Introduction
Timus edinilmiş bağışıklık sisteminin işlevi için önemlidir patojen reaktif, kendine dayanıklı T hücrelerinin çeşitli nüfusun oluşturulması için primer lenfoid organıdır. Bu timik stroma sünger benzeri üç boyutlu (3-D) matris boyunca göç, gelişmekte olan timositleri, lenfosit progenitör hücreler olarak kemik iliğinden göç dinamik bir organdır, soy-şartname ve farklılaşma tabi, ve sonunda da göç olgun T hücreleri. bu iyi programlanmış sürecin başarısı büyük ölçüde göç timositlerde ve konut timik epitel hücreleri (Tecs) kurulması ve timus mikroçevresinin bütünlüğünü korumak için gerekli olan timik stroma baskın nüfus arasındaki çapraz konuşma bağlıdır.
anatomik bir konumda ve eşsiz fonksiyon esas alınarak, TECS iki alt ayrılabilir: kortekste Tecs yanıtlayabiliyor olan (cTECs)Kendi kendine MHC (majör histokompatibilite kompleks) seçilmesi olan kişidir T hücreleri (pozitif seçim) ve otoreaktif T hücreleri (negatif seçim) 1,2 ortadan kaldırmak için gerekli olan medullada Tecs (mTECs) yazılmıştır. Birçok faktör (örneğin, yaşlanma, enfeksiyon, radyasyon, ilaç tedavileri) tehlikeye adaptif bağışıklık sonuçlanan timik epitele geri dönüşü olmayan hasarlara neden olabilir. Çok sayıda girişimlerine rağmen, timus fonksiyonu yeniden nedeniyle timik mikro çoğaltmak zorluk zorlu olmuştur. 2-B ortamında kültürlenmiştir Tecs hızlı thymopoiesis 3,4 kritik genlerin ekspresyonunu azaltmak ise Özellikle, timik üç boyutlu (3-D) konfigürasyonu, Tecs hayatta kalma ve işlevi için önemlidir.
EAK16-II (AEAEKAKAEAEAKAK) ve C-ucu histidinylated analog EAKIIH6 (AEAEKAKAEAEAKAKHHHHHH), düşük molekül ağırlıklı, deiyonize Su sağlama içinde çözünür olan amfifilik oligopeptitlerdir20 mM NaCI (insan vücut sıvısı normal tuz konsantrasyonunun 154 mM) daha yüksek iyonik güce maruz kaldığı zaman R, β-fibriller oluşturur jelleşme ama geçer. Bu çevre duyarlı özellik 3D yapıları oluşturmak üzere onları çok yönlü yapı taşlarını yapar. kompleksleri, protein ilaçları ve diğer biyomoleküllerin demirlemek için bir adaptör olarak hizmet verebilir (: EAKII-H6 üzerinde His-tag takma mekanizması, hangi anti-His IgG'ler / Fc bağlayıcı rekombinant protein A / G (pA / G αH6) sağlar örneğin hidrojel karma yapısını 5-8, antikorlar).
Daha önce hidrojel üzerine bağlanan flüoresan etiketli IgG molekülleri kadar 13 gün 9 enjeksiyon yerinde muhafaza edilebileceğini göstermiştir. ΑH6 Dahası,: Anti-CD4 IgG'lerin ile sabitlenen pA / G adaptörleri EAK16 II / EAKIIH6 (EAK) hidrojel ilave edildi, CD4 + T hücreleri, spesifik olarak 10 ele geçirildi. benzer bir teknik kullanılarak, yakın zamanda göstermiştir ki TECS C 3-D-çekiş(: PA / G: αEpCAM αH6) TEC-özel anti-EpCAM antikorları taşıyan adaptör kompleksleri ile EAK hidrojel terfi ould. Çıplak farelerin böbrek kapsülleri altına nakledildiklerinde, EAK hidrojel gömülü TEC kümeleri etkili in vivo 11,12 işlevsel T hücrelerinin gelişimini destekler.
Burada hızlı ve etkin bir floresan aktive hücre (FACS) ile Tecs arındırmak ve EAK hidrojel sistemi ile 3-D TEC agrega üretmek için bizim yöntemini gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deneylerde kullanılan tüm hayvanlar Allegheny Sağlık Ağı / Allegheny Şarkıcı Araştırma Enstitüsü Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından incelenen ve onaylanan protokol çerçevesinde Allegheny-Singer Araştırma Enstitüsü'nde hayvan tesisine yerleştirilmiştir bulundu.
1. kollagenaz Timüsü özümsemek
- Hasat timüs bezleri.
- Timus bezleri hasat için 3-5 haftalık C57BL6 / J karbondioksit fareler (CO 2) odasına euthanize. Ayrıntılı olarak, 3-5 dakika boyunca CO2 indüksiyonu altında bölme fareler yerleştirin ve kalp ya da solunum doğrulayarak ölüm teyit etmektedir.
- Sırtında karkas yatırın ve% 70 etanol ile vücut ıslak. deri yoluyla karın üzerinde keskin, düz diseksiyon makas ile küçük bir yatay bir kesi yapmak. onun tersyüz böylece her iki ucunda (baş ve bacaklar) deriyi çekin.
- diseksiyon makas hemen altında yatay bir kesim olundüşük kaburga ve yanlara diyafram kesti. Bir forseps ile kılıç şeklinde sürecini tutun ve her iki tarafta yukarı geçmeden kaburga orta kesti. timus açıkça görülebilecek şekilde kaburga / sternum yukarı çekin.
Not: Thymus, doğrudan kalbin üstüne yatıyor 2 lob oluşur ve beyaz saydam renk olduğunu. - yavaşça kepçe ve bağ dokusu ve yıkama çözeltisi içinde transfer kapalı timus lobları çekin kavisli bir forseps kullanarak (Malzeme listesi bakınız).
- 9 ml RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute orta 1640), 0.025 mg / ml saflaştınlmış kolajenaz, 10 mM HEPES [4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit] ve 0.2 mg / ml karıştırılarak sindirim çözeltisi hazırlayın 50 ml'lik bir santrifüj tüpü içinde DNase I. kullanılana kadar 37 ° C su banyosu içinde sindirim çözeltisi tutun.
Not: hazırlanan sindirim solüsyonunun miktarı bir 5 ml polistiren yuvarlık tabanlı birlikte inkübe edilebilir en fazla beş yetişkin fare Thymi için yeterlidiralt tüp. - 5-6 ml RPMI-1640 ihtiva eden bir 60 mm doku kültürü çanağı timus aktarın.
- Lenfositler dışarı akmasına izin vermek, küçük parçalar halinde 28 G insülin şırınga iğnesi (yaklaşık 1 mm 3 kare) ile timus teşrih.
- cam Pasteur pipeti ile petri olan RPMI-1640 ile timik parçaları durulayın. çanak eğin ve timik fragmanları dibe edelim. Yavaş yavaş aspire ve bir cam pipet kullanarak RPMI-1640 süpernatant atın. Solüsyon daha az opak olana kadar cam pipet ile 4-5 kez 5-6 ml RPMI-1640 ile bu durulama adımı yineleyin.
Not: Cam pipetler bu aşamada tavsiye edilir, timik fragmanlar timik dokuların aşırı kaybına neden plastik sopa eğilimindedir beri. Prosedürün geri kalanı için, plastik pipet kullanın. - Adım 1.5'de tarif edildiği gibi son yıkamadan sonra, süpernatant atılır. 3 mi sindirim çözeltisi ekleyin ve 5 ml'lik yuvarlak dipli bir p haline timus parçaları ve çözeltisiniolystyrene tüp.
- tüp rotator Tüp 12 rpm'lik bir dönme hızında 6 dakika için 37 ° C de inkübe edilir.
- kuluçkadan sonra timik fragmanları yerçekimiyle tüpün dibine yerleşmek sağlar. Pasteur pipeti ile süpernatan toplamak ve yıkama solüsyonu 10 ml bir 50 ml'lik santrifüj tüpüne aktarılır. 5 dakika boyunca 300 xg'de santrifüj, supernatant atmak ve 10 ml yıkama solüsyonu hücreleri tekrar süspansiyon. buz üzerinde tutun.
- Yineleyin yuvarlak alt polistiren tüp 5 ml timik parçaları iki kez 1.6-1.8 adımları. Aynı 50 ml tüp içinde süpernatant havuz.
Not: Santrifüj, ikinci ve üçüncü yıkama için gerekli değildir. - 50 ml santrifüj tüpüne tüp ve transferi herhangi bir geri kalan parçaları parçalamak için son sindirimden sonra, yukarı pipetleyin ve 2 ml plastik pipet serolojik aşağı.
- Santrifüj 5 dakika boyunca 300 x g'de 50 ml tüp, çamaşır Buffe 10 ml süpernatan, tekrar süspansiyon aspire100 mikron hücre süzgecinden r ve filtre. buz üzerinde tutun.
Kesintili Yoğunluk Gradyan ile TECS 2. zenginleştirilmesi
- 2.4 mi yoğunluk gradyan ortamı (su içinde iyodiksanol ağ / hac% 60) ve 9.6 ml yıkama solüsyonu karıştırılarak% 21 yoğunluk gradyan çözeltisi hazırlayın.
- 2.5 ml yıkama tamponunda 5 dakika ve tekrar süspansiyon için 300 xg'de adım 1.11 50 ml toplama tüpü ayrışmış timik hücreleri Santrifüj.
- Hücre süspansiyonu 20 ml RPMI-1640 ortamı ekleyin.
- elektronik bir pipet ile 10 ml'lik bir serolojik pipet% 21 yoğunluk gradyan çözeltisi 12 ml doldurun. 50 ml santrifüj borusu içeren hücrelerin alt serolojik pipet ucu yerleştirin ve yoğunluk gradyan çözeltisi yerçekimi ile tüpün dibine drenaj sağlar.
- Yavaşça farklı yoğunluktaki iki kat üreten bitirmek için pipetlemeyin yoğunluk gradyan çözüm sınırdışı.
- 600 x g'de santrifüj foR bir sallanan kepçeli rotor oda sıcaklığında 20 dakika. yavaş düzeyde yavaşlama hızını ayarlayın.
- Yeni 50 ml tüp üst tabaka ve arayüz aktarın.
Not: TECS çoğu arayüzü tutulur. Lenfositler Santrifüj işleminden sonra tüpün dibine çöker. Bu hücreler, başka amaçlar için kullanılmak üzere ise, üç kez 20 ml yıkama solüsyonu ile pelet yıkayın. Yıkama tamponu, 10 ml tekrar süspansiyon hücreleri. - 4 ° C'de 6 dakika boyunca 400 xg'de adım 2.6 ve santrifüj tüpe 40 ml yıkama solüsyonu ekleyin. Bir pipet ile süpernatant, aspire kaldırmak için.
- Adım 2.7 açıklandığı gibi yıkama ve aspirasyon 2 kez daha tekrarlayın.
- yıkama çözeltisi, 2 ml ve yeniden süspanse hemasitometre ile hücre sayımı.
FACS ile 3. Yalıtımlı Tecs
- Yıkama solüsyonu ve transfer 1x10 6 hücre / 100 ul konsantrasyonunda adım 2.9 hücreleri ayarlayın(Akış sıralayıcı tarafından tavsiye edilen şekilde polipropilen veya polistirenin,) 5 mL'lik yuvarlak dipli bir tüp hücre.
- 1x10 6 hücre başına 2 ul anti-Fc reseptörü IgG ekleyin ve 10 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- (: 150 seyrelti, örnek başına 10 ul 1) ve anti-EpCAM, anti-CD45 ekleyin (1: 100 seyrelti, örnek başına 10 ul) antikorları ve en fazla 20 dakika süreyle 4 ° C'de inkübe edin.
- 4 ° C'de 6 dakika boyunca 400 x g'de 2 ml yıkama çözeltisi ve santrifüj ile hücreler yıkanır. Bir pipet ile süpernatant aspire.
- 1 mi 1 x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde tekrar süspansiyon hücreleri.
- 100 mikron süzgeç süzülür.
- sıralama enstrüman hücreleri uygulayın. Yan dağınık ışık (SSC) / ileri-dağınık ışık (FSC) paneli (ölü hücreler), 13 sıralamak için CD45- EpCAM + için seçilen nüfus ardından kapı üzerinde küçük hücreler hariç lenfosit ve TEC nüfusu seçin.
4. GTEC / EAK Agregalarının eneration
Not: reaktif hazırlama ve laminer kaputun altında karıştırma hücreyi içeren adımları uygulayın.
- steril bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde, anti-His-tag IgG 4 ul anti-EpCAM IgG 8 ul ve PA / G 2.6 ul karıştırılarak pA / G Adaptör kompleksleri hazırlamak, ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
- Yıkama çözeltisi ve pipet düşük buharlaşmalı, 96 gözlü yuvarlak tabanlı doku kültürü plakası, bir oyuk 100 ul 5x10 4 hücre / ml aşama 3,7 kriteri Tecs ayarlayın. hücrelere 14.6 ul pA / G Adaptör kompleksleri ekleyin. 4 ° C'de 20 dakika süreyle sallanan bir platform üzerinde plaka koyun.
- 200 ul yıkama çözeltisi ile bir kez yıkanır. 6 dakika boyunca 400 x g'de plaka santrifüj. Bir mikropipet ile süpernatant atın.
- 200 ul% 10 sukroz çözeltisi ile bir kez yıkanır. 6 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin. Bir mikropipet ile süpernatant atın.
- 30 ul 10% s yeniden süspanse hücrelerioyuk başına terile sukroz çözeltisi.
- EAKIIH6 10 ul (7.5 mg / ml) ilave edin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilir.
- TEC karışımına EAK16-II 'nin 20 ul (10 mg / ml) eklenir.
- jelleşme başlatmak için sisteme tam ortam 100 ul ekle. Oda sıcaklığında 15-20 dakika süre ile bir çalkalama platformunda plaka koyun.
- 37 ° C'de inkübatör içinde plaka koyun ve% 5 CO2. 2-4 saat sonra, tam bir ortamda bir 100 ul ilave edin.
- kullanılana kadar her gün orta değiştirin.
- Aspire bir mikropipet kullanarak ve yavaşça kuyunun duvarına pipet koyarak önceden ısıtılmış orta 100 ul eklemek jel bozmadan yüzeyden orta 100 ul.
TEC / EAK Agregalarının 5. Karakterizasyonu
- In vivo TEC / EAK agrega fonksiyonunu incelemek için, bir atimik çıplak böbrek kapsülü altında O / N kültür ve nakli sonrasında TEC / EAK hidrojel toplamakFare, daha önce prosedür 11,14 tarif kullanarak.
- 4-6 hafta anti-CD4 bir kokteyli ile nakli ve lekeyi yayınlamak çıplak farelerde, -CD8, -CD45 EDTA içeren, kan toplama tüpüne 50-100 ul kan örnekleri hasadı çevre T hücrelerinin gelişimini izlemek ve -CD3 12 antikorları.
- Tek hücre analiz yazılımı 12 kullanılarak akış sitometrisi ile çevresel kan lökositleri (FCM) T-lenfositlerin oranı analiz edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CD45- stromal hücreler ettirecek yoğunluk gradyan ayırma protokolü kullanılarak etkinliğini incelemek için, arayüz ve çökelen lenfosit pelet iki hasat hücreleri, anti-CD45 ve anti-EpCAM antikor ile boyandı. Hem anti-Ulex Europaeus Agglutinin 1 (UEA1) ve anti-MHC Sınıf II antikorlar yanı sıra diğer CTEC ve MTec alt kümeleri tespit etmek boyama kokteyli alındı. Şekil 1'de gösterildiği gibi, rutin TECS 15-20 kat zenginleşme yakın yakalamayı başardık.
EAK hidrojel Tecs agregasyonunu incelemek için, Tecs her yerde bulunan bir zara-bağlı, kırmızı floresan tdTomato molekülleri ifade 4 haftalık B6.ROSA mT / Mg farelerden izole edilmiştir. Yukarıda tarif edildiği gibi hazırlanmıştır TEC agregalar, (in vitro iki gün kültürlendi ve konfokal mikroskop altında incelendi 
TECS Şekil 1. Akış sitometrik analizi yoğunluk gradyan çözeltisi ile zenginleştirilmiş. Hücreler TEC popülasyonu (CD45- EpCAM +) ayırt etmek için, anti-CD45 ve anti-EpCAM antikor ile boyandı. Sol paneller: enzim sindirimi sonra Timik hücreler, yoğunluk gradyan prosedüründen önce. Orta paneller: Üst katmanda Hücreler ve yoğunluk gradyan çözeltisi ile ayrıldıktan sonra arayüz. Sağ paneller:. Yoğunluk gradyan çözeltisi ile ayrıldıktan sonra Topak haline getirilen hücreler (lenfosit topak) bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. 
Şekil 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TECS timus stroma baskın nüfus ve timüs bezlerinin yapısı ve fonksiyonu için temel rolleri oynarken, onlar toplam timik sellülarite sadece yaklaşık 0.1-0.5% temsil etmektedir. Bunlar aynı zamanda, hücre ölümü, yüksek yüzdeleri zaman, yani, tedavi hücre dışı matrisin (ECM) ile ilgili Tecs ayırmak için, kollajenaz sindirimi aşağıdaki koşullar kırılgan hücrelerdir. Onların nadir (~ 200.000 fare timus başına) ve kırılganlık o TECS izole etmek zor bir görev yaptı. TEC izole yüksek oranda saflaştırılmış kollajenaz son kullanım önemli ölçüde enzimatik sindirim 15-19 takip eden canlı hücrelerinin sayısında artış var.
antikorların büyük miktarlarda hücre yüzey etiketleme için gerekli ve olayların aşırı sayıda FACS tarafından toplanan gerekir gibi Ancak, Tecs çok az sayıda, onların analiz ve izolasyon için önemli bir sorun olmaya devam etmektedir. antikora konjuge daD manyetik boncuk teknolojisi CD45 + timositleri tüketmek için kullanılabilir, bunların büyük miktarda uzun vadede ekonomik engelleyici hale getirir. Biz etkin bir şekilde basit, bir adım yoğunluk gradyan santrifüj ile Tecs 15-20 kez zenginleştirmek başardık. Iyodiksanol yoğunluk gradyan orta izo-ozmotik özellik onların şekil, boyut ve yoğunluklarda 20-22 dayalı hücrelerin ayrılması sağlar. TECS saflığı ve verimi kullanılan yoğunluk gradyan ortamı yüzdesi etkilenen unutulmamalıdır. yoğunluk gradyan ortamının alt yüzde (% 18-20 h / h) arayüzünde Tecs daha yüksek saflıkta, ancak daha düşük bir verimle sonuçlanır. Bunun tersine, ne zaman daha yüksek iyodiksanol konsantrasyonu (% 22 h / h) kullanılmıştır, timik hücrelerin daha büyük miktarda TECS düşük bir yüzde ile toplanabilir. iyodiksanol konsantrasyonu deney amacına dayanmaktadır ayarlanabilir olmalıdır. TECS saflığı ölçüde yoğunluk gradyan çözeltisi programı ile geliştirilmiş olsa da, bu shoulüst tabaka ve arayüz toplanan hücreler hâlâ (Şekil 1) CD45 + hücreleri, bir nispeten fazla bir bölümünü vurgulanmalıdır d. Bu ekstra işlem hücrelerinin kaybına neden ve fazla zaman gerektirir rağmen nedenle, sadece TEC nüfus bu deneyde olduğu gibi gerektiğinde, hücre sıralama, çok önemli olacak.
iç organlarından astar bir tek ya da çok katlı olarak düzenlenmiş epitel hücrelerinin çoğunun, Tecs bunların hayatta kalma ve fonksiyonu için gerekli olan timus stroma, 3-D konfigürasyonunda düzenlenir. pA / G: αEpCAM adaptörü kompleksleri kendiliğinden montaj EAK hidrojel sistemi üç molekül αH6 aracılık ettiği 3-D TEC agregatların oluşumunu kolaylaştırır. Dikkat çekici bir şekilde, ile konsantrasyonları ve EAK16-II / EAKIIH6 oligopeptidler, gözeneklilik ve hidrojel yoğunluğunun oranları ince ayar besin akışı ve timositlerin göç sağlamak için ayarlanabilir. Gerçekten de, FunctionAL T-hücreleri, Tec / EAK kompozit transplante edilmiş atimik çıplak farede üretilmiştir.
Bu EAK hidrojel sisteminde dezavantajı bu akım protokol ile, belirli bir hücre kompozisyon belirlenmiş bir alana lokalize edilemez olmasıdır. Bir fiziksel çevrede bir timus Tecs belirli türleri bulundukları iki ayrı bölmelere, medullada korteks cTECs ve mTECs oluşur. Bizim sistem burada tanımlanmıştır ile, cTECs ve mTECs hem EpCAM, genel epitel işaretleyici ile etiketlenir. Bu nedenle, oluşturulan hidrojel agrega Tecs iki alt tipleri içerir düşünülmektedir. cTECs ve mTECs ortak bipotent TEC progenitörlerinden elde edilmesine rağmen, T-hücrelerinin gelişmesinde görevleri açıkça ayırt edici. Korteks olgunlaşmamış timik progenitör hücrelerin girmek timus ilk bölgedir ve pozitif seleksiyon yer 23 alır. Sonra Seçilen hücreler w aracılığıyla, medüller bölgeye taşımak ve mTECs ile etkileşimhich kendiliğinden reaktif hücreler negatif seleksiyon 24 tarafından elimine edilir. Ayrıca, gen% 25 farklı şekilde cTECs ve mTECs 25 ile ifade edilmiştir olduğu gösterilmiştir. Bu bulgular T hücresi gelişiminin etkinliğini artırmak için TEC alt gruplarının toplanmasını teşvik edilmesinin önemini vurgulamaktadır. Olası bir yaklaşım, cTECs anti-sitokeratin 8 ve mTECs anti-sitokeratin 5 ile cTECs ya mTECs birine spesifik yüzey molekülleri hedef alan farklı antikorlar kullanmaktır.
gelecekteki klinik uygulama açısından bakıldığında, biyolojik olarak parçalanabilen hidrojel gömülü TEC kümeleri gibi yaşlı bireylerde adaptif bağışıklık sistemini gençleştirici gibi çeşitli tıbbi koşullar için önemli olabilir adaptif bağışıklık sistemini modüle etmek gibi enjekte "mini timus birimleri" işlevi olabilir veya organ naklinde donöre özgü tolerans indükte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu çalışma R21 AI113000 (ATM) ve R01 AI123392 (YF) Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından kısmen hibe desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TEC Isolation | |||
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2701(1 Gallon) | Ethanol 200 Proof, deionized water |
| Dissecting scissors, straight | Fine Science Tools, Inc. | 91460-11 | |
| Graefe forceps, straight | Fine Science Tools, Inc. | 11053-10 | |
| Graefe forceps, curved | Fine Science Tools, Inc. | 11052-10 | |
| Washing solution | 1x PBS, 0.1% BSA, 2 mM EDTA | ||
| 1x PBS (Phosphate buffered saline) | Gibco | 10010-023 | |
| BSA (Bovine serum albumin) | Sigma | A1470-100G | |
| EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | Invitrogen | 15575-038 | |
| Digestion solution | 9 ml RPMI-1640, 0.025 mg/ml Liberase TM Research grade, 10 mM HEPES, 0.2 mg/ml DNaseI | ||
| RPMI-1640 | Gibco | 11879-020 | |
| Liberase TM Research Grade | Roche | 05 401 127 001 | referred as "purified collagenase" |
| 1 M HEPES | Lonza | 17-737E | |
| Dnase I | Roche | 10 104 159 001 | |
| 50 ml Centrifuge tube | Corning | 430290 | |
| 60 mm tissue culture dish | Falcon | 353002 | |
| 1/2 cc U-100 Insulin syringe 28 1/2 G | Becton Dickinson | 329461 | |
| 5 ml Polystyrene round-bottom tube | Falcon | 352058 | |
| 5 ml glass pipet | Fisher Healthcare | 13-678-27E | Use for rinsing the thymic fragments. Thymic fragments tend to stick to the wall with plastic pipets. |
| MACSmix tube rotator | Miltenyi | 130-090-753 | |
| 100 µm Cell strainer | Falcon | 352360 | |
| Density gradient medium: OptiPrep | Axis-Shield | ||
| Cell Sorting | |||
| 5 ml Polypropylene round-bottom tube | Falcon | 352063 | |
| Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | Use as undiluted, 2 µl per sample |
| Anti-mouse CD45-PercpCy5.5 | eBioscience | 45-0451-80 | Use at 1:150, 10 µl per sample |
| Anti-mouse CD326 (EpCAM)-PE | eBioscience | 12-5791-82 | Use at 1:100, 10 µl per sample |
| BD Influx | BD Biosciences | ||
| Single cell analysis software | FlowJo | ||
| EAK Gel Assembly | |||
| Anti-His-Tag | AnaSpec | 29673 | "anti-His-Tag IgG" |
| Purified anti-mouse CD326 (EpCAM) | BioLegend | 118202 | "anti-EpCAM IgG" |
| Recombinant protein A/G | Pierce Biotechnology | ||
| 1.5 ml Safe-Lock Tubes, Biopur, Sterile | Fisher Healthcare | 05-402-24B | referred as "1.5 ml microcentrifuge tube" |
| 96-well, Tissue culture plate, Round-bottom with low evaporation lid | BD Falcon | 353917 | |
| Rocking platform: Nutator Mixer no.1105 | BD Clay Adams | ||
| 10% sucrose | Sigma | S0389 | Prepare with sterile distilled water |
| EAK16-II (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAK-CONH2) | American Peptide Company | custom synthesized, 10 mg/ml | |
| EAKIIH6 (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAKHHHHHH-CONH2) | American Peptide Company | custom synthesized, 7.5 mg/ml | |
| Complete medium | RPMI-1640, 10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% L-glutamine, 1% NEAA, 5 mM HEPES, 50 µM 2-Mercaptoethanol | ||
| RPMI-1640 | Gibco | 11879-020 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Atlanta Biologicals | S11150 | Heat inactivated before use |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| NEAA (non-essential amino acid) 100x | Gibco | 11140-050 | |
| 1 M HEPES | BioWhittaker | 17-737E | |
| 2-Mercaptoethanol (100x) | Millipore | ES-007-E | |
| Platform shaker: The Belly Dancer | Stovall Life Sciences Inc. | model: USBDbo |
References
- Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus. Nature. 362, 70-73 (1993).
- Fan, Y., et al. Thymus-specific deletion of insulin induces autoimmune diabetes. The EMBO J. 28, 2812-2824 (2009).
- Mohtashami, M., Zuniga-Pflucker, J. C. Three-dimensional architecture of the thymus is required to maintain delta-like expression necessary for inducing T cell development. J Immunol. 176, 730-734 (2006).
- Pinto, S., et al. An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression. J Immunol. 190, 1085-1093 (2013).
- Fung, S. Y., Yang, H., Chen, P. Formation of colloidal suspension of hydrophobic compounds with an amphiphilic self-assembling peptide. Colloids Surf B Biointerfaces. 55, 200-211 (2007).
- Jun, S., et al. Self-assembly of the ionic peptide EAK16: the effect of charge distributions on self-assembly. Biophys J. 87, 1249-1259 (2004).
- Saunders, M. J., et al. Engineering fluorogen activating proteins into self-assembling materials. Bioconjug Chem. 24, 803-810 (2013).
- Zhang, S., Holmes, T., Lockshin, C., Rich, A. Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane. Proc of the Natl Acad Sci U S A. 90, 3334-3338 (1993).
- Wen, Y., et al. Coassembly of amphiphilic peptide EAK16-II with histidinylated analogues and implications for functionalization of beta-sheet fibrils in vivo. Biomaterials. 35, 5196-5205 (2014).
- Zheng, Y., et al. A peptide-based material platform for displaying antibodies to engage T cells. Biomaterials. 32, 249-257 (2011).
- Tajima, A., et al. Bioengineering mini functional thymic units with EAK16-II/EAKIIH6 self-assembling hydrogel. Clin Immunol. 160, 82-89 (2015).
- Fan, Y., et al. Bioengineering Thymus Organoids to Restore Thymic Function and Induce Donor-Specific Immune Tolerance to Allografts. Mol Ther. 23, 1262-1277 (2015).
- Fan, Y., et al. Thymus-specific deletion of insulin induces autoimmune diabetes. The EMBO J. 28, 2812-2824 (2009).
- Fan, Y., et al. Compromised central tolerance of ICA69 induces multiple organ autoimmunity. J Autoimmun. 53, 10-25 (2014).
- Palumbo, M. O., Levi, D., Chentoufi, A. A., Polychronakos, C. Isolation and characterization of proinsulin-producing medullary thymic epithelial cell clones. Diabetes. 55, 2595-2601 (2006).
- Williams, K. M., et al. Single cell analysis of complex thymus stromal cell populations: rapid thymic epithelia preparation characterizes radiation injury. Clin Transl Sci. 2, 279-285 (2009).
- McLelland, B. T., Gravano, D., Castillo, J., Montoy, S., Manilay, J. O. Enhanced isolation of adult thymic epithelial cell subsets for multiparameter flow cytometry and gene expression analysis. J Immunol Methods. 367, 85-94 (2011).
- Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. J Immunol methods. 385, 23-34 (2012).
- Xing, Y., Hogquist, K. A. Isolation, identification, and purification of murine thymic epithelial cells. J Vis Exp. , e51780 (2014).
- Graham, J. M. Separation of monocytes from whole human blood. ScientificWorldJournal. 2, 1540-1543 (2002).
- Li, X., Donowitz, M. Fractionation of subcellular membrane vesicles of epithelial and nonepithelial cells by OptiPrep density gradient ultracentrifugation. Methods Mol Biol. 440, 97-110 (2008).
- Mita, A., et al. Purification method using iodixanol (OptiPrep)-based density gradient significantly reduces cytokine chemokine production from human islet preparations, leading to prolonged beta-cell survival during pretransplantation culture. Transplant Proc. 41, 314-315 (2009).
- Anderson, G., Takahama, Y. Thymic epithelial cells: working class heroes for T cell development and repertoire selection. Trends Immunol. 33, 256-263 (2012).
- Kyewski, B., Klein, L. A central role for central tolerance. Annu Rev Immunol. 24, 571-606 (2006).
- St-Pierre, C., et al. Transcriptome sequencing of neonatal thymic epithelial cells. Sci Rep. 3, 1860 (2013).
