Introduction
Thymus er den primære lymfoide organ er ansvarlig for dannelsen af en forskelligartet population af patogen-reaktive, selv-tolerant T-celler, der er afgørende for funktionen af det erhvervede immunsystem. Det er et dynamisk organ, hvor udviklingslandene thymocyter, emigrerede fra knoglemarven som lymfocyt progenitorceller, migrerer gennem det svampelignende tredimensional (3-D) matrix thymiske stroma, undergår slægt-specifikation og differentiering, og til sidst emigrere som modne T-celler. Succesen med dette godt programmeret proces afhænger i høj grad af krydstale mellem de vandrende thymocytter og bolig thymiske epitelceller (TECs), den fremherskende befolkning i thymus stroma, der er afgørende for at skabe og opretholde integriteten af thymus mikromiljø.
Baseret på deres anatomiske placering og unik funktion, kan TEC opdeles i to undergrupper: TECerne med cortex (cTECs), som er Responligt for udvælgelse selv-MHC (major histocompatibility complex) begrænsede T-celler (positiv selektion) og de TECs i medulla (mTECs), der er væsentlige for at eliminere autoreaktive T-celler (negativ selektion) 1,2. Mange faktorer (f.eks aldring, infektion, bestråling, narkotika behandlinger) kan forårsage uoprettelige skader på thymusepitel, hvilket resulterer i kompromitteret adaptiv immunitet. Trods talrige forsøg, genoprette brisselfunktion har været en udfordring på grund af vanskeligheden ved at gengive den thymiske mikromiljø. Især thymisk tredimensionale (3-D) -konfiguration er kritisk for overlevelse og funktion af TECs, hvorimod TECs dyrket i en 2-D miljø hurtigt formindske ekspressionen af gener kritiske for thymopoiesis 3,4.
EAK16-II (AEAEKAKAEAEAKAK) og dens C-terminale histidinylated analog EAKIIH6 (AEAEKAKAEAEAKAKHHHHHH) er lav-molekylvægt, amfifile oligopeptider, som er opløselige i deioniseret water, men undergår gelering til dannelse p-fibriller når de udsættes for ionstyrke højere end 20 mM NaCl (koncentration normal salt i human kropsvæske er 154 mM). Dette miljø lydhør egenskab gør dem alsidige byggesten til at danne 3D-strukturer. His-tag på EAKII-H6 tilvejebringer en docking mekanisme, hvorved anti-His IgG'er / Fc-binding rekombinant protein A / G (αH6: pA / G) komplekser kan tjene som en adapter til at forankre proteinlægemidler og andre biomolekyler ( fx, antistoffer) på hydrogel sammensatte 5-8.
Vi har tidligere vist, at fluorescensmærkede IgG-molekyler forankret på hydrogelen kan tilbageholdes ved injektionsstedet i op til 13 dage 9. Endvidere, når de αH6: pA / G-adaptere forankret med anti-CD4 IgG'er blev tilsat til EAK16-II / EAKIIH6 (EAK) hydrogel, CD4 + -T-celler blev specifikt fanget 10. Anvendelse af en lignende teknik, har vi for nylig vist, at 3-D aggregering af TECs cOuld fremmes i EAK hydrogel med adapter komplekser bærer TEC-specifikke anti-EpCAM antistoffer (αH6: PA / G: αEpCAM). Når transplanteret nedenunder nyre kapsler af nøgne mus, kan de TEC klynger indlejret i EAK hydrogel effektivt at støtte udviklingen af funktionelle T-celler in vivo 11,12.
Her illustrerer vi vores metode til hurtigt og effektivt at oprense TECs med fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) og generere 3-D TEC aggregater med EAK hydrogel system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr, der anvendes i forsøgene blev opstaldet i dyret facilitet på Allegheny-Singer Research Institute i henhold til protokollen og godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg for Allegheny Health Network / Allegheny Singer Research Institute.
1. fordøje Thymus med Collagenase
- Harvest halskirtel.
- Afliv 3-5 uger gamle C57BL6 / J mus i en kuldioxid (CO 2) kammer til at høste halskirtel. I detaljer, placere musene i kammeret under CO 2 induktion i 3-5 min og bekræft død ved at kontrollere hjerte- eller respirationsstop.
- Lægge slagtekroppen på ryggen og våd kroppen med 70% ethanol. Lav en lille vandret snit med en skarp, lige Dissecting saks på sin mave gennem huden. Trække huden på begge ender (hoved og ben), så den vendes med indersiden udad.
- Lav en vandret snit med de dissekere saks lige underden laveste ribben og skære gennem membranen sidelæns. Hold xiphoid proces med en pincet og skæres midt ribberne skrider op på begge sider. Træk ribben / brystben så thymus er klart synlig.
Bemærk: Thymus ligger direkte oven på hjertet, består af 2 kamre og er af en hvid gennemskinnelig farve. - Ved hjælp af en buet pincet, forsigtigt scoop og træk brissel lapper ud af bindevæv og overførsel i vask opløsning (se liste over materialer).
- Forbered fordøjelsen opløsning ved at blande 9 ml RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute medium-1640), 0,025 mg / ml renset collagenase, 10 mM HEPES [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsyre] og 0,2 mg / ml DNase i i en 50 ml centrifugerør. Holde fordøjelsen opløsning i 37 ° C vandbad indtil anvendelse.
Bemærk: Mængden af fordøjelsen klargjort er tilstrækkelig til op til fem voksne mus Thymi, som kan inkuberes sammen i en 5 ml polystyren rund-nederste rør. - Overfør thymus til en 60 mm vævskulturskål indeholdende 5-6 ml RPMI-1640.
- Dissekere thymus med 28 g insulin sprøjtenål i små stykker (ca. 1 mm 3 firkant) at lade lymfocytterne flyde ud.
- Skyl de thymiske stykker med RPMI-1640, der er i petriskålen med glas Pasteur-pipette. Vip fadet og lad thymiske fragmenter afregne til bunden. aspirere Langsomt og kassér RPMI-1640 supernatant ved hjælp af et glas pipette. Gentag dette skylletrin med 5-6 ml RPMI-1640 til 4-5 gange med glaspipette indtil opløsningen er mindre uigennemsigtig.
Bemærk: Glas pipetter anbefales på dette trin, eftersom thymiske fragmenter tendens til at holde sig til plast, hvilket resulterer i alt for stort tab af thymus væv. For resten af proceduren, bruge plastik pipetter. - Efter den sidste skylning, supernatanten som beskrevet i trin 1.5. Tilsæt 3 ml fordøjelse opløsning og overføre thymus stykker og opløsningen i en 5 ml rundbundet polystyrene rør.
- Glasset anbringes på et rør rotator og inkuberes ved 37 ° C i 6 minutter ved en rotationshastighed på 12 rpm.
- Efter inkubation lade thymiske fragmenter sedimentere til bunden af røret ved hjælp af tyngdekraften. Opsaml supernatanten med Pasteur-pipette og overføres til et 50 ml centrifugerør med 10 ml vaskeopløsning. Centrifuger ved 300 xg i 5 min, supernatanten og udeluk cellerne i 10 ml vask løsning. Hold på is.
- Gentage trin 1,6-1,8 to gange på de thymiske fragmenter i de 5 ml rundbundet polystyrenrør. Pool supernatanten i samme 50 ml rør.
Bemærk: Centrifugering er ikke nødvendigt for den anden og den tredje vask. - Efter den sidste fordøjelse, pipetteres op og ned med 2 ml plast serologisk pipette for at nedbryde eventuelle resterende fragmenter i røret og overførsel til 50 ml centrifugerør.
- Centrifuger 50 ml rør ved 300 xg i 5 min, aspireres supernatanten, resuspender i 10 ml vask buffer og filter gennem 100 um celle si. Hold på is.
2. Berigelse af TEC med Diskontinuerlig Density Gradient
- Forbered 21% densitetsgradient opløsning ved at blande 2,4 ml densitetsgradient medium (60% vægt / volumen af iodixanol i vand) og 9,6 ml vaskeopløsning.
- Centrifuger dissocierede thymiske celler i 50 ml opsamlingsrør fra trin 1.11 ved 300 xg i 5 min og resuspenderes i 2,5 ml vaskebuffer.
- Der tilsættes 20 ml RPMI-1640-medium til cellesuspensionen.
- Fyld 12 ml 21% densitetsgradient opløsning i en 10 ml serologisk pipette med en elektronisk pipette. Placér spidsen af den serologiske pipette i bunden af de 50 ml centrifugerør indeholdende celler, og lad densitetsgradient opløsningen går til bunden af røret via tyngdekraften.
- Forsigtigt udvise densitetsgradient løsning fra pipetten til slut resulterer i de to lag af forskellige densiteter.
- Centrifugeres ved 600 xg for 20 minutter ved stuetemperatur i en svingende spand-rotor. Indstil deceleration hastighed den langsomste niveau.
- Overfør det øverste lag og grænsefladen til et nyt 50 ml rør.
Bemærk: De fleste af TECs bevares i grænsefladen. Lymfocytter vil fælde til bunden af røret efter centrifugering. Hvis disse celler skal anvendes til andre formål, skylles pelleten med 20 ml vaskeopløsning til tre gange. Resuspender cellerne i 10 ml vaskebuffer. - Tilføj vaskeopløsning til 40 ml til røret i trin 2.6 og der centrifugeres ved 400 xg i 6 min ved 4 ° C. For at fjerne supernatanten, aspirat med en pipette.
- Bundfaldet vaskes og aspiration 2 flere gange som beskrevet i trin 2.7.
- Resuspender i 2 ml vaskeopløsning og tælle cellerne med et hæmocytometer.
3. isolerende TEC med FACS
- Juster celler fra trin 2.9 i en koncentration på 1x10 6 celler / 100 pi med vaskeopløsning og overførselcellerne til en 5 ml rundbundet rør (polypropylen eller polystyren, som anbefalet af anvisninger strømmen sorteringsanlæg).
- Tilsæt 2 pi anti-Fc-receptor-IgG pr 1x10 6 celler og inkuberes ved 4 ° C i 10 minutter.
- Tilføj anti-CD45 (1: 150 fortynding, 10 pi per prøve) og anti-EpCAM (1: 100 fortynding, 10 pi per prøve) antistoffer og inkuberes ved 4 ° C i mere end 20 min.
- Vask cellerne med 2 ml vaskeopløsning og der centrifugeres ved 400 xg i 6 min ved 4 ° C. Aspirer supernatanten med en pipette.
- Resuspender cellerne i 1 ml 1x phosphatpufret saltvand (PBS).
- Filtreres gennem 100 um si.
- Påfør cellerne til sortering instrument. Vælg lymfocyt og TEC befolkning eksklusive de mindste celler på side-spredte lys (SSC) / fremadrettede spredte lys (FSC) panel (døde celler), så porten på den valgte population for CD45- EpCAM + til sortering 13.
4. Generation af TEC / EAK Aggregates
Bemærk: Udfør forberedelse og trin, der involverer celle blanding under laminar hætte reagens.
- Forbered pA / G adapter komplekser ved at blande 4 pi anti-His-mærke IgG, 8 pi anti-EpCAM IgG og 2,6 pi pA / G i en steril 1,5 ml mikrocentrifugerør, og inkuberes ved stuetemperatur i 5 minutter.
- Juster de sorterede TECs fra trin 3,7 til 5x10 4 celler / ml med vaskeopløsning, og pipette 100 pi til en brønd af en lav evaporativ, 96-brønds rundbundet vævsdyrkningsplade. Tilføj 14.6 pi pA / G adapter komplekser til cellerne. Pladen anbringes på en vippende platform i 20 minutter ved 4 ° C.
- Der vaskes én gang med 200 pi vaskeopløsning. Centrifugeres pladen ved 400 xg i 6 min. Supernatanten med en mikropipette.
- Der vaskes én gang med 200 pi 10% sucroseopløsning. Centrifuger ved 400 xg i 6 min. Supernatanten med en mikropipette.
- Resuspender celler i 30 pi 10% sterile sucroseopløsning per brønd.
- Tilsæt 10 pi EAKIIH6 (7,5 mg / ml) og inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Tilsæt 20 pi EAK16-II (10 mg / ml) til TEC blanding.
- Tilsæt 100 pi komplet medium til systemet starte gelering. Pladen anbringes på en platform-ryster i 15-20 minutter ved stuetemperatur.
- Pladen anbringes i inkubatoren ved 37 ° C og 5% CO2. Efter 2-4 timer, tilsættes yderligere 100 ul komplet medium.
- Skift medium hver anden dag indtil brug.
- Aspirer 100 pi af mediet fra overfladen uden at forstyrre under anvendelse af en mikropipette og forsigtigt tilsættes 100 pi foropvarmet medium ved at placere pipettespidsen til væggen af borehullet.
5. Karakterisering af TEC / EAK Aggregates
- For at undersøge funktionen af TEC / EAK aggregater in vivo, indsamle TEC / EAK hydrogel efter O / N kultur og transplantation under nyrekapslen af en athymiske nøgenmus, under anvendelse af tidligere beskrevne procedure 11,14.
- Overvåge udviklingen af T-celler i periferien ved at høste 50-100 pi blodprøver i EDTA-holdige blodprøvetagning rør fra nøgne mus 4-6 uger efter transplantation og pletten med en cocktail af anti-CD4, -CD8, -CD45 og -CD3 antistoffer 12.
- Analyser de procentdele af T-lymfocytter i det perifere blod leukocytter med flowcytometri (FCM), under anvendelse af enkelt celle analyse software 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at undersøge effektiviteten af at anvende den densitetsgradient separation protokol til at berige CD45- stromaceller blev celler høstet fra både grænsefladen og de udfældede lymfocyt pellets farvet med anti-CD45 og anti-EpCAM-antistoffer. Både anti-Almindelig Tornblad Agglutinin 1 (UEA1) og anti-MHC klasse II-antistoffer også inkluderet i farvningen cocktail for yderligere at identificere de CTec og MTEC delmængder. Som vist i figur 1, var vi i stand til rutinemæssigt at opnå tæt på 15-20 gange berigelse af TEC.
For at undersøge aggregering af TECs i EAK hydrogel, blev TEC isoleret fra 4 uger gamle B6.ROSA mT / Mg-mus, som ubikvitært udtrykker membranbundne, røde fluorescerende tdTomato molekyler. TEC aggregater, fremstillet som beskrevet ovenfor, blev dyrket i to dage in vitro og undersøgt under et konfokalt mikroskop ( 
Figur 1. Flow cytometri af TECs beriget med densitetsgradient opløsning. Celler blev farvet med anti-CD45 og anti-EpCAM-antistoffer til at skelne TEC population (CD45- EpCAM +). Venstre paneler: Thymic celler efter enzymfordøjelse, før proceduren densitetsgradienten. Middle paneler: Celler i det øverste lag og grænsefladen efter separation med densitetsgradient løsning. Højre paneler:. Pelleterede celler (lymfocyt pellet) efter separation med densitetsgradient løsning Klik her for at se en større version af dette tal. 
Figur 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mens TECs er den fremherskende befolkning i thymus stroma og spille vigtige roller for struktur og funktion af halskirtel, de kun udgør omkring 0,1-0,5% af den samlede thymisk cellularitet. De er også skrøbelige celler så høje procentdele af celledød er lejlighedsvis observeres efter collagenasefordøjelse, dvs. til behandling dissociere TECs fra den ekstracellulære matrix (ECM). Deres sjældenhed (~ 200.000 per mus thymus) og skrøbelighed gjorde det til en udfordrende opgave at isolere TECs. Den nylige udnyttelse af højt oprenset collagenase i TEC isolation har øget antallet af levende celler efter den enzymatiske fordøjelse 15-19.
Men det meget lille antal TECs stadig en stor udfordring for deres analyse og isolation, som der er behov for store mængder af antistoffer til celleoverfladen mærkning og store antal hændelser skal indsamles ved FACS. Mens antistof-konjugatd magnetisk perle-teknologi kan anvendes til at udtømme CD45 + thymocyter, deres store mængde gør det økonomisk prohibitiv i det lange løb. Vi var i stand til effektivt at berige TECs 15-20 gange med en enkel, et skridt densitetsgradientcentrifugering. Den iso-osmotisk ejendom iodixanol densitetsgradient medium tillader adskillelse af celler baseret på deres former, størrelser og tætheder 20-22. Det skal bemærkes, at renheden og udbyttet af TECs påvirkes af den procentdel af densitetsgradient anvendte medie. Lavere procentdel af densitetsgradient-medium (18-20% v / v) vil resultere i højere renhed af TECs i grænsefladen, men lavere udbytte. I modsætning hertil, når højere iodixanol koncentration (22% v / v) anvendes, kan større mængde thymiske celler opsamles med lavere procentdel af TECs. Koncentrationen af iodixanol bør justeres på grundlag af formålet med forsøget. Mens renheden af TECs stort set er forbedret med anvendeligheden af densitetsgradient opløsning, shoul detd understreges, at de indsamlede data fra det øverste lag og grænsefladen celler stadig indeholde en relativt høj brøkdel af CD45 + -celler (figur 1). Når derfor kun TEC befolkning er påkrævet som i dette eksperiment, vil cellesortering være afgørende, selv om dette ekstra procedure kan medføre et vist tab af celler og kræver mere tid.
Modsætning til de fleste epitelceller arrangeret i et enkelt eller flere lag foring indre organer, er TEC organiseret i 3-D-konfiguration i thymus stroma, som er afgørende for deres overlevelse og funktion. Den selv-montage EAK hydrogel letter dannelsen af 3-D TEC aggregater, der er medieret af tri-molekylære αH6: pA / G: αEpCAM adapter komplekser. Notatet af at finjustere de koncentrationer og forhold af EAK16-II / EAKIIH6 oligopeptider, porøsiteten og massefylden af hydrogelen kan justeres til at tillade strømmen af næringsstoffer og migrationen af thymocytter. Faktisk functional T-celler blev dannet i athymiske nøgne mus transplanteret med TEC / EAK kompositter.
Ulempen i dette EAK hydrogel-system er, at med det nuværende protokol, bestemt celle sammensætning kan ikke være lokaliseret til et bestemt område. I et fysisk miljø en thymus består af to adskilte rum, hvor bestemte typer af TECs bor, cTECs i cortex og mTECs i medulla. Med beskrevet vores system her, er både cTECs og mTECs mærket med EpCAM, en generel epitelial markør. Det er derfor spekuleret, at aggregaterne i den dannede hydrogel omfatter både undertyper af TECs. Selvom cTECs og mTECs stammer fra fælles bipotente TEC stamfædre, deres roller i udviklingen af T-celler er klart særpræg. Cortex er den første region i thymus, hvor de umodne thymiske progenitorceller indtaster, og den positive selektion foregår 23. Så de markerede celler flytte ind i medullær region og interagere med mTECs gennem which de selvnedbrydende celler elimineres ved negativ udvælgelse 24. Endvidere er det blevet vist, at 25% af generne differentielt udtrykt mellem cTECs og mTECs 25. Disse resultater understreger betydningen af at fremme aggregering af TEC delmængder at øge effektiviteten af T-celle udvikling. En mulig fremgangsmåde er at anvende forskellige antistoffer rettet mod overflademolekyler specifikke for enten cTECs eller mTECs, såsom anti-cytokeratin 8 for cTECs, og anti-cytokeratin 5 for mTECs.
Set fra fremtidig klinisk anvendelse, kan de TEC klynger indlejret i bionedbrydelige hydrogel fungere som injicerbare "mini thymus enheder" til at modulere det adaptive immunsystem, som kunne være vigtigt for forskellige medicinske tilstande, såsom foryngende adaptive immunsystem hos ældre individer eller inducere donor-specifik tolerance i organtransplantation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet delvist af National Institutes of Health giver R21 AI113000 (WSM) og R01 AI123392 (YF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TEC Isolation | |||
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2701(1 Gallon) | Ethanol 200 Proof, deionized water |
| Dissecting scissors, straight | Fine Science Tools, Inc. | 91460-11 | |
| Graefe forceps, straight | Fine Science Tools, Inc. | 11053-10 | |
| Graefe forceps, curved | Fine Science Tools, Inc. | 11052-10 | |
| Washing solution | 1x PBS, 0.1% BSA, 2 mM EDTA | ||
| 1x PBS (Phosphate buffered saline) | Gibco | 10010-023 | |
| BSA (Bovine serum albumin) | Sigma | A1470-100G | |
| EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | Invitrogen | 15575-038 | |
| Digestion solution | 9 ml RPMI-1640, 0.025 mg/ml Liberase TM Research grade, 10 mM HEPES, 0.2 mg/ml DNaseI | ||
| RPMI-1640 | Gibco | 11879-020 | |
| Liberase TM Research Grade | Roche | 05 401 127 001 | referred as "purified collagenase" |
| 1 M HEPES | Lonza | 17-737E | |
| Dnase I | Roche | 10 104 159 001 | |
| 50 ml Centrifuge tube | Corning | 430290 | |
| 60 mm tissue culture dish | Falcon | 353002 | |
| 1/2 cc U-100 Insulin syringe 28 1/2 G | Becton Dickinson | 329461 | |
| 5 ml Polystyrene round-bottom tube | Falcon | 352058 | |
| 5 ml glass pipet | Fisher Healthcare | 13-678-27E | Use for rinsing the thymic fragments. Thymic fragments tend to stick to the wall with plastic pipets. |
| MACSmix tube rotator | Miltenyi | 130-090-753 | |
| 100 µm Cell strainer | Falcon | 352360 | |
| Density gradient medium: OptiPrep | Axis-Shield | ||
| Cell Sorting | |||
| 5 ml Polypropylene round-bottom tube | Falcon | 352063 | |
| Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | Use as undiluted, 2 µl per sample |
| Anti-mouse CD45-PercpCy5.5 | eBioscience | 45-0451-80 | Use at 1:150, 10 µl per sample |
| Anti-mouse CD326 (EpCAM)-PE | eBioscience | 12-5791-82 | Use at 1:100, 10 µl per sample |
| BD Influx | BD Biosciences | ||
| Single cell analysis software | FlowJo | ||
| EAK Gel Assembly | |||
| Anti-His-Tag | AnaSpec | 29673 | "anti-His-Tag IgG" |
| Purified anti-mouse CD326 (EpCAM) | BioLegend | 118202 | "anti-EpCAM IgG" |
| Recombinant protein A/G | Pierce Biotechnology | ||
| 1.5 ml Safe-Lock Tubes, Biopur, Sterile | Fisher Healthcare | 05-402-24B | referred as "1.5 ml microcentrifuge tube" |
| 96-well, Tissue culture plate, Round-bottom with low evaporation lid | BD Falcon | 353917 | |
| Rocking platform: Nutator Mixer no.1105 | BD Clay Adams | ||
| 10% sucrose | Sigma | S0389 | Prepare with sterile distilled water |
| EAK16-II (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAK-CONH2) | American Peptide Company | custom synthesized, 10 mg/ml | |
| EAKIIH6 (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAKHHHHHH-CONH2) | American Peptide Company | custom synthesized, 7.5 mg/ml | |
| Complete medium | RPMI-1640, 10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% L-glutamine, 1% NEAA, 5 mM HEPES, 50 µM 2-Mercaptoethanol | ||
| RPMI-1640 | Gibco | 11879-020 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Atlanta Biologicals | S11150 | Heat inactivated before use |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| NEAA (non-essential amino acid) 100x | Gibco | 11140-050 | |
| 1 M HEPES | BioWhittaker | 17-737E | |
| 2-Mercaptoethanol (100x) | Millipore | ES-007-E | |
| Platform shaker: The Belly Dancer | Stovall Life Sciences Inc. | model: USBDbo |
References
- Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus. Nature. 362, 70-73 (1993).
- Fan, Y., et al. Thymus-specific deletion of insulin induces autoimmune diabetes. The EMBO J. 28, 2812-2824 (2009).
- Mohtashami, M., Zuniga-Pflucker, J. C. Three-dimensional architecture of the thymus is required to maintain delta-like expression necessary for inducing T cell development. J Immunol. 176, 730-734 (2006).
- Pinto, S., et al. An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression. J Immunol. 190, 1085-1093 (2013).
- Fung, S. Y., Yang, H., Chen, P. Formation of colloidal suspension of hydrophobic compounds with an amphiphilic self-assembling peptide. Colloids Surf B Biointerfaces. 55, 200-211 (2007).
- Jun, S., et al. Self-assembly of the ionic peptide EAK16: the effect of charge distributions on self-assembly. Biophys J. 87, 1249-1259 (2004).
- Saunders, M. J., et al. Engineering fluorogen activating proteins into self-assembling materials. Bioconjug Chem. 24, 803-810 (2013).
- Zhang, S., Holmes, T., Lockshin, C., Rich, A. Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane. Proc of the Natl Acad Sci U S A. 90, 3334-3338 (1993).
- Wen, Y., et al. Coassembly of amphiphilic peptide EAK16-II with histidinylated analogues and implications for functionalization of beta-sheet fibrils in vivo. Biomaterials. 35, 5196-5205 (2014).
- Zheng, Y., et al. A peptide-based material platform for displaying antibodies to engage T cells. Biomaterials. 32, 249-257 (2011).
- Tajima, A., et al. Bioengineering mini functional thymic units with EAK16-II/EAKIIH6 self-assembling hydrogel. Clin Immunol. 160, 82-89 (2015).
- Fan, Y., et al. Bioengineering Thymus Organoids to Restore Thymic Function and Induce Donor-Specific Immune Tolerance to Allografts. Mol Ther. 23, 1262-1277 (2015).
- Fan, Y., et al. Thymus-specific deletion of insulin induces autoimmune diabetes. The EMBO J. 28, 2812-2824 (2009).
- Fan, Y., et al. Compromised central tolerance of ICA69 induces multiple organ autoimmunity. J Autoimmun. 53, 10-25 (2014).
- Palumbo, M. O., Levi, D., Chentoufi, A. A., Polychronakos, C. Isolation and characterization of proinsulin-producing medullary thymic epithelial cell clones. Diabetes. 55, 2595-2601 (2006).
- Williams, K. M., et al. Single cell analysis of complex thymus stromal cell populations: rapid thymic epithelia preparation characterizes radiation injury. Clin Transl Sci. 2, 279-285 (2009).
- McLelland, B. T., Gravano, D., Castillo, J., Montoy, S., Manilay, J. O. Enhanced isolation of adult thymic epithelial cell subsets for multiparameter flow cytometry and gene expression analysis. J Immunol Methods. 367, 85-94 (2011).
- Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. J Immunol methods. 385, 23-34 (2012).
- Xing, Y., Hogquist, K. A. Isolation, identification, and purification of murine thymic epithelial cells. J Vis Exp. , e51780 (2014).
- Graham, J. M. Separation of monocytes from whole human blood. ScientificWorldJournal. 2, 1540-1543 (2002).
- Li, X., Donowitz, M. Fractionation of subcellular membrane vesicles of epithelial and nonepithelial cells by OptiPrep density gradient ultracentrifugation. Methods Mol Biol. 440, 97-110 (2008).
- Mita, A., et al. Purification method using iodixanol (OptiPrep)-based density gradient significantly reduces cytokine chemokine production from human islet preparations, leading to prolonged beta-cell survival during pretransplantation culture. Transplant Proc. 41, 314-315 (2009).
- Anderson, G., Takahama, Y. Thymic epithelial cells: working class heroes for T cell development and repertoire selection. Trends Immunol. 33, 256-263 (2012).
- Kyewski, B., Klein, L. A central role for central tolerance. Annu Rev Immunol. 24, 571-606 (2006).
- St-Pierre, C., et al. Transcriptome sequencing of neonatal thymic epithelial cells. Sci Rep. 3, 1860 (2013).
