulinspritze Nadel in kleine Stücke (ca. 1 mm 3 Quadrat) die Lymphozyten zu lassen abfließen.
- Spülen Sie die Thymus-Stücke mit RPMI-1640, das mit Glas Pasteur Pipette in der Petrischale ist. Kippen Sie die Schüssel und lassen Sie die Thymus-Fragmente am Boden absetzen. Langsam ansaugen und das RPMI-1640-Überstandes mit einer Glaspipette zu verwerfen. Wiederholen Sie diesen Spülschritt mit 5-6 ml RPMI-1640 für 4-5 mal mit Glaspipette, bis die Lösung weniger undurchsichtig ist.
Hinweis: Glaspipetten werden bei diesem Schritt zu empfehlen, da Thymus-Fragmente zu Kunststoff Verkleben neigen, was zu einem übermäßigen Verlust von Thymus-Gewebe. Für den Rest des Verfahrens, verwenden Sie Plastikpipetten. - Nach dem letzten Spülgang, den Überstand verwerfen, wie in Schritt 1.5 beschrieben. 3 ml Aufschlusslösung und übertragen Sie die Thymusdrüse Stücke und die Lösung in einen 5 ml Rundboden-polystyrene Rohr.
- Das Röhrchen wird auf einem Rohr Rotator und inkubieren bei 37 ° C für 6 min bei einer Rotationsgeschwindigkeit von 12 Umdrehungen pro Minute.
- Nach der Inkubation ließ die Thymus-Fragmente auf den Boden des Rohres durch die Schwerkraft absetzen. Sammeln Sie den Überstand mit Pasteur-Pipette und Überführung in eine 50 ml-Zentrifugenröhrchen mit 10 ml Waschlösung. Zentrifuge bei 300 g für 5 min den Überstand verwerfen und Resuspendieren der Zellen in 10 ml Waschlösung. Halten Sie sich auf dem Eis.
- Wiederholen Sie die Schritte 1,6-1,8 zweimal auf den Thymus-Fragmente in den 5 ml Rundboden-Polystyrolröhrchen. Pool den Überstand in der gleichen 50-ml-Tube.
Anmerkung: Die Zentrifugation nicht notwendig, für die zweite und die dritte Waschung. - Nach der endgültigen Verdauung, pipettieren nach oben und unten mit 2 ml Kunststoff serologischen Pipette auf die Zentrifugenröhrchen 50 ml alle verbleibenden Fragmente in der Röhre und den Transfer zu brechen.
- Zentrifuge das 50 ml-Röhrchen bei 300 xg für 5 min, Überstand absaugen, Resuspendieren in 10 ml Wasch buffer und filtriert durch 100 & mgr; m Zellsieb. Halten Sie sich auf dem Eis.
2. Anreicherung von TECs mit unstetigen Dichtegradienten
- Vorbereitung 21% Dichtegradient-Lösung von 2,4 ml Dichtegradientenmedium Mischen (60% w / v von Iodixanol in Wasser) und 9,6 ml Waschlösung.
- Zentrifugieren Sie die dissoziierten Thymus-Zellen in der 50 ml Sammelröhrchen aus Schritt 1.11 bei 300 g für 5 min und Resuspendieren in 2,5 ml Waschpuffer.
- 20 ml RPMI-1640-Medium zu der Zellsuspension.
- Füllen 12 ml 21% Dichtegradient-Lösung in einem 10 ml serologische Pipette mit einer elektronischen Pipettiervorrichtung. Die Spitze der serologischen Pipette am Boden der 50-ml-Zentrifugenröhrchen, das Zellen und ermöglichen der Dichtegradient-Lösung auf den Boden des Rohres durch Schwerkraft zu entleeren.
- Sanft auszustoßen, die zwei Schichten unterschiedlicher Dichte zu beenden die Dichtegradientenlösung aus der Pipette zu erzeugen.
- Zentrifuge bei 600 xg for 20 min bei RT in einem Schwenkbecherrotor. Stellen Sie die Verzögerungsrate am langsamsten Niveau.
- Übertragen Sie die obere Schicht und die Schnittstelle zu einem neuen 50-ml-Tube.
Hinweis: Die meisten der TECs sind in der Schnittstelle beibehalten. Lymphozyten werden dem Boden des Röhrchens nach der Zentrifugation auszufällen. Wenn diese Zellen für andere Zwecke verwendet werden sollen, spült das Pellet mit 20 ml Waschlösung dreimal. Resuspendieren der Zellen in 10 ml Waschpuffer. - Hinzufügen Waschlösung in das Röhrchen zu 40 ml bis in Schritt 2.6 und Zentrifuge bei 400 × g für 6 Minuten bei 4 ° C. Zu dem Überstand absaugen mit einer Pipette entfernen.
- Wiederholen Sie das Waschen und die Streben 2 weitere Male, wie in Schritt 2.7 beschrieben.
- Resuspension in 2 ml Waschlösung und der Zellen mit einem Hämozytometer zählen.
3. Isolierkanne TECs mit FACS
- Einstellen Zellen aus Schritt 2.9 in der Konzentration von 1x10 6 Zellen / 100 & mgr; l mit Waschlösung und Transferdie Zellen in einem 5 ml-Rundbodenrohr (Polypropylen oder Polystyrol, wie durch die Anweisungen des Flusssortierer empfohlen).
- Fügen Sie 2 & mgr; l anti-Fc - Rezeptor - IgG pro 1x10 6 Zellen und Inkubieren bei 4 ° C für 10 min.
- Hinzufügen anti-CD45 (1: 150 Verdünnung, 10 ul pro Probe) und anti-EpCAM (1: 100-Verdünnung, 10 ul pro Probe) Antikörper und Inkubieren bei 4 ° C für mehr als 20 min.
- Waschen der Zellen mit 2 ml Waschlösung und Zentrifugation bei 400 × g für 6 Minuten bei 4 ° C. Saugen Sie den Überstand mit einer Pipette.
- Resuspendieren der Zellen in 1 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
- Man filtriert durch 100 & mgr; m Sieb.
- Anwenden, um die Zellen auf die Sortieranlage. Wählen Sie die Lymphozyten und TEC Bevölkerung mit Ausnahme der kleinsten Zellen auf Seitenstreulicht (SSC) / Vorwärtsstreulicht (FSC) Platte (tote Zellen), dann Tor auf der ausgewählten Population für CD45- EpCAM + 13 Sortierung.
4. Generation von TEC / EAK Aggregates
Hinweis: Führen Sie Reagenzzubereitung und Schritten Zelle unter der laminaren Haube zu mischen.
- Bereiten pA / G Adaptor-Komplexe durch Mischen von 4 & mgr; l anti-His-Tag-IgG, 8 & mgr; l anti-EpCAM IgG und 2,6 ul pA / G in ein steriles 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, und Inkubation für 5 min bei RT.
- Passen Sie die sortiert TECs aus Schritt 3,7 bis 5x10 4 Zellen / ml mit Waschlösung, und pipettieren 100 & mgr; l zu einer Vertiefung einer niedrigen Verdampfungs, 96-Well - Rundboden - Gewebekulturplatte. Hinzufügen 14,6 ul pA / G Adaptor-Komplexe zu den Zellen. Legen Sie die Platte auf einer Schwingplattform für 20 min bei 4 ° C.
- Waschen Sie einmal mit 200 & mgr; l Waschlösung. Zentrifugieren Sie die Platte bei 400 × g für 6 min. Entsorgen Sie den Überstand mit einer Mikropipette.
- Wasche einmal mit 200 ul 10% igen Saccharoselösung. Zentrifuge bei 400 × g für 6 min. Entsorgen Sie den Überstand mit einer Mikropipette.
- Resuspendiere Zellen in 30 & mgr; l 10% sterile Saccharoselösung pro Vertiefung.
- Fügen Sie 10 & mgr; l EAKIIH6 (7,5 mg / ml) und Inkubation für 5 min bei RT.
- Geben Sie 20 & mgr; l EAK16-II (10 mg / ml) zu der Mischung TEC.
- Füge 100 & mgr; l vollständigem Medium in das System Gelbildung einzuleiten. Legen Sie die Platte auf einem Plattformschüttler für 15-20 min bei RT.
- Die Platte wird in den Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2. Nach 2-4 Stunden, fügen Sie weitere 100 & mgr; l Vollmedium.
- Ändern Medium jeden zweiten Tag bis zum Gebrauch.
- Absaugen 100 ul des Mediums von der Oberfläche, ohne das Gel zu stören mit einer Mikropipette und fügen Sie vorsichtig 100 ul vorgewärmte Medium durch die Pipettenspitze an der Wand des Bohrlochs platzieren.
5. Charakterisierung der TEC / EAK Aggregates
- Um die Funktion der TEC / EAK - Aggregate in vivo zu untersuchen, sammeln die TEC / EAK - Hydrogel nach O / N - Kultur und Transplantation unter die Nierenkapsel einer athymischen NacktMaus unter Verwendung von zuvor Prozedur 11,14 beschrieben.
- Überwachen Sie die Entwicklung von T-Zellen in der Peripherie durch Ernten 50-100 ul Blutproben in EDTA-enthaltenden Blutentnahmeröhrchen aus dem nackten Mäusen 4-6 Wochen nach der Transplantation und Flecken mit einem Cocktail aus anti-CD4, -CD8, -CD45 und -CD3 Antikörper 12.
- Analysieren die Prozentsätze von T-Lymphozyten in den peripheren Blutleukozyten mit Durchflusszytometrie (FCM), unter Verwendung von Einzelzellanalyse - Software 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Um die Wirksamkeit der Verwendung der Dichtegradiententrennung Protokoll untersuchen die CD45- Stromazellen zu bereichern, geerntete Zellen, sowohl von der Oberfläche und den ausgefällten Lymphozyten Pellets wurden mit anti-CD45 und anti-EpCAM-Antikörper. Sowohl anti-Ulex Europaeus Agglutinin 1 (UEA1) und Anti-MHC-Klasse II-Antikörper wurden auch in der Färbungs Cocktail aufgenommen, um die cTEC und mTEC Untergruppen identifizieren. Wie in Abbildung 1 gezeigt, konnten wir routinemäßig nahe der TECs zu 15-20 mal Anreicherung zu erreichen.
Um die Aggregation der TECs im EAK Hydrogel zu untersuchen, wurden TECs isoliert von 4 Wochen alten B6.ROSA mT / mG Mäuse, die ubiquitär die membrangebundenen, rot fluoreszierende tdTomato Moleküle exprimieren. TEC - Aggregate, hergestellt wie oben beschrieben, wurden für zwei Tage in vitro untersucht und unter einem konfokalen Mikroskop ( 
Abbildung 1. Die durchflusszytometrische Analyse von TECs mit der Dichtegradient - Lösung angereichert. Die Zellen wurden mit anti-CD45 und anti-EpCAM - Antikörper gegen TEC Bevölkerung (CD45- EpCAM +) unterscheiden. Linke Platten: Thymus-Zellen nach Enzym die Verdauung, vor dem Dichtegradienten Verfahren. Mittelplatten: Zellen in der oberen Schicht und die Grenzfläche nach der Trennung mit der Dichtegradient-Lösung. Rechts Platten. Pelletierten Zellen (Lymphozyten - Pellet) nach der Trennung mit der Dichtegradientenlösung Bitte klicken Sie hier eine größere Version dieser Figur zu sehen. 
Figur 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Während TECs die vorherrschende Bevölkerung der Thymus-Stroma und spielen eine entscheidende Rolle für die Struktur und Funktion der Thymusdrüse sind, repräsentieren sie nur etwa 0,1-0,5% des gesamten Thymus Zellularität. Sie sind auch zerbrechlich Zellen als hohe Anteile an Zelltod werden gelegentlich folgenden Kollagenaseverdau beobachtet, dh die Behandlung TECs aus der extrazellulären Matrix (ECM) zu dissoziieren. Ihre Seltenheit (~ 200.000 pro Maus Thymus) und Zerbrechlichkeit machte es eine anspruchsvolle Aufgabe TECs zu isolieren. Die jüngste Verwendung von hochgereinigten Kollagenase in TEC Isolation haben deutlich zugenommen , die Zahl der lebenden Zellen nach der enzymatischen Aufschluss 15-19.
Allerdings bleibt die sehr geringe Anzahl von TECs eine große Herausforderung für ihre Analyse und Isolation, da große Mengen von Antikörpern erforderlich sind für die Zelloberflächenmarkierung und eine übermäßige Anzahl von Ereignissen müssen durch FACS gesammelt werden. Während Antikörper-Konjugatd magnetischen Bead-Technologie verwendet werden kann, CD45 + Thymozyten, ihre großen Menge macht es ökonomisch untragbar auf lange Sicht zu verarmen. Wir waren in der Lage, effektiv TECs 15-20 mal mit einem einfachen, einen Schritt Dichtegradientenzentrifugation bereichern. Die iso-osmotische Eigenschaft des Dichtegradientenmedium Iodixanol ermöglicht die Trennung von Zellen basierend auf ihren verschiedenen Formen, Größen und Dichten 20-22. Es sei darauf hingewiesen, daß die Reinheit und Ausbeute der TECs durch den Prozentsatz des Dichtegradienten-Medium verwendet, betroffen sind. Geringeren Prozentsatz des Dichtegradienten-Medium (18-20% v / v) wird in der Grenzfläche in höherer Reinheit von TECs führen aber geringere Ausbeute. Wenn im Gegensatz dazu höher Iodixanol Konzentration (22% v / v) verwendet wird, größere Menge an Thymus-Zellen können mit geringeren Anteil an TECs gesammelt werden. Die Konzentration von Iodixanol sollte basierend auf dem Ziel des Experiments eingestellt werden. Während die Reinheit von TECs weitgehend mit dem Nutzen der Dichtegradient-Lösung verbessert wird, es should betont werden , dass die von der obersten Schicht gesammelten Zellen und der Schnittstelle noch einen relativ hohen Anteil an CD45 + Zellen (1) enthalten. Daher kann, wenn nur der TEC Bevölkerung in diesem Experiment erforderlich ist, wird Zellsortierung von entscheidender Bedeutung sein, obwohl dies zusätzliche Verfahren einen gewissen Verlust von Zellen führen können und mehr Zeit erfordert.
Anders als die meisten der epithelialen in einer einzigen oder mehreren Schichten angeordnet sind Zellen, die die inneren Organe auskleiden, sind TECs organisiert in 3-D-Konfiguration im Thymus-Stroma, die für ihr Überleben und ihre Funktion wesentlich ist. Die selbstorganisierende EAK Hydrogelsystem erleichtert die Bildung von 3-D TEC Aggregate, die durch den trimolekularen αH6 vermittelt werden: pA / G: αEpCAM Adaptor-Komplexe. Zu beachten ist, durch eine Feinabstimmung der Konzentrationen und Verhältnisse der EAK16-II / EAKIIH6 Oligopeptide, können die Porosität und die Dichte des Hydrogels eingestellt werden, um den Fluss von Nährstoffen und die Migration von Thymozyten zu ermöglichen. Tatsächlich functional T-Zellen wurden in athymische Nacktmäuse transplantiert erzeugt mit den TEC / EAK Composites.
Der Nachteil in diesem EAK Hydrogel Systems ist, dass mit diesem aktuellen Protokoll spezifische Zellzusammensetzung kann nicht in einem bestimmten Bereich lokalisiert werden. In einer physischen Umgebung ist ein Thymus aus zwei getrennten Kammern besteht, in denen bestimmte Arten von TECs wohnen, CTEC in der Hirnrinde und mTEZ in Medulla. Mit unserem System hier beschrieben, die beide CTEC und mTEZ mit EpCAM, einem allgemeinen epithelialen Marker markiert. Daher wird spekuliert, dass die Aggregate in dem gebildeten Hydrogel beide Subtypen des TECs umfasst. Obwohl CTEC und mTEZ von gemeinsamen bipotent TEC Vorläufern stammen, sind ihre Rollen in der Entwicklung von T-Zellen deutlich ausgeprägt. Cortex ist die erste Region im Thymus , wo die unreifen Thymus - Vorläuferzellen eindringen und die positive Selektion erfolgt 23. Dann bewegen sich die ausgewählten Zellen in den Mark Region und die Interaktion mit mTEZ, durch which die selbstreaktiven Zellen durch negative Selektion 24 eliminiert. Außerdem wurde gezeigt , dass 25% der Gene werden differentiell zwischen CTEC und mTEZ 25 ausgedrückt. Diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung Aggregation von TEC Untergruppen der Förderung der Wirksamkeit von T-Zell-Entwicklung zu erhöhen. Ein möglicher Ansatz ist, verschiedene Antikörper verwenden Targeting Oberflächenmoleküle spezifisch für entweder CTEC oder mTEZ, wie Anti-Cytokeratin-8 für CTEC und anti-Cytokeratin 5 für mTEZ.
Aus der Perspektive der zukünftigen klinischen Anwendung könnten die TEC-Cluster in dem biologisch abbaubaren Hydrogel eingebettet funktionieren als injizierbare "Mini-Thymus-Einheiten", um das adaptive Immunsystem modulieren, die für verschiedene medizinische Bedingungen, wie Verjüngung des adaptiven Immunsystems bei älteren Menschen wichtig sein könnte oder Induktion spenderspezifischen Toleranz im Bereich der Organtransplantation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde zum Teil durch die National Institutes of Health gewährt R21 AI113000 (WSM) und R01 AI123392 (YF) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TEC Isolation | |||
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2701(1 Gallon) | Ethanol 200 Proof, deionized water |
| Dissecting scissors, straight | Fine Science Tools, Inc. | 91460-11 | |
| Graefe forceps, straight | Fine Science Tools, Inc. | 11053-10 | |
| Graefe forceps, curved | Fine Science Tools, Inc. | 11052-10 | |
| Washing solution | 1x PBS, 0.1% BSA, 2 mM EDTA | ||
| 1x PBS (Phosphate buffered saline) | Gibco | 10010-023 | |
| BSA (Bovine serum albumin) | Sigma | A1470-100G | |
| EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | Invitrogen | 15575-038 | |
| Digestion solution | 9 ml RPMI-1640, 0.025 mg/ml Liberase TM Research grade, 10 mM HEPES, 0.2 mg/ml DNaseI | ||
| RPMI-1640 | Gibco | 11879-020 | |
| Liberase TM Research Grade | Roche | 05 401 127 001 | referred as "purified collagenase" |
| 1 M HEPES | Lonza | 17-737E | |
| Dnase I | Roche | 10 104 159 001 | |
| 50 ml Centrifuge tube | Corning | 430290 | |
| 60 mm tissue culture dish | Falcon | 353002 | |
| 1/2 cc U-100 Insulin syringe 28 1/2 G | Becton Dickinson | 329461 | |
| 5 ml Polystyrene round-bottom tube | Falcon | 352058 | |
| 5 ml glass pipet | Fisher Healthcare | 13-678-27E | Use for rinsing the thymic fragments. Thymic fragments tend to stick to the wall with plastic pipets. |
| MACSmix tube rotator | Miltenyi | 130-090-753 | |
| 100 µm Cell strainer | Falcon | 352360 | |
| Density gradient medium: OptiPrep | Axis-Shield | ||
| Cell Sorting | |||
| 5 ml Polypropylene round-bottom tube | Falcon | 352063 | |
| Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | Use as undiluted, 2 µl per sample |
| Anti-mouse CD45-PercpCy5.5 | eBioscience | 45-0451-80 | Use at 1:150, 10 µl per sample |
| Anti-mouse CD326 (EpCAM)-PE | eBioscience | 12-5791-82 | Use at 1:100, 10 µl per sample |
| BD Influx | BD Biosciences | ||
| Single cell analysis software | FlowJo | ||
| EAK Gel Assembly | |||
| Anti-His-Tag | AnaSpec | 29673 | "anti-His-Tag IgG" |
| Purified anti-mouse CD326 (EpCAM) | BioLegend | 118202 | "anti-EpCAM IgG" |
| Recombinant protein A/G | Pierce Biotechnology | ||
| 1.5 ml Safe-Lock Tubes, Biopur, Sterile | Fisher Healthcare | 05-402-24B | referred as "1.5 ml microcentrifuge tube" |
| 96-well, Tissue culture plate, Round-bottom with low evaporation lid | BD Falcon | 353917 | |
| Rocking platform: Nutator Mixer no.1105 | BD Clay Adams | ||
| 10% sucrose | Sigma | S0389 | Prepare with sterile distilled water |
| EAK16-II (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAK-CONH2) | American Peptide Company | custom synthesized, 10 mg/ml | |
| EAKIIH6 (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAKHHHHHH-CONH2) | American Peptide Company | custom synthesized, 7.5 mg/ml | |
| Complete medium | RPMI-1640, 10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% L-glutamine, 1% NEAA, 5 mM HEPES, 50 µM 2-Mercaptoethanol | ||
| RPMI-1640 | Gibco | 11879-020 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Atlanta Biologicals | S11150 | Heat inactivated before use |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| NEAA (non-essential amino acid) 100x | Gibco | 11140-050 | |
| 1 M HEPES | BioWhittaker | 17-737E | |
| 2-Mercaptoethanol (100x) | Millipore | ES-007-E | |
| Platform shaker: The Belly Dancer | Stovall Life Sciences Inc. | model: USBDbo |
References
- Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus. Nature. 362, 70-73 (1993).
- Fan, Y., et al. Thymus-specific deletion of insulin induces autoimmune diabetes. The EMBO J. 28, 2812-2824 (2009).
- Mohtashami, M., Zuniga-Pflucker, J. C. Three-dimensional architecture of the thymus is required to maintain delta-like expression necessary for inducing T cell development. J Immunol. 176, 730-734 (2006).
- Pinto, S., et al. An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression. J Immunol. 190, 1085-1093 (2013).
- Fung, S. Y., Yang, H., Chen, P. Formation of colloidal suspension of hydrophobic compounds with an amphiphilic self-assembling peptide. Colloids Surf B Biointerfaces. 55, 200-211 (2007).
- Jun, S., et al. Self-assembly of the ionic peptide EAK16: the effect of charge distributions on self-assembly. Biophys J. 87, 1249-1259 (2004).
- Saunders, M. J., et al. Engineering fluorogen activating proteins into self-assembling materials. Bioconjug Chem. 24, 803-810 (2013).
- Zhang, S., Holmes, T., Lockshin, C., Rich, A. Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane. Proc of the Natl Acad Sci U S A. 90, 3334-3338 (1993).
- Wen, Y., et al. Coassembly of amphiphilic peptide EAK16-II with histidinylated analogues and implications for functionalization of beta-sheet fibrils in vivo. Biomaterials. 35, 5196-5205 (2014).
- Zheng, Y., et al. A peptide-based material platform for displaying antibodies to engage T cells. Biomaterials. 32, 249-257 (2011).
- Tajima, A., et al. Bioengineering mini functional thymic units with EAK16-II/EAKIIH6 self-assembling hydrogel. Clin Immunol. 160, 82-89 (2015).
- Fan, Y., et al. Bioengineering Thymus Organoids to Restore Thymic Function and Induce Donor-Specific Immune Tolerance to Allografts. Mol Ther. 23, 1262-1277 (2015).
- Fan, Y., et al. Thymus-specific deletion of insulin induces autoimmune diabetes. The EMBO J. 28, 2812-2824 (2009).
- Fan, Y., et al. Compromised central tolerance of ICA69 induces multiple organ autoimmunity. J Autoimmun. 53, 10-25 (2014).
- Palumbo, M. O., Levi, D., Chentoufi, A. A., Polychronakos, C. Isolation and characterization of proinsulin-producing medullary thymic epithelial cell clones. Diabetes. 55, 2595-2601 (2006).
- Williams, K. M., et al. Single cell analysis of complex thymus stromal cell populations: rapid thymic epithelia preparation characterizes radiation injury. Clin Transl Sci. 2, 279-285 (2009).
- McLelland, B. T., Gravano, D., Castillo, J., Montoy, S., Manilay, J. O. Enhanced isolation of adult thymic epithelial cell subsets for multiparameter flow cytometry and gene expression analysis. J Immunol Methods. 367, 85-94 (2011).
- Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. J Immunol methods. 385, 23-34 (2012).
- Xing, Y., Hogquist, K. A. Isolation, identification, and purification of murine thymic epithelial cells. J Vis Exp. , e51780 (2014).
- Graham, J. M. Separation of monocytes from whole human blood. ScientificWorldJournal. 2, 1540-1543 (2002).
- Li, X., Donowitz, M. Fractionation of subcellular membrane vesicles of epithelial and nonepithelial cells by OptiPrep density gradient ultracentrifugation. Methods Mol Biol. 440, 97-110 (2008).
- Mita, A., et al. Purification method using iodixanol (OptiPrep)-based density gradient significantly reduces cytokine chemokine production from human islet preparations, leading to prolonged beta-cell survival during pretransplantation culture. Transplant Proc. 41, 314-315 (2009).
- Anderson, G., Takahama, Y. Thymic epithelial cells: working class heroes for T cell development and repertoire selection. Trends Immunol. 33, 256-263 (2012).
- Kyewski, B., Klein, L. A central role for central tolerance. Annu Rev Immunol. 24, 571-606 (2006).
- St-Pierre, C., et al. Transcriptome sequencing of neonatal thymic epithelial cells. Sci Rep. 3, 1860 (2013).
